Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

MicroRNA baserad reglering av Picornavirus Tropism

Published: February 6, 2017 doi: 10.3791/55033
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic College of Medicine

Introduction

Utvecklingen av en mångsidigt användbar, enkel och effektiv metod för att konstruera en vektor med begränsad tropism ger en stor möjlighet att öka säkerheten, biologisk förståelse och terapeutisk användbarhet av virus. Flera mekanismer för att rikta viral tropism inklusive transductional, transkriptions och translationella baserade tekniker. Men dessa metoder är i allmänhet inte är tillämpliga på alla vektorsystem, kan kräva defekta signalvägar i målceller eller kräver införande av stora kodande sekvenser i det virala genomet. Dessutom kan dessa metoder resulterar i attenuering av viruset, vilket avsevärt hindrar deras terapeutiska aktivitet och begränsa insikt i den omodifierade systemet.

MicroRNAs är små (22-25 nukleotider), icke-kodande RNA som förmedlar geners uttryck i eukaryota celler. MicroRNAs funktion genom att binda komplementära målsekvenser (responselement) i budbärar-RNA (mRNA) resulti ng i avskrift destabilisering, nedbrytning eller translationella repression. MicroRNAs binder normalt svarselement med partiell komplementaritet och ger små ändringar i genuttryck 1, 2, 3, 4, 5. Mer betydande förändringar i genuttryck kan åstadkommas genom att öka kompletterar svarselementet 6. Tusentals mogna mikroRNA har identifierats i ett antal olika arter och många uppvisar differentiella uttrycksmönster i en mängd olika cell- och vävnadstyper 7, 8, 9. Dessa mikroRNA signaturer kan utnyttjas för cellspecifik begränsning av virusamplifiering genom att införliva perfekt komplementära responselement i det virala genomet 10,= "xref"> 11, 12, 13. Det övergripande målet för denna microRNA inriktning teknik är att styra tropism av en vektorgenomet utan ytterligare dämpning.

Användbarheten av denna metod för att reglera viral tropism ursprungligen visats i lentivirala vektorer för att begränsa transgent uttryck i specifika vävnader 14, 15, 16. Denna teknik har sedan använts på ett brett spektrum av replikerande och icke-replikerande virala vektorer för förbättrad genterapi samt att förbättra säkerhetsprofilen för många onkolytiska virus genom att eliminera oönskade toxicitet i normala vävnader 10, 11, 12, 13, 17 . Det har också använts för att skapa säker och effective levande försvagade vacciner samt att förbättra virus och vaccintillverkningsprocesser 18, 19, 20, 21. MicroRNA inriktning av en vektor kan möjliggöra dämpning hos vaccinerade värdar eller riktade system med bibehållen vildtyp tillväxtnivåer i producentsystem. MicroRNA inriktning kan också användas för att förbättra biosäkerhet av virus för forskningsändamål genom att begränsa överföring i en art (t.ex. människa) med bibehållen överföring i andra värdar 22. Slutligen microRNA inriktning kan möjliggöra fördjupade analyser av virus livscykler och specifika roller celltyper i patogenes och immunitet genom segregerande virustillväxt 23, 24, 25, 26.

Denna teknik erbjuder en alternative inriktningsmetod som lätt genomförs och tillämpas för alla virussystem. Dessutom, den ständigt växande samling av mogna mikroRNA med differentialuttrycksmönster i specifika celltyper gör denna teknik mycket mångsidig. MicroRNA baserad inriktning har visat effektiva för en mängd olika virussystem utan att kompromissa med systemfunktion. De största begränsningarna av denna teknik inbegriper trial and error optimering, potentialen för utrymnings mutationer, och potentiella ej åsyftade effekter på endogena transkript. Emellertid kan dessa begränsningar i allmänhet övervinnas med optimerat och rationell responselement design. Positiv-sense RNA-virus tenderar att vara särskilt mottaglig för microRNA-inriktning på grund av den positiva ense-riktning av deras genom och tillgången av transkripten till mikroRNA maskiner under helt cytoplasmatisk replikationscykeln. Här beskriver vi ett protokoll för att generera en mikroRNA inriktade picornavirus och experimental metoder för att kontrollera effektiviteten och specificiteten av att rikta in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kloning microRNA Response Elements i det virala genomet

  1. Utformning mikroRNA responselement skär.
    1. Identifiera den önskade mikroRNA och dess motsvarande målsekvensen. Flera databaser finns med mogna mikroRNA sekvenser. Rekommenderas: http://www.mirbase.org/ 9, 27, 28, 29, 30.
  2. Klona svarselementet i plasmid DNA som kodar för vektorgenomet eller avskrift.
    OBS: För två eller flera exemplar responselement med hjälp av ett unikt restriktionsställe för insättning är lättare och mer mångsidig.
    1. Sätt responselement eller unika restriktionsställen med hjälp av skarv-överlappningsförlängning (SOE) PCR. Denna metod har beskrivits i detalj 31.
    2. Vid användning av ett restriktionsställe för insättning, purjaga kommersiellt syntetiserade, PAGE-renade sense- och antisense ultramers kodar insatssekvenserna flankeras av överhänget sekvenser av det unika restriktionsstället (Figur 2).
    3. Kombinera 0,5 ug avkänning ultramer, 0,5 ^ g antisens ultramer, DNA ligeringsbuffert till slutkoncentration av 1 x, och sätta till 50 ^ il med H2O glödga ultramers genom att inkubera reaktionen vid 85 ° C under 10 min och därefter reducerar temperaturen med 0,5 ° C every 30 sec tills reaktionen når 25 ° C.
    4. Kombinera 0,5 ^ g av vektor-DNA som kodar för den nya unika restriktionsstället, enzymbuffert till en 1x slutlig koncentration, 1 | il av det lämpliga restriktionsenzymet, och sätta till en slutlig volym av 20 | j, l med H2O Digest vektorn vid 37 ° C under 2 h. Rena den lineariserade DNA: t genom agarosgelrening 32.
    5. Ligera de hybridiserade ultramers in i den digererade vektorn över natten vid 16 °; C med hjälp av en 3: 1 ultramers: vektor molförhållandet och standard ligeringstekniker 33.
      OBS: Om du använder en enda restriktionsenzymställe för insättning kan det vara mer effektivt att defosforylera ändarna av den kluvna vektorn och fosforylera ändarna av de hybridiserade oligonukleotiderna.
    6. Omvandla det ligerade DNA i E. coli med hjälp av värmechockmetoden 34.
      OBS: Plasmider som kodar för virala genom är i allmänhet stora, därför med användning av kompetenta celler optimeras för att upptag stora DNA-konstruktioner kan öka transformationseffektiviteten.
    7. Rena plasmid-DNA från individuella kolonier med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt reningskit 35. Identifiera en lämplig klon med mikroRNA responselementet i den korrekta orienteringen (fig 2) genom sekvensering av insert-regionen 36.

