Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

صالحة يجند نانو الكتلة في الدهن طبقة ثنائية المعتمدة

Published: April 23, 2017 doi: 10.3791/55060
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Aix-Marseille Université, CNRS, UMR 7325, CINaM, 2State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science of Jiangnan University

Summary

نقدم بروتوكول لfunctionalize الزجاج مع بقع البروتين النانومترية تحيط بها طبقة ثنائية الدهن السائل. هذه ركائز متوافقة مع المجهر الضوئي المتقدمة، ومن المتوقع أن تكون بمثابة منصة للدراسات التصاق الخلايا والهجرة.

Abstract

حاليا هناك اهتماما كبيرا في خلق صفائف أمر من الجزر البروتين لاصقة في بحر من سطح تخميلها للدراسات البيولوجية الخلية. في السنوات الماضية، فقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن الخلايا الحية تستجيب، وليس فقط لطبيعة البيوكيميائية من الجزيئات المقدمة لهم ولكن أيضا على الطريقة التي يتم بها عرض هذه الجزيئات. خلق البروتين أنماط الصغرى ولذلك المعيار الآن في العديد من المختبرات البيولوجية. متعدد الأنماط نانو هي أيضا أكثر سهولة. ومع ذلك، في سياق التفاعلات خلية خلية، هناك حاجة إلى نمط ليس فقط ولكن أيضا البروتينات طبقات ثنائية الدهون. وحتى الآن لم تكن هذه المزدوجة الزخرفة-PROTEO شحمي الوصول إليها بسهولة. نحن نقدم تقنية السطحية لخلق البروتين نانو النقاط معتمدة على الزجاج واقتراح طريقة لردم مساحة بين نقطة مع طبقة ثنائية الدهون المدعومة (SLB). من الصور تبييض التتبع الدهون الفلورسنت المدرجة في SLB، علينا أن نبرهن على طبقة ثنائية المعارض الكبيرة في وررسيولة انو. Functionalizing النقاط البروتين مع مجموعات الفلورسنت يسمح لنا صورة لها وتظهر أنها تنظم في شعرية سداسية منتظمة. النقطة حجم النموذجي هو حوالي 800 نانومتر، والتباعد تظاهر هنا هو 2 ميكرون. ويتوقع لهذه ركائز لخدمة منصات مفيدة لالتصاق الخلايا والهجرة والدراسات والميكانيكية الاستشعار عن بعد.

Introduction

التصاق الخلايا تتم من خلال جزيئات متخصصة التصاق الخلية (الحدب)، البروتينات الموجودة على غشاء الخلية التي هي قادرة على الربط إلى نظيرتها في نسيج خارج الخلية أو على خلية أخرى. على خلايا الالتزام، ومعظم جزيئات الالتصاق بما في ذلك إنتغرين في كل مكان وكادهيرين، وتوجد في شكل مجموعات 1. تفاعل الخلايا الليمفاوية T (خلايا T) مع خلايا مقدمة للمستضد (ناقلات الجنود المدرعة) يوفر التوضيح ولا سيما ضرب من أهمية مجموعات مستقبلات شكلت في واجهة بين خليتين - غالبا ما يسمى المشبك المناعي. على تشكيل أول اتصال مع مستقبلات الخلايا APC، T (TCRs) على سطح T شكل خلية ميكرون مجموعات على نطاق والتي تكون بمثابة إشارات منصات 2، 3، 4، ومركزية في نهاية المطاف إلى تشكيل أكبر كتلة supramolecular المركزية (cSMAC )معشوقة = "XREF"> 5، 6، 7. مؤخرا، تبين أن على الجانب APC، وتتركز في بروابط من TCR أيضا 8.

في سياق T خلية APC التفاعل، ونشر الأنظمة الهجينة، حيث حاكت APC قبل العشب الصناعي functionalized مع البروتينات ذات الصلة، وقد تقدمت كثيرا فهمنا واجهة متشابك 2، 3، 4، 5، 6، 7 . في هذا السياق، هو ذات أهمية كبيرة لتصميم APC السطوح المحاكاة التي تستحوذ واحد أو أكثر من جوانب الخلية المستهدفة. على سبيل المثال، إذا تم المطعمة بروابط على طبقات ثنائية الدهون المعتمدة، فإنها يمكن أن تنتشر في الطائرة من طبقة ثنائية، تحاكي الوضع على سطح APC، وفي الوقت نفسه تسمح تشكيلcSMAC 6 و 7. وبالمثل، وقد حاكت مجموعات على APC من خلال خلق جزر بروابط في بحر من البوليمرات 9، 10، 11، 12، 13، 14. ومع ذلك، حتى الآن لم يتم الجمع بين هذه الميزات اثنين.

نحن هنا وصف تقنية الرواية لخلق نانو النقاط مكافحة CD3 (الأجسام المضادة التي تستهدف مجمع TCR) وتحيط بها طبقة ثنائية الدهون مع الدهون نشرها. وتودع طبقة ثنائية باستخدام انجمير-بلودجيت / انجمير-شايفر تقنية 7 و 15 و 16 و إذا رغبت في ذلك، يمكن functionalized مع بروتين معين - على سبيل المثال، يجند للخلية إنتغرين T (وتسمى ICAM1). وبالإضافة إلى ذلك، ومكافحة CD3 النقاط البروتين فصول التوجيه الجامعييتم استبدال دينار مع الأجسام المضادة أو CAM آخر. في حين أننا اخترنا البروتينات لاستخدامها في المستقبل كمنصة لT الدراسات التصاق الخلية، واستراتيجية مفصلة هنا يمكن تكييفها لأي البروتين، وحتى الحمض النووي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تنظيف الزجاج غطاء الشرائح وغرف المراقبة

  1. ترتيب الزجاج غطاء الشرائح على صينية متعدد الشرائح المصنوعة من مادة خاملة مثل تترافلوروإيثيلين (PTFE).
  2. تزج صينية مع الشرائح وغرفة المراقبة في حل السطحي (أي منتج الموصى بها لتنظيف cuvettes الكوارتز هو مناسبة).
  3. استخدام حمام بالموجات فوق الصوتية، فائقة يصوتن في حل السطحي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (ما بين 20 و 30 درجة مئوية).
  4. شطف 5 مرات مع الماء عالى النقاء (18.2 MΩ.cm، 0.059 ميكرو ثانية / سم).
  5. فائقة يصوتن في حل السطحي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (ما بين 20 و 30 درجة مئوية).
  6. شطف 10 مرات مع الماء عالى النقاء.
  7. كرر الخطوات من 1.5 و 1.6 ضعف.
  8. متجر في الماء في درجة حرارة الغرفة (ما بين 20 و 30 درجة مئوية) لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

