Summary
Vi præsenterer en protokol til funktionalisering glas med nanometriske protein patches omgivet af en fluid lipiddobbeltlaget. Disse substrater er kompatible med avanceret optisk mikroskopi og forventes at tjene som platform for celleadhæsion og migrationsundersøgelser.
Abstract
I øjeblikket er der betydelig interesse i at skabe ordnede arrays af selvklæbende protein øer i et hav af passiveret overflade til cellebiologiske studier. I de seneste år er det blevet mere og mere klart, at levende celler reagerer, ikke kun for den biokemiske natur af molekylerne præsenteret for dem, men også til den måde disse molekyler er præsenteret. Oprettelse protein mikro-mønstre er derfor nu standard i mange biologiske laboratorier; nano-mønstre er også mere tilgængelige. Men i forbindelse med celle-celle-interaktioner, er der behov for mønster ikke blot proteiner, men også lipiddobbeltlag. En sådan dual Proteo-lipid mønster har hidtil ikke været let tilgængelige. Vi tilbyder en let teknik til at skabe protein nano-prikker understøttet på glas og foreslå en metode til at efterfylde den inter-dot rum med en understøttet lipid-dobbeltlag (SLB). Fra foto-blegning af sporstof fluorescerende lipider inkluderet i SLB viser vi, at dobbeltlaget udviser betydelige i-plane flydende. Funktionalisering af protein prikker med fluorescerende grupper giver os mulighed for at billedet dem og for at vise, at de er bestilt i en regulær sekskantet gitter. Den typiske punktstørrelse er ca. 800 nm og afstanden demonstreret her er 2 mikrometer. Disse substrater forventes at tjene som nyttige platforme for celleadhæsion, migrering og mekanisk-sensing undersøgelser.
Introduction
Celleadhæsion sker gennem specialiserede celleadhæsionsmolekyler (CAM'er), proteiner til stede på cellemembranen, der er i stand til at binde til deres modpart på den ekstra cellulære matrix eller på en anden celle. På adhærerede celler, de fleste adhæsionsmolekyler, herunder den allestedsnærværende integrin og cadherin, findes i form af klynger 1. Interaktionen af T-lymfocytter (T-celler) med antigenpræsenterende celler (APC'er) tilvejebringer en særlig slående illustration af vigtigheden af receptor klynger dannet ved grænsefladen mellem de to celler - ofte kaldet en immunologisk synapse. Ved dannelse af den første kontakt med APC, T-cellereceptorer (TCR'er) på overfladen af celle formular micron skala klynger T, der tjener som signalering platforme 2, 3, 4, og til sidst centraliserede til dannelse af en større central supramolekylært klynge (cSMAC )lass = "xref"> 5, 6, 7. For nylig blev det vist, at på APC side, er ligander af TCR også klynger 8.
I forbindelse med T-celle-APC-vekselvirkning, indsættelse af hybride systemer, hvor APC efterlignes af en kunstig overflade funktionaliseret med relevante proteiner, har i høj grad avancerede vores forståelse af den synaptiske grænseflade 2, 3, 4, 5, 6, 7 . I denne sammenhæng er det yderst relevant at designe APC mimetiske overflader, der fanger en eller flere aspekter af målcellen. For eksempel, hvis ligander er podet på understøttede lipiddobbeltlag, kan de diffundere i planet af dobbeltlaget, efterligner situationen på APC-overfladen og samtidig tillade dannelse af dencSMAC 6, 7. Ligeledes har klyngerne på APC blevet efterlignet ved at skabe øer af ligander i et hav af polymerer 9, 10, 11, 12, 13, 14. Disse to funktioner er hidtil ikke blevet kombineret,.