2. Rädda microRNA inriktade Picornavirus tillbakam Plasmid-DNA

  1. Räddnings microRNA inriktade picornavirus i en cellinje tillåtande för virusreplikation som inte uttrycker besläktade mikroRNA (s). Detta protokoll använder H1-HeLa-celler eftersom de inte uttrycker miR-142, MIR-124, eller MIR-125, men det inte krävs för att använda H1-HeLa-celler till undsättning.
    VARNING: Alla riktlinjer för säker hantering och kassering av smittämnen bör följas i enlighet därmed.
    1. Platt H1-HeLa-celler i en 6-brunnsplatta så att de är ~ 80% konfluenta vid tidpunkten för transfektion (24 h efter sådd). Plate celler i 2 ml per brunn av DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum.
    2. Värma transfektionsreagens till rumstemperatur. Kombinera 250 pl serumfritt medium, 2,5 | j, g av plasmid-DNA som kodar för microRNA inriktade genomet, och 7,5 mikroliter av transfektionsreagens i ett sterilt mikrocentrifugrör och pipett försiktigt för att blanda. Inkubera blandningen vid rumstemperatur under 15-30 min.
    3. Aspireramedia från de pläterade cellerna och tillsätt 2 ml av färskt komplett medium.
    4. Tillsätt hela transfektion blandningen från steg 2.1.2 till en brunn på 6-brunnar droppvis. Lägg varje droppe till en annan del av brunnen.
    5. Inkubera cellerna vid 37 ° C tills cytopatiska effekter (CPE) eller rapportörproteiner är detekterbara (~ 24-72 h).
  2. Harvest och passage den räddade virus till färska celler.
    1. Plate celler i en 6-brunnsplatta så att de är 80-90% sammanflytande vid tiden för infektion (24 h efter sådd).
      OBS: Skala upp eller ner beroende på mängden virus som behövs för alla efterföljande experiment.
    2. Harvest varje räddnings väl genom att skrapa cellerna i supernatanten med hjälp av en gummicellskrapa eller gummiskrapa. dra försiktigt skrapan över botten av brunnen. Överföra celler och supernatanten i en kryogen förvaringsröret.
    3. Frysa / tina proverna två gånger och sedan pelletera cellrester genomcentrifugering vid 1200 xg under 5 min vid 4 ° C.
    4. Filtrera den rensas supernatanten två gånger med användning av 0,2 | j, m sprutfilter. Den filtrerade räddningsvätskan innehåller viruset.
      OBS: Filter porstorlek kan variera beroende på storleken på viruspartiklar och kan inte tillämpas för stora virus.
    5. Aspirera medium från de pläterade cellerna, tvätta en gång med serumfritt medium och tillsätt 1 ml av färska serumfria media till varje brunn.
    6. Tillsätt 50 mikroliter per brunn av filtrerad räddnings supernatanten och försiktigt gunga plattan jämnt fördela viruset.
    7. Inkubera plattan vid 37 ° C under 2 h och därefter Aspirera medium från varje brunn för att avlägsna ej införlivad virus.
    8. Lägga 1,5-2 ml färskt komplett medium per brunn och inkubera vid 37 ° C tills CPE eller rapportörproteiner är uppenbara (~ 24-48 h).
    9. Upprepa steg 2.2.2 till 2.2.4. Filtrerad räddnings supernatant innehåller virus lager. Store virusstammar i engångs portioner i kryogeniska lagrings rören vid -80 °C.

3. Rädda microRNA inriktade Virus från In Vitro transkriberat RNA Avskrifter

  1. Generera RNA-transkript från plasmid-DNA som kodar för mikroRNA inriktade virala genomet med hjälp av en uppströms promotor.
    OBS: Standardrutiner för att generera och upprätthålla en nukleasfritt miljön bör användas för alla efterföljande steg.
  2. Linearisera plasmid-DNA med användning av en enzymrestriktionsställe nedströms av transkriptet. Kombinera 5 ^ g plasmid-DNA, 1x slutkoncentration enzymbuffert, 3 ^ il restriktionsenzym och sätta till 50 ^ il med H2O Inkubera reaktionen vid 37 ° C under 3 h.
  3. Lägga 1/20: e volym av 0,5 M EDTA, 1/10: e volym 5 M NH 4-acetat, och 2 volymer 100% etanol till den digererade reaktionen och blanda. Inkubera vid -20 ° C under 1 h upp till över natten.
  4. Pelletera det utfällda DNA under 10 min vid 17000 xg vid 4 ° C. Häll av supernatant, resuspendera pelleten i 500 mikroliter av kall 70% etanol och pelletera DNA: t genom centrifugering vid 17.000 xg under 10 min vid 4 ° C.
  5. Häll av supernatanten och centrifugera igen under 30 sek. Avlägsna återstående supernatanten med en pipett och lufttorka pelleten. Resuspendera DNA-pelleten i sterilt nukleasfritt H2O vid en koncentration av 0,5-1 pg / pL.
  6. Tina in vitro transkription reagens vid rumstemperatur i och placera ribonukleotider på is (enzymer i glycerol inte frysa och bör gå direkt på is). Hålla reaktionsbuffert vid rumstemperatur.
  7. Montera transkriptionsreaktionen i en PCR-rör genom att kombinera 2 mikroliter vardera av ATP, CTP, GTP och UTP lösningar, 2 mikroliter 10x reaktion buffert, ett mikrogram linjäriserad DNA, 2 pl enzym, och få till en slutlig volym av 20 mikroliter med nukleas -fri H 2 O.
  8. Inkubera reaktionen vid 37 ° C under 2 h.
  9. Rena RNA-transkripten.
  10. Ta transkriptionsreaktionen till 100 mikroliter med elueringslösningen (icke förvärmd). Lägg 350 mikroliter av bindande lösning koncentrat och 250 mikroliter av 100% etanol till reaktionen och blanda.
  11. Överföra provet till en filterpatron införd i ett uppsamlingsrör och centrifugera i 1 min vid 12000 x g. Kassera genomströmning.
  12. Tillsätt 500 pl tvättlösning till filterpatronen och centrifugera i 1 min vid 12000 x g. Släng genomströmning. Upprepa detta tvättsteg en gång. Släng genomströmning. Centrifugera under 1 min vid 12,0000 xg för att avlägsna rester av etanol.
  13. Överföra filterpatronen till ett rent uppsamlingsrör och tillsätt 50 | il av den förvärmda elueringslösningen till filterpatronen. Centrifugera under 1 min vid 12000 x g. Upprepa detta elueringssteg för en total volym av 100 ^ il eluent fortsaining renade RNA-transkript. Släng filterpatron.
  • Bestämma RNA-koncentrationen i eluatet genom mätning av absorbansen för provet vid 260 och 280 nm och med användning av Beer-Lamberts lag.
  • Bedöma integriteten hos RNA med användning av RNA-gelelektrofores 37. Se figur 3 för exempel på bra och dåliga RNA integritet. RNA ska alikvoterades in i engångstuber och förvarades vid -80 ° C för att upprätthålla integritet.
  • Varma transfektionsreagens till rumstemperatur. Kombinera 250 | j, l serumfritt medium, 2,5 | j, g av renade RNA-transkript, 5 mikroliter av boost-lösning, och 5 mikroliter av transfektionsreagens i ett sterilt mikrocentrifugrör och pipett försiktigt för att blanda. Inkubera blandningen vid rumstemperatur under 2-5 min.
  • Platt H1-HeLa-celler i en 6-brunnsplatta så att de är ~ 80% konfluenta vid tidpunkten för transfektion (24 h efter sådd). Plate celler i 2 ml per brunn av DMEM kompletterat med 10% fetal bovint serum.
  • Aspirera media från strukna cellerna och tillsätt 2 ml av färskt komplett medium.
  • Tillsätt hela transfektion blandningen från steg 3,12 till en brunn på 6-brunnar droppvis. Lägg varje droppe till en annan del av brunnen.
  • Inkubera cellerna vid 37 ° C tills cytopatiska effekter (CPE) eller rapportörproteiner är detekterbara (~ 24-72 h).
  • Fortsätt rädda microRNA inriktade virus som beskrivs i steg 2,2 till 2.2.9.

    • 4. titrering virusstammar genom att beräkna 50% vävnadsodlings Infectious Dose (TCID 50)

    1. Platt H1-HeLa-celler i en 96-brunnars platta vid 10 4 celler per brunn i DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum. Inkubera cellerna vid 37 ° C över natten.
      OBS: Titrera virus i celler toleranta för virusreplikation som inte uttrycker besläktade mikroRNA.
    2. Göra 10-faldiga seriespädningar av virus var och en i en total volym av 1 ml serumfrittmedia.
      OBS: Använd lägre utspädningar om större precision erfordras.
      OBS: Byt tips efter varje utspädning för att förhindra överskattning av titer som virus kan hålla sig till tips.
    3. Spets 96-brunnar åt sidan och aspirera mediet från utstrukna HeLa-celler. Tillsätt 100 mikroliter av varje virusspädning per brunn till 8-brunnar av 96-brunnsplatta (1 rad per spädning). Tillsätt 100 | il av serumfritt medium utan virus till rad 1 och rad 12 på plattan för kontroller.
      OBS: Alltid aspirera och lägga till media till brunnarna genom att trycka på tips till sida väl att förhindra cell lossnar.
    4. Inkubera plattan vid 37 ° C under 2 h. Spetsplatta åt sidan och aspirera media från brunnarna.
      OBS: Byt tips mellan varje späd rad.
    5. Tillsätt 100 | il av fullständigt medium till varje brunn. Inkubera plattan vid 37 ° C under 72 timmar.
    6. Visualisera brunnarna under ett mikroskop och markera varje brunn positiv eller negativ för CPE.
    7. Beräkna varje virus titer med följande ekvation: Log 10 (TCID 50 / ml) = L + D (S-0,5) + log 10 (1 / V). L är den negativa log 10 av de mest koncentrerade virusspädning testades i vilka samtliga brunnar är positiva. D är log 10 av utspädningsfaktorn. S är summan av de individuella proportioner (pi). pi är den beräknade andelen av en enskild utspädning (mängd av positiva brunnar / totala mängden av brunnar per utspädning. V är volymen av inokulatet (ml / brunn).

    bord 1
    Tabell 1: Kvantifiering infektiösa viruspartiklar genom beräkning av TCID50. Representativa resultat från celler infekterade med en serie av tio-faldiga spädningar av en virusstam. "L" är lika med 4, eftersom den sista utspädningen där alla brunnarna är positiva för CPE är 10 -4. "D" är log 10 av 10 sedan 10-faldiga utspädningaranvändes och är därför lika med 1. "S" är summan av de individuella proportioner. I detta exempel enskilda proportionerna är 1,0, 0,875, 0,375, 0,125, och 0. Summan av dessa (S) är 2,375. "V" är volymen av inokulatet i ml användes för att infektera cellerna initialt.

    5. Utvärdera mikroRNA inriktning Effekt: Singel-steg tillväxt kinetik

    1. Kontroller för denna analys omfattar skeninfekterade celler, omodifierade virus och virus som innehåller en icke-riktad eller icke-funktionella responselement.
    2. Platt H1-HeLa-celler för ett tidsförlopp experiment i 12-brunnars vävnadskulturplattor så att de är 80-90% sammanflytande vid tiden för infektion (24 h efter sådd). Plate celler i DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum vid 1 ml per brunn.
      OBS: Rekommenderas till plattan en separat platta för varje tidpunkt. Detta protokoll använder 7 olika tidpunkter för ett virus med en 8-12 tim replikationscykeln. H1-HeLa-celler behöver inte utföra detta enssay. Denna analys bör utföras i tillåtande celler som inte uttrycker de riktade mikroRNA. Denna analys kan även utföras i celler som uttrycker de besläktade mikroRNA för att utvärdera tillväxt kinetik under selektivt tryck.
    3. Aspirera media från brunnar. Tvätta brunnarna genom tillsats av 0,5 ml serumfritt medium till varje brunn, snurra plattan, och aspirera mediet från brunnarna. Tillsätt 0,5 ml av färska serumfria media till varje brunn.
    4. Infektera varje brunn vid en hög infektionsmultiplicitet (MOI, antalet infektiösa partiklar per cell) för att säkerställa att alla celler bli smittad. Detta protokoll använder en MOI av 3.
      1. Späd virusstammar i serumfritt medium till en koncentration av MOI = 3 per 100 mikroliter. Tillsätt 100 | il av virusutspädning vardera till sju olika brunnar och inkubera vid 37 ° C under 2 h.
      2. Aspirera media från alla brunnar och tvätta två gånger genom att tillsätta 0,5 ml komplett medium per brunn, gunga försiktigt och sedan aspire.
    5. Tillsätt 1 ml av complete media till varje brunn och inkubera vid 37 ° C tills önskad tidpunkt.
    6. Samla in prover för virustitrering vid 2, 4, 6, 8, 10, 24 och 48 h efter infektion (en brunn per tidpunkt). Överför 700 mikroliter av media i brunnen för att en kryogen lagring rör. Skrapa cellerna i den återstående supernatanten genom att försiktigt flytta en gummiskrapa över hela brunnen. Överför cell / vätskan blandning till motsvarande kryogeniska lagrings rör innehållande 700 mikroliter av supernatanten.
      OBS: Se till att inte stänka supernatant från en brunn till en annan under skrapning resulterar i förorenade prover. Överföra 700 mikroliter före skrapning minimerar stänk.
    7. Place proverna vid -80 ° C tills alla prov uppsamlas.
    8. Frys / tina proverna tre gånger och avlägsna cellrester genom centrifugering av proverna vid 1200 xg under 5 min vid 4 ° C.
    9. Titrera viruset som beskrivs i avsnitt 4 och jämföra tillväxt kinetik över tIME.

    6. Utvärdera mikroRNA inriktning Specificitet: Virus spridande analys med hjälp av syntetiska mikroRNA Härmar

    OBS: Användning av en syntetisk mikroRNA härma utförs för att visa specificiteten hos microRNA: mikroRNA-mål interaktion.

