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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

ピコルナウイルス向性のマイクロRNAベースの規制

Published: February 6, 2017 doi: 10.3791/55033
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic College of Medicine

Introduction

制限された親和性を有するベクターを設計するために広く、適用可能な簡単かつ効果的な方法の開発は、安全性、生物学的理解とウイルスの治療的有用性を高めるための主要な機会を提供します。いくつかのメカニズムは、形質導入、転写、および翻訳ベースの技術を含む、ウイルス親和性を標的とするために存在します。しかし、これらの方法は、標的細胞内の欠陥シグナル伝達経路を必要とするか、またはウイルスゲノムに大規模なコード配列の挿入を必要とするかもしれない、すべてのベクター系に一般的に適用されません。さらに、これらの方法は、有意にその治療活性を阻害し、修飾されていないシステムへの洞察を制限する、ウイルスの弱毒化をもたらすことができます。

マイクロRNAは、真核細胞において遺伝子サイレンシングを媒介する非コードRNA小さな（22~25ヌクレオチド）です。メッセンジャーRNA（mRNAの）に相補的な標的配列（応答要素）を結合することによりマイクロRNAの機能resulti転写産物の不安定化、分解又は翻訳抑制でNG。マイクロRNAは、通常、部分的な相補性を有する応答エレメントに結合し、遺伝子発現を1、2、3、4、5に小さな修正をもたらします。遺伝子発現のより有意な変化は、応答エレメント6の相補性を増加させることによって達成することができます。成熟マイクロRNAの何千もの細胞や組織の種類7、8、9のさまざまな種と多数出品差分発現パターンの様々な同定されています。これらのマイクロRNAシグネチャーは、ウイルスゲノム10内に完全に相補的な応答エレメントを組み込むことによって、ウイルス増幅の細胞特異的な制限のために利用することができます= "外部参照"> 11、12、13。このマイクロRNA標的化技術の全体的な目標は、追加の減衰することなくベクターゲノムの指向性を制御することです。

ウイルスの親和性を調節するためのこの方法の有用性は、もともと特定の組織14、15、16における導入遺伝子の発現を制限するレンチウイルスベクターで実証されました。この技術は、その後、正常組織10に望ましくない毒性を排除することによって、多くの腫瘍溶解性ウイルスの安全性プロファイルを改善するために複製および非複製増強遺伝子療法のためのウイルスベクター、ならびに膨大な配列、11、12、13、17に印加されています。また、安全かつ電子を生成するために利用されていますffective生弱毒化ワクチン、ならびにウイルスおよびワクチンの製造18を処理し 、19、20、21を改善します。生産システムにおける野生型の成長レベルを維持しながら、マイクロRNA-ターゲティングベクターのは、ワクチン接種のホストまたはターゲット・システムの減衰を可能にすることができます。マイクロRNA標的はまた、他のホスト22の送信を維持しながら、一つの種（ 例えばヒト）の送信を制限することによって、研究目的のためにウイルスの生物学的安全性を向上させるために使用することができます。最後に、中・深ウイルスの増殖23、24、25、26を分離することにより、ウイルスのライフサイクルと病因と免疫における細胞型の特定の役割の分析を可能にすることができるマイクロRNAは、標的とします。

この技術は代替を提供していますすべてのウイルス系のために簡単に実装された方法および適用をターゲットernative。さらに、特定の細胞型で異なる発現パターンを有する成熟マイクロRNAの拡大を続けるコレクションは、この技術は汎用性の高いことができます。マイクロRNAに基づく標的化は、システムの機能を損なうことなく、ウイルスの様々なシステムに有効であることが証明されています。この技術の主要な制限は、試行錯誤の最適化、エスケープ変異のための潜在的な、および内因性転写産物に対する潜在的なオフターゲット効果が含まれます。しかし、これらの制限は、一般的に最適化され、合理的な応答エレメントの設計で克服することができます。プラスセンスRNAウイルスは、そのゲノムのプラスセンスの向きと完全に細胞質複製サイクル中にマイクロRNAの機械への転写物の利用可能性にマイクロRNAを標的に特に応答する傾向にあります。ここでは、マイクロRNA標的ピコルナウイルスを生成するためのプロトコルとexperimを記述します内部の方法は、in vitroでのターゲティングの効率性と特異性を検証します。

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Protocol

ウイルスゲノムに1クローニングマイクロRNAレスポンス要素

  1. デザインマイクロRNA応答エレメントを挿入。
    1. 希望するマイクロRNAとその対応する標的配列を同定します。いくつかのデータベースは、成熟マイクロRNA配列とご利用いただけます。推奨：http://www.mirbase.org/ 9、27、28、29、30。
  2. ベクターゲノムまたは転写産物をコードするプラスミドDNAに応答要素を複製します。
    注：2つ以上のコピー応答要素が挿入のためのユニークな制限部位を使用してのために簡単に、より汎用性があります。
    1. 応答エレメントまたはスプライスオーバーラップエクステンション（SOE）PCRを用いて、ユニークな制限部位を挿入します。この方法について詳しく31に記載されています。
    2. 挿入のための制限部位を使用して、PUR場合商業的に合成され、PAGE精製感とユニークな制限部位（ 図2）のオーバーハング配列に隣接し、挿入配列をコードするアンチセンスultramersを追いかけます。
    3. 0.5μgのセンスultramer、0.5μgのアンチセンスultramer、DNAライゲーションバッファーを1×の最終濃度になるように組み合わせ、そして10分間85℃で反応をインキュベートし、その後によって温度を低下させることによってH 2 Oアニールと50μlのultramersにもたらします0.5°C反応は25℃に達するまで、30秒毎。
    4. 新しいユニークな制限部位、1×最終濃度に酵素緩衝液、適切な制限酵素の1μLをコードするベクターDNAの0.5μgのを組み合わせて、37℃でH 2 Oダイジェストベクターと20μlの最終容量にもたらします2時間。アガロースゲル精製32によって線状化DNAを精製します。
    5. 16℃で一晩消化したベクターにアニールultramersを連結; C 3を使用して：1 ultramers：ベクターのモル比と標準的なライゲーション技術33。
      注：挿入のための単一制限酵素部位を使用する場合は、消化されたベクターの末端を脱リン酸化し、アニーリングしたオリゴヌクレオチドの末端をリン酸化することがより効率的であることができます。
    6. ヒートショック法34を用いて、大腸菌に連結したDNAを変換します。
      注：ウイルスゲノムをコードするプラスミドは、したがって、形質転換効率を増加させることができる大規模なDNA構築物を取り込むために最適化されたコンピテント細胞を用いて、一般的に大きいです。
    7. 市販の精製キット35を使用して、個々のコロニーからのプラスミドDNAを精製します。挿入領域36を配列決定することによって正しい方向でマイクロRNA応答エレメント（ 図2）との適切なクローンを特定します。

