Abstract
尽管在血浆或血清中的循环无细胞DNA的存在已被广泛证明是生物标记物的合适来源为许多类型的癌症，很少研究都集中在可能利用尿无细胞（UCF）的DNA。从正常凋亡细胞产生高度片段化DNA的假设和癌细胞开始释放更长的DNA，评价为能够患者前列腺或膀胱癌和健康个体之间进行区分的早期诊断标志物的UCF DNA完整性的潜在作用。
一个UCF DNA完整性分析，提出的超过250 bp的长四个序列四个实时定量PCR的基础上：C-MYC，BCAS1，HER2和AR。经常有在膀胱和前列腺癌的增加的DNA拷贝数序列被选择用于分析，但该方法是灵活的，这些基因可以与INTE的其他基因被取代休息。 UCF的DNA作为生物标志物的来源的潜在效用已被证实为泌尿系统恶性肿瘤，从而为在UCF DNA鉴定进一步研究的方式。在UCF DNA完整性测试具有作为非侵入性，快速，容易执行，以进行分析所需的尿只有几毫升的优点。
Introduction
无细胞的DNA可以在血液和尿液由于细胞死亡通过细胞凋亡或坏死的机制来检测。血液中的游离细胞DNA已被广泛地研究了在各种疾病的诊断和预后目的，尤其是癌症1。然而，较少有人知道尿无细胞（UCF）DNA的作用。 UCF DNA可以从血液穿过肾小球滤过系统或从直接来与该体液2（ 例如，上皮细胞或前列腺细胞）接触的细胞产生。作为生物标志物的来源，使用的UCF的DNA已经主要研究了肾，膀胱癌，和前列腺癌的早期诊断由于UCF的DNA直接从尿道细胞3,4-未来的高百分比。
鲜为人知的是，UCF DNA以及分离和鉴定的最佳方法。给定的假设肿瘤细胞释放比正常细胞较长的DNA片段，评价无细胞DNA完整性已被研究以试图阐明DNA的原点在血液循环中5。一些研究表明，在血液中的游离细胞DNA完整性表示用于多种癌症6良好的诊断测试，并且在同一假设已经关于拟尿7-9。
本文介绍了一个潜在的应用膀胱和前列腺癌检测DNA UCF完整性分析的新方法。特别是，UCF DNA的完整性片段长度大于250 bp的已知的4个区域测试，以在实体肿瘤，包括前列腺癌和膀胱癌增加的DNA拷贝数：C-MYC（8q24.21），HER2（17q12.1 ），BCAS1（20q13.2）和AR（Xq12）10-14。特定癌基因，而不是随机的序列，被选择来增加癌症患者的无细胞级分发现它们的概率。之一的主要优点这种方法是，它是柔性的，并且其他区域也可以被肿瘤的类型和特性的基础上选择的。
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Protocol
该协议遵循IRST人类研究伦理委员会的指导方针。
注：在这个协议中，我们提取的DNA从尿液样本以进行DNA UCF完整性分析。 LNCaP和MRC细胞系用于构建标准。技术如DNA提取，DNA定量（分光光度计和实时PCR的对照基因，STOX1），以及对特定的癌基因的实时PCR进行（ 图1）。
1.尿液收集与处理
- 获得清洁，干燥，塑料杯干净的副渔获物第一晨尿样品。收集至少50毫升的尿液样本。
- 保持尿液，在4℃下不超过3小时，它在相同的温度发送至实验室。
- 通过在实验室和转印到达时立即两次反相它分成两个50-mL锥形底聚丙烯管中混合各样品。
- 离心管在850×g离心在4℃下或在室温下10分钟。
- 小心转移10毫升尿上清的上部成两个5-mL管，而使细胞沉淀上面的上清液中的至少2毫升。
注意：传输上清液的上部降低污染的被细胞或细胞碎片的风险。有上部和下部部分之间没有明确的划分。 - 弃沉淀，并立即在-80冻结上清液℃直至使用。
2.从尿液上清，细胞系DNA分离
注：来自细胞系隔离的DNA（ 例如，LNCAP前列腺癌或MRC膀胱癌）使用商业试剂盒并按照制造商的说明。应使用商业协议来执行从尿上清液DNA的分离，修改如下：
- 解冻尿上清液在室温下的一个等分试样。</ LI>
- 涡和混合尿样和转移尿上清液1毫升到一个清晰的5毫升管。冷冻在-80℃的残余尿。
- 添加100微升蛋白酶K的直接向样品。
- 添加1毫升AL缓冲到样品并吹打混匀。
- 关闭管，并在56℃孵育样品15分钟。
- 孵育期间，制备每个样品一列和制备洗涤缓冲液，AW1和AW2，按照制造商的说明（加100％的乙醇的指示量）。
- 使样品回到室温，并添加1毫升的无水乙醇中。吹打充分拌匀。
- 添加650微升在步骤2.7到塔中获得的混合物中，并在6000 xg离心离心它为1分钟。
- 丢弃含有通流管，并放置在塔上的新的，干净的收集管。直到所有的样品混合物的已使用的（5次）重复步骤2.8和2.9。
- 添加500＃181; l缓冲AW1无润湿柱的边缘。离心它在6000 xg离心1分钟。
- 丢弃该管含有流通并用新的，干净的收集管更换。
- 添加缓冲液AW2的500微升无润湿塔的边缘。全速（20,000 XG）3 min离心它。
- 丢弃该管含有流通并用新的，干净的收集管更换。
- 重复步骤2.12以除去任何残留的洗涤缓冲液。
- 将列到一个干净的1.5毫升管。添加洗脱缓冲液AE中的50微升并等待7分钟，以确保缓冲区润湿列。
- 离心它在8000 xg离心1分钟。
- 吸管从步骤2.15洗脱液进入微型柱中，在最大速度离心它为1分钟，以确保DNA的最大回收。
3. DNA定量和稀释
- 使用分光光度计，从机器人进行DNA的定量小时的细胞系和尿上清液样品。使用2μL的样品在台式光谱仪，按照制造商的说明。
- 稀释UCF DNA样品以获得1毫微克/微升的浓度，并于-20℃下将DNA储存，直到DNA的完整性分析。
注意：如果该DNA量不足以与实时PCR（至少100纳克）来进行，执行新的DNA分离过程。 - 稀从细胞系样品的DNA，以获得六类标准不同浓度：0.001，0.01,0.1，1,0.5，和2纳克/微升，每100微升的体积（ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，并ST6）。在-20℃直到DNA完整性分析存储细胞系DNA的标准。
4. DNA完整性检测 - PCR
- 解冻的引物（浓度取决于测定的类型），绿色超混合液，细胞系的DNA的标准，并在冰上UCF DNA稀释的样品。
- 准备带管的托盘f或72孔转子盘。等分试样10μL的一式两份每个标准和稀释试样和无RNase水10μL的阴性对照。
- 制备的每种引物的1微升的组合（浓度如表1所示），Green超12.5微升，和6.5微升的无RNase水各样品。当准备搭配，请使用以下的样本数量：6标准的2次重复，样品数量为2的重复，2重复阴性对照，以及2个额外的样本。
- 分装15μL混合到每口井的。不要吸管或旋管。
- 开始与在表1所示的PCR条件的协议。
注：29×2样品+ 6×2标准+阴性对照×2 = 72（UCF脱氧核糖核酸值）：对于在UCF脱氧核糖核酸值，29 DNA样品使用72孔转子盘中的每个实时实验处理。
注：为UCF DNA完整性分析该协议还可以使用另一个PCR实时仪（使用其他设备时，ROX染料可能需要添加）进行。
5. DNA完整性检测 - 数据分析与解读
注：各样品的UCF DNA值是通过使用标准曲线构造为每个单独的PCR基因评价，并使用标准曲线内插实时仪器检测系统软件获得，如先前所述7-9（ 图2）。
- 评估重复;样本复制与差≥1的Ct必须被丢弃，并在第二个实验中重新评估。
- 计算位数的Ct每个样品和Ct值≤36考虑样本。
- 评估使用熔点分析的PCR产物的特异性。
- 通过评估与标准曲线插补每个扩增子的浓度;获得每个扩增子的浓度值（纳克/μL）。
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Representative Results
总游离DNA浓度是通过分光光度法量化的所有样品进行分析，呈现出范围1.51和138之间纳克/微升。五个控制样品用于数据的再现性：两个独立的实时实验对c-MYC，HER2，BCAS1，AR和STOX1进行。变化（CV）的系数，然后计算每个基因（ 表2），用两个独立的实验之间的良好度再现性（ 表2）。
125-bp的STOX1序列进行分析，以排除PCR抑制剂的存在。如果该样品显示STOX1的扩增，进行UCF DNA的完整性测试。缺乏放大，意味着DNA量不足以执行UCF DNA完整性检测，这意味着需要重复Ť他分析了新的尿液收集。因为提供了有关的放大或在膀胱癌和前列腺癌STOX1删除信息很少，这种基因可作为这些肿瘤类型的控制顺序。最后，在UCF DNA完整性的评价通过加入三个癌基因（ 图3）获得的值一起进行。
使用的c-MYC，HER2，和BCAS1基因的总和的已提出膀胱癌检测9，而c-MYC，AR和HER2已经被建议用于前列腺癌7,8。确定用于膀胱和前列腺癌检测的最佳截止值分别为0.1毫微克/微升和0.04纳克/微升。使用这些临界值，在检测膀胱癌与症状的个体获得的73％的灵敏度和84％的特异性，而58％的灵敏度和44％特异性性检测前列腺癌患者与良性泌尿生殖道疾病7-9观察。总之，UCF DNA完整性测试是柔性的，所以在本研究中使用的基因可以与其他感兴趣的长序列，根据疾病被取代。
图1.尿游离DNA完整性工作流和时间表。该方法的工作流被划分为不同的步骤和时间。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. C-MYC扩增分析报告。熔化分析，扩增曲线的例子和标准曲线都报道了c-myc的评估。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. UCF DNA完整性分析工作流程。报道为UCF DNA完整性分析一个简单的工作流程。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 基因 | 参考序列 | 正向引 | 反向底漆 | 扩增子长度（BP） | 实时协议 |
| MYC（c-Myc的） （Ⅴ-Myc的禽骨髓细胞瘤病病毒癌基因同源，轨迹8q24.21） | NG_007161.1 | TGGAGTAGGG ACCGCATATC | CCCAACACCA CGTCCTAAC | 264 | 95℃，3分钟，接着45个循环的94℃40秒，56℃40秒和72℃1分钟。 |
| ERBB2（HER2） （ERB-B2受体酪氨酸激酶2，基因17q12.1） | NG_007503.1 | CCAGGGTGTT CCTCAGTTGT | TCAGTATGGC CTCACCCTTC | 295 | |
| BCAS1 （乳腺癌扩增序列1，基因20q13.2） | NC_000020 | GGGTCAGAGC TTCCTGTGAG | CGTTGTCCTG AAACAGAGCA | 266 | |
| AR （雄激素受体，基因Xq12） | NG_009014.2 | AGCCCAGGTT CTCTCCTGAT | TGGCTAGTC CTCAGCTT | 265 | |
| STOX1 （Storkhead BOX1，轨迹10q21.3） | NG_012975.1 | GAAAACAGG GCAGCAAGAAG | CAGACAGCAT GGAGGTGAGA | 125 | 95℃90秒，接着在94℃下45个循环40秒，54℃1分钟。 |
表1.引物序列和检测条件。
| 样品 | HER2 | 简历 （％） | BCAS1 | 简历 （％） | ç-MYC | 简历 （％） | AR | 简历 （％） | STOX1 | 简历 （％） | |||||
| REPLI-美食1 * | REPLI-美食2 * | REPLI-美食1 * | REPLI-美食2 * | REPLI-美食1 * | REPLI-美食2 * | REPLI-美食1 * | REPLI-美食2 * | REPLI-美食1 * | REPLI-美食2 * | ||||||
| 1 | 0.0 | 0.0 | | 0.1 | 0.1 | 3.4 | 0.1 | 0.1 | 14.0 | 0.6 | 0.5 | 29.1 | 0.6 | 0.8 | 4.5 | |
| 2 | 2.6 | 2.7 | 2.3 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.9 | 1.5 | 28.6 | 0.1 | 0.1 | 22.0 | 2.6 | 3.0 | 6.1 |
| 3 | 0.4 | 0.2 | 17.0 | 0.1 | 0.1 | 5.9 | 2.6 | 3.2 | 11.6 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.7 | 1.2 | 23.1 |
| 4 | 0.0 | 0.0 | NE | 1.1 | 1.0 | 3.0 | NE | 0.0 | NE | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | NE |
| 五 | 2.5 | 3.1 | 9.8 | 0.1 | 0.1 | 14.0 | NE | 0.0 | NE | 0.1 | 0.0 | 27.1 | 0.0 | 0.0 | NE |
表2.实时PCR重现每个基因。
*结果以毫微克/μL
CV，变异系数; NE，不能评价
| 基因UCF DNA的完整性 | 派息缓解 | 癌症患者 （n） | 对照组 （） | 切断（ 纳克/μL） | 敏感 率 （95％CI） | 特异性率 （95％CI） | 参考 |
| MYC HER2 BCAS1 | 膀胱癌 | 52 | 46症状者32健康个体 | 0.1 | 0.73（0.61-0.85） | 0.83（0.72-0.94） | CASADIO V 等。 2013 9 |
| MYC HER2 BCAS1 | 前列腺癌 | 29 | 25健康人 | 0.04 | 0.79（.62-0.90） | 0.84（0.65-0.94） | CASADIO V 等。 2013 8 |
| c-Myc的 AR BCAS1 | 前列腺癌 | 67 | 64例泌尿生殖道的良性疾病 | 0.04 | 0.58（0.46-0.73） | 0.44（0.30-0.58） | 萨尔维S 等。 2015年7 |
表3.获得对前列腺和膀胱癌的早期诊断结果。
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Discussion
UCF DNA完整性分析是在尿评估DNA完整性一种新的，非侵入性的方法。它最近提出了膀胱9和前列腺癌7,8的早期诊断。有许多优点和UCF DNA完整性检测的缺点在这里讨论，未来的前景一起。
该方法的主要优点是，它提供了一种廉价的，非侵入性的方法和简单的协议来研究尿作为生物标志物的一个潜在来源，只需要的分子生物学技术的基本知识。该测试是快速执行，其结果，可在2个工作日内 （ 图1），可以很容易地不用医生的帮助下解释。仅由DNA的提取流程和2实时PCR的，该方法还具有良好的成本效益比。在准确性方面，UCF DNA完整性具有检测灵敏度高（73％）和特异性（84％）膀胱癌的症状的患者9。最后，该方法是灵活的，所提出的基因可以很容易地与其他感兴趣的基因取代的，只要它们比250碱基长。
试验也有一些限制。首先，将DNA光度法定量方法是经常不精确，并可能与其他，更精确，荧光方法（ 如，量子位或的PicoGreen）来代替。 DNA的质量也比较差，由经常低260/280和260/230的比率为证明。此外，在我们的研究中，在前列腺癌患者中观察到与患者的泌尿生殖道7，其可能是良性的炎性坏死细胞释放出更多的完整DNA进入循环的结果的良性疾病非常低的特异性（44％）。这是一个严重的问题，因为这两种前列腺癌患者和个人良性疾病可具有在其ü炎性成分rinary细胞。因此，前列腺癌的早期诊断的范围内，从UCF DNA完整性分析结果可能会产生误导。
UCF DNA完整性在314尿样进行了评估患者前列腺或膀胱癌，健康和症状的个体，并与泌尿生殖道的良性疾病的患者。需要以更大的情况下，一系列的前瞻性研究，以更好地确定为泌尿生殖道肿瘤的早期诊断标志物这种方法的作用。
虽然几乎没有已发表的UCF DNA作为生物标记用于癌症的来源的问题，在这方面的兴趣正在增加。近日，Togneri 等。 4公布了一个有趣的纸张，其中来自膀胱癌患者的尿上清液提取无细胞的DNA显示出比从尿沉淀中分离的细胞的DNA的高的肿瘤基因组的负担，这表明无细胞级分的研究尿中的DNA的可能是有用的表征泌尿癌症。
根据我们的经验，在UCF DNA完整性测试没有被证明是前列腺癌的一个良好的早期诊断测试。相反，与常规的尿细胞学组合使用时，它表现出作为用于早期检测膀胱癌的标志物的潜力。在更大的前瞻性病例系列的验证性研究，目前正在规划中。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µL rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 mL tubes | |||
| incubator | |||
| -80 °C freezer | |||
| -20 °C freezer | |||
| 10 μL pipette | |||
| 20 μL pipette | |||
| 200 μL pipette | |||
| 1,000 μL pipette | |||
| pipette tips (10; 20; 200; 1,000) | |||
| 1.5 mL tubes | |||
| 50 mL tubes | |||
| 15 mL tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 mL) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10 mL) | Qiagen | 19133 |
References
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