Her beskriver vi en ny teknik til at skabe nano-prikker af anti-CD3 (et antistof rettet mod TCR-komplekset) omgivet af et lipiddobbeltlag med spredende lipider. Dobbeltlaget deponeres ved anvendelse Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schaefer teknik 7, 15, 16 og om ønsket kunne være funktionaliseret med et specifikt protein - f.eks liganden af T-integrin (kaldet ICAM1). Hertil kommer de anti-CD3 protein dots could erstattes med et andet antistof eller CAM. Mens vi har valgt de proteiner til fremtidig anvendelse som platform for T-celle vedhæftning undersøgelser, kan den strategi detaljeret her tilpasses til ethvert protein og endda DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rengøring glasafdækning-slides og Observation Chambers
- Arrangere glas cover-glider på en multi-slide bakke fremstillet af et inert materiale, såsom polytetrafluorethylen (PTFE).
- Fordybe bakken med objektglas og observationskammeret i en opløsning af overfladeaktivt middel (ethvert produkt anbefales til rensning kvartskuvetter er egnede).
- Under anvendelse af et ultralydsbad, ultra-sonikat i opløsningen af overfladeaktivt middel i 30 minutter ved stuetemperatur (mellem 20 og 30 ° C).
- Skyl 5 gange med ultrarent vand (18,2 MΩ.cm, 0,059 uS / cm).
- Ultra-soniker i overfladeaktivt opløsning i 30 minutter ved stuetemperatur (mellem 20 og 30 ° C).
- Skyl 10 gange med ultrarent vand.
- Gentage trin 1.5 og 1.6 to gange.
- Opbevares i vand ved stuetemperatur (mellem 20 og 30 ° C) i op til én uge.
2. Fabrikation af Protein Nano-prikker
- Deposition af perler
- depositiont suspensionen af silicaperler (2% vol / vol, 70 uL) dråbe for dråbe på en forside-slide (24 x 24 mm, tykkelse 170 pm) holdt ved en hældning på 15 grader.
- Lad suspensionen spredes i ca. 1 minut, mens flipping glasset ved 90 ° hvert 15. s.
- Lad væsken fordampe under omgivelsesbetingelser.
- Opbevares i et rent glas eller PTFE kammer ved omgivende betingelser i op til 2 dage.
- Aflejring af aluminium
- Objektglassene anbringes (fremstillet i afsnit 2.1) inde i en radiofrekvens (RF) magnetronforstøvning udstyr 8, på et roterende bord i en afstand på ca. 105 mm fra en aluminium (99%): silicium (1%) target.
- Pump down afsætningskammeret til 2,6 x 10 -4 Pa under anvendelse af en turbo-molekylær pumpe. Dette trin er vigtigt for fjernelse af eventuelle gasformige urenheder.
- Indføre ren argonatmosfære (5N, 99,999%) med en flux på 10 sccm ved et tryk på 0,8 Pa (6,6 mTorr).
- Tænd for RF-generator.
BEMÆRK: Her blev en typisk område på 400-600 W radiofrekvent effekt ved 13,56 MHz frekvens, der anvendes. RF generatoren anvendes med en matchende netværk i en kapacitiv plasma koblingsmåde. Den reflekterede effekt overvåges og minimeres ved hjælp af netværket tilpasning. - Efter plasmaet stabiliseres, sputter i 2 min holde lukkeren lukket for at fjerne eventuelle urenheder fra overfladen af målet.
- Åbne lukkeren og tillade sputtering at fortsætte i 60 min for at deponere aluminium på objektglasset til en tykkelse på 200 nm.
- Sender strømmen af argon lukke porten ventil til at isolere turbomolekylarpumpe fra aflejringskammeret og udlufte kammeret med ren nitrogen til opnåelse rummet tryk. Recover aluminium-coatede objektglas. Opbevar i op til en måned i en ren og hermetisk lukket glas eller PTFE kasse under omgivende forhold.
- Pådampning af organosilan
- Nedsænkes aluminium-coatede objektglas fremstillet i trin 2.2.6 i ultrarent vand ved stuetemperatur, og ultra-soniker i 30 sekunder i et ultralydsbad (50 W, 50/60 Hz, mellem 20 og 30 ° C).
- Deponering 0,5 ml (3-aminopropyl) -triethoxysilane (APTES) i bunden af en ekssikkator.
ADVARSEL: APTES er en organosilan, som fordamper let og er giftigt. APTES bør håndteres kun under en strøm-hætte og med handsker. - Sætte objektglas (fremstillet i 2.3.1) på et keramisk gitter og sted inde i ekssikkatoren.
- Tilslut exsikkatoren til en membranpumpe og kørt ved maksimal effekt i 30 min for at generere et lavt vakuum.
- Luk ventilen af ekssikkatoren og slukke pumpen.
- Varm ekssikkatorentil ca. 50 ° C i 1 time.
- Åbn ekssikkator og indsamle dias.
- Overførsel til en anden ren ekssikkator til lagring af op til 48 timer ved stuetemperatur (20 til 30 ° C).
- Aflejring af første lag af protein - bovint serumalbumin mærket med biotin (BSA-biotin)
- Placer en af de dias udarbejdet i afsnit 2.3 på en PTFE støtte.
- Deponering 1 ml 25 pg / ml BSA-biotin opløst i phosphatpufret saltvand (PBS). Efterlad i 30 minutter ved stuetemperatur (20 til 30 ° C).
- Skylles 10 gange med PBS. Prøven opbevares i op til 24 timer ved 4 ° C væk fra lyskilden.
- Fjernelse af aluminium maske
- Glassene inkuberes i en opløsning af NaOH i PBS (fremstillet ved dråbevis tilsætning af 1 M NaOH til ca. 100 ml PBS for at opnå pH≈12) natten over ved stuetemperatur (mellem 20 og 30 ° C).
ADVARSEL. NaOH er ætsende og skal håndteres ved anvendelse af handsker. - Skylle10 gange i ultrarent vand.
- Glassene inkuberes i en opløsning af NaOH i PBS (fremstillet ved dråbevis tilsætning af 1 M NaOH til ca. 100 ml PBS for at opnå pH≈12) natten over ved stuetemperatur (mellem 20 og 30 ° C).
3. Deponering af Understøttet lipiddobbeltlag (SLB)
- Rengøring af Langmuir trug
- Fjerne vandet i PTFE indeslutning af Langmuir truget anvendelse af en pumpe.
- Ren med en fnugfri ikke-vævede engangs håndklæde dyppet i chloroform.
ADVARSEL. Chloroform er toksiske og skal manipuleres i et godt ventileret område, med en maske (eller under en strøm-hætte) og med egnede handsker. - Ren 4 gange med lunkent ultrarent vand (40 til 50 ° C).
- Ren mindst 6 gange med koldt ultrarent vand.
- Afsætning af det første lipidlag
- Placere PTFE bakker i PTFE indeslutning af Langmuir truget og derefter fylde den med ultrarent vand.
- Bruge styresoftware af Langmuir apparatet for at indstille det målte tryk til 0 mN / m.
- Brug en gastæt glas / metal sprøjte for at deponere 30 pi af en 1 mg / ml lipidopløsning (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) i chloroform) på overfladen af vandet. Chloroformen fordamper og lipidmolekyler danner spontant et monolag.
- Brug styresoftwaren at komprimere lipidmonolaget ved at lukke PTFE barriere indtil det ønskede tryk (27 mN / m for DOPC) er nået.
- Brug styresoftwaren at dyppe objektglas fremstillet på punkt 2.5.2 i PTFE indelukke anvendelse af en motoriseret klemme.
- Holde slæden, i klemmen, vinkelret på luft-vand-grænsefladen. Brug styresoftwaren for at hæve det langsomt (15 mm / min) gennem grænsefladen, og samtidig opretholde et konstant tryk på 27 mN / m.
- Sted i et tørt miljø for enten øjeblikkelig brug eller til opbevaring op til 24 timer ved stuetemperatur (mellem 20 og 30 ° C).
- Afsætning af det andet lipidlag
- Opretholde fladetrykket i Langmuir truget på den ønskede værdi på 27 mN / m. Komprimere ved hjælp afstyresoftware af Langmuir apparat og / eller tilføje en lille mængde af lipid for at opnå det ønskede tryk.
- Placer objektglas der bærer lipidmonolaget, fremstillet i afsnit 3.2.6, vandret på overfladen af vandet. Sikre, at hver slæde flyder over en PTFE bakke.
- Skubbe objektglas ned, lysbilleder ad gangen, til den tilsvarende PTFE skuffen med PTFE eller metal pincet, således at de er nedsænket i vandet. Undgå at vippe dias, mens du trykker.
- Brug PTFE eller metal pincet til at overføre PTFE bakker, der indeholder de glider ind en krystallisator fyldt med ultrarent vand og sørg for, at de glider ikke udsættes for luft.
- Anvende PTFE eller metal pincet til at overføre, mens de arbejder under vandet, et dobbeltlag overtrukket objektglas i en observation kammer.
BEMÆRK: Observation kammer sættes under vand i krystallisatoren. Observationskammeret er specialfremstillet og består af en PTFE ring med en gummipakning end tarme stål, som kan samles under vandet til at foretage en vandtæt kammer hvis bundflade er lavet af objektglasset tidligere overtrukket med lipiddobbeltlaget. - Kammeret lukkes samtidig med at arbejde under vand og sikre, at ca. 1 ml vand er fanget inde i kammeret.
- Tag den samlede kammer ud af vandet. Sørg for, at det er vandtæt og lækage fri.
- Erstatte de 1 ml ultrarent vand til stede i observationskammeret med PBS ved at tilføje og fjerne 500 pi PBS 10 gange. Sikre, at kammeret er aldrig fri for væske.
- SLB blokeringstrin
- Indføre 100 pg / ml bovint serumalbumin (BSA) i observationskammeret indeholdende slæden fremstillet i afsnit 3.3.6 og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur (mellem 20 og 30 ° C).
- Skyl dobbeltlaget ved at fjerne og tilsætning af 500 pi PBS 10 gange. Dobbeltlaget kan holdes 24 timer ved 4 ° C.
4. Funktionalisering med Ugander
- Tilføj fluorescerende eller ikke-fluorescerende neutravidin (NAV, en deglycosyleret version af avidin ikke ladet ved pH 7) ved 2 ug / ml ind i kammeret indeholdende objektglasset fremstillet i afsnit 3.4.2 i 30 minutter ved stuetemperatur (mellem 20 og 30 ° C).
- Skyl ved at tilføje og fjerne 500 pi PBS 10 gange.
- Tilføje biotinyleret anti-CD3 ved 2 ug / ml til kammeret indeholdende objektglasset fremstillet i afsnit 3.4.2. For dobbelt funktionalisering af SLB og prikkerne, tilføje Fc-ICAM1 His-mærke ved 5 pg / ml (her er dobbeltlaget lavet af DOPC + 1% af nitrilotrieddikesyre (NTA) lipider). Efterlad i 30 minutter ved stuetemperatur (mellem 20 og 30 ° C).
- Skyl ved at tilføje og fjerne 500 pi PBS 10 gange
- Erstatte PBS med cellemedium (PBS + 0,1% BSA) ved at tilføje og fjerne 500 pi cellemediet 10 gange.
- Efterlad 200 gi celle medium i chamber med glideren.
- Placer kammer i 10 minutter ved 37 ° C før tilsætning celler.
5. Cell Deposition (se reference 7 for detaljer)
- deponere omhyggeligt 400 pi af cellesuspensionen ind i kammeret. Inkubere cellerne i 30 minutter ved 37 ° C.
- Fiksere cellelaget med 2% paraformaldehyd (PFA) i 15 minutter ved 37 ° C. Erstatte PFA med PBS ved gentagen fjernelse og tilsætning af 500 pi PBS.
6. Observation
- Proteo-lipid Nano-mønster og SLB fluiditet
- Bruge et fluorescensmikroskop at afbilde protein mønster i epi-fluorescens-tilstand ved hjælp passende belysningsbølgelængde (639 nm) og filter terninger (f.eks her, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688).