    1. Inkludera mock transfektion, negativa kontroll microRNA härma och experimentella microRNA härma endast kontroller för varje analys för att utvärdera microRNA-medierad toxicitet. Det är också idealiskt för att inkludera en positiv kontroll (dvs. microRNA inriktade gen eller genom) som låg transfektionseffektivitet av mikroRNA härmar kan resultera i falskt negativa.
    2. Platt H1-HeLa-celler i en 96-brunnars vävnadsodlingsplatta, så att de är 80-90% sammanflytande vid tiden för transfektion (24 h efter sådd). Plate celler i DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum vid 0,1 ml per brunn.
      OBS: Utför denna analys i celler toleranta för virusreplikation som inte uttrycker besläktade mikroRNA.
    3. varm the transfektionsreagens till rumstemperatur. Kombinera 9 mikroliter serumfritt medium, 200 nM slutlig koncentration per brunn av mikroRNA härmare lager, 0,18 mikroliter boost reagens, 0,18 mikroliter transfektionsreagens och blanda. Inkubera blandningen vid rumstemperatur under 2-5 min.
      OBS: Volymer anges är per brunn. Det rekommenderas att en huvudblandning monteras för transfektion av alla brunnar för att upprätthålla konsekvens och minimera pipettering fel. Den optimala koncentrationen av microRNA härmare kommer att variera. Se tillverkarens anvisningar som medföljer mikroRNA härma en rimlig utgångspunkt koncentration. Detta kommer i allmänhet sträcka sig från 5-200 nM slutkoncentrationer.
    4. Aspirera media från brunnarna och tillsätt 92 pl färskt komplett medium.
      OBS: Om det finns ett stort antal prover, slutföra det här steget före montering av transfektion lösning och förvara plattan vid 37 ° C tills redo.
    5. Lägga till hela transfektionsblandningen in steg 6,3 till cellerna droppvis.
    6. Inkubera vid 37 ° C under 6 h.
    7. Infektera varje brunn vid en låg MOI för att säkerställa en låg andel av celler bli smittad att möjliggöra analys av virusspridning. Detta protokoll använder en MOI av 0,2.
      1. Späd virusstammar i serumfritt medium till en koncentration av MOI = 0,2 per 100 mikroliter. Ta ut mediet från brunnarna och tillsätt 100 mikroliter av virusutspädning per brunn.
      2. Inkubera vid 37 ° C under 2 h.
    8. Aspirera media från varje brunn och tillsätt 100 mikroliter av färska komplett media.
    9. Inkubera vid 37 ° C under 20-22 h.
    10. Bestäm virustitrering i supernatanterna.
      1. Samla in supernatanten från varje brunn och ersätta med 100 mikroliter av färskt komplett medium.
        OBS: Om du använder suspensionsceller, resuspendera cellpelleten från det följande steget i 100 mikroliter av färskt fullständigt medium och återvända till exempel bra för viabilitetsanalys.
      2. ta bort Cellular skräp från de uppsamlade supematantema genom centrifugering vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C.
      3. Överför rensas supernatanten till ett nytt rör och titrera smittsamt virus på tillåtande celler som inte uttrycker besläktade mikroRNA som beskrivs i avsnitt 4.
        OBS: Se till att alla prover på is för att förhindra förlust av smittsamhet.
    11. Bestäm cellernas viabilitet.
      1. Tillsätt 10 mikroliter av MTT (3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) reagens per brunn.
      2. Inkubera vid 37 ° C under 2-4 h tills purpurfärgad fällning är synlig.
      3. Tillsätt 100 mikroliter av tvättmedel reagens.
      4. Inkubera vid rumstemperatur i mörker under två timmar.
      5. Läs absorbans alla brunnar vid 570 nm.
        OBS: Normalisera alla prover att skentransfekterade celler för jämförelse av procent cellviabilitet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Tabell 1 visar resultaten som är typiska för en titrering analys för en picornavirus och beskriver hur man beräknar vävnadskultur infektiös dos 50%. En schematisk representation av den övergripande begreppet microRNA baserad reglering av viral tropism som beskrivs i detta manuskript är visad i figur 1. Orienteringen av mikroRNA till svarselementet under intracellulära interaktioner, lämplig utformning av svarselement oligonukleotider för glödgning och plasmid insertion och en karta av plasmid-DNA som kodar för ett mikroRNA inriktade virala genomet för transkription in vitro är avbildad i Figur 2. Figur 3 visar RNA-transkript vid varierande grader av integritet kan visualiseras med agarosgelelektrofores. Korrekt hantering och användning av DNA mallar saknar föroreningar kommer att resultera i korrekt transkriberade RNA-transkript som visas i 3A bana 2. Rest föroreningar inom lineatecknat DNA mallar eller spårmängder av nukleas kan leda till låga nivåer av felaktigt transkriberad RNA och / eller nedbrytningsprodukter som liknar den som observerades i 3A bana 3. Ofullständig linearisering av plasmid-DNA eller DNA som innehåller höga halter av föroreningar såsom kvarvarande etanol kommer att resultera i opassande transkriptions- och nedbrytningsprodukter är representerade i 3A spår 4 och 5. Figur 3 visar också en bild av Mengovirus-medierade cytopatiska effekter (CPE) efter transfektion av rena RNA-transkript. Figur 4 visar data som representerar ett tidsförlopp experiment utvärdera tillväxt kinetik omodifierade och mikroRNA inriktade Mengovirus. Resultaten visar att mikroRNA svarselement engineered in i Mengovirus genomet inte förändrar kinetiken för virusreplikation i H1-HeLa-celler, som inte uttrycker någon av de besläktade mikroRNA. Men i RAW 264.7 makrofager, som uttrycker mellanliggande nivåer av mikroRNA-125 och höga nivåer av mikroRNA-142, virus som kodar motsvarande svarselementen uppvisar inhiberade replikering kinetik som korrelerar med nivån av mikro-RNA uttrycks. Data i figur 5 visar specificiteten av microRNA baserad reglering av Mengovirus tropism. Överuttryck av varje enskild mikroRNA i H1-HeLa-celler hämmar specifikt förökningen (lägre virustitrar) och cytotoxicitet (ökad cellviabiliteten) av Mengovirus kodar för besläktade mikroRNA svarselementet.