2.マイクロRNA標的ピコルナウイルスあちこちを救出メートルプラスミドDNA

  1. 同族マイクロRNA（複数可）を発現しないウイルス複製を許容する細胞株におけるレスキューマイクロRNA標的ピコルナウイルス。それらはのmiR-142、のmiR-124又はmiR-125を発現しないため、このプロトコルは、しかし、レスキューのためH1-HeLa細胞を使用する必要はないが、H1-HeLa細胞を使用します。
    注意：感染性物質の安全な取り扱いおよび廃棄のためのすべてのガイドラインには、それに応じて従うべきです。
    1. それらは、トランスフェクションの時点で~80％コンフルエント（24時間後播種）となるように6ウェルプレート中にプレートH1-HeLa細胞。 DMEMのウェルあたり2mlのプレートの細胞を、10％ウシ胎児血清を補充しました。
    2. 室温へのトランスフェクション試薬を温めます。 250μLの無血清培地、をコードするプラスミドDNAのマイクロRNA標的ゲノム2.5μgの、およびトランスフェクション試薬の7.5μLを穏やかに混合するために滅菌マイクロチューブとピペットで結合します。 15〜30分間、室温で混合物をインキュベートします。
    3. 吸引物播種した細胞からの培地とは、新鮮な完全培地2 mLを加え。
    4. ステップ2.1.2から滴下6ウェルプレートの1ウェルに全体のトランスフェクション混合物を追加します。ウェルの異なる領域にそれぞれのドロップを追加します。
    5. 細胞変性効果（CPE）またはレポータータンパク質は、（〜24〜72時間）、検出可能になるまで37℃で細胞をインキュベートします。
  2. 新鮮な細胞上に収穫し、通路レスキューされたウイルス。
    1. 6ウェルプレート中にプレートの細胞は、感染の時間（24時間後播種）で80〜90％コンフルエントであるようにします。
      注：すべてのその後の実験のために必要なウイルスの量に応じてダウンスケールアップまたは。
    2. ゴム製のセルスクレーパーやラバーポリスマンを使用して、上清中に細胞を掻き取って、各ウェル救助を収穫。ゆっくりウェルの底全体にスクレーパーをドラッグします。低温貯蔵チューブに細胞と上清を転送します。
    3. サンプルを2回解凍/凍結し、その後により細胞破片をペレット化4℃で5分間1200×gで遠心分離します。
    4. 二回、0.2μmのシリンジフィルターを使用して、透明な上清をフィルタリングします。フィルタリング救助上清は、ウイルスが含まれています。
      注：フィルター孔径は、ウイルス粒子の大きさに依存して変化することができ、大型のウイルスに適用可能ではないかもしれません。
    5. 播種した細胞からの培地を吸引し、無血清培地で1回洗浄し、各ウェルに新鮮な無血清培地の1ミリリットルを追加します。
    6. フィルタリング救助上清のウェルあたり50μLを加え、穏やかに均等にウイルスを配布するプレートを揺らし。
    7. 37℃で2時間プレートをインキュベートした後、取り込まれていないウイルスを除去するために、各ウェルから培地を吸引除去します。
    8. ウェルあたり新鮮な完全培地の1.5〜2 mLを加え、およびCPEまたはレポータータンパク質が（〜24〜48時間）明らかになるまで37℃でインキュベートします。
    9. 繰り返しは、2.2.4に2.2.2を繰り返します。フィルタ処理救助上清をウイルスストックが含まれています。 -80℃で凍結保存チューブ中の単回使用分量を保存するウイルスストックC.

3. in vitroで転写されたRNA転写産物でからマイクロRNA標的ウイルスを救出

  1. 上流のプロモーターを使用して、マイクロRNA標的ウイルスゲノムをコードするプラスミドDNAからRNA転写物を生成します。
    注：ヌクレアーゼフリーの環境を生成し、維持するための標準的なプラクティスは、すべての後続のステップのために使用されるべきです。
  2. 転写産物の下流の酵素制限部位を用いてプラスミドDNAを線状化。 5μgのプラスミドDNA、1×最終濃度の酵素緩衝液、3μlの制限酵素を結合し、3時間H 2 Oでインキュベートして50μlに、37℃で反応をもたらします。
  3. 0.5 M EDTAの1/20量 、1月10日第 5巻M NH 4酢酸、および消化反応に2容量の100％エタノールを加え、混合します。一晩まで1時間、-20℃でインキュベートします。
  4. 4℃で17000×gで10分間、沈殿したDNAをペレット化。 supernataを捨てNT、冷70％エタノール500μLにペレットを再懸濁し、4℃で10分間17000×gで遠心分離してDNAをペレット化。
  5. 30秒間再び上清および遠心分離機をオフに注ぎます。ピペットで残留上清を除去し、ペレットを空気乾燥させます。 0.5〜1μgの/μLの濃度で滅菌ヌクレアーゼフリーのH 2 O中のDNAペレットを再懸濁します。
  6. 室温でのインビトロ転写試薬を解凍し、氷上にリボヌクレオチドを配置（グリセロール中の酵素は凍結していないし、氷上に直接行く必要があります）。室温で反応バッファーを保管してください。
  7. 、ATP、CTP、GTP、およびUTPソリューションの各2μLを組み合わせることにより、PCRチューブで転写反応を組み立てる2μLの10×反応緩衝液、1μgの線状化DNA、2μlの酵素、およびヌクレアーゼで20μLの最終容量にもたらしますフリーH 2 O
  8. 2時間37℃で反応をインキュベートします。
  9. RNA転写物を精製します。
  10. 溶出液（ - 予熱しない）と100μLに転写反応を持参してください。結合溶液濃縮物の350μLと反応への100％エタノールを250μLを加え、混合します。
  11. 12,000×gで1分間収集管と遠心分離に挿入フィルターカートリッジに試料を移します。フロースルーを捨てます。
  12. 12,000×gで1分間フィルターカートリッジ及び遠心分離機に洗浄溶液の500μLを追加します。フロースルーを捨て。この洗浄ステップをもう一度繰り返します。フロースルーを捨て。残留エタノールを除去し12,0000×gで1分間遠心します。
  13. きれいなコレクションチューブにフィルターカートリッジを移し、フィルターカートリッジに予熱した溶出液の50μLを追加します。 12,000×gで1分間遠心操作します。溶離液の続きの総容量100μlのために、この溶出工程を繰り返し精製されたRNA転写物をaining。フィルターカートリッジを廃棄してください。
  • 260および280 nmでサンプルの吸光度を測定し、ランベルト・ベール法則を用いて、溶離液中のRNA濃度を決定します。
  • RNAゲル電気泳動37を用いてRNAの完全性を評価します。善と悪のRNA完全性の例については、 図3を参照してください。 RNAは、単回使用の管に等分し、整合性を維持するために、-80℃で保存されるべきです。
  • 室温に戻しトランスフェクション試薬。混合するために穏やかに滅菌マイクロチューブとピペットで250μlの無血清培地、精製されたRNA転写物の2.5μgの、ブースト溶液5μL、およびトランスフェクション試薬の5μLを兼ね備えています。 2-5分間、室温で混合物をインキュベートします。
  • それらは、トランスフェクションの時点で~80％コンフルエント（24時間後播種）となるように6ウェルプレート中にプレートH1-HeLa細胞。 DMEMのウェルあたり2mlのプレートの細胞を、10％のFETを補充しますアルウシ血清。
  • プレートされた細胞から培地を吸引し、新鮮な完全培地2 mlを加え。
  • ステップ3.12から滴下6ウェルプレートの1ウェルに全体のトランスフェクション混合物を追加します。ウェルの異なる領域にそれぞれのドロップを追加します。
  • 細胞変性効果（CPE）またはレポータータンパク質は、（〜24〜72時間）、検出可能になるまで37℃で細胞をインキュベートします。
  • 2.2.9へのステップ2.2で説明したように、マイクロRNA標的ウイルスの救助を続けます。

    • 4. 50％組織培養感染量（TCID 50）を計算することによって、ウイルスストックを滴定

    1. DMEM中でウェルあたり10 4細胞で96ウェルプレート中にプレートH1-HeLa細胞を、10％ウシ胎児血清を補充しました。 37℃で一晩細胞をインキュベートします。
      注：同族マイクロRNAを発現しないウイルス複製を許容する細胞でウイルスを滴定します。
    2. 血清を含まない1mlの総容積でウイルスの10倍連続希釈物をそれぞれ行いますメディア。
      注：より高い精度が必要な場合は下の希釈液を使用してください。
      注：ウイルスとして力価の過大評価を防ぐために、各希釈後の変更ヒントがヒントに固執することができます。
    3. メッキHeLa細胞から側と吸引メディアへのヒント96ウェルプレート。 96ウェルプレート（希釈につき1行目）の8ウェルにウェル当たり各ウイルス希釈液の100μLを加えます。コントロールのプレートに1行12行するために、ウイルスなしの無血清培地の100μLを加えます。
      注：常に吸引と細胞の剥離を防止するために、ウェルの側に先端に触れることでウェルにメディアを追加。
    4. 37℃で2時間プレートをインキュベートします。側へのヒントプレート、ウェルから培地を吸引除去します。
      注：各希釈列間の変更のヒント。
    5. 各ウェルに、完全培地100μlのを追加します。 72時間、37℃でプレートをインキュベートします。
    6. 顕微鏡下で井戸を視覚化し、CPEのために、各ウェル正または負をマーク。
    7. ロー：以下の式で各ウイルス力価を計算しますG 10（TCID 50 / ml）をL + D（S-0.5）+（10 / V）をLOG =。 Lは、全てのウェルが正である、試験された最も濃縮したウイルス希釈液の負の対数10です。 Dは希釈係数のlog 10です。 Sは、個々の割合（PI）の合計です。 piが陽性ウェル/希釈あたりのウェルの総量の量（個々の希釈の計算割合である。Vは接種物の体積（ミリリットル/ウェル）です。

    表1
    表1：TCID 50を 計算 する ことによって、感染性ウイルス粒子の定量化 。ウイルスストックの10倍希釈系列を感染させた細胞からの代表的な結果。すべてのウェルがCPEについて陽性である最後の希釈は10 -4であるため、「L」は4に等しいです。 「D」は、10から10倍希釈のlog 10であります使用され、1 "S"に等しくなるし、個々の割合の合計です。この例では、個々の割合は、これらの（S）の合計1.0、0.875、0.375、0.125、および0.1である2.375です。 「V」は、最初に細胞を感染させるために使用される溶液に加え接種材料の体積です。

    シングルステップの成長速度：5マイクロRNAを標的と有効性を評価します

    1. このアッセイの対照は、非標的または非機能的応答エレメントを含むモック感染細胞、非修飾ウイルスおよびウイルスが含まれます。
    2. これらは、感染の時間（24時間後播種）で80〜90％コンフルエントになるように12ウェル組織培養プレート中で、時間経過実験用プレートH1-HeLa細胞。 DMEM中板細胞をウェル当たり1 mLの10％ウシ胎児血清を補充しました。
      注：各時点で別のプレートをプレートすることをお勧めします。このプロトコルは、8-12時間の複製サイクルでウイルスのために7異なる時点を使用しています。 H1-HeLa細胞は、このAを実行する必要はありませんssay。このアッセイは、標的マイクロRNAを発現しない許容細胞内で行われるべきです。このアッセイはまた、選択圧の下で増殖速度を評価するために、同族のマイクロRNAを発現する細胞で行うことができます。
    3. ウェルから培地を吸引。ウェルの各ウェルに、無血清培地0.5mlを添加することによりウェルを洗浄し、プレートを旋回し、吸引メディア。各ウェルに新鮮な無血清培地の0.5 mLを加え。
    4. すべての細胞が感染し得る確実にするために、高い感染多重度（細胞当たりの感染性粒子の数MOI）で各ウェルに感染します。このプロトコルは、3のMOIを使用しています。
      1. = MOIの濃度に100μLあたり3を無血清培地中のウイルスストックを希釈します。 7つの異なるウェルにウイルス希釈液100μLずつ加え、37℃で2時間インキュベートします。
      2. 全てのウェルから培地を吸引し、ウェルあたり0.5 mLの完全培地を加える優しくロッキングした後、吸引することにより2回洗浄します。
    5. Cの1 mLを加えそれぞれにompleteメディアだけでなく、目的の時点まで37℃でインキュベートします。
    6. 2、4、6、8、10、24及び48時間感染後（時点あたり1ウェル）でウイルス力価測定のためのサンプルを収集します。低温貯蔵管に十分にメディアの700μLを転送します。優しくウェル全体を横断ゴムスクレーパーを動かすことによって、残りの上清に細胞をこすり取ります。上清の700μLを含む対応する低温貯蔵チューブに細胞/上清混合物を転送します。
      注：汚染されたサンプルの結果掻き取り中に別のものに1つのウェルからの上清をかけないようにしてください。飛散を最小限に抑えることができますスクレーピングの前に700μLを転送します。
    7. -80℃での場所サンプルは全てのサンプルが収集されるまで。
    8. フリーズ/サンプルを3回解凍し、4℃で5分間、1200×gでサンプルを遠心分離することにより、細胞破片を除去します。
    9. セクション4で説明したようにウイルスを滴定し、トンの上に増殖速度を比較IME。

    合成マイクロRNAミミックを用いたウイルス拡散アッセイ：6.マイクロRNAを標的特異性を評価します

    注：マイクロRNA標的との相互作用：合成マイクロRNA模倣体の使用は、マイクロRNAの特異性を示すために行われます。

    1. 偽トランスフェクション、陰性対照マイクロRNAミミックと実験マイクロRNAは、唯一のマイクロRNA媒介毒性を評価するためにあらゆるアッセイに制御模倣含まれます。偽陰性になることがポジティブコントロール（ すなわちマイクロRNA標的遺伝子またはゲノム）マイクロRNA模倣のような低トランスフェクション効率を含めることも理想的です。
    2. それらは、トランスフェクションの時点（24時間後播種）で80〜90％コンフルエントになるように96ウェル組織培養プレート中にプレートH1-HeLa細胞。 DMEM中板細胞をウェル当たり0.1 mlの10％ウシ胎児血清を補充しました。
      注：同族マイクロRNAを発現しないウイルスの複製を許容する細胞では、このアッセイを実行します。
    3. 温かい目室温に電子トランスフェクション試薬。 9μLの無血清培地、マイクロRNA模倣株式のウェルあたり200 nMの最終濃度が、0.18μLブースト試薬、0.18μLトランスフェクション試薬を組み合わせて混合します。 2-5分間、室温で混合物をインキュベートします。
      注：記載されているボリュームはウェルあたりです。マスターミックスは、一貫性を維持し、ピペッティングの誤差を最小化するためにすべてのウェルのトランスフェクションのために組み立てすることをお勧めします。マイクロRNA模倣の最適濃度は変化します。妥当な出発濃度のためにマイクロRNA模倣を伴う製造業者の取扱説明書を参照してください。これは、一般に5〜200 nMの最終濃度の範囲であろう。
    4. 井戸から培地を吸引し、新鮮な完全培地92μlを添加します。
      注：サンプルのかなりの数がある場合は、前のトランスフェクション溶液を組み立てるには、この手順を完了し、準備が整うまで、37℃でプレートを保存。
    5. 私は、全体のトランスフェクション混合物を追加します。nは滴下細胞に6.3ステップ。
    6. 6時間37℃でインキュベートします。
    7. 細胞の低い割合を確実にするために、低MOIで各ウェルに感染するウイルスの広がりの分析を可能にするために感染し得ます。このプロトコルは、0.2のMOIを使用しています。
      1. MOIの濃度= 100μLあたり0.2に無血清培地中のウイルスストックを希釈します。井戸から培地を除去し、ウェルあたりのウイルス希釈液100μLを加えます。
      2. 2時間37℃でインキュベートします。
    8. 各ウェルから培地を吸引しとは、新鮮な完全培地の100μLを加えます。
    9. 20-22時間、37℃でインキュベートします。
    10. 上清中のウイルス力価測定を決定します。
      1. 各ウェルからの上清を収集し、新鮮な完全培地100μLで置き換えます。
        注：懸濁細胞を使用している場合は、新鮮な完全培地100μLで、次のステップからの細胞ペレットを再懸濁し、生存率アッセイのために十分にサンプリングするために戻ります。
      2. celluを削除します4℃で5分間、300×gで遠心分離することにより回収した上清からLAR破片。
      3. 新しいチューブにクリアして上清を移し、4章で説明したように、同族のマイクロRNAを発現しない許容細胞に感染性ウイルスを滴定。
        注：感染性の損失を防ぐために氷の上にすべてのサンプルを保管してください。
    11. 細胞の生存率を決定します。
      1. MTTのウェル当たり10μL（3-（4,5- dimethylthiazolyl-2）-2,5-ジフェニルブロマイド）試薬を追加します。
      2. 紫色の沈殿が表示されるまで2〜4時間、37℃でインキュベートします。
      3. 洗剤試薬100μLを加えます。
      4. 2時間暗所で室温でインキュベートします。
      5. 570 nmで全てのウェルの吸光度を読みます。
        注：パーセント細胞生存率の比較のためにトランスフェクトされた細胞を模擬するために、すべてのサンプルを正規化します。

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    Representative Results

    表1は、ピコルナウイルスのための滴定アッセイの典型的な結果を示し、50％組織培養感染量を計算する方法について説明します。この原稿で説明ウイルス親和性のマイクロRNAに基づく規制の全体的な概念の概略図では、細胞内の相互作用、アニーリングおよびプラスミド挿入するための応答要素のオリゴヌクレオチドの適切な設計時の応答エレメントに、図1のマイクロRNAの向きに示されており、 インビトロ転写のためのマイクロRNA標的ウイルスゲノムをコードするプラスミドDNAのマップは、図2、 図3に示されているアガロースゲル電気泳動により可視化整合性の様々な程度で、RNA転写物を示します。図3（a）のレーンにリネア内2.残留不純物を示すように適切な取り扱いや不純物を欠いたDNAテンプレートの使用が適切に転写されたRNA転写物になりますrized DNAテンプレートまたはヌクレアーゼの微量は3Aレーンにおいて観察されたものと同様の不適切な転写されたRNAおよび/または分解生成物の低いレベルをもたらすことができる。3.このようなことになるの残留エタノールなどの不純物を大量に含むプラスミドDNAまたはDNAの不完全な線形図3のレーン4および5、図3に示される不適切な転写および分解生成物はまた、清浄なRNA転写物のトランスフェクション後Mengovirus媒介性の細胞変性効果（CPE）の画像を示します。非修飾およびマイクロRNA標的Mengovirusの成長動態を評価するタイムコース実験の図4のディスプレイ・データ・代表。結果はMengovirusゲノム内に操作マイクロRNA応答要素は、同族のマイクロRNAのいずれかを発現しないH1-HeLa細胞におけるウイルス複製の動態を変化させないことを示しています。しかし、マイクロRNA-125およびマイクロRNA-14の高レベルの中間レベルで発現するRAW 264.7マクロファージ、中2、対応する応答エレメントをコードするウイルスが発現するマイクロRNAのレベルと相関する阻害し、複製速度を表示します。 図5のデータはMengovirus向性のマイクロRNAに基づく規制の特異性を示しています。 H1-HeLa細胞の個々のマイクロRNAの過剰発現は、特にMengovirusは同族マイクロRNA応答エレメントをコードするの伝播（低いウイルス力価）および細胞傷害性（増加した細胞生存能力）を阻害します。

    図1
    図1： ウイルス親和性のマイクロRNAに基づく規制の概略図。ウイルスゲノムに組み込まれたマイクロRNA応答エレメント（RE）は、特定の細胞型内で濃縮された同族のマイクロRNAによって認識され、ウイルス転写/ゲノムの標的化分解を招くことになります。これは、番目にウイルス複製、普及と毒性を防ぐことができます細胞周囲の電子。しかし、ウイルス複製は、ウイルスの増殖、拡散および細胞死を可能に同族のマイクロRNAを発現しない細胞内で維持されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    図2
    図2： マイクロRNA応答エレメントデザイン。成功は、完全に相補的であるべきであるREのシード配列領域を標的とする（A）。 REは、mRNA転写物、および/またはウイルスゲノム中に同族の成熟マイクロRNAによって認識することができるようにウイルスゲノム内に配向されるべきです。 REの大部分は、転写産物の3 'UTR内に配置されています。 （B）タンデムを含むのREをコードする適切に設計およびアニールしたオリゴヌクレオチドの描写XhoI制限酵素部位のオーバーハングヌクレオチドが隣接ミクロRNA標的配列（miRT）の繰り返し。タンデムリピートのREを設計するとき、各マイクロRNA標的コピーの間にスペーサーヌクレオチド（一般的に4-6）を含めるようにしてください。 （C）プラスミドDNAは、3 'UTR、T7プロモーターに組み込まRE、およびインビトロ転写のための線形化のためのユニークな制限部位を有する完全長のウイルスゲノムをコードします。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    図3
    図3： ゲノムをコードするRNA転写物からのウイルスのレスキュー。 （A）転写産物の完全性を評価するために、ピコルナウイルスゲノムをコードするインビトロ転写されたRNAのRNAのゲル電気泳動。 LANE 1：RNAラダー。レーン2：高い整合性を持つ適切に転写されたRNA。レーン3：中程度の整合性を有するRNA転写産物。高いバンドは正しいサイズと下のバンドは、潜在的に分解生成物または望ましくないRNA転写産物です。レーン4：不適切転写されたRNA。レーン5：低整合性のRNA。 インビトロ転写RNAの500ngのウェル当たりロードしました。不適切な転写または分解産物が原因で低純度または不完全に線状化DNAの使用可能性があります。 （B）MengovirusをコードするRNA転写物をトランスフェクトした偽トランスフェクトH1-HeLa細胞と細胞のイメージ。トランスフェクション試薬のみ（モック）の投与は、新鮮な細胞にトランスフェクションと同様の通路を、以下の細胞生存率を維持します。新鮮なH1-HeLa細胞上に上清と通路のろ過を以下に維持される細胞変性効果、でMengovirusゲノム（VMC 24）の結果をコードするRNA転写物のトランスフェクション。スケールバー=100μmです。ce.jove.com/files/ftp_upload/55033/55033fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    図4
    図4： 同族マイクロRNAの存在下または非存在下で、非修飾およびマイクロRNA標的Mengovirusesの成長動態。参照17から変更されました。 （A）H1-HeLa細胞は、miR-124、-125、または-142を発現しません。すべての3つのMengovirusエンコードマイクロRNAのREは、この場所でのマイクロRNAの挿入（5 'UTR）はウイルス複製を変更しないことを示す修飾されていないウイルス（VMC 24）と同様の反応速度で複製します。 （B）RAW 264.7マクロファージは、miR-125BおよびmiR-142-3pの高レベルの中間レベルで発現するが、のmiR-124を発現しません。ウイルスATTにおけるゲノムの結果に対応するマイクロRNA標的配列の組み込みマイクロRNA発現のレベルと一致してenuation。データは平均ウイルス力価+/- SDとして表されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    図5
    図5： 合成マイクロRNA模倣を使用して、マイクロRNAを標的特異性の解析。参照17から変更されました。個々のマイクロRNA模倣でトランスフェクトし、H1-HeLa細胞を0.2のMOIで修正されていないウイルス（VMC 24）またはマイクロRNA標的ウイルス（miRT-VMC 24）を感染させました。 （A）偽処理細胞に対して正規化細胞生存率は、MTT細胞増殖アッセイを介して24時間の感染後に決定しました。すべてのサンプルの上清中の（B）ウイルス力価はまた、24時間の感染後で測定しました。ザデータは、平均生存率またはウイルス力価+/- SDとして表されます。 （不等分散の場合）ウェルチの補正と不対スチューデントt検定の二つの尾統計分析のために使用しました。 p値<0.01を有意とみなしました。 （**、P <0.01、***、p <0.001）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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    Discussion

    ウイルスゲノム内のマイクロRNA応答エレメントの設計、組成およびローカリゼーションは、有効性及び特異性を標的に決定するであろう。これらの最適化は、試行錯誤が必要になります。しかし、合理的な設計RNA構造解析と最小最適化10、11、12、13、38と、この技術の実装におけるウイルス複製およびマイクロRNAシグネチャー助剤の以前の研究に基づきます。

    REの設計を開始するとき、研究者は、目的の標的細胞で発現されるマイクロRNAのセットをコンパイルすることによって開始する必要があり、目的の非標的細胞において減少され、それは実験的に検証されています。このコンパイルに続いて、いくつかの予測に基づく分析は、マイクロRNA-タージェ競合の可能性に対処するために実施すべきですT相互作用。多くのウイルスは、マイクロRNAまたはウイルスと宿主の遺伝子発現を操作するために、携帯マイクロRNAを隔離する非コードRNAをコードします。また、いくつかのRNAウイルスは、その複製能力39,40を増強するために細胞のマイクロRNAと相互作用することが示されています。 REを設計する際従って、携帯マイクロRNAとウイルスの相互作用が知られているかどうか、彼らが潜在的に選択されたマイクロRNAターゲットを認識したり選択されたマイクロRNAの内因性の発現を変化させることができるウイルスのマイクロRNAを表現するかどうかを調査することを確認してください。文献検索に加えて、読者はREの合理的な設計を支援するために、ウイルスのマイクロRNAターゲット情報を含むオンラインバイオインフォマティクス予測ツールとデータベースを考慮する必要があります。このようなデータベースおよび予測ツールは、複数のマイクロRNAまたはプレ重複シード配列によって認識することができる標的配列の同定を容易にすることができますウイルスゲノム内に送りました。マイクロRNA標的を同定する方法およびオンライン予測ツールのいくつかの長所と短所についてより詳細な議論については、読者は参考文献41、42と呼ばれています。何度も予測などのガイドが偽陽性か陰性を得ることができるよう、これらの予測ツールのみを果たすことをお勧めします。この目的のために、マイクロRNAの一方の3 '末端はまた、標的化効率に影響を与える重なるシード配列があってもよいです。ルールセットのあまりに厳しいを使用すると、時には有害であり得ます。

    潜在的なマイクロRNAターゲットのセットが識別されると、研究者は、マイクロRNAとRNA構造予測10、11、12、13の生物学的特性に基づいてターゲットを順位付けすることによって継続するべきであり、EF "> 38。成熟した標的細胞におけるマイクロRNAと遺伝子サイレンシングの程度を決定するであろうアルゴノートタンパク質との会合のそのレベルの絶対豊富。いくつかの研究が唯一豊富に発現マイクロRNAが大幅に遺伝子発現16、43を制御することを実証しています、いくつかのマイクロRNAが豊富アルゴノートタンパク質とRISCの形成との相互作用を発現している間44。また、変換44を抑制するには不十分である。また、標的細胞とそれに続くオフにおけるマイクロRNAの飽和の可能性を最小にする検証機能を備えた高度に豊富なマイクロRNAの使用ターゲット毒性が。別のアプローチは、まだオフターゲットtoxicitiの可能性を最小限に抑えながら減少したコピー数を可能にすることができ、複数のmiRNA 45、46によって標的とされたREを、使用することとすることができますエス。マイクロRNAの標的mRNAの比も、このアプローチの成功に大きな影響を持つことになります。マイクロRNA比が高い対象を抑圧42、43、47、48のレベルを減少させます。これは、不適切に感染中に早期に規制場合、内因性マイクロRNAの制御を超えたレベルまで蓄積したときに迅速に複製するウイルスで特に重要です。標的とするためのマイクロRNAを選択する際に、これらの特性を考慮することが不可欠です。理想的には、その機能は実験的に検証されたマイクロRNAを使用。

    標的遺伝子のサイレンシングの効率は、成熟マイクロRNAの標的のパーセント相補性と同様に、挿入マイクロRNA標的配列のコピー数に影響されます。マイクロRNA（ヌクレオチド2-8）の5 '領域は、シード配列を構成しています。これは、一般的に受け入れられていますこの領域は成功した標的48、49に完全に相補的でなければならないこと。それは転写物とマイクロRNAの急速なリサイクルのエンドヌクレアーゼ的切断を促進することにより、遺伝子サイレンシング活性を増加させることができるので、大多数の研究は、完全な相補性と応答エレメントを使用します。マイクロRNAは、哺乳動物細胞中でアルゴノート2に制限されているエンドヌクレアーゼ活性を有するアルゴノートタンパク質と相互作用すると、このエンドヌクレアーゼ的切断にのみ発生します。その他のアルゴノートタンパク質は、脱アデニル化および転写物のエキソヌクレアーゼ攻撃によってmRNAの分解を促進します。読者は、マイクロRNAの生合成と機能の詳細な説明については、参考文献4、5、13、50、51、52と呼ばれています。一般にINCRと考えられていますコピー数を緩和することは、さらに標的と効率を向上させます。しかし、これはまた、マイクロRNAの飽和を増強することができ、常により有効証明されていません。標的細胞に富む複数の異なるマイクロRNAのための標的配列を組み込むために、または複数のマイクロRNAによって認識される標的配列を使用する方が良い場合があります。必要なコピー数はまた、サイレンシング必要となる転写物の量と、標的細胞におけるマイクロRNAの相対存在量に大きく依存します。すぐに蓄積される転写物は、マイクロRNAのレベルをoutcompetingからそれらを防ぐために、複数のコピーが必要な場合があります。実験的に十分な標的になり、各マイクロRNAの標的のための最適なコピー数を決定する、ウイルス適応性を維持し、それは、エスケープ変異の速度が推奨される最小限に抑えることができます。

    ウイルスゲノム内のマイクロRNA応答エレメントのローカリゼーションは非常に重要です。陰性の結果分析ターゲティング効率は常にウイルスがマイクロRNAを標的にすることはできませんという意味ではありません。これは単に、ターゲットがその場所にアクセスできないか、または標的遺伝子の抑制が病原性を阻害するのに十分ではありません意味してもよいです。応答要素の大部分は、標的転写物の3 '非翻訳領域（UTR）に挿入されます。しかし、ウイルスゲノムの成功した標的化が達成されており、応答エレメントは、5 'UTRにまたは本質的な遺伝子38のコード領域内に挿入されたときに時々展示は遺伝的安定性を増強しました。最適な挿入部位は、マイクロRNAの標的配列の高いアクセス性を可能にします。アクセシビリティは、RNA二次構造と化学量論的干渉によって妨げられることができます。したがって、高度に保存されている構造化されていない地域で応答エレメントをローカライズすることは良い出発点です。挿入される配列はまた、影響を及ぼすことができ、周囲の配列によって影響されます。 THUS、1マイクロRNA標的配列のための最適な位置は、他の応答要素には必ずしも最適ではありません。潜在的な挿入部位をスクリーニングするために、RE局在化の実験的検証及び最適化は、予測ソフトウェア（http://rna.urmc.rochester.edu/software.html例えばhttp://unafold.rna.albany.edu/）を使用して、必要であるが周囲のRNA構造の摂動のために高度53、54をお勧めします。

    高い整合性のきれいな核酸調製物の使用はまた、最良の結果を得るために重要です。 RNA転写物またはマイクロRNA模倣を扱うRNaseフリー環境の無菌技術とメンテナンスが不可欠です。最良の結果を得るRNA転写物について、マイクロRNA模倣、および最終的な滴定ウイルスストックは、RNA分解およびウイルス感染性の喪失凍結融解の繰り返しを避けるために、少量ずつ-80℃で保存する必要があります。使用時には、これらの試薬■すべての回で氷上に維持されるべきです。

    多くのマイクロRNAの相補性を共有するマイクロRNAのファミリーのメンバーであることに留意することが重要です。研究を行う際したがって、標的特異性の評価を改善するために、即時のマイクロRNAファミリーのメンバーを含むことが有益であり得ます。ウイルスの複製が望まれる範囲内の細胞は、家族（ 例えば 、のmiR-Let7ファミリー）のメンバーを表現するときに重要になります。また、マイクロRNA模倣物を使用して、特異性アッセイは、人工的なシステムであり、過剰発現は、いくつかの細胞におけるマイクロRNAのオフターゲット効果55をもたらすことができることに留意すべきです。このような場合、特異性はまた、代わりにマイクロRNA阻害剤を使用して適切なマイクロRNAを発現する細胞において評価することができます。このアッセイは、マイクロRNAの生理的に適切なレベルの存在下でのウイルス力価測定し、細胞生存率読み出しに基づく標的特異性の解析を可能にします。