BEMÆRK: Intensiteten af signalet kan kvantificeres at estimere mængden af protein i og uden for prik. Bruge en passende belysningsbølgelængde (330 nm) og filter terning til billedet dobbeltlaget (BP 365/12, FT 395, LP 397), som fremtræder lyst med mørke huller. - Anvende kontinuerlig fotoblegning (CPB) teknikken 13, 15 til at måle diffusionskonstant tracer lipider i dobbeltlaget. Denne iagttagelse er fortrinsvis fremstillet lige efter SLB aflejring.
BEMÆRK: For at kvantificere diffusionskonstanten, er to parametre målt under CPB processen: den specifikke blegning tid af farvestoffet (stramt) og henfaldet længde af det fluorescerende profil af halo dannes omkring bleget område (TAUD). Den første opnås ved at afbilde tidsudvikling fluorescensintensiteten ved midten af den belyste felt under CPB processen. Den anden er opnået ved at afbilde intensitetsprofilen ved kanten af den belyste zone (gennemsnit over 12 linjer og 5 billeder efter steady-state er nået). Kurverne er monteret for at opnå stram og TAUD. Diffusionskonstanten er givet ved taUD 2 / Taut (D =
).
- Bruge et fluorescensmikroskop at afbilde protein mønster i epi-fluorescens-tilstand ved hjælp passende belysningsbølgelængde (639 nm) og filter terninger (f.eks her, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688).
). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescens billeder blev analyseret for at måle afstanden og størrelsen af prikker. Typisk mellemrum blev fundet at være 1.900 ± 80 nm og typisk dot-størrelse var 600 ± 100 nm (figur 1 g). Afstanden indstilles ved størrelsen af perlerne anvendes til masken. Dot-størrelse indstilles af perle-størrelse samt aflejringsbetingelser. SLB aflejres entydigt omkring protein prikker og ikke på dem (figur 2), med perfekt komplementaritet mellem hullerne set i SLB billeddannelse kanal og prikkerne set i NAV imaging kanal. Analyse af kontinuerlig fotoblegning data viser, at lipiderne i den mønstrede dobbeltlag forbliver flydende og har en typisk diffusionskonstant af 5 μm² / s (figur 3).
Figur 1: Skematisk repræsentation af fabrikationstrin. (en -7 Torr, Argon flux 10 sccm, procestrykket 6,2 mTorr, afbildet ved acceleration spænding på 5 kV. Billederne bekræfter bemærkning med optisk mikroskopi (billedet ikke inkluderet) før aluminium deposition at perlerne er anbragt i et monolag centreret sekskantet gitter på glas-objektglas. (B) Sekundær maske af aluminium skabt af katodeforstøvningsafsætning efter fjernelse af den primære perle-maske. (C) Afsætning af organosilan og BSA-biotin selvom den sekundære maske. (D) Fjernelse af aluminium afslørende nano-prikker af BSA-biotin. (E) Afsætning af SLB. (F) Binding NAV til BSA-biotin. (G) Binding anti-CD3 til NAV. Indsat viser epi-fluorescens billede af nano-prikker arrays. Her NAV fluorescens-mærket. Typisk dot-størrelse er 600 ± 100 nm og typisk afstand er 1.900 ± 80 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Komplementaritet af nano-prik og SLB mønster. (A, b) Epi-fluorescensbilleder af fluorescerende NAV nano-prikker og af SLB med fluorescerende tracer lipider. (C) Sammensat billede af nav prikker (røde) i havet af SLB (grøn) viser perfekt komplementaritet af Nav og SLB. Fast Fourier Transform (FFT) billede i det indsatte indikerer langtrækkende orden. Skalasøjle: 4 um.rge.jpg" target = '_ blank'> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kvantificering af lipid diffusion i SLB. (A) Epi-fluorescens billede af en SLB før blegning. Protein- prikker viser sig som mørke huller i en lys hav af lipider. Feltet-membran begrænser det belyste område. (B) Epi-fluorescens af SLB efter blegning kontinuerligt i 50 s. Halo synlige inden i regionen afgrænset af field-membran indikerer, at lipiderne er mobile. Skalasøjle: 10 um. (C) Gennemsnitlig intensitetsprofil langs markkanten-membran (øverst) og henfaldet