    Figur 1
    Figur 1: Schematisk bild av microRNA baserad reglering av viral tropism. MicroRNA responselement (RE) införlivade i ett viralt genom inses av besläktade mikroRNA anrikade inom specifika celltyper och resulterar i målinriktad nedbrytning av de virala transkript / genomer. Detta kommer att förhindra virusreplikation, spridning och toxicitet till the omgivande celler. Dock kommer viral replikation upprätthållas i celler som inte uttrycker de besläktade mikroRNA möjliggör virusförökning, spridning och celldöd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 2
    Figur 2: MicroRNA svarselement design. (A) För framgångsrik inriktning fröet sekvensregionen av RE bör vara perfekt komplementär. RE bör inriktas inom det virala genomet så att det kan kännas igen av det besläktade mogna mikroRNA i mRNA-transkript och / eller virala genomet. Majoriteten av RE placeras inom 3 'UTR av transkripten. (B) Visning av rätt utformade och hybridiserade oligonukleotider som kodar RE innehåller tandemupprepningar av de mikroRNA-målsekvensema (Mirt) flankerade av de överhängande nukleotiderna i Xhol-restriktionsenzymställe. Vid utformningen av tandemupprepning res, se till att inkludera distans nukleotider (vanligtvis 4-6) mellan varje mikroRNA-mål kopia. (C) Plasmid-DNA som kodar för en fullängds-virusgenomet med en RE införlivas i 3 'UTR, en T7-promotor, och ett unikt restriktionsställe för linearisering för in vitro-transkription. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 3
    Figur 3: Räddning av virus från genom-kodande RNA-transkript. (A) RNA gelelektrofores av in vitro-transkriberade RNA som kodar för picornavirus-genom för att utvärdera transkriptet integritet. Körfält 1: RNA stege. Bana 2: Korrekt transkriberat RNA med hög integritet. Lane 3: RNA-transkript med moderat integritet. Högre band är rätt storlek och undre bandet är potentiellt en nedbrytningsprodukt eller en oönskad RNA-transkript. Bana 4: Felaktigt transkriberad RNA. Bana 5: Låg integritet RNA. 500 ng av in vitro-transkriberat RNA laddades per brunn. Felaktiga transkriptions- eller nedbrytningsprodukter är sannolikt på grund av användningen av låg renhet eller ofullständigt lineariserad DNA. (B) Bild av skentransfekterade H1-HeLa-celler och celler transfekterade med RNA-transkript som kodar för Mengovirus. Administration av transfektionsreagens endast (Mock) kommer att behålla cellviabiliteten efter transfektion samt passage på färska celler. Transfektion av RNA-transkript som kodar för en Mengovirus genomet (VMC 24) resulterar i cytopatiska effekter, som upprätthålls följande filtrering av supernatanten och passage på färska H1-HeLa-celler. Skalstreck = 100 | j, m.ce.jove.com/files/ftp_upload/55033/55033fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 4
    Figur 4: Tillväxt kinetiken av omodifierade och mikroRNA inriktade Mengoviruses i närvaro eller frånvaro av besläktade mikroRNA. Modifierad från referens 17. (A) H1-HeLa-celler inte uttrycker miR-124, -125, eller -142. Alla tre Mengovirus kodnings mikroRNA RE replikera med liknande kinetik som den omodifierade virus (VMC 24) tyder på att införandet av mikroRNA på denna plats (5 'UTR) ändrar inte virusreplikation. (B) RAW 264.7 makrofager uttrycker mellanliggande nivåer av MIR-125b och höga nivåer av MIR-142-3p, men uttrycker inte MIR-124. Införlivning av motsvarande microRNA-målsekvenser i genomet resulterar i virus ATTenuation överensstämmer med nivån av mikro-RNA-uttryck. Data representeras som medel virustitrar +/- SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 5
    Figur 5: Analys av microRNA inriktning specificitet med användning av syntetiska mikroRNA härmar. Modifierad från referens 17. H1-HeLa-celler transfekterade med individuella mikroRNA härmar infekterades med omodifierade virus (VMC 24) eller mikroRNA inriktade virus (Mirt-VMC 24) vid ett MOI av 0,2. (A) Cellviabiliteten normaliserade till mock-behandlade celler bestämdes vid 24 h efter infektion via MTT-cellproliferationsanalys. (B) Virus titer i supernatanten från samtliga prover bestämdes också vid 24 h efter infektion. Dedata representeras som medelvärde livskraft eller viral titer +/- SD. Tvåsidiga oparade Student t test med Welch korrigering (för ojämlika varianser) användes för statistisk analys. Ett p-värde <0,01 ansågs signifikant. (**, P <0,01, ***, p <0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Konstruktion, sammansättning och lokalisering av mikroRNA svarselement inom det virala genomet kommer att diktera inriktnings effektivitet och specificitet. Optimera dessa kommer att kräva försök och misstag. Men rationell design baserad på RNA strukturell analys och tidigare studier av virusreplikation och mikroRNA signaturer stöd i genomförandet av denna teknik med minimal optimering 10, 11, 12, 13, 38.

    När du initierar utformningen av förnybara energikällor, bör utredare börja med att sammanställa en uppsättning av mikroRNA som uttrycks i målcellerna av intresse, är sämre i de icke-målceller av intresse, och som har experimentellt validerade. Efter denna sammanställning bör flera prognosbaserade analyser genomföras för att ta itu med möjligheten att konkurrera microRNA-Target interaktioner. Många virus kodar mikroRNA eller icke-kodande RNA som sekvestrerar cellulära mikroRNA för att manipulera viral och värd genuttryck. Dessutom har flera RNA-virus visats interagera med cellulära mikroRNA i syfte att öka deras replikering kapacitet 39, 40. Därför när man utformar RE, vara säker på att undersöka om det finns kända interaktioner av viruset med cellulära mikroRNA eller om de uttrycker virala mikroRNA som skulle kunna känna igen den valda mikroRNA mål eller ändra den endogena uttrycket av den valda microRNA. Förutom litteratursökning, bör läsaren beakta nätet bioinformatik prognosverktyg och databaser som innehåller viral mikroRNA riktad information för att underlätta en rationell utformning av förnybara energikällor. Sådana databaser och prognosverktyg kan också underlätta identifiering av målsekvenser som kan kännas igen av flera mikroRNA eller överlappande utsädessekvenser pre skickas inom det virala genomet. För en mer ingående diskussion om metoder för att identifiera mikroRNA mål och för- och nackdelar med några av de online prognosverktyg läsaren hänvisas till referenserna 41, 42. Det rekommenderas att dessa prognosverktyg tjänar bara som guider som många gånger förutsägelser kan ge falska positiva eller negativa. För detta ändamål kan det finnas utsäde sekvenser som överlappar varandra, kommer dock den 3 'änden av mikroRNA också påverka inriktning effektivitet. Genom att använda alltför stränga av en regeluppsättning kan ibland vara skadligt.

    När en uppsättning av potentiella mikroRNA mål har identifierats, bör utredaren fortsätta genom att rangordna de mål som grundar sig på de biologiska egenskaperna hos mikroRNA och RNA strukturella förutsägelser 10, 11, 12, 13,ef "> 38. Den absoluta överflöd av det mogna mikroRNA i målsökta celler och dess nivå för association med en Argonaute protein kommer att diktera graden av geners uttryck. Flera studier har visat att endast rikligt uttryckt mikroRNA avsevärt kommer att reglera genuttryck 16, 43, 44. dessutom, medan vissa mikroRNA är rikligt uttryckt sin interaktion med Argonaute proteiner och bildandet av RISC är otillräcklig för att undertrycka översättning 44. med hjälp av ett mycket rikligt mikroRNA med validerade funktion kommer också att minska risken för mikroRNA mättnad i målcellen och efterföljande off- mål toxicitet. en annan strategi kan vara att använda RE som är riktade av flera miRNA 45, 46, som skulle kunna möjliggöra en förminskad kopia nummer samtidigt minimerar risken för off-target toxicities. Förhållandet mellan mål-mRNA till mikroRNA kommer också att ha en betydande inverkan på framgången med detta tillvägagångssätt. En hög mål att mikroRNA förhållandet kommer att minska nivån av repression 42, 43, 47, 48. Detta är särskilt viktigt med virus som replikerar snabbt när om felaktigt reglerat tidigt under infektion kommer att samlas till nivåer utanför kontroll av endogena mikroRNA. Det är viktigt att överväga dessa egenskaper när man väljer en mikroRNA för inriktning; idealt, med användning av ett mikroRNA vars funktion har experimentellt verifierats.

    Effektiviteten av riktade geners uttryck påverkas också av den procentuella kompletterar målet till den mogna microRNA samt antalet kopior av microRNA-målsekvenser insatta. 5'-regionen av de mikroRNA (nukleotiderna 2-8) utgör fröet sekvensen. Det är allmänt acceptatt denna region måste vara perfekt komplementär för framgångsrik inriktning 48, 49. Majoriteten av studier använder svarselement med perfekt komplementaritet eftersom det kan öka gen-tystande aktivitet genom att främja endonukleolytisk klyvning av transkriptet och snabb återvinning av mikroRNA. Detta endonukleolytisk klyvning inträffar bara när en mikroRNA interagerar med en Argonaute protein som har endonukleolytisk aktivitet, som i däggdjursceller är begränsad till Argonaute-2. Andra Argonaute proteiner främjar mRNA nedbrytning av deadenylation och exonukleolytisk attack av utskriften. Läsaren hänvisas till referenserna 4, 5, 13, 50, 51, 52 för en ingående beskrivning av mikroRNA biogenes och funktion. Det anses allmänt att inkrlätta kopietal kommer att ytterligare stärka den målsökande effektiviteten. Detta kan dock även förstärka mikroRNA mättnad och har inte alltid visat sig vara mer effektiv. Det är ibland bättre att införliva målsekvenser för flera olika mikroRNA berikade i målceller eller att använda målsekvenser som känns igen av flera mikroRNA. Kopietalet krävs är också i hög grad beroende på mängden av transkript som kommer att behöva ljuddämpning och den relativa förekomsten av den mikroRNA i målcellerna. Transkript som ackumuleras snabbt kan kräva fler exemplar för att hindra dem från outcompeting de mikroRNA nivåer. Experimentellt bestämma det optimala antalet kopior för varje mikroRNA mål som resulterar i tillräcklig inriktning, underhåller viral fitness, och som minimerar graden av utrymnings mutationer rekommenderas.

    Lokalisering av mikroRNA responselementet inom det virala genomet är oerhört viktigt. Ett negativt resultat vid analysmålsökningseffektiviteten inte alltid betyda att viruset kan inte vara microRNA inriktade. Det kan helt enkelt innebära att målet inte är tillgänglig på den platsen eller att repression av den målsökta genen inte är tillräcklig för att inhibera patogeniciteten. Majoriteten av svarselement förs in i tre 'otranslaterade regioner (UTR) av den riktade transkript. Emellertid har framgångsrik målinriktning av virala genom åstadkommits och ibland uppvisar förbättrad genetisk stabilitet när svarselement är införda i 5 'UTR eller inom de kodande regionerna av essentiella gener 38. Optimala insättningsställen ska medge en hög tillgänglighet av målsekvensen till microRNA. Tillgänglighet kan hindras av RNA sekundära strukturer och stökiometrisk störningar. Därför lokalisera svarselement i ostrukturerade regioner som är starkt bevarade är en bra utgångspunkt. De sekvenser som infogas kan också påverka och påverkas av de omgivande sekvenserna. Thus, är en optimal plats för ett mikroRNA målsekvens inte nödvändigtvis optimal för andra svarselement. Medan experimentell validering och optimering av RE lokalisering är nödvändigt, med hjälp av förutsägelse programvara, till (t.ex. http://unafold.rna.albany.edu/ http://rna.urmc.rochester.edu/software.html) screena potentiella insats platser för störning av de omgivande RNA-strukturer rekommenderas 53, 54.

    Användningen av rena nukleinsyra beredningar av hög integritet är också kritisk för att erhålla de bästa resultaten. Aseptisk teknik och underhåll av en RNas-fri miljö vid hantering av RNA-transkript eller mikroRNA härmar är viktigt. För bästa resultat RNA-transkript, bör mikroRNA härmar, och slut titreras virusstammar förvaras vid -80 ° C i små portioner för att undvika upprepad frysning och upptining resulterar i RNA nedbrytning och förlust av virus smittsamhet. Vid användning, dessa reagenss bör hållas på is hela tiden.

    Det är viktigt att notera att många mikroRNA är medlemmar av en familj av mikroRNA som delar komplementaritet. Därför när de utför studier kan det vara fördelaktigt att inkludera medlemmar av den närmaste mikroRNA familjen för att förbättra inriktning-specificitet utvärdering. Detta blir kritisk när cellerna inom vilken virusreplikation är önskvärd, uttrycka medlemmar av familjen (t.ex. miR-Let7 familj). Det bör också noteras att specificiteten analys med användning av mikroRNA härmar är ett artificiellt system och överexpression av ett mikroRNA i vissa celler kan resultera i ej åsyftade effekter 55. Om detta inträffar, kan specificiteten också utvärderas i celler som uttrycker de lämpliga mikroRNA använder mikroRNA-hämmare i stället. Denna analys skulle möjliggöra analys av rikta-specificitet baserad på virustitrering och cellernas viabilitet avläsning i närvaro av fysiologiskt relevanta nivåer av mikroRNA.

    10, 11, 12, 13. Många virus uppvisar höga mutationshastigheter och fly mutanter kan uppstå snabbt. Inklusive flera kopior av en målsekvens, inklusive mål för mer än en microRNA, lokalisera mål inom flera mycket konserverade regioner, eller förekomsten av ytterligare antivirala faktorer, bland annat ett immunsvar kan lindra detta. Dessutom kommer insättning av främmande genetiskt material i ett viralt genom resulterar ofta i minskad replikationskapacitet av viruset. Om detta inträffar, kommer sannolikt att vara genetiskt instabilt och fly-mutanter kommer att uppstå snabbare den mikroRNA målet. Införande av flera mikroRNA mål kopior can ökar också risken för rekombinanta radering av mikroRNA mål. Därför är det nödvändigt experimentell bestämning av den minsta antal kopior som krävs för tillräcklig inriktning. Lokalisera mikroRNA mål kopior på olika platser i hela genomet jämfört med hjälp av tandemupprepningar kan hjälpa till att kringgå denna begränsning. Men att identifiera optimala RE konfigurationer med det minsta antalet mål exemplar som behövs och insats webbplatser som inte resulterar i förändrade replikering kinetik viruset är avgörande för att minimera graden av rekombination och mål mutation. Införande av alltför många kopior av en målsekvens kan också öka risken för off-mål toxicitet om det resulterar i mikroRNA mättnad. En stor förändring i mängden av mikro-RNA tillgängligt för att reglera normala cellulära proteiner skulle kunna leda till oönskade effekter 55. För detta ändamål, många virus förändrar mikroRNA miljön inom en cell 56 och om dettainnefattar den riktade mikroRNA, kan effektiviteten i reglering minskas om tillräckligt virusreplikation upprätthålles. Alla dessa problem kan lösas genom att optimera svarskomponentinnehåll och / eller lokalisering och med en grundlig förståelse av systemet som målinriktad och dess begränsningar.

    Typiska problem som är förknippade med andra inriktningsmetoder inkluderar off-target försvagning av viruset, till storleksbegränsningar för genetisk inriktning material i virus med begränsade bärförmåga och som är förknippade med tekniska virus målceller som normalt inte är infekterade. MicroRNA-inriktning kan för reglering av viral tropism med minimal modifiering av viruset. Den kräver minimalt utrymme i ett viralt genom och kan skräddarsys baserat på en expansiv samling av cellulära mikroRNA signaturer. Denna teknik inte införa nya tropisms för viruset och därför inte införa några nya säkerhetsproblem. Dessutom, dettaMetoden kan användas för att reglera multipla tropisms samtidigt genom användning av målsekvenser för flera olika mikroRNA anrikade inom olika celltyper 16, 17, 57, 58, 59, 60, 61. Detta kan alla åstadkommas utan att dämpa viruset i celler som inte uttrycker de motsvarande mikroRNA och därför kan ge en mekanism för att förbättra säkerheten för terapeutiska virus med förbättrad potens.

    Utnyttjande av cellulär microRNA maskiner kan användas för reglering av tropism av många olika klasser av virus. Protokollen som beskrivs här är utformade för att rädda och karakterisering av en microRNA inriktad picornavirus, men de kan anpassas till ett virus "replikationscykeln och specifik reporter readouts. Även om olika virus har specifika räddningsstrategier kan mikroRNA målsekvenser sättas in i det virala genomet, oavsett om hela genomet kodas i en enda plasmid, eller om viruset har en DNA- eller RNA-genom. Så länge producentcellerna inte uttrycker besläktade mikroRNA, bör optimerade mikroRNA mål inte störa virus räddning. Experiment för att analysera virustillväxt kinetik och mikroRNA-targeting specificitet kan modifieras genom att ändra tidpunkterna insamlade baserat på längden av en enda runda av virusreplikation och om särskilda avläsning för virusreplikation / toxicitet (t.ex. reporter proteiner, cytotoxicitet, genom kvantifiering, etc). Det är viktigt att notera att även om denna teknik teoretiskt kan tillämpas på alla klasser av virus, kan många faktorer påverkar effektiviteten hos denna metod. Till exempel, har negativ-sense RNA-virus inte visat sig lika lyhörd som positiv-sense RNA-virus troligen på grund av begränsad acgänglighet av det genomiska RNA till maskinen 13 miRNA. Således kommer de biologiska egenskaperna hos varje klass av virus ger ytterligare restriktioner på RE optimering. Trots dessa begränsningar, erbjuder denna teknik en alternativ metod för att rikta viral tropism underlättar forskning som berör produktens säkerhet, användbarhet och grundläggande förståelse för biologiska processer för alla typer av virus.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RE encoding Oligonucleotides IDT PAGE-Purified Ultramer Sequence Designed by Investigator
    Oligonucleotides encoding unique restriction site IDT 25nM Sequence Designed by Investigator
    Expand High Fidelity PCR Kit Sigma Aldrich 11732641001 Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
    T4 DNA Ligase System NEB M0202S
    MEGAscript Kit ThermoFisher Scientific AM1333
    MEGAclear Kit ThermoFisher Scientific AM1908
    0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific AM9260G RNase-free
    5 M NH4 Acetate ThermoFisher Scientific N/A Comes in MEGAclear Kit
    Ethanol ThermoFisher Scientific BP2818100
    Nuclease-free Water Fisher Scientific AM9938
    TransIT-2020 Transfection Reagent Mirus MIR 5404
    TransIT-mRNA Transfection Reagent Mirus MIR 2225
    0.2 μm syringe filter Millipore SLGP033RS
    2 ml Screw-Cap Tubes Sarstedt 72.694.005
    Cell Scrapers Fisher Scientific 08-100-241
    MicroRNA Mimics Dharmacon Varied
    MTT Cell Proliferation Assay ATCC 30-1010K
    Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells ThermoFisher Scientific 18265017
    pBlueScript II Vectors Agilent Technologies Variable (e.g. 212205) There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional Regulation of the Heterochronic Gene Lin-14 By Lin-4 Mediates Temporal Pattern Formation in C. Elegans. Cell. 75 (5), 855-862 (1993).
    2. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. Elegans Heterochronic Gene Lin-4 Encodes Small RNAs With Antisense Complementarity to Lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
    3. Ambros, V. The Functions of Animal MicroRNAs. Nature. 431 (7006), 350-355 (2004).
    4. Bartel, D. P. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
    5. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target Recognition and Regulatory Functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
    6. Benitez, A. A., Spanko, L. A., Bouhaddou, M., Sachs, D., Tenoever, B. R. Engineered Mammalian RNAi Can Elicit Antiviral Protection That Negates the Requirement for the Interferon Response. Cell Rep. 13 (7), 1456-1466 (2015).
    7. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Yalcin, A., Meyer, J., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of Tissue-Specific MicroRNAs From Mouse. Curr Biol. 12 (9), 735-739 (2002).
    8. Landgraf, P., et al. A Mammalian MicroRNA Expression Atlas Based on Small RNA Library Sequencing. Cell. 129 (7), 1401-1414 (2007).
    9. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: Tools for MicroRNA Genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
    10. Kelly, E. J., Russell, S. J. MicroRNAs and the Regulation of Vector Tropism. Mol Ther. 17 (3), 409-416 (2009).
    11. Brown, B. D., Naldini, L. Exploiting and Antagonizing MicroRNA Regulation for Therapeutic and Experimental Applications. Nat Rev Genet. 10 (8), 578-585 (2009).
    12. Tenoever, B. R. RNA Viruses and the Host MicroRNA Machinery. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 169-180 (2013).
    13. Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNAs and Oncolytic Viruses. Curr Opin Virol. 13, 40-48 (2015).
    14. Brown, B. D., Venneri, M. A., Zingale, A., Sergi Sergi, L., Naldini, L., L, Endogenous MicroRNA Regulation Suppresses Transgene Expression in Hematopoietic Lineages and Enables Stable Gene Transfer. Nat Med. 12 (5), 585-591 (2006).
    15. Brown, B. D., et al. A MicroRNA-Regulated Lentiviral Vector Mediates Stable Correction of Hemophilia B Mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
    16. Brown, B. D., et al. Endogenous MicroRNA Can be Broadly Exploited to Regulate Transgene Expression According to Tissue, Lineage and Differentiation State. Nat Biotechnol. 25 (12), 1457-1467 (2007).
    17. Ruiz, A. J., Hadac, E. M., Nace, R. A., Russell, S. J. MicroRNA-Detargeted Mengovirus for Oncolytic Virotherapy. J Virol. 90 (8), 4078-4092 (2016).
    18. Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. Engineering Attenuated Virus Vaccines By Controlling Replication Fidelity. Nat Med. 14 (2), 154-161 (2008).
    19. Barnes, D., Kunitomi, M., Vignuzzi, M., Saksela, K., Andino, R. Harnessing Endogenous MiRNAs to Control Virus Tissue Tropism as a Strategy for Developing Attenuated Virus Vaccines. Cell Host Microbe. 4 (3), 239-248 (2008).
    20. Perez, J. T., Pham, A. M., Lorini, M. H., Chua, M. A., Steel, J., Tenoever, B. R. MicroRNA-Mediated Species-Specific Attenuation of Influenza a Virus. Nat Biotechnol. 27 (6), 572-576 (2009).
    21. Saydaminova, K., et al. Efficient Genome Editing in Hematopoietic Stem Cells With Helper-Dependent Ad5/35 Vectors Expressing Site-Specific Endonucleases Under MicroRNA Regulation. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14057 (2015).
    22. Langlois, R. A., et al. MicroRNA-Based Strategy to Mitigate the Risk of Gain-of-function Influenza Studies. Nat Biotechnol. 31 (9), 844-847 (2013).
    23. Kelly, E. J., Hadac, E. M., Cullen, B. R., Russell, S. J. MicroRNA Antagonism of the Picornaviral Life Cycle: Alternative Mechanisms of Interference. PLoS Pathog. 6 (3), e1000820 (2010).
    24. Pham, A. M., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Replication in Cells of Hematopoietic Origin is Necessary for Dengue Virus Dissemination. PLoS Pathog. 8 (1), 1002465 (2012).
    25. Langlois, R. A., Varble, A., Chua, M. A., García-Sastre, A., Tenoever, B. R. Hematopoietic-Specific Targeting of Influenza a Virus Reveals Replication Requirements for Induction of Antiviral Immune Responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (30), 12117-12122 (2012).
    26. Chua, M. A., Schmid, S., Perez, J. T., Langlois, R. A., Tenoever, B. R. Influenza a Virus Utilizes Suboptimal Splicing to Coordinate the Timing of Infection. Cell Rep. 3 (1), 23-29 (2013).
    27. Griffiths-Jones, S. The MicroRNA Registry. Nucleic Acids Res. 32, D109-D111 (2004).
    28. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: MicroRNA Sequences, Targets and Gene Nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).
    29. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Integrating MicroRNA Annotation and Deep-Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 39, D152-D157 (2011).
    30. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: Annotating High Confidence MicroRNAs Using Deep Sequencing Data. Nucleic Acids Res. 42, D68-D73 (2014).
    31. Heckman, K. L., Pease, L. R. Gene Splicing and Mutagenesis By PCR-Driven Overlap Extension. Nat Protoc. 2 (4), 924-932 (2007).
    32. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. . , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5063/gel-purification (2016).
    33. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Ligation Reactions. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5069/dna-ligation-reactions (2016).
    34. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method (2016).
    35. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA From Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
    36. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.. , Jove Science Education Database. Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016).
    37. Separation of RNA in Agarose Gels. Sourcebook for Electrophoresis. Lonza. , Available from: http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_BenchGuides_SourceBook_Section_VIII_-_Separation_of_RNA_in_Agarose_Gels.pdf 132-145 (2016).
    38. Kueberuwa, G., Cawood, R., Tedcastle, A., Seymour, L. W. Tissue-Specific Attenuation of Oncolytic Sindbis Virus Without Compromised Genetic Stability. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 154-165 (2014).
    39. Grundhoff, A., Sullivan , C. S. Virus-Encoded MicroRNAs. Virology. 411 (2), 325-343 (2011).
    40. Kincaid, R. P., Sullivan, C. S. Virus-Encoded MicroRNAs: An Overview and a Look to the Future. PLoS Pathog. 8 (12), e1003018 (2012).
    41. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental Strategies for MicroRNA Target Identification. Nucleic Acids Res. 39 (16), 6845-6853 (2011).
    42. Thomson, D. W., Dinger, M. E. Endogenous MicroRNA Sponges: Evidence and Controversy. Nat Rev Genet. 17 (5), 272-283 (2016).
    43. Mullokandov, G., et al. High-Throughput Assessment of MicroRNA Activity and Function Using MicroRNA Sensor and Decoy Libraries. Nat Methods. 9 (8), 840-846 (2012).
    44. Thomson, D. W., et al. Assessing the Gene Regulatory Properties of Argonaute-Bound Small RNAs of Diverse Genomic Origin. Nucleic Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
    45. Wu, S., et al. Multiple MicroRNAs Modulate P21cip1/waf1 Expression By Directly Targeting Its 3' Untranslated Region. Oncogene. 29 (15), 2302-2308 (2010).
    46. Vo, N. K., Dalton, R. P., Liu, N., Olson, E. N., Goodman, R. H. Affinity Purification of MicroRNA-133a With the Cardiac Transcription Factor, Hand2. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19231-19236 (2010).
    47. Arvey, A., Larsson, E., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Target mRNA Abundance Dilutes MicroRNA and siRNA Activity. Mol Syst Biol. 6, 363 (2010).
    48. Garcia, D. M., Baek, D., Shin, C., Bell, G. W., Grimson, A., Bartel, D. P. Weak Seed-Pairing Stability and High Target-Site Abundance Decrease the Proficiency of Lsy-6 and Other MicroRNAs. Nat Struct Mol Biol. 18 (10), 1139-1146 (2011).
    49. Jinek, M., Doudna, J. A. A Three-Dimensional View of the Molecular Machinery of RNA Interference. Nature. 457 (7228), 405-412 (2009).
    50. Pasquinelli, A. E. MicroRNAs and Their Targets: Recognition, Regulation and an Emerging Reciprocal Relationship. Nat Rev Genet. 13 (4), 271-282 (2012).
    51. Finnegan, E. F., Pasquinelli, A. E. MicroRNA Biogenesis: Regulating the Regulators. Crit Rev Biochem Mol Biol. 48 (1), 51-68 (2013).
    52. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of MicroRNA Biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 509-524 (2014).
    53. Zuker, M. Mfold Web Server for Nucleic Acid Folding and Hybridization Prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
    54. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: Software for RNA Secondary Structure Prediction and Analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
    55. Khan, A. A., Betel, D., Miller, M. L., Sander, C., Leslie, C. S., Marks, D. S. Transfection of Small RNAs Globally Perturbs Gene Regulation By Endogenous MicroRNAs. Nat Biotechnol. 27 (6), 549-555 (2009).
    56. Skalsky, R. L., Cullen, B. R. Viruses, MicroRNAs, and Host Interactions. Annu Rev Microbiol. 64, 123-141 (2010).
    57. Sugio, K., et al. Enhanced Safety Profiles of the Telomerase-Specific Replication-Competent Adenovirus By Incorporation of Normal Cell-Specific MicroRNA-Targeted Sequences. Clin Cancer Res. 17 (9), 2807-2818 (2011).
    58. Fu, X., Rivera, A., Tao, L., De Geest, B., Zhang, X. Construction of an Oncolytic Herpes Simplex Virus That Precisely Targets Hepatocellular Carcinoma Cells. Mol Ther. 20 (2), 339-346 (2012).
    59. Yao, W., Guo, G., Zhang, Q., Fan, L., Wu, N., Bo, Y. The Application of Multiple MiRNA Response Elements Enables Oncolytic Adenoviruses to Possess Specificity to Glioma Cells. Virology. 458-459, 69-82 (2014).
    60. Bofill-De Ros, X., Gironella, M., Fillat, C. Mir-148a- and Mir-216a-regulated Oncolytic Adenoviruses Targeting Pancreatic Tumors Attenuate Tissue Damage Without Perturbation of MiRNA Activity. Mol Ther. 22 (9), 1665-1677 (2014).
    61. Baertsch, M. A., et al. MicroRNA-Mediated Multi-Tissue Detargeting of Oncolytic Measles Virus. Cancer Gene Ther. 21 (9), 373-380 (2014).

    Tags

    Immunologi microRNA microRNA-inriktning picornavirus onkolytiska tropism virus cytotoxicitet replikering genuttryck
    MicroRNA baserad reglering av Picornavirus Tropism
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Ruiz, A. J., Russell, S. J.… More

    Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism. J. Vis. Exp. (120), e55033, doi:10.3791/55033 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter