Abstract
Selv om nærværet av sirkulerende celle-frie DNA i plasma eller serum har blitt mye vist seg å være en egnet kilde av biomarkører for mange typer kreft, er det få studier fokusert på den potensielle anvendelse av urin cellefritt (UCF) DNA. Starter fra hypotesene som normale apoptotiske celler produserer svært fragmentert DNA og at kreftceller slipp lenger DNA, den potensielle rolle UCF DNA integritet ble vurdert som en tidlig diagnostisk markør stand til å skille mellom pasienter med prostata eller blærekreft og friske individer.
En UCF DNA integritet analyse er foreslått på bakgrunn av fire kvantitative real-time PCR av fire sekvenser lengre enn 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, og AR. Sekvenser som ofte har et økt DNA-kopi-antall i blære og prostata cancer ble valgt for analyse, men metoden er fleksibel, og disse genene kan bli substituert med andre gener av intehvile. Den potensielle nytten av UCF DNA som en kilde til biomarkører har allerede blitt demonstrert for urologiske kreftformer, og dermed banet vei for videre studier på UCF DNA karakterisering. UCF DNA-integritet test har fordelen av å være ikke-invasiv, hurtig og lett å utføre, med bare noen få milliliter urin som trengs for å utføre analysen.
Introduction
Celle-frie DNA kan påvises i blod og urin på grunn av celledød ved apoptotiske eller nekrotiske mekanismer. Cell-free DNA i blodet har vært mye studert for diagnostiske og prognostiske formål i ulike sykdommer, spesielt kreft en. Men mindre er kjent om rollen til urin celle-fri (UCF) DNA. UCF DNA kan stamme fra blodet som passerer gjennom glomerulær filtreringssystem eller fra celler som kommer direkte i kontakt med denne kroppsvæske 2 (f.eks urotelialceller eller prostata celler). Bruken av UCF DNA som en kilde av biomarkører har hovedsakelig blitt undersøkt for tidlig diagnostisering av nyre-, blære og prostata kreft på grunn av den høye prosentandel av UCF DNA som kommer direkte fra urinveisceller 3,4.
Lite er kjent om UCF DNA og de beste metodene for å isolere og karakterisere det. Gitt den hypotese at tumorceller frigjør lengre DNA-fragmenter enn normale celler, evalueringenav celle-fri DNA-integritet har blitt undersøkt i et forsøk på å belyse opprinnelsen av DNA i blodsirkulasjonen 5. Noen undersøkelser har vist at cellefrie DNA-integritet i blodet representerer en god diagnostisk test for mange typer kreft 6, og det samme hypotese er foreslått i forbindelse med urin 7-9.
Dette notatet beskriver en ny metode for UCF DNA integritet analyse med en potensiell søknad til blære og prostata kreft gjenkjenning. Spesielt integriteten UCF DNA-fragmenter som er lengre enn 250 bp ble testet i 4 områder som er kjent for å ha en øket DNA-kopi-antall i faste tumorer, inkludert prostata og blærekreft: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2), og AR (Xq12) 10-14. Spesifikke onkogener, i stedet for tilfeldige sekvenser, ble valgt for å øke sannsynligheten for å finne dem i den cellefrie fraksjon av kreftpasienter. En av de viktigste fordelene meddenne metoden er at den er fleksibel og at andre regioner kan også velges på basis av tumortype og egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen følger retningslinjene for IRST menneskelige forskningsetiske komité.
MERK: I denne protokollen, isolert vi DNA fra urinprøver for å utføre en UCF DNA integritet analyse. LnCap og MRC-cellelinjer ble brukt til å konstruere standarder. Teknikker slik som DNA-ekstraksjon, DNA kvantifisering (spektrofotometer og real-time PCR for kontroll genet, STOX1) og real-time PCR for spesifikke onkogener ble utført (figur 1).
1. Urin Innsamling og behandling
- Få tak i en ren-fangst første morgen urinprøve i en ren, tørr, plastkopp. Samle minst 50 ml av urinprøven.
- Oppretthold urinen ved 4 ° C i maksimalt 3 h og sende den til laboratoriet ved samme temperatur.
- Bland hver prøve ved å vende det to ganger umiddelbart etter ankomst i laboratoriet og overføring inn i to 50-ml koniske bunn polypropylenrør.
- Sentrifuger røreneved 850 xg i 10 min ved 4 ° C eller ved romtemperatur.
- overføre forsiktig 10 ml av den øvre delen av urinen supernatanten i to 5 ml rør og etterlater i det minste 2 ml av supernatanten ovenfor cellepelleten.
Merk Overføring av den øvre del av supernatanten reduserer risikoen for forurensning av celler eller cellerester. Det er ingen klar avgrensning mellom øvre og nedre deler. - Kasser pelleten og umiddelbart fryses supernatanten ved -80 ° C inntil bruk.
2. DNA isolert fra urin Overstående og cellelinjer
MERK: Isoler DNA fra en cellelinje (f.eks LNCaP for prostatakreft eller MRC for blærekreft) ved hjelp av et kommersielt kit og følge produsentens instruksjoner. Isolering av DNA fra urinen supernatanten bør utføres ved bruk av kommersielt protokollen, modifisert som følger:
- Tine en aliquot av urinen supernatanten ved romtemperatur. </ Li>
- Vortex og blande urinprøven og overføre 1 ml av urinen supernatanten til en klar 5-ml tube. Fryse den resturin ved -80 ° C.
- Tilsett 100 ul proteinase k direkte til prøven.
- Tilsett 1 ml AL-buffer til prøven og bland godt ved pipettering.
- Lukk rørene, og prøvene inkuberes ved 56 ° C i 15 min.
- Under inkubasjon, forberede en kolonne for hver prøve og forberede vaske buffere, AW1 og AW2, som per produsentens instruksjoner (legge den angitte mengden av 100% etanol).
- Bringe prøvene til romtemperatur og tilsett 1 ml absolutt etanol. Bland fullt ved pipettering.
- Legg 650 mL av blandingen oppnådd i trinn 2.7 til kolonnen og den sentrifuge ved 6000 x g i 1 min.
- Kast rør inneholdende gjennomstrømnings og plassere kolonnen på en ny, ren oppsamlingsrør. Gjenta trinn 2,8 og 2,9 inntil alt prøveblandingen har blitt brukt (5 ganger).
- Legg 500 &# 181; L buffer AW1 uten fukte kanten av kolonnen. Sentrifuger den på 6000 xg i 1 min.
- Kast tuben inneholder gjennomstrømning og erstatte den med en ny, ren samling rør.
- Legg 500 mL buffer AW2 uten å tisse kanten av kolonnen. Sentrifuger det i full fart (20000 xg) for 3 min.
- Kast tuben inneholder gjennomstrømning og erstatte den med en ny, ren samling rør.
- Gjenta trinn 2,12 til å fjerne eventuelt gjenværende vaskebuffer.
- Plasser kolonnen i en ren 1,5-ml tube. Tilsett 50 ul elueringsbuffer AE og vente 7 min for å sikre at buffer tisser kolonnen.
- Sentrifuger den på 8000 xg i 1 min.
- Pipetter elueringsmiddel fra trinn 2.15 inn i mini-kolonnen og sentrifuger det ved maksimal hastighet i 1 min for å sikre maksimal utvinning av DNA.
3. DNA Kvantifisering og fortynning
- Ved hjelp av et spektrofotometer, utfører kvantifisering av DNA fra both cellelinjen og urin supernatantprøvene. Bruk 2 mL av prøven på en benk-top spektrometer, i henhold til produsentens anvisninger.
- Fortynn de UCF DNA-prøver for å oppnå en konsentrasjon på 1 ng / mL og lagre DNA ved -20 ° C inntil analyse DNA-integritet.
MERK: Hvis DNA kvantitet er ikke tilstrekkelig til å fortsette med real-time PCR (minst 100 ng), utfør en ny DNA isolert prosess. - Fortynn DNA fra cellelinje prøver for å oppnå seks standarder med forskjellige konsentrasjoner: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5, og 2 ng / mL, hver med et volum på 100 ul (ST1, ST2, ST3, sT4, ST5, og ST6). Oppbevar cellelinje DNA-standarder ved -20 ° C inntil analyse DNA-integritet.
4. DNA Integrity Test - PCR
- Tine primere (konsentrasjonen avhenger av hvilken type analyse), grønn Supermix, celle linjer DNA standarder, og UCF DNA fortynnede prøver på is.
- Forbered stripe rør i platen feller 72-brønnen rotor plate. Alikvot 10 ul i to for hver standard og fortynnet prøve og 10 ul RNase-fritt vann til den negative kontrollen.
- Fremstille en blanding av 1 ul av hver primer (de konsentrasjoner som er angitt i tabell 1), 12,5 mL av grønn SuperMix, og 6,5 ul RNase-fritt vann til hver prøve. Ved utarbeidelsen av mix, bruker du følgende antall prøver: 6 standarder for 2 gjentak, antall prøver for 2 gjentak, negativ kontroll for 2 gjentak, og 2 ekstra prøver.
- Alikvot 15 ul av blandingen i hver brønn. Ikke pipette eller snurre rørene.
- Start protokoll med PCR-betingelser som er angitt i tabell 1.
MERK: For UCF DNA verdi, ble 29 DNA-prøver behandlet for hver sanntid eksperiment ved hjelp av 72-brønn rotor plate: 29 x 2 prøver + 6 x 2 standarder + negativ kontroll x 2 = 72 (UCF DNA-verdi).
MERK: Protokollen for UCF DNA integritet analyse kan også væreutføres ved hjelp av en annen PCR sanntid instrument (når du bruker en annen enhet, kan ROX fargestoff må legges til).
5. DNA Integrity Test - dataanalyse og tolkning
MERK: UCF DNA verdi for hver prøve Den ble oppnådd ved en real-time instrument-detection system programvare ved hjelp av en standard kurve konstruksjon for hver enkelt PCR genet evaluering og bruk av standardkurve interpolering, som tidligere beskrevet 7-9 (figur 2).
- Vurdere replika; Prøven replikerer med en forskjell ≥1 Ct må kastes og re-evaluert i et andre forsøk.
- Beregn medianen Ct for hver prøve og vurdere prøver med en Ct-verdi ≤ 36.
- Vurdere spesifisiteten av PCR produkter ved hjelp av smelte analyse.
- Evaluere konsentrasjonen av hvert fragment ved interpolasjon med standardkurven; oppnå en konsentrasjonsverdi (ng / mL) for hvert fragment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den totale frie DNA-konsentrasjonen var målbar ved spektrofotometri for alle prøver analysert, og viser et område mellom 1,51 og 138 ng / mL. Fem kontrollprøver ble anvendt for reproduserbarheten av data: to uavhengige sanntids eksperimenter ble utført for c-MYC, HER2, BCAS1, AR, og STOX1. Koeffisientene til variasjon (CV) ble deretter beregnet for hvert gen (tabell 2), med en god grad av reproduserbarhet mellom de to uavhengige eksperimenter (tabell 2).
Den 125 bp STOX1 sekvensen ble analysert for å utelukke nærværet av PCR-inhibitorer. Dersom prøvene viste en forsterkning av STOX1 ble UCF DNA integritet test utført. Mangel på forsterkning menes at DNA-mengde var ikke tilstrekkelig til å utføre den UCF DNA-integritet test, noe som indikerer nødvendigheten av å gjenta than analyse med en ny urinoppsamling. Da det er lite informasjon tilgjengelig om forsterkningen eller sletting av STOX1 i blære og prostata cancer, kan dette genet bli brukt som en kontroll sekvens for disse tumortyper. Til slutt ble UCF DNA integritet evaluering utført ved å legge sammen verdiene oppnådd for de tre onkogener (figur 3).
Bruken av summen av c-myc, HER2, og BCAS1 gener har blitt foreslått for påvisning av blærekreft 9, mens c-myc, AR, og HER2 har vært foreslått for prostatakreft 7,8. De beste cut-off-verdier som er identifisert for blære og diagnose av kreft prostata er 0,1 ng / mL og 0,04 ng / mL, henholdsvis. Ved hjelp av disse cut-off-verdier, ble en sensitivitet på 73% og en spesifisitet på 84% oppnådd ved påvisning av blærekreft versus symptomatiske individer, mens 58% sensitivitet og 44% spesifikkligheten ble observert i å oppdage prostatakreft versus pasienter med godartet urogenitale veissykdommer 7-9. Som konklusjon, er det UCF DNA-integritet test fleksibel, slik at genene som anvendes i den foreliggende undersøkelsen kan være substituert med andre lange sekvenser av interesse, avhengig av sykdommen.
Figur 1. Urin Cell-free DNA Integrity arbeidsflyt og Timeline. Arbeidsflyten for fremgangsmåten er delt inn i forskjellige trinn og tider. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Rapport for c-MYC Amplicon Analysis. Et eksempel på smelte analyse, forsterkning tomtOg standardkurve er rapportert for c-MYC evaluering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. UCF DNA Integrity Analysis arbeidsflyt. En enkel arbeidsflyt for UCF DNA integritet analyse er rapportert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Gene | referansesekvens | primer fremover | primer revers | Fragment lengde (bp) | Sanntid protokollen |
| MYC (c-MYC) (V-Myc Avian Myelocytomatosis Viral Oncogene homolog, locus 8q24.21) | NG_007161.1 | TGGAGTAGGG ACCGCATATC | CCCAACACCA CGTCCTAAC | 264 | 95 ° C i 3 minutter etterfulgt av 45 sykluser ved 94 ° C i 40 sekunder, 56 ° C i 40 sekunder og 72 ° C i 1 minutt. |
| ErbB2 (HER2) (Erb-B2 reseptortyrosinkinasehemming 2, locus 17q12.1) | NG_007503.1 | CCAGGGTGTT CCTCAGTTGT | TCAGTATGGC CTCACCCTTC | 295 | |
| BCAS1 (Brystkreft Amplified Sequence 1, locus 20q13.2) | NC_000020 | GGGTCAGAGC TTCCTGTGAG | CGTTGTCCTG AAACAGAGCA | 266 | |
| AR (Androgen Receptor, locus Xq12) | NG_009014.2 | AGCCCAGGTT CTCTCCTGAT | TGGCTAGTC CTCAGCTT | 265 | |
| STOX1 (Storkhead Box1, locus 10q21.3) | NG_012975.1 | GAAAACAGG GCAGCAAGAAG | CAGACAGCAT GGAGGTGAGA | 125 | 95 ° C i 90 sekunder etterfulgt av 45 sykluser ved 94 ° C i 40 sekunder og 54 ° C i 1 minutt. |
Tabell 1. Primer Følger og analysebetingelser.
| Prøve | HER2 | CV (%) | BCAS1 | CV (%) | c -MYC | CV (%) | AR | CV (%) | STOX1 | CV (%) | |||||
| Repli-kat 1 * | Repli-kat 2 * | Repli-kat 1 * | Repli-kat 2 * | Repli-kat 1 * | Repli-kat 2 * | Repli-kat 1 * | Repli-kat 2 * | Repli-kat 1 * | Repli-kat 2 * | ||||||
| 1 | 0.0 | 0.0 | | 0.1 | 0.1 | 3.4 | 0.1 | 0.1 | 14,0 | 0.6 | 0.5 | 29.1 | 0.6 | 0. 8 | 4.5 | |
| 2 | 2.6 | 2.7 | 2.3 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.9 | 1.5 | 28.6 | 0.1 | 0.1 | 22,0 | 2.6 | 3.0 | 6.1 |
| 3 | 0.4 | 0.2 | 17,0 | 0.1 | 0.1 | 5.9 | 2.6 | 3.2 | 11.6 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.7 | 1.2 | 23,1 |
| 4 | 0.0 | 0.0 | NE | 1.1 | 1.0 | 3.0 | NE | 0.0 | NE | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | NE |
| 5 | 2,5 | 3.1 | 9.8 | 0.1 | 0.1 | 14,0 | NE | 0.0 | NE | 0.1 | 0.0 | 27.1 | 0.0 | 0.0 | NE |
Tabell 2. Real-time PCR reproduserbarhet for hvert gen.
* Resultatene rapporteres som ng / mL
CV, variasjonskoeffisient; NE, ikke evalueres
| Gener for UCF DNA integritet | disletthet | Kreftpasienter (n) | Controls (n) | Avskåret (ng / mL) | Følsomhet rate (95% KI) | Spesifisitet rate (95% KI) | Henvisning |
| MYC HER2 BCAS1 | Blærekreft | 52 | 46 symptomatiske individer 32 friske individer | 0.1 | 0,73 (0,61 til 0,85) | 0,83 (0,72 til 0,94) | Casadio V et al. 2013 9 |
| MYC HER2 BCAS1 | Prostatakreft | 29 | 25 friske individer | 0,04 | 0,79 (0,62 til 0,90) | 0,84 (0,65 til 0,94) | Casadio V et al. 2013 8 |
| c-MYC AR BCAS1 | Prostatakreft | 67 | 64 pasienter med godartede sykdommer i urogenitaltractus | 0,04 | 0,58 (0,46 til 0,73) | 0,44 (0,30 til 0,58) | Salvi S et al. 2015 7 |
Tabell 3. Oppsummering av resultatene oppnådd for tidlig diagnostisering av prostata og blære kreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
UCF DNA-integritet analyse er en ny, ikke-invasiv metode for å vurdere DNA-integritet i urin. Det ble nylig foreslått for tidlig diagnostisering av blæren 9 og prostata cancer 7,8. En rekke fordeler og ulemper ved UCF DNA integritet test er omtalt her, sammen med fremtidsutsikter.
Den største fordel med metoden er at det gir en billig, ikke-invasiv metode og en enkel protokoll for å studere urin som en potensiell kilde av biomarkører, som krever bare en grunnleggende kunnskap av molekylærbiologiske teknikker. Testen er rask å utføre, og resultatene blir tilgjengelig etter to arbeidsdager (Fig. 1), kan lett tolkes uten hjelp av en lege. Består av kun DNA prosesser og 2 real-time PCR, har tilnærmingen også en god kost-nytte-forhold. Når det gjelder nøyaktighet, har UCF DNA integritet høy følsomhet (73%) og spesifisitet (84%) i å oppdageblærekreft i symptomatiske pasienter 9. Endelig er fremgangsmåten fleksibel, og den foreslåtte genene lett kan erstattes med andre gener av interesse, så lenge de er lengre enn 250 bp.
Testen har også en rekke begrensninger. For det første er DNA spektrofotometriske kvantifiseringen metode ofte unøyaktige og kan erstattes med andre, mer nøyaktig, fluorometriske metoder (f.eks qubit eller picogreen). DNA kvalitet er også ganske dårlig, som demonstrert av de ofte lave 260/280 og 260/230 forholdstall. Videre er det i en av våre studier, var meget lav spesifisitet (44%) observert i prostatakreftpasienter versus pasienter med godartede sykdommer i urogenitaltraktus 7, som var sannsynligvis et resultat av godartede inflammatoriske nekrotiske celler frigjør mer intakt DNA inn i sirkulasjonen. Dette er et kritisk problem, fordi begge prostatakreftpasienter og personer med godartede sykdommer kan ha en inflammatorisk komponent i deres urinary celler. Således, innenfor rammen av tidlig diagnose av prostatakreft, kan resultatene fra en UCF DNA-integritet analyse være misvisende.
UCF DNA integritet ble evaluert i 314 urinprøver fra pasienter med prostata eller blærekreft, sunne og symptomatiske individer, og pasienter med godartede sykdommer i urogenitaltractus. En prospektiv studie på et større sak serie er nødvendig for å bedre definere rolle av denne tilnærmingen som et tidlig diagnostisk markør for urogenitaltractus kreft.
Selv om lite har blitt publisert på temaet UCF DNA som en kilde til biomarkører for kreft, er interesse for dette området øker. Nylig Togneri et al. 4 publisert en interessant papirbane hvor celle-fri DNA ekstrahert fra urinen supernatanten av blærecancerpasienter viste en stor tumorbyrde genom enn den til cellulært DNA isolert fra urinen pellet, noe som tyder på at studiet av den cellefrie fraksjonDNA i urinen kan være nyttig for å karakterisere urologiske kreft.
I vår erfaring, gjorde UCF DNA integritet test ikke vise seg å være en god tidlig diagnostisk test for prostatakreft. Omvendt, det viste potensial som en markør for tidlig deteksjon av blærekreft ved bruk i kombinasjon med konvensjonell urin cytologi. En bekreftende studie på en større prospektiv case-serien er under planlegging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µL rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 mL tubes | |||
| incubator | |||
| -80 °C freezer | |||
| -20 °C freezer | |||
| 10 μL pipette | |||
| 20 μL pipette | |||
| 200 μL pipette | |||
| 1,000 μL pipette | |||
| pipette tips (10; 20; 200; 1,000) | |||
| 1.5 mL tubes | |||
| 50 mL tubes | |||
| 15 mL tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 mL) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10 mL) | Qiagen | 19133 |
References
- Francis, G., Stein, S. Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer. Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).
- Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential. Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).
- Szarvas, T., et al. Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment. Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).
- Togneri, F. S., et al. Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA. Eur.J.Hum.Genet. , (2016).
- Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research. Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).
- Hao, T. B., et al. Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer. Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).
- Salvi, S., et al. Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients. Dis.Markers. 2015, 574120 (2015).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study. Biomed.Res.Int. 2013, 270457 (2013).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data. Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Ishkanian, A. S., et al. High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer. Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).
- Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer. J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).
- Nord, H., et al. Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma. Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).
- Tabach, Y., et al. Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer. PLoS One. 6 (1), e14632 (2011).
