Abstract
Utgivelsen av ekstracellulære vesikler (EVS) inkludert små endosomal-avledet exosomes (Exos, diameter <100 nm) og store plasmamembran avledet mikrovesikler (MVS diameter> 100 nm) er en grunnleggende cellulær prosess som skjer i alle levende celler. Disse blemmer transportproteiner, lipider og nukleinsyrer spesifikke for sin celle opprinnelsesland og in vitro studier har markert sin betydning som formidlere av interkommunikasjon. Elbiler har blitt isolert fra ulike kroppsvæsker og spesielt elbiler i blodet har blitt identifisert som lovende biomarkører for kreft eller infeksjonssykdommer. For å muliggjøre studier av MV subpopulasjoner i blod, presenterer vi en protokoll for det standardiserte isolering og karakterisering av MV fra perifere blodprøver. MV pelleteres fra EDTA-antikoagulert plasmaprøver ved differensialsentrifugering og har typisk en diameter på 100 - 600 nm. På grunn av deres større størrelse, kan delett bli studert ved flowcytometri, en teknikk som blir rutinemessig brukt i klinisk diagnostikk og tilgjengelig i de fleste laboratorier. Flere eksempler for kvalitetskontroll analyser av de isolerte MV vil bli gitt, og markører som kan brukes for diskriminering av forskjellige MV subpopulasjoner i blod vil bli presentert.
Introduction
I de siste årene har mange in vitro-studier har vist at ekstracellulære vesikler (EV) spiller en viktig rolle ved intercellulær kommunikasjon. Levende celler stadig kaster vesikler som varierer i størrelse, innhold og biogenesis. De beste studerte elbiler er exosomes som stammer fra endosomal system hvor de er lagret som intraluminale vesikler i muitivesikulære organer. Når den sistnevnte sikring med plasmamembranen, er inneholdt vesiklene frigjøres som exosomes (Exos, diameter 30-100 nm 1). En annen populasjon av EV som har fått økende oppmerksomhet i de siste årene er store mikrovesikler (MVS diameter 100 - 1000 nm) som knopp av direkte fra plasmamembranen to.
Begge typer av vesikler er omgitt av et lipidbilag og inneholder nukleinsyrer, for eksempel, DNA, mRNA eller miRNA 3 - 5, og en mengde av proteiner som de kan overføre til nabo calen. Mens generelt proteinsammensetningen av vesiklene reflekterer tilstanden av cellen ifølge opprinnelsen, noen proteiner synes å være selektivt målrettet og anriket på elbil 1. En stor forskningsinteresse er å karakter elbiler fra unormale og syke celler for å definere bestemte EV signaturer som kan tillate bruk av elbiler som nye biomarkører. Spesielt i kreft, i hvilket ofte selve tumoren ikke er lett tilgjengelig, kan det flytende biopsier målrettet mot tumorspesifikt EV i blod tillate overvåking av terapi responser eller hjelpe til å karakterisere den primære svulsten uten behov for invasive prosedyrer 6.
Faktisk elbiler har allerede blitt isolert fra ulike kroppsvæsker inkludert urin 7, CSF 8, morsmelk 9 eller blod 10. Flere studier identifisert endringer i EV teller og sammensetning i ulike menneskelige sykdommer. For eksempel, i sepsis pasienter antall pro-koagulerende MV erbetydelig økt sammenlignet med friske individer 11. Også hos pasienter med alvorlig cerebral malaria kan observeres en økning i totale MV i blod og tellinger av plate avledet MV korrelerer med koma dybde og trombocytopeni 12. Andre studier rapporterer forhøyede antall av endotel-avledede vesikler hos pasienter med systemisk lupus erythematosus eller hjertesvikt og i tilfelle av sistnevnte, dette korrelerer med en høyere sannsynlighet av kardiovaskulære hendelser 13,14.