    10、11、12、13のウイルスによって媒介される効果です。多くのウイルスは、高い変異率を示し、迅速に発生する可能性のある変異体を逃れます。複数のマイクロRNAの標的を含む標的配列の複数のコピーを含む複数の高度に保存された領域内のターゲットの局在化、または免疫応答を含む追加の抗ウイルス因子の存在は、これを緩和することができます。さらに、ウイルスゲノムへの外来遺伝物質の挿入は、多くの場合、ウイルスの減少複製能力をもたらします。この問題が発生した場合、マイクロRNAの目標は、遺伝的に不安定であると、より迅速に起きる突然変異体を脱出する可能性があります。複数のマイクロRNA標的コピーCAのインクルージョンnはまた、マイクロRNA標的の組み換え削除の可能性を高めます。そのため、十分なターゲティングのために必要な最低限のコピー数の実験的な決意が必要です。タンデムリピートを使用して対ゲノム全体の様々な場所でのマイクロRNA標的コピーをローカライズすると、この制約をバイパスするのを助けることができます。しかし、ウイルスの改変された複製速度を生じない必要標的コピーと挿入部位の最小数と最適なREの構成を特定する組換えおよび標的突然変異率を最小化するために重要です。それは、マイクロRNAの飽和が生じる場合、標的配列のあまりに多くのコピーを含めることも、オフターゲット毒性の可能性を増加させることができます。正常な細胞タンパク質を調節するために利用可能なマイクロRNAの量の主要な変化は望ましくない影響55につながる可能性があります。このため、多くのウイルスは、細胞56内及びこの場合のマイクロRNAの環境を変更します標的マイクロRNAを含む十分なウイルス複製が維持される場合、調節の効率が低下することがあります。これらの問題の全ては、応答エレメントの組成及び/又は局在化を最適化することにより、目標とされるシステム及びその限界を十分に理解して対処することができます。

    他のターゲティング方法に関連する典型的な問題は、ウイルスの標的外減衰量を含む、限定された帳簿能力を有するウイルス、および通常は感染していない細胞を標的とするために、エンジニアリングウイルスに関連した安全上の懸念で遺伝子標的材料のサイズ制約。マイクロRNA-ターゲッティングは、ウイルスの最小限の変更でウイルス親和性の調節を可能にします。これは、ウイルスゲノム内の最小限の空間を必要とし、細胞のマイクロRNAシグネチャーの広大な配列に基づいて調整することができます。この技術は、ウイルスのための新しい向性を導入しないため、任意の新たな安全上の懸念を導入しません。さらに、このこの方法は、異なる細胞型16、17、57、58、59、60、61内に濃縮された複数の異なるマイクロRNAのための標的配列を使用して同時に複数の指向性を調整するために使用することができます。これは、すべてを高める効力を有する治療用ウイルスの安全性を向上させるための機構を提供することができ、したがって、対応するマイクロRNAを発現しない細胞にウイルスを弱毒化することなく達成することができます。

    細胞のマイクロRNAの機構の利用は、ウイルスの多くの異なるクラスの親和性を調節するために使用することができます。ここでの詳細なプロトコルは、しかし、彼らはウイルスの複製サイクルおよび特定のレポーターレアに応じて適合させることができる、マイクロRNA標的ピコルナウイルスの救助及び特徴付けのために設計されていますdouts。異なるウイルスが特定救済戦略を持っているが、マイクロRNA標的配列に関係なく、全ゲノムを単一のプラスミドまたはウイルスDNAまたはRNAゲノムを持っているかどうかを符号化されているかどうかのウイルスゲノムに挿入することができます。限りプロデューサー細胞は、同族のマイクロRNAを発現しないように、最適化されたマイクロRNAターゲットはウイルスの救助を妨害するべきではありません。実験はウイルスの増殖速度を分析し、マイクロRNAは、標的特異性は、ウイルス複製の単一ラウンドの長さと特定のウイルス複製/毒性の読み出し（ 例えば、レポータータンパク質、細胞毒性、ゲノムの定量化に基づいて収集された時点を変更することによって変更することができます等 ）。なお、この技術は、理論的には、ウイルスのすべてのクラスに適用することができるが、多くの要因が、この方法の効率に影響を与えることができることに留意することが重要です。例えば、ネガティブセンスRNAウイルスが原因で制限された交流の可能性が高いプラスセンスRNAウイルスのように応答証明されていませんmiRNAの機械13へのゲノムRNAのcessibility。したがって、ウイルスの各クラスの生物学的特性は、REの最適化に関する追加の制約を付与します。これらの制約にもかかわらず、この技術は、ウイルスのすべてのクラスの生物学的プロセスの安全性、有用性、および基本的な理解に関わる研究を促進するウイルス親和性を標的とするための別の方法を提供しています。

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RE encoding Oligonucleotides IDT PAGE-Purified Ultramer Sequence Designed by Investigator
    Oligonucleotides encoding unique restriction site IDT 25nM Sequence Designed by Investigator
    Expand High Fidelity PCR Kit Sigma Aldrich 11732641001 Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
    T4 DNA Ligase System NEB M0202S
    MEGAscript Kit ThermoFisher Scientific AM1333
    MEGAclear Kit ThermoFisher Scientific AM1908
    0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific AM9260G RNase-free
    5 M NH4 Acetate ThermoFisher Scientific N/A Comes in MEGAclear Kit
    Ethanol ThermoFisher Scientific BP2818100
    Nuclease-free Water Fisher Scientific AM9938
    TransIT-2020 Transfection Reagent Mirus MIR 5404
    TransIT-mRNA Transfection Reagent Mirus MIR 2225
    0.2 μm syringe filter Millipore SLGP033RS
    2 ml Screw-Cap Tubes Sarstedt 72.694.005
    Cell Scrapers Fisher Scientific 08-100-241
    MicroRNA Mimics Dharmacon Varied
    MTT Cell Proliferation Assay ATCC 30-1010K
    Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells ThermoFisher Scientific 18265017
    pBlueScript II Vectors Agilent Technologies Variable (e.g. 212205) There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.

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    References

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    免疫学、問題120、マイクロRNA、マイクロRNA-ターゲティング、ピコルナウイルス、腫瘍溶解性、親和性、ウイルス、細胞毒性、複製、遺伝子発現
    ピコルナウイルス向性のマイクロRNAベースの規制
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    Ruiz, A. J., Russell, S. J.… More

    Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism. J. Vis. Exp. (120), e55033, doi:10.3791/55033 (2017).

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