2. تصنيع البروتين نانو النقاط

  1. ترسب من الخرز
    1. Deposiتي تعليق الخرز السيليكا (2٪ ت / ت، 70 ميكرولتر) قطرة قطرة على غطاء الشريحة (24 × 24 مم، سماكة 170 ميكرون) الذي عقد في الميل 15 درجة.
    2. السماح للتعليق تنتشر لحوالي 1 دقيقة في حين التقليب الزجاج بنسبة 90 درجة كل 15 ثانية.
    3. اترك السائل يتبخر في ظل الظروف المحيطة.
    4. مخزن في كوب نظيف أو غرفة PTFE في الظروف المحيطة لتصل إلى 2 أيام.
  2. ترسب الألومنيوم
    1. ضع الشرائح (المعد في القسم 2.1) داخل تردد الراديو (RF) المغناطيسية المعدات الاخرق 8، على طاولة الدورية على مسافة حوالي 105 ملم من الألومنيوم (99٪): السيليكون (1٪) الهدف.
    2. ضخ أسفل غرفة ترسب إلى 2.6 × 10 -4 باسكال باستخدام مضخة توربو الجزيئية. هذه الخطوة مهمة لإزالة الشوائب الغازية المحتملة.
    3. إدخال الأرجون الجو النقي (5N، 99.999٪) مع تدفق 10 SCCM عند ضغط 0.8 باسكال (6.6 mTorr).
    4. التبديل على مولد للطاقة الترددات اللاسلكية.
      ملاحظة: هنا، تم استخدام مجموعة نموذجية من قوة الترددات الراديوية 400-600 W في 13.56 ميغاهرتز. يستخدم مولد RF مع شبكة مطابقة في وضع اقتران البلازما بالسعة. ويتم رصد قوة ينعكس والتقليل من استخدام التكيف الشبكة.
    5. بعد استقرار البلازما، وتفل لمدة 2 دقيقة الحفاظ على مصراع الكاميرا مغلقة لإزالة الشوائب التي يمكن تقديمها من السطح من الهدف.
    6. فتح مصراع والسماح للالاخرق أن يستمر لمدة 60 دقيقة لإيداع الألومنيوم على شريحة زجاجية لسمك من 200 نانومتر.
    7. قطع تدفق الأرجون، وإغلاق صمام بوابة لعزل مضخة turbomolecular من غرفة خلع وتنفيس الغرفة مع ن نظيفةitrogen للحصول على ضغط الغرفة. استرداد الشرائح الألمنيوم المغلفة. تخزين لمدة تصل الى شهر واحد في كوب أو PTFE مربع نظيفة ومغلقة بإحكام في ظل الظروف المحيطة.
  3. ترسيب البخار من Organosilane
    1. تزج الشريحة الألمنيوم المغلفة التي أعدت في الخطوة 2.2.6 في الماء عالى النقاء في درجة حرارة الغرفة وفائقة يصوتن لمدة 30 ثانية في حمام بالموجات فوق الصوتية (50 W، 50/60 هرتز، ما بين 20 و 30 درجة مئوية).
    2. إيداع 0.5 مل من (3-أمينو) -triethoxysilane (APTES) في الجزء السفلي من مجفف.
      تنبيه: APTES هو organosilane، الذي يتبخر بسهولة وسامة. يجب التعامل مع APTES إلا في ظل تدفق غطاء محرك السيارة ومع القفازات.
    3. وضع الشرائح الزجاجية (المعد في 2.3.1) على شبكة السيراميك ومكان داخل مجفف.
    4. ربط مجفف للمضخة الغشاء وتشغيلها في الطاقة القصوى لمدة 30 دقيقة لتوليد فراغ منخفض.
    5. إغلاق صمام المجفف وإيقاف المضخة.
    6. حرارة المجففإلى حوالي 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    7. فتح مجفف وجمع الشرائح.
    8. نقل إلى مجفف نظيف آخر للتخزين لمدة تصل إلى 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة (20-30 درجة مئوية).
  4. ترسب الطبقة الأولى من البروتين - ألبومين المصل البقري المسمى مع البيوتين (BSA البيوتين)
    1. مكان واحد من الشرائح التي أعدت في القسم 2.3 على دعم PTFE.
    2. إيداع 1 مل من 25 ميكروغرام / مل BSA-البيوتين الذائبة في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). تترك لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (20-30 درجة مئوية).
    3. شطف 10 مرات مع برنامج تلفزيوني. تخزين العينة لمدة تصل إلى 24 ساعة عند 4 درجات مئوية بعيدا عن مصدر الضوء.
  5. إزالة قناع الألومنيوم
    1. احتضان الشرائح في حل من هيدروكسيد الصوديوم في برنامج تلفزيوني (بواسطة قطرة قطرة إضافة 1 M هيدروكسيد الصوديوم على استعداد لحوالي 100 مل PBS الحصول pH≈12) خلال الليل في درجة حرارة الغرفة (ما بين 20 و 30 درجة مئوية).
      الحذر. هيدروكسيد الصوديوم هو تآكل، وينبغي أن يتم التعامل معها باستخدام القفازات.
    2. شطف10 مرات في الماء عالى النقاء.

3. ترسب الدهون المعتمدة طبقة ثنائية (SLB)

  1. تنظيف حوض انجمير
    1. إزالة الماء في العلبة PTFE من الحوض انجمير باستخدام مضخة.
    2. نظيفة مع منشفة القابل للتصرف غير المنسوجة خالية من الوبر غارقة في الكلوروفورم.
      الحذر. الكلوروفورم غير سامة ولا ينبغي التلاعب في منطقة جيدة التهوية، مع قناع (أو تحت التدفق هود) ومع القفازات المناسبة.
    3. نظيفة 4 مرات بالماء الفاتر عالى النقاء (40-50 درجة مئوية).
    4. نظيفة 6 مرات على الأقل مع الماء عالى النقاء البارد.
  2. ترسب طبقة الدهون الأولى
    1. وضع صواني PTFE في العلبة PTFE من الحوض انجمير ثم ملء مع الماء عالى النقاء.
    2. استخدام برنامج حاسوبي لمراقبة الجهاز انجمير لضبط الضغط قياس 0 م ن / م.
    3. استخدام حقنة gastight الزجاج / المعادن لإيداع 30 ميكرولتر من 1 ملغ / مل حل الدهون (12-dioleoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine (DOPC) في الكلوروفورم) على سطح الماء. الكلوروفورم يتبخر وجزيئات الدهون تشكل بشكل عفوي أحادي الطبقة.
    4. استخدام برنامج حاسوبي لمراقبة لضغط أحادي الطبقة الدهنية عن طريق إغلاق حاجز PTFE حتى الضغط المطلوب (27 م ن / م للDOPC) يتم التوصل إليه.
    5. استخدام برنامج حاسوبي لمراقبة الى الانخفاض الشريحة الزجاجية التي أعدت في القسم 2.5.2 في العلبة PTFE باستخدام المشبك الآلية.
    6. عقد الشريحة، في المشبك، عمودي على واجهة بين الهواء والماء. استخدام برنامج حاسوبي لمراقبة لرفعه ببطء (15 مم / دقيقة) من خلال واجهة، مع الحفاظ على ضغط ثابت في 27 م ن / م.
    7. مكان في بيئة جافة إما استخدام الفوري أو لتخزين ما يصل إلى 24 ساعة عند درجة حرارة الغرفة (ما بين 20 و 30 درجة مئوية).
  3. ترسب طبقة الدهون الثانية
    1. الحفاظ على الضغط السطحية في حوض انجمير في القيمة المطلوبة من 27 مليون / م. ضغط باستخدامبرنامج للتحكم في جهاز انجميور و / أو إضافة كمية صغيرة من الدهون لتحقيق الضغط المطلوب.
    2. وضع الشرائح الزجاجية تحمل أحادي الطبقة الدهنية، التي أعدت في القسم 3.2.6، أفقيا على سطح الماء. تأكد من أن كل شريحة يعوم فوق علبة PTFE.
    3. دفع الشرائح الزجاجية أسفل، شريحة واحدة في كل مرة، في علبة لها PTFE المقابلة باستخدام PTFE أو المعدن ملاقط بحيث أنها مغمورة في الماء. تجنب إمالة الشرائح في حين دفع.
    4. استخدام PTFE أو المعدن ملاقط لنقل صواني PTFE التي تحتوي على الشرائح في عرض عاء التبلور مليئة جعل الماء عالى النقاء من أن الشرائح لا تتعرض للهواء.
    5. استخدام PTFE أو المعدن ملاقط لنقل، في الوقت الذي تعمل تحت الماء، وطبقة ثنائية المغلفة شريحة زجاجية إلى غرفة المراقبة.
      ملاحظة: يتم وضع غرفة المراقبة تحت الماء داخل وعاء التبلور. هو العرف غرفة المراقبة ويتكون من حلقة PTFE مع والمطاط طوقاأغلفة الصلب د، والتي يمكن تجميعها تحت الماء لجعل غرفة ضيقة في المياه التي تتم من شريحة زجاجية مغلفة سابقا مع طبقة ثنائية المادة الدهنية السطح السفلي.
    6. إغلاق الغرفة مع الاستمرار في العمل تحت الماء وضمان أن حوالي 1 مل من الماء محاصرين داخل الغرفة.
    7. خذ غرفة تجميعها من الماء. تأكد من خلوه ضيق للماء والتسرب.
    8. استبدال 1 مل من الماء عالى النقاء موجودة في غرفة المراقبة مع برنامج تلفزيوني عن طريق إضافة وإزالة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 10 مرات. تأكد من أن الغرفة هي أبدا خالية من السائل.
  4. SLB خطوة حجب
    1. إدخال 100 ميكروغرام / مل من ألبومين المصل البقري (BSA) في غرفة المراقبة التي تحتوي على شريحة أعدت في القسم 3.3.6 واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (ما بين 20 و 30 درجة مئوية).
    2. شطف طبقة ثنائية عن طريق إزالة وإضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 10 مرات. طبقة ثنائية يمكن أن تبقى 24 ساعة عند 4 درجات مئوية.

4. Functionalization مع الليجندات

  1. إضافة الفلورسنت أو neutravidin غير فلوري (NAV، نسخة deglycosylated من أفيدين لا تحمل في الرقم الهيدروجيني 7) في 2 ميكروغرام / مل في غرفة تحتوي على الشريحة التي أعدت في القسم 3.4.2 لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (ما بين 20 و 30 درجة C).
  2. شطف طريق إضافة وإزالة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 10 مرات.
  3. إضافة المعقدة البيروكسيديز مكافحة CD3 في 2 ميكروغرام / مل إلى غرفة تحتوي على الشريحة التي أعدت في القسم 3.4.2. لfunctionalization المزدوج للSLB والنقاط، إضافة FC-ICAM1 صاحب العلامة في 5 ميكروغرام / مل (هنا، يرصد طبقة ثنائية من DOPC + 1٪ من حامض nitrilotriacetic (NTA) الدهون). تترك لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (ما بين 20 و 30 درجة مئوية).
  4. شطف طريق إضافة وإزالة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 10 مرات
  5. استبدال PBS مع المتوسط ​​خلية (PBS + 0.1٪ BSA) عن طريق إضافة وإزالة 500 ميكرولتر من المتوسطة خلية 10 مرات.
  6. ترك 200 ميكرولتر من المتوسطة خلية في chambeص مع الشريحة.
  7. مكان الغرفة لمدة 10 دقيقة عند 37 ° C قبل أن يضيف الخلايا.

5. ترسب الخليوي (أنظر المرجع 7 لمزيد من التفاصيل)

  1. إيداع بعناية 400 ميكرولتر من تعليق خلية في الغرفة. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  2. إصلاح الخلية مع 2٪ من امتصاص العرق (PFA) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. استبدال PFA مع برنامج تلفزيوني عن طريق إزالة المتكررة وإضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.

6. مراقبة

  1. PROTEO-شحمي نانو نمط وSLB سيولة
    1. استخدام المجهر مضان لصورة نمط البروتين في وضع برنامج التحصين الموسع ومضان باستخدام الطول الموجي المناسب إضاءة (639 نانومتر) ومكعبات فلتر (على سبيل المثال هنا، EX TBP 483 + 564 + 642، BS TFT 506 + 582 + 659، EM TBP 526 + 601 +688).
      ملاحظة: شدة إشارة يمكن كميا لتقدير كمية البروتين داخل وخارج نقطة. استخدام الطول الموجي المناسب إضاءة (330 نانومتر) و fمكعب إلتر لصورة طبقة ثنائية (BP 365/12، FT 395، LP 397)، والذي يظهر مشرق مع الثقوب السوداء.
    2. استخدام المستمر الصورة تبيض (CPB) تقنية 13 و 15 لقياس ثابت نشر الدهون التتبع في طبقة ثنائية. يرصد هذه الملاحظة ويفضل بعد ترسب SLB.
      ملاحظة: من أجل تحديد ثابت الانتشار، يتم قياس معلمتين أثناء عملية CPB: الوقت تبيض معين من الصبغة (مشدود) وطول اضمحلال الشخصية الفلورسنت من الهالة تشكلت حول منطقة المبيض (tauD). يتم الحصول على أول مرة من قبل المتهم بالتآمر في تطور الزمن من شدة مضان في وسط الميدان مضيئة أثناء عملية CPB. يتم الحصول على المركز الثاني قبل المتهم بالتآمر في ملف كثافة على حافة منطقة مضيئة (المتوسط ​​أكثر من 12 خطوط و5 صور بعد التوصل ثابتة للدولة). تم تجهيز منحنيات للحصول مشدود وtauD. الثابت يعطى نشر التي كتبها taUD 2 / مشدود (D = معادلة ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد تم تحليل الصور مضان لقياس المسافات وحجم النقاط. تم العثور على تباعد نموذجي ليكون 1900 ± 80 نانومتر، ونموذجي نقطة بحجم كان 600 ± 100 نانومتر (الشكل 1G). تم تعيين تباعد حسب حجم حبات تستخدم لقناع. يتم تعيين حجم نقطة من حجم حبة فضلا عن ظروف الترسيب. وتودع SLB فريد حول النقاط البروتين وليس عليهم (الشكل 2)، مع التكامل المثالي بين الثقوب ينظر في قناة التصوير SLB والنقاط ينظر في القناة NAV التصوير. تحليل البيانات المستمر تبييض صورة تبين أن نسبة الدهون في طبقة ثنائية منقوشة تبقى السوائل ويكون ثابت نشر نموذجي من 5 μm² / ثانية (الشكل 3).

شكل 1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي من الخطوات تلفيق. (أ -7 عربة، الأرجون تدفق 10 SCCM، الضغط عملية 6.2 mTorr، تصوير في تسريع الجهد من 5 كيلو فولت. الصور تؤكد الملاحظة التي مع المجهر الضوئي (صورة غير مدرجة) قبل ترسب الألمنيوم التي يتم ترتيب الخرز في أحادي الطبقة تركز شعرية سداسية على الزجاج الشرائح. (ب) قناع الثانوي من الألومنيوم التي أنشأتها ترسيب بالرش بعد إزالة الأساسي حبة قناع. (ج) ترسب organosilane وBSA-البيوتين على الرغم من أن قناع الثانوي. (د) إزالة الألمنيوم تكشف نانو النقاط من BSA-البيوتين. (ه) ترسب SLB. (و) ربط التنقل إلى BSA-البيوتين. (ز) ملزم مكافحة CD3 إلى التنقل. يظهر أقحم صورة برنامج التحصين الموسع ومضان من صفائف نانو النقاط. هنا التنقل وfluorescently المسمى. نموذجي نقطة بحجم 600 ± 100 نانومتر، وتباعد النموذجي هو 1900 ± 80 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: التكامل للنانو نقطة ونمط SLB. (أ، ب) وصور برنامج التحصين الموسع ومضان من الفلورسنت NAV نانو النقاط وSLB مع الدهون التتبع الفلورسنت. (ج) صورة مركبة من النقاط NAV (الحمراء) في بحر من SLB (الأخضر) معارض التكامل المثالي من التنقل وSLB. بسرعة تحويل فورييه (الاتحاد الفرنسي للتنس) صورة في أقحم تشير أجل بعيدة المدى. شريط مقياس: 4 ميكرون.rge.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): الكمي لنشر الدهون في SLB. (أ) صورة برنامج التحصين الموسع ومضان من SLB قبل التبييض. تظهر النقاط البروتين تصل الثقوب السوداء كما في بحر المشرق من الدهون. والحجاب الحاجز الحقل يحد من المنطقة المضاءة. (ب) برنامج التحصين الموسع ومضان من SLB بعد تبيض بشكل مستمر لمدة 50 ثانية. الظاهر هالة داخل منطقة محددة من الحجاب الحاجز الحقل يشير إلى أن الدهون هي النقالة. مقياس شريط: 10 ميكرومتر. (ج) متوسط ملف كثافة على طول حافة الحجاب الحاجز الميدان (أعلى) واضمحلال شدة مع مرور الوقت أثناء عملية ملقية (القاع). ويتم تحليل هذه البيانات لاستخراج ثابت نشرها، وهو عادة 5 μm² / ثانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ترتبط الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول المذكورة أعلاه إلى تشكيل البروتين نانو النقاط أو العودة ملء الفضاء حول النقاط التي كتبها طبقة ثنائية الدهون المعتمدة. الخطوة الأولى الحاسمة فيما يتعلق البروتين نانو النقاط هي إعداد حبة قناع. تنظيف غطاء الشريحة أمر بالغ الأهمية. ويجب تنظيف إما بمحلول منظف أن ينصح لتنظيف cuvettes الكوارتز، أو مع البلازما الأكسجين الشرائح. تقنيات التنظيف الأخرى مثل الغمر في الإيثانول أو المعاملة ايزو بروبانول لا تجعل الزجاج محبة للماء بما فيه الكفاية، وبالتالي لا تدعم تشكيل التغطية كبيرة حبة أحادي الطبقة. في الوقت نفسه، على سطح الشريحة يحتاج لتكون متوافقة مع الخطوة التالية من تشكيل SLB التي كتبها انجمير-بلودجيت تقنية 7 و 15 و 16. الخطوة الهامة التالية هي ترسب وإزالة لluminum. إذا ترسب هو عبر تقنية الاخرق، كما فعلت هنا، يجب على الهدف المراد مخدر مع السيليكون (بنسبة 1٪). خلاف ذلك، إذا تم إجراء الهدف من الألمنيوم النقي، وطبقة المودعة من الصعب إزالة مع محلول هيدروكسيد القلوي كما هو موضح أعلاه، وربما يرجع ذلك إلى تكوين أكسيد الألومنيوم وتداخل بين طبقة الألومنيوم المودعة والركيزة شريحة زجاجية. مدة ترسب يحدد حجم النقاط بروتين 9، ومع ذلك، وهنا عملنا مع وقت ترسب واحد، وبالتالي واحد حجم نقطة. ويمكن تخزين العينة في ظل الظروف المحيطة لعدة أشهر بعد ترسب الألومنيوم ولمدة اسبوع تقريبا بعد خلع BSA-البيوتين.

الخطوة الحاسمة الثانية تتعلق ترسب SLB. تنظيف الزجاج غطاء الانزلاق مرة أخرى إلى نقطة في غاية الأهمية. كما هو الحال بالنسبة لأي عمل ترسب انجمير-بلودجيت، وينبغي بذل كل المواد المستخدمة من الزجاج أو بوlytetrafluoroethylene (PTFE)، وينبغي أن تكون نظيفة بدقة. بعد خلع أول أحادي الطبقة الدهنية، و-الشرائح غطاء يمكن تخزينها لبضعة أيام ولكن بعد ترسب أحادي الطبقة الثانية، فإنها تحتاج إلى استخدامها على الفور.

في حين أننا أثبتنا بروتوكول لإنشاء مكافحة CD3 نانو النقاط للاستخدام في الدراسات T اللمفاوية التصاق 9، 13، هذا الإجراء هو درجة عالية من المرونة ويمكن أن تتكيف لأي بروتين المعقدة البيروكسيديز. تكوين طبقة ثنائية المادة الدهنية يمكن تغييرها بسهولة ويمكن زيادة functionalized إذا رغبت في ذلك. وثمة نقطة هامة للنظر هو ممكن امتصاص غير محدد من البروتينات، وخاصة على طبقة ثنائية المادة الدهنية المحيطة النقاط.

القيد الرئيسي للتقنية تنشأ عن استخدام الغروية حبة التجميع الذاتي للقناع الأساسي. كونها تقنية من أسفل إلى أعلى، تشترك معها بعض المشاكل من كل هذه النهجعلى سبيل المثال، عدم وجود المرونة والسيطرة الكاملة على شكل نمط. شعرية نمط تعكس بالضرورة التماثل للقناع حبة، ولذلك فهي دائما سداسية. شكل عزر النمط هو دائرة ويتم تحديدها من قبل مجموعة من حبة حجم ومدة الألومنيوم ترسب 9 و 13. كما تم اقتراح أساليب بديلة للسيطرة على حجم نقطة 14 و 17 و 18.

ركائز أنماط نانو مع البروتينات والبروتين شظايا أو الببتيدات وقد استخدمت على نطاق واسع في الماضي للتحقيق في التفاعلات سطح الخلية، خصوصا التصاق 19 و 20 الهجرة. وقد أظهرت العمل الرائد الذي الخلايا المكونة للنسيج تفشل لنشر على أنماط مع الملعب أكبر من عتبة معينة 21، ومزيد من شو التحقيق الأربعاء أنه تم تعيين مقياس طول هذه الظاهرة حسب حجم talins، التي تؤدي دورا فعالا في ربط مستقبلات إنتغرين إلى الأكتين الهيكل الخلوي 22. ومع ذلك، في كل هذه الدراسات، تم ربط البروتينات إلى الذهب نانو الجسيمات، التي كانوا هم أنفسهم ثبتوا على الزجاج.

في سياق خلايا T، الأغشية PROTEO شحمي، وعادة ما يقلد مستضد الخلايا، وقد استخدمت على نطاق واسع لفهم الجوانب الأساسية للT وظيفة الخلية 6. وقد استخدمت تقنيات النانو الزخرفة بارعة لإنشاء حظائر مع الحواجز المعدنية التي تفصل البروتين functionalized بقع SLB، التي قدمت نظرة ثاقبة هيكل والتواصل بين الخلايا التائية / واجهة APC 23. هذا النوع من الزخرفة النانو هو ولكن مختلفة جدا من البروتين نانو النقاط المقترحة هنا. مؤخرا، تم إنشاؤها نانو مجموعات باستخدام الربط الكيميائي للدهون البروتين functionalizedSS = "XREF"> 3، التي تسلط الضوء على نتيجة لتجمع المستقبل. وكانت ميزة أنه، على عكس الحالة الراهنة، مجموعات يمكن من حيث المبدأ أن يكون أنفسهم المحمول. بيد أن هذه المجموعات شكلت بشكل عفوي وبالضرورة التحكم أقل جودة من حيث الحجم والكثافة من البروتين نانو النقاط شكلت قبل موضح هنا.

ونحن نتوقع أن البروتين عرض SLBs زينت نانو دوت هنا يمكن استخدامها لتحقيق جوانب مختلفة من التصاق الخلية خلية. سؤال واحد واضح الذي يطرح نفسه هو ما إذا كان، كما هو موضح أعلاه لأنسجة الخلايا التي تشكل 19، الخلايا الليمفاوية يكون مفرط جوهري طول على نطاق ويرتبط مع التصاق. ويبدو أن النتائج الأولية تشير إلى أن ما لا يقل عن عندما يتم بوساطة الالتصاق من قبل مجمع TCR، وكثافة بروابط بدلا من التباعد هي المعلمة تحديد لنشر وتفعيل 10، 11، 12 13. إذا كان إدراج بروابط المتنقلة في المناطق المحيطة الآثار SLB هذه الملاحظة وكيف الكسور المتنقلة وغير متحرك معا هو السؤال ممكن، والتي كانت موجهة جزئيا باستخدام SLB مجموعات ملزمة الذاتي تجميعها 24. سيكون تطبيق آخر للاهتمام في سياق والميكانيكية الاستشعار حيث أظهرت التصاق الخلية / التنشيط على بروابط النقالة ويجمد أن تكون مختلفة ليس فقط للخلايا T 7، 25 ولكن أيضا للخلايا التي تلتزم عادة إلى نسيج خارج الخلية 26.

المزايا الرئيسية اثنين من هذه الأنماط PROTEO شحمي هي التوافق من ركائز مع المجهر الضوئي المتطورة وسهولة التحضير مما يجعلها متوافقة مع استخدام التطبيقات ورمي. وبعد ترسب الألومنيوم، ويمكن تنفيذ جميع الخطوات إعداد من على مقاعد البدلاء القياسية الرطب مختبر. في المستقبل، فإنه يمكن تصور أن ويتم نقل حبة أقنعة المدعومة من الزجاج المنتج في منشأة متخصصة وتخزينها في مختبرات علم الأحياء للاستخدام عند الاقتضاء الألمنيوم المغلفة. ومن هذا المنطلق، فإننا نعتقد أن هذه ركائز لديها القدرة على أن تصبح منصة الاختيار لدراسة تفاعل الخلايا مع الأغشية PROTEO شحمي نقوش نانو التي تسيطر عليها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

نشكر لوران Limozin، بيير ديلارد واستريد فاهل لمواصلة مناقشات مثمرة حول التطبيقات الخلوية. كما نشكر فريدريك البدو من مرفق غرف الأبحاث PLANETE لمساعدته مع الملاحظات SEM. وقد تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل مجلس البحوث الأوروبي عبر منحة رقم 307104 FP / 2007-2013 / ERC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass coverslips Assistent, Karl Hecht KG 
Observation chamber Home made
Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) Hella Analytics 9-307-011-4-507
Ultra-sonicator ThermoFisher
Desiccator Labbox
Crystallizer  Shott
Neutravidine Thermo Fischer Scientifique 84607
PBS  Sigma-aldrich P3813
Water MQ  ELGA, Veolia France
Silica beads Corpuscular Inc 147114-10
APTES Sigma-aldrich A3648
BSA-Biotin Sigma-aldrich A8549
DOPC Avanti Polar Lipids 850375C
Dansyl-PE Avanti Polar Lipids 810330C
Chloroform Sigma-aldrich 650471
Gastight syringe  Dominique Dustcher , France 74453
Film balance NIMA Medium
Microscope Zeiss, Germany TIRF-III system
Aluminium Target  Kurt J. Lesker Compagny, USA
Radio Frequency Magnetron sputtering Système  modified SMC 600 tool by ALCATEL , France

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York. (2002).
  2. Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
  3. Kaizuka, Y., et al. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).
  4. Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
  5. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).
  6. Grakoui, A., et al. The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation. Science. 285, 221-228 (1999).
  7. Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells. Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).
  8. Lu, X., et al. Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).
  9. Pi, F., Dillard, P., et al. Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells. Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).
  10. Deeg, J., et al. T cell activation is determined by the number of presented antigens. Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).
  11. Delcassian, D., et al. Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells. Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).
  12. Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays. Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).
  13. Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization. Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).
  14. Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies. Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).
  15. Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion. Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).
  16. Sengupta, K., et al. Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid. Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).
  17. Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography. Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).
  18. Massou, S., et al. Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates. Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).
  19. Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion. Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).
  20. Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).
  21. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  22. Schvartzman, M., et al. Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level. Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).
  23. Mossman, K., Groves, J. Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse. Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).
  24. Furlan, G., et al. Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters. J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).
  25. Hsu, C. J., et al. Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation. PloS One. 7 (2), e32398 (2012).
  26. Yu, C., et al. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 122، بروتين نانو النقاط، nanobiopatterning، نانو مجموعات، دعمت الدهون طبقة ثنائية، nanobiofunctionalization، التصاق الخلية
صالحة يجند نانو الكتلة في الدهن طبقة ثنائية المعتمدة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Benard, E., Pi, F., Ozerov, I.,… More

Benard, E., Pi, F., Ozerov, I., Charrier, A., Sengupta, K. Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer. J. Vis. Exp. (122), e55060, doi:10.3791/55060 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter