Abstract
Selv om tilstedeværelsen af cirkulerende cellefri DNA i plasma eller serum er blevet bredt vist sig at være en egnet kilde af biomarkører for mange typer af cancer, har kun få undersøgelser fokuseret på den potentielle anvendelse af urin cellefrit (UCF) DNA. Med udgangspunkt i de hypoteser, normale apoptotiske celler producerer meget fragmenteret DNA, og at kræftceller slip længere DNA, blev vurderet som en tidlig diagnostisk markør stand til at skelne mellem patienter med prostata- eller blærecancer og raske personer potentielle rolle UCF DNA integritet.
Der foreslås en UCF DNA integritet analyse på grundlag af fire kvantitative realtid PCR'er af fire sekvenser længere end 250 bp: c-myc, BCAS1, HER2, og AR. Sekvenser, der ofte har en øget DNA-kopital i blære og prostatacancer blev valgt til analyse, men metoden er fleksibel, og disse gener kan være substitueret med andre gener af intehvile. Den potentielle anvendelighed af UCF DNA som en kilde til biomarkører er allerede blevet påvist for urologiske maligniteter og dermed bane vejen for yderligere undersøgelser af UCF DNA karakterisering. UCF DNA integritet test har den fordel at være ikke-invasiv, hurtig og let at udføre, med kun et par milliliter urin er nødvendige til gennemførelse af analysen.
Introduction
kan detekteres cellefrie DNA i blod og urin på grund af celledød ved apoptotiske eller nekrotiske mekanismer. Celle-frit DNA i blod er blevet bredt undersøgt til diagnostiske og prognostiske formål i forskellige sygdomme, især kræft 1. Men mindre vides om den rolle, urin celle-fri (UCF) DNA. UCF DNA kan stamme fra blod passerer gennem glomerulær filtration system eller af celler, der kommer direkte i kontakt med denne kropsvæske 2 (f.eks urothelial celler eller prostataceller). Anvendelsen af UCF DNA som en kilde til biomarkører er hovedsageligt blevet undersøgt for tidlig diagnose af nyre-, blære-, og prostatacancer på grund af den høje procentdel af UCF DNA kommer direkte fra urinvejene celler 3,4.
Der vides kun lidt om UCF DNA og de bedste metoder til isolering og karakterisering af det. I betragtning af den hypotese, at tumorceller frigiver længere DNA-fragmenter end normale celler, evalueringenaf cellefri DNA integritet er blevet undersøgt i et forsøg på at belyse oprindelsen af DNA i blodcirkulationen 5. Nogle undersøgelser har vist, at celle-frit DNA integritet i blod udgør en god diagnostisk test for mange typer af cancer 6, og den samme hypotese er blevet foreslået i forbindelse med urin 7-9.
Dette papir beskriver en ny metode til UCF DNA integritet analyse med en potentiel anvendelse til påvisning blære og prostatacancer. Især integritet UCF DNA-fragmenter længere end 250 bp blev testet i 4 regioner, der vides at have en øget DNA kopital i faste tumorer, herunder prostata og blærecancer: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2), og AR (Xq12) 10-14. Specifikke onkogener, snarere end tilfældige sekvenser, blev valgt til at øge sandsynligheden for at finde dem i den cellefrie fraktion af cancerpatienter. En af de største fordele veddenne metode er, at den er fleksibel og at andre regioner kan også vælges på basis af tumortype og karakteristika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen følger retningslinjerne fra FØRSTE menneskelige forskningspotentiale etiske komité.
BEMÆRK: I denne protokol, isoleret vi DNA fra urinprøver til at udføre en UCF DNA integritet analyse. LNCaP og MRC-cellelinier blev anvendt til konstruktion standarder. Teknikker såsom DNA-ekstraktion, DNA kvantificering (spektrofotometer og realtids-PCR for kontrol genet, STOX1), og real-time PCR for specifikke onkogener blev udført (figur 1).
1. Urin Indsamling og behandling
- Anskaf en ren bifangst urinprøve første morgen i en ren, tør, plastik kop. Saml mindst 50 ml af urinprøven.
- Oprethold urinen ved 4 ° C i højst 3 timer og sende den til laboratoriet ved den samme temperatur.
- Bland hver prøve ved at vende det to gange straks ved ankomsten i laboratoriet og overførsel i to 50 ml konisk bund polypropylen rør.
- Centrifuger røreneved 850 x g i 10 minutter ved 4 ° C eller ved stuetemperatur.
- overføre forsigtigt 10 ml af den øvre del af urinen supernatant i to 5-ml rør, idet dog mindst 2 ml af supernatanten over cellepelleten.
BEMÆRK: Overførsel den øverste del af supernatanten reducerer risikoen for forurening med celler eller cellerester. Der er ingen klar afgrænsning mellem de øvre og nedre dele. - Kassér pelleten og straks nedfryses supernatanten ved -80 ° C indtil anvendelse.
2. DNA Isolation fra urin Supernatant og cellelinier
BEMÆRK: Separation DNA'et fra en cellelinje (f.eks LNCaP for prostatacancer eller MRC for blærekræft) under anvendelse af et kommercielt kit og ved at følge producentens instruktioner. Isolering af DNA fra urinen supernatanten skal udføres ved hjælp af den kommercielle protokol, ændres som følger:
- Tø en alikvot af urin supernatanten ved stuetemperatur. </ Li>
- Vortex og bland urinprøven og overføre 1 ml af urinen supernatanten til en klar 5-ml rør. Frys residualurin ved -80 ° C.
- Tilsæt 100 pi proteinase K direkte til prøven.
- Tilsæt 1 ml af AL buffer til prøven og bland godt ved pipettering.
- Luk rørene og inkuberes prøverne ved 56 ° C i 15 min.
- Under inkubation forberede en kolonne for hver prøve og forberede vaskebuffere, AW1 og AW2, jævnfør producentens instruktioner (indsæt den angivne mængde 100% ethanol).
- Bring prøverne tilbage til stuetemperatur og tilsæt 1 ml absolut ethanol. Bland fuldt ved pipettering.
- Tilføj 650 pi af opnået i trin 2.7 til søjlen blandingen og centrifugere det ved 6000 x g i 1 min.
- Kassér rør indeholdende gennemløbet og placere søjlen på en ny, ren opsamlingsrør. Gentag trin 2.8 og 2.9 indtil hele prøven blandingen er blevet anvendt (5 gange).
- Tilføj 500 &# 181; L puffer AW1 uden befugtning kanten af søjlen. Centrifuger det ved 6.000 xg i 1 min.
- Kassér rør indeholdende gennemløbet og erstatte den med en ny, ren opsamlingsrør.
- Der tilsættes 500 pi puffer AW2 uden befugtning kanten af søjlen. Centrifuger det ved fuld hastighed (20.000 xg) i 3 min.
- Kassér rør indeholdende gennemløbet og erstatte den med en ny, ren opsamlingsrør.
- Gentag trin 2.12 for at fjerne eventuelle vaskebuffer.
- Kolonnen anbringes i en ren 1,5-ml rør. Der tilsættes 50 pi elueringsbuffer AE og vente 7 min for at sikre, at bufferen befugter kolonnen.
- Centrifuger det ved 8.000 xg i 1 min.
- Pipette eluenten fra trin 2.15 til mini-søjlen og centrifugere det ved maksimal hastighed i 1 min for at sikre maksimal genvinding af DNA.
3. DNA Kvantificering og fortynding
- Ved hjælp af et spektrofotometer, udføre kvantificering af DNA fra both cellelinjen og urinen supernatantprøver. Brug 2 uL prøve på en bænk-top spektrometer, som pr fabrikantens anvisninger.
- Fortynde UCF DNA-prøver for at opnå en koncentration på 1 ng / pi og opbevar DNA ved -20 ° C indtil DNA'et integritet analyse.
BEMÆRK: Hvis DNA mængde ikke er tilstrækkelig til at gå videre med real-time PCR (mindst 100 ng), udføre en ny DNA isolation proces. - Fortynd DNA fra cellelinje prøver at opnå seks standarder med forskellige koncentrationer: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5, og 2 ng / pi, hver med et volumen på 100 pi (ST1, ST2, ST3, sT4, ST5, og ST6). Opbevar cellelinje-DNA-standarder ved -20 ° C indtil DNA'et integritet analyse.
4. DNA Integrity Test - PCR
- Optø primerne (koncentrationen afhænger af typen af assay), grøn Supermix, celle-line DNA standarder, og UCF DNA fortyndede prøver på is.
- Forbered striben rør i pladen feller 72-brønd rotorskiven. Alikvot 10 pi to gange for hver standard og fortyndet prøve og 10 pi RNase-frit vand til den negative kontrol.
- Der fremstilles en blanding af 1 pi af hver primer (koncentrationerne er angivet i tabel 1), 12,5 pi grøn Supermix, og 6,5 pi RNase-frit vand for hver prøve. Ved udarbejdelsen af mix, bruge følgende antal prøver: 6 standarder for 2 replikater, antal prøver for 2 replikater, negativ kontrol for 2 gentagelser, og 2 ekstra prøver.
- Portion 15 uL af blandingen i hver brønd. Må ikke pipette eller dreje rørene.
- Start protokol med PCR-betingelserne anført i tabel 1.
BEMÆRK: For UCF DNA-værdi, blev 29 DNA-prøver behandles for hver realtid eksperiment ved hjælp af 72-brønd rotor disk: 29 x 2 prøver + 6 x 2 standarder + negativ kontrol x 2 = 72 (UCF DNA-værdi).
BEMÆRK: Protokollen for UCF DNA integriteten analyse kan også væreudføres ved hjælp af en anden PCR realtid instrument (når du bruger en anden enhed, kan ROX farvestof skal tilføjes).
5. DNA Integrity Test - Dataanalyse og fortolkning
BEMÆRK: UCF DNA-værdi for hver prøve blev opnået ved en real-time instrument-detection system software ved hjælp af en standardkurve konstruktion for hver enkelt PCR-gen evaluering og anvendelse af standardkurve interpolation, som tidligere beskrevet 7-9 (figur 2).
- Vurdere gentagelser; prøve replikerer med en forskel ≥1 Ct skal kasseres og re-evalueret i et andet eksperiment.
- Beregn medianen Ct for hver prøve og overveje prøver med en Ct-værdi ≤ 36.
- Vurdere specificiteten af PCR-produkterne ved hjælp af smeltning analyse.
- Evaluere koncentrationen af hvert amplikon ved interpolation med standardkurven; opnå en koncentration værdi (ng / uL) for hver amplikon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den totale frie DNA-koncentration var kvantificerbar ved spektrofotometri for analyseret alle prøver, der viser et interval på mellem 1,51 og 138 ng / pl. Fem kontrolprøver blev brugt til reproducerbarheden af data: blev udført to uafhængige realtid eksperimenter for c-myc, HER2, BCAS1, AR, og STOX1. Variationskoefficienterne (CV) blev derefter beregnet for hvert gen (tabel 2), med en god grad af reproducerbarhed mellem de to uafhængige forsøg (tabel 2).
Den 125-bp STOX1 sekvensen blev analyseret for at udelukke forekomst af PCR-inhibitorer. Hvis prøverne viste en forstærkning af STOX1 blev UCF DNA integritet test. En mangel på amplifikation betød, at DNA mængde ikke var tilstrækkeligt til at udføre UCF DNA integritet test, der angiver behovet for at gentage than analyse med en ny urinopsamling. Da der er lidt information tilgængelig om forstærkning eller sletning af STOX1 i blære- og prostatakræft, kan dette gen anvendes som en kontrol sekvens for disse tumortyper. Endelig blev UCF DNA integritet evaluering foretaget ved sammenlægning af de værdier, der opnås for de tre onkogener (Figur 3).
Er blevet foreslået anvendelse af summen af c-myc, HER2, og BCAS1 gener for blærekræft detektion 9, mens c-myc, AR, og HER2 er blevet foreslået til prostatakræft 7,8. De bedste afskæringsværdier identificeret for blære- og prostatakræft påvisning er 0,1 ng / uL og 0,04 ng / uL hhv. Ved hjælp af disse afskæringsværdier, blev en følsomhed på 73% og en specificitet på 84% opnået i detektering blærekræft versus symptomatiske individer, mens 58% følsomhed og 44% specifiktet blev observeret i at opdage prostatakræft versus patienter med benigne urogenitale tarmkanalen sygdomme 7-9. Afslutningsvis UCF DNA integritet test er fleksibel, så generne anvendes i den foreliggende undersøgelse kunne erstattes med andre lange sekvenser af interesse, afhængigt af den sygdom.
Figur 1. Urin Celle-fri DNA Integritet Workflow og tidslinje. Arbejdsgangen af metoden er opdelt i forskellige trin og tidspunkter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Rapport for c-myc Amplikon Analysis. Et eksempel på den smeltende analyse, amplifikationsplotOg standardkurve er rapporteret for c-myc evaluering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. UCF DNA Integrity Analysis Workflow. En simpel arbejdsgang for UCF DNA integritet analyse er rapporteret. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Gene | referencesekvens | Primer fremad | Primer omvendt | Amplicon længde (bp) | Real time-protokol |
| MYC (c-myc) (V-Myc Avian Myelocytomatosis Viral Oncogene homolog locus 8q24.21) | NG_007161.1 | TGGAGTAGGG ACCGCATATC | CCCAACACCA CGTCCTAAC | 264 | 95 ° C i 3 minutter efterfulgt af 45 cykler ved 94 ° C i 40 sekunder, 56 ° C i 40 sekunder og 72 ° C i 1 minut. |
| ERBB2 (HER2) (Erb-B2-receptor-tyrosinkinase 2, locus 17q12.1) | NG_007503.1 | CCAGGGTGTT CCTCAGTTGT | TCAGTATGGC CTCACCCTTC | 295 | |
| BCAS1 (Breast Carcinoma Amplified Sequence 1, locus 20q13.2) | NC_000020 | GGGTCAGAGC TTCCTGTGAG | CGTTGTCCTG AAACAGAGCA | 266 | |
| AR (Androgen receptor, locus Xq12) | NG_009014.2 | AGCCCAGGTT CTCTCCTGAT | TGGCTAGTC CTCAGCTT | 265 | |
| STOX1 (Storkhead Box1, locus 10q21.3) | NG_012975.1 | GAAAACAGG GCAGCAAGAAG | CAGACAGCAT GGAGGTGAGA | 125 | 95 ° C i 90 sekunder efterfulgt af 45 cykler ved 94 ° C i 40 sekunder og 54 ° C i 1 minut. |
Tabel 1. Primer Sekvenser og Assay betingelser.
| Prøve | HER2 | CV (%) | BCAS1 | CV (%) | c-Myc | CV (%) | AR | CV (%) | STOX1 | CV (%) | |||||
| Repli-kat 1 * | Repli-kat 2 * | Repli-kat 1 * | Repli-kat 2 * | Repli-kat 1 * | Repli-kat 2 * | Repli-kat 1 * | Repli-kat 2 * | Repli-kat 1 * | Repli-kat 2 * | ||||||
| 1 | 0,0 | 0,0 | | 0,1 | 0,1 | 3.4 | 0,1 | 0,1 | 14,0 | 0,6 | 0.5 | 29,1 | 0,6 | 0. 8 | 4,5 | |
| 2 | 2.6 | 2.7 | 2.3 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0.9 | 1.5 | 28,6 | 0,1 | 0,1 | 22,0 | 2.6 | 3.0 | 6.1 |
| 3 | 0.4 | 0.2 | 17,0 | 0,1 | 0,1 | 5.9 | 2.6 | 3.2 | 11.6 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,7 | 1.2 | 23.1 |
| 4 | 0,0 | 0,0 | NE | 1.1 | 1.0 | 3.0 | NE | 0,0 | NE | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | NE |
| 5 | 2.5 | 3.1 | 9.8 | 0,1 | 0,1 | 14,0 | NE | 0,0 | NE | 0,1 | 0,0 | 27.1 | 0,0 | 0,0 | NE |
Tabel 2. Real-time PCR reproducerbarhed for hvert gen.
* Resultater rapporteret som ng / uL
CV, variationskoefficient; NE, ikke evaluerbare
| Gener for UCF DNA integritet | Dislethed | Cancer patienter (n) | Controls (n) | Skær (ng / uL) | Følsomhed rate (95% CI) | Specificitet rate (95% CI) | Reference |
| MYC HER2 BCAS1 | blærekræft | 52 | 46 symptomatiske individer 32 raske individer | 0,1 | 0,73 (0,61-0,85) | 0,83 (0,72-0,94) | Casadio V et al. 2013 9 |
| MYC HER2 BCAS1 | Prostatakræft | 29 | 25 raske individer | 0,04 | 0,79 (0,62-0,90) | 0,84 (0,65-0,94) | Casadio V et al. 2013 8 |
| c-myc AR BCAS1 | Prostatakræft | 67 | 64 patienter med godartede sygdomme i urogenitale kanal | 0,04 | 0,58 (0.46-0.73) | 0,44 (0.30-0.58) | Salvi S et al. 2015 7 |
Tabel 3. Oversigt over de opnåede resultater for tidlig diagnosticering af prostata og blære kræft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µL rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 mL tubes | |||
| incubator | |||
| -80 °C freezer | |||
| -20 °C freezer | |||
| 10 μL pipette | |||
| 20 μL pipette | |||
| 200 μL pipette | |||
| 1,000 μL pipette | |||
| pipette tips (10; 20; 200; 1,000) | |||
| 1.5 mL tubes | |||
| 50 mL tubes | |||
| 15 mL tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 mL) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10 mL) | Qiagen | 19133 |
References
- Francis, G., Stein, S. Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer. Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).
- Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential. Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).
- Szarvas, T., et al. Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment. Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).
- Togneri, F. S., et al. Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA. Eur.J.Hum.Genet. , (2016).
- Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research. Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).
- Hao, T. B., et al. Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer. Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).
- Salvi, S., et al. Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients. Dis.Markers. 2015, 574120 (2015).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study. Biomed.Res.Int. 2013, 270457 (2013).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data. Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Ishkanian, A. S., et al. High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer. Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).
- Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer. J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).
- Nord, H., et al. Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma. Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).
- Tabach, Y., et al. Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer. PLoS One. 6 (1), e14632 (2011).