Spesielt i kreft, er elbiler i blodet for tiden diskutert som nye biomarkører med diagnostisk og prognostisk verdi. Nivåer av MV som uttrykker tumor-assosierte proteiner som MUC1, EGFR eller FAK synes å være forhøyet i blodet hos brystkreftpasienter 15,16. Også for Exos Nyere studier har vist at blodavledede Exos bærer tumorspesifikke antigener slik som Glypican-1 for kreft i bukspyttkjertelen eller Del-1 for brystkreft tillate tidlig sykdom debeskyttelse med høy spesifisitet og sensitivitet 17,18. I tillegg kan serum-avledet tumor Exos inneholde DNA som kan anvendes for påvisning av mutasjoner som KRAS og p53 som antyder deres anvendelse for terapi forutsigelse 19. Nylige fremskritt har vist at analyse av Exos i blodet hos pasienter med glioblastom bruke en bestemt microfluidic chip tillater kontroll av behandlingen 20. Samlet utgjør disse funnene antyder at analyse av sykdomsspesifikke subpopulasjoner av vesikler gir verdifull informasjon om diagnose, prognose samt behandlingsalternativer og suksess.
Men isolering og analyse av Exos fra blod er tidkrevende, krever spesiell lab utstyr og derfor er ennå ikke egnet for rutinemessig klinisk diagnostikk. I motsetning til dette, kan MV isoleres mye raskere og, på grunn av sin større størrelse, kan lett bli analysert ved strømningscytometri uten behov for å koble dem til lateksperler som det er nødvendig for Exos 18, 21. Således, her presenterer vi en protokoll som kan anvendes for den standardiserte isolering av MV fra blodprøver, og den påfølgende karakterisering av MV subpopulasjoner ved strømningscytometri. Denne protokollen vil tillate videre studier og i inngående karakterisering av MV profiler i store pasientgrupper som vil være nødvendig for å kunne bruke MV for daglige kliniske diagnostikk.
Protocol
Alle eksperimenter inkludert mennesker har blitt godkjent av den lokale etikkutvalg (godkjenning nr. 3/2/14). For valg av pasienter bør det bemerkes at flere faktorer slik som alder, kjønn, aktuelle behandlingsregimer, og mange flere kan påvirke MV preparatet i blodet, og derfor bør tas i betraktning før prøvetakingen 22,23.
1. Utarbeidelse av plasmaprøver
- Tegn 1 - 2 rør blod per donor gjennom en 21-gauge butterfly nål inn en Vacutainer blod samling rør som inneholder EDTA (1.6 mg / ml blod). Sørg for å invertere tube (s) flere ganger for å garantere effektiv blod antikoagulasjon.
MERK: Anbefalt mengde blod for påfølgende flowcytometri og Western Blot analyse er 5 - 15 ml. For å hindre MV degradering og tap, Blodprøver skal håndteres <30 minutter etter blodtilbaketrekning. - Fremstille plasmaprøver ved sentrifugering av prøvene i 15 minutter ved 1200 xg vedromtemperatur (RT).
- Anvende en ventil filter for å bidra til separering av plasma (= øvre lag) fra gjenværende blodceller (= lavere lag).
- Overfør plasma inn i en 15 ml tube.
- Sentrifuger i 15 minutter ved 1500 xg, RT for å pelletisere større cellerester og fjerne gjenværende blodplater.
- Overfør supernatanten til et 15 ml rør og direkte videre med MV isolasjon eller lagre prøvene for opptil 6 måneder ved -20 ° C.
MERK: Den presenterte protokollen kan også brukes til å isolere MV (og Exos) fra cellekultursupernatanter. For å gjøre det, dyrke celler ved 60 - 80% konfluens i 24 - 48 timer i dyrkingsmedium supplert med vesikkel-utarmet FCS, og deretter samle supernatanten. Sentrifuger i 5 minutter ved 750 xg, 4 ° C for å utarme gjenværende flytende celler, fyll supernatanten til et nytt 15 ml rør og sentrifuger på nytt i 5 min ved 1500 x g, 4 ° C for å pelletere celleavfallet større. Denne supernatant kan deretter brukes for isolering av MVsom beskrevet i trinn 2.1 til 2.16.
2. Isolering av MV
- Overfør plasmaprøven i et passende rør sentrifugering. Om nødvendig, fyll opp røret med PBS for å fortynne prøven og hindre kollaps av tynne vegger rør under sentrifugering prosedyren.
- -Sentrifuge i 35 min ved 14 000 xg, 4 ° C.
- Dekanter supernatanten, holde rørene snudd opp-ned og sette på et papirhåndkle. Vent i 3-5 minutter inntil all gjenværende supernatant er blitt bløtlagt i servietten og derved fjernet fra prøven.
- Resuspender pellet i MV 1 000 ul PBS, overføring til et 1,5 ml rør og sentrifuger i 35 min ved 14 000 xg, 4 ° C i en bordsentrifuge.
- Aspirer supernatant.
- Resuspender pellet i MV 50-500 ul PBS, avhengig av størrelsen av pelleten. Alternativt kan lyse MV direkte, for eksempel i RIPA-buffer (150 mM NaCl / 0,1% SDS / 0,5% Na-deoksykolat / 1% Triton X-100/50 mM Tris, pH 7,2)for påfølgende Western blot-analyse. Oppbevar MV ved -20 ° C. De vil holde seg stabilt i flere måneder, men unngå gjentatte fryse-tine-sykluser.
- Valgfritt: Bestem proteinkonsentrasjonen med en proteinanalyse MV (f.eks Bradford eller Lowry-metoden) for å vurdere MV avkastning eller dose MV for senere eksperimenter.
- Hvis ytterligere Exos skal isoleres fra plasmaprøver, dekanter supernatanten fra trinn 2,3 til en ultrasentrifuge rør og sentrifuger i 2 timer ved 110 000 xg, 4 ° C. Dekanter supernatanten som beskrevet i trinn 2.3, resuspender Exo pellet i 1000 ul PBS og overfør til små (1,5 ml) ultra-sentrifugeringsrørene.
- Ultrasentrifuge i 2 timer ved 110 000 xg, 4 ° C, supernatanten aspireres og resuspender Ekso pellet på 50-75 ul PBS eller RIPA-buffer.
3. Karakterisering av MV ved flowcytometri
- Overføre 15 ul PBS + 1% vesikkel-utarmet føtalt kalveserum (FCS) i en flowcytometri rør.
MERK: Vesikkel-utarmet FCS fremstilles ved sentrifugering av varme-inaktivert (30 min ved 56 ° C) FCS i 18 timer ved 110 000 xg, og filtrering av supernatanten gjennom et 0,2 um filter som beskrevet tidligere 24. - Tilsett 5 mikrogram (i tilfelle av lav avkastning 3 mikrogram er også aktuelt) av MV i PBS.
- Inkuber prøvene i 30 minutter ved RT for å blokkere uspesifikke bindingsseter på den MV overflate og derved redusere bakgrunnsfarging.
- Legg en fluorescensmerket antistoff mot protein-of-interesse. Titrere mengden av antistoff som brukes for farging før bruk for å bestemme den optimale konsentrasjonen og garanterer et lavt signal-til-støyforholdet. Sørge for å også inkludere en tube med ufargede MV som negativ kontroll, og en tube av MV farget med passende isotype kontroll-antistoff ved samme konsentrasjon (for eksempel hvis en ug antistoff blir anvendt, også bruke en mikrogram av en isotypekontrolltibody) for å kvantifisere bakgrunnsfarging.
MERK: Det er også mulig å utføre flerfarget flowcytometri ved å legge til flere antistoffer koblet til forskjellige fluorokromer. - Inkuber i 20 minutter ved romtemperatur i mørke.
- Tilsett 250 ul PBS og fortsetter med måling av prøven ved hjelp av et strømningscytometer.
- I tilfelle at prøvene ikke kan måles umiddelbart, tilsett 150 mL PBS og 50 ul 4% paraformaldehyde (PFA) for å fikse prøver og oppbevar ved 4 ° C. FORSIKTIG: PFA er giftig. Bruk hansker og egnet personlig verneutstyr.
- Redusere terskelen for strømningscytometeret til lavest mulig verdi og søk etter MV befolkningen ved hjelp av en fremover scatter (FSC) versus side scatter (SSC) tomt i logaritmisk skala. Gate på MV populasjonen og evaluere det fluorescerende signal på en tilsvarende histogram.
4. Karakterisering av MV ved Western blotting
- Resuspender MV pellet direkte ien egnet lyseringsbuffer (f.eks RIPA-buffer).
- I tilfelle MV pellet har allerede blitt resuspendert i PBS, fortynne det på minst 1: 1 i en egnet lyseringsbuffer (f.eks RIPA-buffer).
- Bestem proteinkonsentrasjonen av MV prøven, for eksempel ved Lowry-analysen.
- Forbered 10-20 mikrogram av MV i 22,5 mL RIPA buffer. Deretter legger 7,5 mL 4x Laemmli lasting buffer og varme i 5 minutter ved 95 ° C.
- Laste prøver på en polyakrylamidgel og utføre elektroforese og immunoblotting ifølge standardprotokoller.
- Etter overføring av proteinene på membranen, utføre en Ponceau flekker som en lastekontroll i henhold til standard protokoller.
- Destain membran i TBST i 5 min ved RT.
- Blokk membran i 30 minutter inntil en time ved RT i 5% BSA i TBST.
- Inkuber membran med det primære antistoff ved 4 ° C over natten eller i 2 timer ved RT.
- Vask membranen med TBST 3 x 5 min.
- Inkuber membran med HRP-koblet sekundært antistoff i en fortynning på 1: 10.000 i 5% BSA. Merk: Ved høye bakgrunnssignaler, bruke melkepulver i stedet for BSA.
- Vask membranen med TBST 3x 5 min.
- Utvikle membran med en ECL deteksjonsreagensen og oppdage signaler på Chemiluminescence filmer eller et chemiluminescence imaging system.
MERK: For å diskriminere MV fra Exos, proteiner som Tubulin, actinin-4 eller mitofilin kan brukes som bør hovedsakelig være til stede på MV 16,25. Vær oppmerksom på at de fleste tetraspanin antistoffer (f.eks CD9, CD81), som brukes som markører for Exos, ikke arbeider under reduserende betingelser, og bør derfor fremstilles i ikke-reduserende ladningsbuffer, etterfulgt av oppvarming i 10 minutter ved 70 ° C.
Representative Results
For å kvantifisere utbyttet av MV som kan isoleres etter den beskrevne protokoll beregnet vi mengden av MV isolert fra blodprøver av 10 givere. MV utbytte, som ble vurdert i en Lowry proteinanalyse, varierte fra 10 til 30 mikrogram med et gjennomsnitt på 19,2 ug MV per ml blod (Tabell 1). Partikkelkonsentrasjonen bestemt ved nanopartikkelsporings analyse (NTA) varierte fra 1,66 x 10 9 til 2,36 x 10 10 med et gjennomsnitt på 5,9 x 10 9 partikler per ml plasmaprøve (tabell 2). Ytterligere karakterisering av MV ved transmisjonselektronmikroskopi avslørte en populasjon av vesikler med en diameter> 100 nm som var omgitt av et lipidbilag, og inneholdt ikke noen celleorganeller (figur 1A). NTA bekreftet at størrelsen av de isolerte MV varierte fra 100 til 600 nm (figur 1B), og den midlere MV størrelsen var 201nm (figur 1C). Farging for typiske MV og Exo markører ved Western blotting viste at de isolerte MV var positive for Tubulin og bare viste en svak uttrykk for CD9 og CD81, mens Exos var negative for Tubulin og beriket i CD9 og CD81 (figur 2).
Analyse av de isolerte MV ved flowcytometri (figur 3A) viste en definert vesikkel populasjon som kan bli styrt ved hjelp av de samme parametere som normalt anvendes for MV isolert fra cellekultursupernatanter, og det var klart forskjellig fra bakgrunnssignalet som oppnås ved måling av PBS + 1% vesikler-utarmet FCS uten tilsetning av MV (figur 3B). For å analysere de forskjellige MV populasjoner som er tilstede i blodet, ble MV farget med etablerte markører for de forskjellige blodcellepopulasjoner, f.eks CD62P for blodplateavledet MV, CD45 for leukocytt-avledede MV, for CD235arøde blodcelle-avledet MV og CD62E for endoteliale celle-stammer MV (figur 4). Denne karakterisering viste at prosentandelen av MV subpopulasjoner forskjellig blant de undersøkte donorblodprøver, mens majoriteten av MV syntes å være felle av blodplater i alle prøver.
Figur 1: Størrelsesfordeling av MV Isolerte fra perifert blod. A, Isolerte MV ble visualisert ved transmisjonselektronmikroskopi. B, Representative nanopartikkel sporing analyse (NTA) av MV som illustrerer størrelsesfordelingen av vesiklene. C, Gjennomsnittlig MV størrelse fra 10 uavhengige preparater ble målt ved NTA (mener). Klikk her for å se alArger versjon av denne figuren.
Figur 2: Karakterisering av Isolerte MV ved Western blotting. Differential protein uttrykk på de isolerte MV og Exos fra to givere ble visualisert ved Western blotting. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Analyse av MV ved strømningscytometri. A, MV først visualisert på fremover (FSC) versus sidescatter (SSC) tomter til gate på respektive MV befolkningen. Deretter er disse MV tegnes for antigenet av interesse ved ved hjelp av fluorescensmerkede antistoffer som er rettet mot antigenet. B, Typisk FSC versus SSC tomter for MVS isolert fra plasma fra to givere. Som sammenligning er et typisk plott for tumorcelle-avledet MV fra A549 lungekreftceller isolert fra cellekultursupernatanten, så vel som en negativ kontroll med bare PBS + 1% vesikkel-utarmet FCS uten MV vist til høyre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Karakterisering av Isolerte MV ved flowcytometri. MV fra tre donorer ble karakterisert for ekspresjon av etablerte blodcellemarkører (røde) ved flowcytometri. De respektive isotype kontroller er vist i grått.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Prøve | MVS / ml blod [ug] |
| #1 | 29.4 |
| # 2 | 10.3 |
| # 3 | 15.2 |
| # 4 | 31.1 |
| # 5 | 18.8 |
| # 6 | 22,7 |
| # 7 | 19.1 |
| # 8 | 18,7 |
| # 9 | 15,0 |
| # 10 | 11.9 |
Tabell 1: MV Protein Yield fra perifere blodprøver.
| Prøve | MVS / ml plasma [partikkeltelling] |
| #1 | 6.42E + 09 |
| # 2 | 2.36E + 10 |
| # 3 | 1.88E + 09 |
| # 4 | 6.51E + 09 |
| # 5 | 3.48E + 09 |
| # 6 | 4.57E + 09 |
| # 7 | 2.09E + 09 |
| # 8 | 1.66E + 09 |
| # 9 | 2.54E + 09 |
| # 10 | 6.20E + 09 |
Tabell 2: MV Particle Yield fra perifere blodprøver.
Discussion
Nyere studier på elbiler i blodet har vist at EV sammensetning og teller endres i løpet av årsaken til flere sykdommer. Derfor analysen og videre karakterisering av disse elbiler er av høy interesse for å vurdere ytterligere deres potensielle bruk som sykdoms biomarkører for diagnose og prognose eller å evaluere terapi svar. Protokollen vi presenterer her tillater isolering av vesikler med en diameter på opp til 600 nm, som ikke inneholder noen celleorganeller. Disse observasjonene er i linje med den nåværende definisjonen av MV og utelukke tilstedeværelse av apoptotiske legemer 2. Ved hjelp av Western blotting, var vi i stand til å vise at de isolerte MV viser en høy uttrykk for Tubulin, mens tetraspanins CD9 og CD81 som ofte brukes som Exo markører ble bare litt uttrykt. Dette bekrefter at MV avvike fra Exos og passer til nyere grundig karakterisering og sammenligning av begge EV populasjoner av proteomikk 25.
innhold "> Under anskaffelse av blodprøver, er det avgjørende å holde tiden mellom venepunkteringen og plasma-fremstilling så kort som mulig for å forhindre MV nedbryting. Videre kan forlenget lagring av blodprøver fører til aktivering av blodceller som forårsaker forbedret MV shedding og til slutt apoptose som resulterer i frigjøring av apoptotiske legemer. en annen viktig faktor for MV isolasjon er å hindre forurensing av MV preparater med plasmaproteiner eller mindre Exos. Derfor er det viktig å fjerne så mye av supernatanten som mulig etter å spinne ned MVS ved 14000 x g. etter pelleten normalt er synlig og tett festet til veggen av røret, supernatanten kan lett fjernes med en pipettespiss. i motsetning til Exos som har en tendens til å danne aggregater under fremstilling ved høy hastighet ultrasentrifugering og er ofte vanskelig å suspendere, betyr dette problemet oppstår ikke med MV.Vår studie viser at det er imidleold til å karakterisere MV subpopulasjoner som er tilstede i blodet ved flowcytometri. Selv om påvisningsgrensen for de fleste flowcytometere er omkring 200-300 nm, ble MV reproduserbart målt i donor, så vel som cellekulturprøver med de samme parametre for analyse og porter som klart er tillatt deres forskjell fra bakgrunnssignaler. Det er viktig å kontrollere før målingene som PBS benyttet for analysen ikke inneholder forurensende partikler som kan føre til en høy bakgrunn ved flowcytometri (figur 3). Selv om noen mindre MV ikke kan bli fanget i en flowcytometrisk tilnærming, vi har oppdaget MV fra alle de store blodcellepopulasjoner (f.eks blodplater, røde blodceller, leukocytter, endotelceller). I våre analyser vi brukte standardmarkører for de forskjellige blodceller som er blitt funnet på MV 26 - 29. Det skal bemerkes at for å oppnå de best mulige resultater ved flowcytometri, than mengden og konsentrasjonen av alle antistoffer bør titreres på en MV prøve som uttrykker antigenet av interesse. Hvis MV spesifikke subpopulasjoner i blodet skal identifiseres med høyere spesifisitet, er det mulig å utføre dobbelt-farging mot to forskjellige antigener til stede på de respektive MV og bare ta hensyn til alle dobbelt positive MV for etterfølgende analyser 23. For tiden er det arbeidet med å definere et standard utvalg av MV subpopulasjoner i blodet hos friske individer 23,30. Disse studiene har allerede vist at plate avledet MV utgjør den største bestanden av MV i blodet som er i samsvar med våre observasjoner.
En fordel med flowcytometri for å karakterisere MV prøvene er at denne metoden er allerede godt etablert for diagnostiske formål i de fleste kliniske sentre som ville tillate mulig bruk av MV som biomarkører i hverdags klinisk diagnostikk. Tidligere studier på elbiler i blodet som har mest fokused på mindre Exos, er avhengige av enten spesifikke sorterings prosedyrer for å selektivt analysere ønsket Exo målgruppen 31,32 eller krever en tidkrevende (2 dager) isolasjon prosessen med kobling av Exos mot lateks perler før analyse 18. Våre egne upubliserte observasjoner tyder på at den flowcytometrisk analyse av MV fra fullblods forberedelser gjør at selv påvisning av MV som tumor-avledet MV uten slike utvelgelsesprosesser.
Til sammen protokollen presenteres her muliggjør rask isolering av MV fra perifere blodprøver med standard laboratorieutstyr og deres påfølgende karakterisering ved hjelp av flowcytometri og Western blotting. Hele prosessen kan utføres i rundt to timer som vil legge til rette for fremtidige studier på MV profiler i pasientenes blod som er nødvendige for å vurdere potensialet for MV som sykdoms biomarkører.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| butterfly needle (21 gauge) | Hospira Deutschland GmbH | 490P29201 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roth | 8076.3 | For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6 |
| For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20 | |||
| CD235a-PE | Beckman Coulter | A07792 | use 5 µl for staining |
| CD45-FITC | Beckman Coulter | 7782 | use 5 µl for staining |
| CD62E-PE | Biolegend | 336008 | use 0.8 µg for staining |
| CD62P-PE | Biolegend | 304905 | use 0.1 µg for staining |
| CD81 antibody | Biolegend | 349501 | 1:2,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
| CD9 antibody | Immunotools | 21270091 | 1:1,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
| Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000 | Fujitsu Life Sciences | ||
| DC protein assay kit II | Bio-Rad | 5000112 | |
| ECL detection reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
| EDTA vacutainers for blood collection | Sarstedt | 01.1605.001 | |
| FACSCanto II | BD Biosciences | ||
| fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 10091148 | heat-inactivated (30 min, 56 °C) |
| filter 0.22 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HRP-coupled anti-mouse secondary antibody | santa cruz | sc-2005 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
| HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody | santa cruz | sc-2004 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
| 4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1 | Roth | K929.1 | |
| microfuge SIGMA 1-15K | Sigma Laborzentrifugen | ||
| milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk) | BioRad | 170-6404 | |
| multifuge 3 L-R | Heraeus | ||
| NanoSight LM10 | NanoSight Ltd. | ||
| PBS, w/o Ca and Mg | Pan biotech | P04-36500 | |
| perfusor syringe 50 mL | Braun | 8728844F | |
| Ponceau-S staining solution | PanReac AppliChem | A2935,0500 | |
| rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6 x 17 mL) | Beckman Coulter | ||
| rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10 x 1.5 mL) | Beckman Coulter | ||
| tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom) | BD Biosciences | 352054 | |
| tubes for ultracentrifugation (15 mL) | Beckman Coulter | 344061 | |
| tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm) | Beckman Coulter | 343778 | |
| Tubulin antibody | Millipore | 05-829 | 1:5,000 in 5%BSA in TBST |
| ultracentrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | ||
| ultracentrifuge TL-100 | Beckman Coulter | ||
| valve filter Seraplas V15 | Sarstedt | 53,428 | |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4 (0), (2015).
- Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., Agnati, L. F. Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA. J Neural Transm (Vienna). 117 (1), 1-4 (2010).
- Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nat Commun. 2, 180 (2011).
- Lee, T. H., et al. Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells. Biochem Biophys Res Commun. 451 (2), 295-301 (2014).
- Chi, K. R. The tumour trail left in blood. Nature. 532 (7598), 269-271 (2016).
- Pisitkun, T., Shen, R. -F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
- Harrington, M. G., et al. The morphology and biochemistry of nanostructures provide evidence for synthesis and signaling functions in human cerebrospinal fluid. Cerebrospinal Fluid Res. 6, 10 (2009).
- Admyre, C., et al. Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk. J Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Caby, M. -P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).
- Nieuwland, R., et al. Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis. Blood. 95 (3), 930-935 (2000).
- Mfonkeu, J. B. P., et al. Elevated Cell-Specific Microparticles Are a Biological Marker for Cerebral Dysfunctions in Human Severe Malaria. PLoS One. 5 (10), e13415 (2010).
- Parker, B., et al. Suppression of inflammation reduces endothelial microparticles in active systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 73 (6), 1144-1150 (2014).
- Nozaki, T., et al. Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure. Eur J Heart Fail. 12 (11), 1223-1228 (2010).
- Galindo-Hernandez, O., et al. Elevated concentration of microvesicles isolated from peripheral blood in breast cancer patients. Arch Med Res. 44 (3), 208-214 (2013).
- Menck, K., et al. Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN. J Mol Cell Biol. 7 (2), 143-153 (2015).
- Moon, P. -G., et al. Identification of Developmental Endothelial Locus-1 on Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Biomarker for Early Breast Cancer Detection. Clin Cancer Res. 22 (7), 1757-1766 (2016).
- Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
- Kahlert, C., et al. Identification of Double-stranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer. J Biol Chem. 289 (7), 3869-3875 (2014).
- Shao, H., et al. Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy. Nat Med. 18 (12), 1835-1840 (2012).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J Vis Exp. (59), (2012).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2 (0), (2013).
- Gustafson, C. M., Shepherd, A. J., Miller, V. M., Jayachandran, M. Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans. Biol Sex Differ. 6, (2015).
- Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 3 (0), (2014).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Dignat-George, F., Boulanger, C. M. The Many Faces of Endothelial Microparticles. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 27-33 (2011).
- Esser, M. T., et al. Differential Incorporation of CD45, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), and Major Histocompatibility Complex Class I and II Molecules into Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions and Microvesicles: Implications for Viral Pathogenesis and Immune Regulation. J Virol. 75 (13), 6173-6182 (2001).
- Canellini, G., et al. Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry. Blood Transfus. 10 (2), s39-s45 (2012).
- Scholz, T., Temmler, U., Krause, S., Heptinstall, S., Lösche, W. Transfer of tissue factor from platelets to monocytes: role of platelet-derived microvesicles and CD62P. Thromb Haemost. 88 (6), 1033-1038 (2002).
- Berckmans, R. J., et al. Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation. Thromb Haemost. 85 (4), 639-646 (2001).
- Rupp, A. -K., et al. Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage. Gynecol Oncol. 122 (2), 437-446 (2011).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