af intensitet over tid under strandværfter fremgangsmåde (nederst). Disse data analyseres for at udtrække diffusionskonstanten, som typisk er 5 μm² / s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiske trin i protokollen ovenfor beskrevne er relateret til dannelsen af protein-nano-prikker eller back-fyldning af rummet omkring prikkerne af et understøttet lipiddobbeltlaget. Den første kritiske trin i forhold til protein nano-prikker er fremstillingen af den perle-maske. Rensningen af dækslet-slide er kritisk. Objektglassene skal enten renses med en detergentopløsning, der anbefales til rengøring kvartskuvetter eller med oxygenplasma. Andre rengøring teknikker som nedsænkning i ethanol eller iso-propanol behandling ikke gør glasset tilstrækkeligt hydrofile og støtter derfor ikke dannelsen af en stor dækning perle monolag. På samme tid, kan overfladen af objektglasset skal være forenelig med det efterfølgende trin af dannelse af SLB ved Langmuir-Blodgett teknik 7, 15, 16. Den næste kritiske trin er aflejringen og fjernelse af enluminum. Hvis aflejringen er via katodeforstøvningsteknik, som gjort her, målet bør være doteret med silicium (ved 1%). Ellers, hvis målet er lavet af ren aluminium, det afsatte lag er svært at fjerne med den alkalihydroxidopløsning som beskrevet ovenfor, sandsynligvis på grund af dannelsen af aluminiumoxid og den gensidige mellem aflejret aluminiumlag og objektglasset substrat. Varigheden af aflejring bestemmer størrelsen af det protein prikker 9, men her vi har arbejdet med en enkelt deposition tid, og derfor enkelt punktstørrelse. Prøven kan opbevares under omgivelsesbetingelser i flere måneder efter aluminium aflejring og for ca. en uge efter aflejringen af BSA-biotin.
Det andet afgørende trin vedrører aflejring af SLB. Rengøring af glasset cover-slide er igen en afgørende vigtigt punkt. Som det er tilfældet for enhver Langmuir-Blodgett deposition arbejde, bør alle anvendte materiale være fremstillet af glas eller Polytetrafluoroethylene (PTFE) og bør være omhyggeligt rene. Efter afsætning af den første lipidmonolaget kan dække-objektglas opbevares i et par dage, men efter aflejringen af den anden monolag, de skal anvendes straks.
Mens vi har vist protokollen til at skabe anti-CD3 nano-prikker til anvendelse i T-lymfocyt adhæsion undersøgelser 9, 13, er proceduren meget fleksibel og kan tilpasses til enhver biotinyleret protein. Sammensætningen af lipiddobbeltlaget kan let ændres, og det kan yderligere funktionaliseres om ønsket. Et vigtigt punkt at overveje er mulig uspecifik absorption af proteiner, især på lipiddobbeltlaget omgiver prikker.
Den væsentligste begrænsning af teknikken opstår ved anvendelse af kolloid-perle selvsamling for den primære maske. At være en bottom-up-teknik, det deler nogle af problemerne ved alle sådanne tilgangefor eksempel manglende fleksibilitet og fuld kontrol over mønstret form. Mønstret gitter nødvendigvis afspejler symmetrien af perlen maske og er derfor altid sekskantet. Formen på det mønster motivet er en cirkel og bestemmes af en kombination af perle-størrelse og varigheden af aluminium deposition 9, 13. Alternative teknikker til styring af punktstørrelsen er også blevet foreslået 14, 17, 18.
Substrater nano-mønstre med proteiner, protein-fragmenter eller peptider er blevet udbredt anvendt i fortiden for at sondere celleoverflade-interaktioner, især adhæsion 19 og migration 20. Pionerarbejde har vist, at vævsdannende celler ikke spredes på mønstre med en stigning større end en given tærskel 21, og yderligere undersøgelser sho wed at længden målestok af dette fænomen er indstillet af størrelsen af Talins, som er medvirkende til at knytte integrinreceptorer til actincytoskelettet 22. Men i alle disse studier blev proteinerne bundet til guld nanopartikler, der i sig selv blev immobiliseret på glas.
I forbindelse med T-celler, Proteo-lipid membraner, der typisk efterlignende antigenpræsenterende celler, er blevet grundigt bruges til at forstå grundlæggende aspekter af T-cellefunktion 6. Opfindsomme nano-mønstringsteknikker teknikker har været brugt til at skabe corrals med metal barrierer separere protein funktionaliserede SLB patches, som har givet indsigt i strukturen og tilslutning af T celle / APC-grænsefladen 23. Denne form for nano-mønster er dog meget forskellig fra protein nano-prikker foreslås her. For nylig blev nano- klynger skabt ved hjælp af kemisk binding af protein-funktionaliserede lipiderss = "xref"> 3, der belyser konsekvensen af receptor klyngedannelse. Fordelen var, at i modsætning til den foreliggende sag, kunne de klynger i princippet være sig selv mobil. Imidlertid er sådanne spontant dannede klynger nødvendigvis mindre velkontrolleret med hensyn til størrelse og tæthed end præformede protein nano-prikker beskrevet her.
Vi forestiller os, at proteinet nano-prik dekorerede SLBs præsenteres her kan bruges til at undersøge forskellige aspekter af celle-celle-adhæsion. Et oplagt Spørgsmålet er, om, som beskrevet ovenfor for væv danner celler 19, lymfocytter også har en iboende længde målestok forbundet med adhæsion. Foreløbige resultater tyder på, at i det mindste når adhæsion medieres af TCR-komplekset, tætheden af ligander snarere end afstand er den definerende parameter for spredning og aktivering 10, 11, 12
De to vigtigste fordele ved disse Proteo-lipid mønstre er forenelighed mellem substrater med avanceret optisk mikroskopi og lette fremstilling, hvilket gør dem kompatible med brug-og-smid-applikationer. Efter aluminium aflejring, kan alle trin præparatet udføres på en standard våd-laboratoriearbejdet. I fremtiden kan det være muligt, at aluminium-coatede og glas-understøttet perle-masker fremstillet på en specialafdeling overføres og lagres i biologiske laboratorier til brug, når behovet. Med dette for øje, mener vi, at disse substrater har potentiale til at blive den foretrukne platform for at studere samspillet mellem celler med kontrollerede nano-mønstrede Proteo-lipid membraner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Laurent Limozin, Pierre Dillard og Astrid Wahl for fortsat frugtbare diskussioner om cellulære applikationer. Vi takker også Frederic Bedu fra PLANETE renrum for hans hjælp med SEM observationer. Dette arbejde blev delvist finansieret af Det Europæiske Forskningsråd via tilskud nr 307.104 FP / 2007-2013 / ERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | ||
| Observation chamber | Home made | ||
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 | |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | ||
| Desiccator | Labbox | ||
| Crystallizer | Shott | ||
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 | |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 | |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | ||
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 | |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 | |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C | |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 | |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 | |
| Film balance | NIMA | Medium | |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system | |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | ||
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
References
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York. (2002).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Kaizuka, Y., et al. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
- Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).
- Grakoui, A., et al. The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation. Science. 285, 221-228 (1999).
- Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells. Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).
- Lu, X., et al. Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).
- Pi, F., Dillard, P., et al. Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells. Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).
- Deeg, J., et al. T cell activation is determined by the number of presented antigens. Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).
- Delcassian, D., et al. Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells. Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).
- Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays. Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).
- Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization. Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).
- Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies. Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).
- Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion. Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).
- Sengupta, K., et al. Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid. Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).
- Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography. Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).
- Massou, S., et al. Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates. Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).
- Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion. Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).
- Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Schvartzman, M., et al. Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level. Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).
- Mossman, K., Groves, J. Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse. Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).
- Furlan, G., et al. Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters. J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).
- Hsu, C. J., et al. Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation. PloS One. 7 (2), e32398 (2012).
- Yu, C., et al. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).
