Summary
Nous présentons un protocole pour fonctionnaliser verre avec des taches de protéines nanométriques entourées par une bicouche lipidique fluide. Ces substrats sont compatibles avec la microscopie optique de pointe et devraient servir de plate-forme pour les études d'adhésion cellulaire et la migration.
Abstract
À l'heure actuelle, il y a un intérêt considérable dans la création de réseaux ordonnés d'îlots de protéines adhésives dans une mer de surface passivée pour les études biologiques cellulaires. Au cours des dernières années, il est devenu de plus en plus clair que les cellules vivantes répondent, non seulement à la nature biochimique des molécules qui leur sont présentées, mais aussi à la façon dont ces molécules sont présentées. Création de micro-motifs de protéines est donc maintenant la norme dans de nombreux laboratoires de biologie; nano-modèles sont également plus accessibles. Cependant, dans le contexte des interactions cellule-cellule, il est nécessaire de modèle non seulement des protéines, mais aussi des bicouches lipidiques. Un tel double patterning proteo-est jusqu'à présent lipidique pas été facilement accessible. Nous vous proposons une technique facile pour créer des protéines nano-points pris en charge sur le verre et de proposer une méthode pour remblayer l'espace inter-points avec une bicouche lipidique pris en charge (SLB). De photo-blanchiment de lipides fluorescents traceur inclus dans le SLB, nous démontrons que la double couche présente beaucoup en plane fluidité. Fonctionnaliser les points de protéines avec des groupes fluorescents permet d'imager eux et de montrer qu'ils sont ordonnés dans un réseau hexagonal régulier. La taille de point typique est d'environ 800 nm et l'espacement montré ici est de 2 microns. Ces substrats sont censés servir de plates-formes utiles pour l'adhésion cellulaire, la migration et les études mécano-détection.
Introduction
L'adhésion cellulaire a lieu par l'intermédiaire des molécules d'adhésion de cellules spécialisées (CAMs), des protéines présentes sur la membrane cellulaire qui sont capables de se lier à leur homologue sur la matrice extra-cellulaire ou sur une autre cellule. Sur les cellules adhérées, la plupart des molécules d'adhésion , y compris l'intégrine ubiquitaire et cadhérine, se trouvent sous la forme de groupes 1. L'interaction des lymphocytes T (cellules T) avec des cellules présentant l'antigène (APC) fournit une illustration particulièrement frappante de l'importance des amas de récepteurs formés à l'interface entre les deux cellules - souvent appelé une synapse immunologique. Lors de la formation du premier contact avec les APC, les récepteurs des cellules T (TCR) sur la surface de la forme de cellules T microns grappes d'échelle qui servent de plates - formes de signalisation 2, 3, 4, et sont finalement centralisé pour former un cluster supramoléculaire centrale plus grande (cSMAC )lass = "xref"> 5, 6, 7. Récemment, il a été montré que, du côté APC, les ligands de TCR sont également regroupés 8.
Dans le contexte de l' interaction des cellules T-APC, le déploiement de systèmes hybrides, où l'APC est imitée par une surface artificielle fonctionnalisés avec des protéines pertinentes, a considérablement fait progresser notre compréhension de l'interface synaptique 2, 3, 4, 5, 6, 7 . Dans ce contexte, il est très utile pour concevoir des surfaces APC mimétiques qui capturent un ou plusieurs aspects de la cellule cible. Par exemple, si les ligands sont greffés sur bicouches lipidiques pris en charge, ils peuvent diffuser dans le plan de la double couche, imiter la situation sur la surface APC et en même temps permettre la formation ducSMAC 6, 7. De même, les clusters sur l'APC ont été mimé par la création d' îlots de ligands dans une mer de polymères 9, 10, 11, 12, 13, 14. Cependant, ces deux caractéristiques ont jusqu'à présent pas été combinées.
Nous décrivons ici une nouvelle technique pour créer des nano-points de l'anti-CD3 (un anticorps qui cible le complexe TCR) entouré par une bicouche lipidique avec des lipides diffusants. La bicouche est déposé à l' aide de Langmuir-Blodgett / technique de Langmuir-Schaefer 7, 15, 16 et , si on le souhaite, peut être fonctionnalisé avec une protéine spécifique - par exemple, le ligand de l'intégrine de la cellule T (appelé ICAM - 1). De plus, les points de protéine anti-CD3 COUld être remplacé par un autre anticorps ou CAM. Alors que nous avons choisi les protéines pour une utilisation future en tant que plate-forme pour les études d'adhésion des cellules T, la stratégie ici détaillée peut être adaptée pour toute protéine et même l'ADN.
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Protocol
1. diapositives Cover-verre Nettoyage et Chambres d'observation
- Disposer les lames de couvre-objet sur un plateau-diapositive multiple constituée d'un matériau inerte tel que polytétrafluoroéthylène (PTFE).
- Immerger le plateau avec les diapositives et la chambre d'observation dans une solution d'agent tensio-actif (un produit recommandé pour le nettoyage des cuvettes de quartz est approprié).
- En utilisant un bain à ultrasons, ultra-sonication dans la solution d'agent tensio-actif pendant 30 min à température ambiante (entre 20 et 30 ° C).
- Rincer 5 fois avec de l'eau ultrapure (18,2 MΩ.cm, 0.059 uS / cm).
- Ultra-sonication dans une solution d'agent tensio-actif pendant 30 min à température ambiante (entre 20 et 30 ° C).
- Rincer 10 fois avec de l'eau ultra pure.
- Répétez les étapes 1,5 et 1,6 fois.
- Magasin dans l'eau à température ambiante (entre 20 et 30 ° C) pendant jusqu'à une semaine.
2. Fabrication de protéines Nano-points
- Le dépôt de perles
- Deposit la suspension de billes de silice (2% v / v, 70 uL) goutte à goutte sur un couvercle coulissant (24 x 24 mm, épaisseur 170 um) maintenus à une inclinaison de 15 degrés.
- Laissez la suspension répandre pendant environ 1 min tout en feuilletant le verre de 90 ° tous les 15 s.
- Laisser le liquide à évaporer dans les conditions ambiantes.
- Conserver dans un verre propre ou une chambre de PTFE dans les conditions ambiantes pendant 2 jours.
- Dépôt d'aluminium
- Placer les lames (préparé dans la section 2.1) à l' intérieur d' une fréquence radio (RF) l' équipement de pulvérisation cathodique à magnétron 8, sur une table rotative à une distance d'environ 105 mm à partir d'aluminium (99%): silicium (1%) cible.
- Pomper la chambre de dépôt à 2,6 x 10 -4 Pa à l' aide d' une pompe turbo-moléculaire. Cette étape est importante pour l'élimination des impuretés gazeuses possibles.
- L'introduction d'air pur argon (5N, 99,999%) avec un flux de 10 sccm sous une pression de 0,8 Pa (6,6 mTorr).
- Allumez le générateur de puissance RF.
REMARQUE: Ici, une gamme typique de 400-600 W puissance radiofréquence à la fréquence 13,56 MHz a été utilisé. Le générateur RF est utilisé avec un réseau d'adaptation à un mode de couplage plasma capacitif. La puissance réfléchie est contrôlée et réduite au minimum en utilisant l'adaptation de réseau. - Après que le plasma est stabilisé par pulvérisation pendant 2 minutes en gardant l'obturateur fermé pour éliminer les impuretés à partir de la surface de la cible.
- Ouvrir l'obturateur et permettre à la pulvérisation cathodique se poursuivre pendant 60 min à déposer l'aluminium sur la lame de verre à une épaisseur de 200 nm.
- Couper le flux d'argon, fermer la vanne pour isoler la pompe turbomoléculaire à partir de la chambre de dépôt et de ventilation de la chambre avec n propreitrogen pour obtenir la pression ambiante. Récupérer les lames recouvertes d'aluminium. Stocker jusqu'à un mois dans un verre propre et hermétique ou une boîte PTFE dans des conditions ambiantes.
- dépôt en phase vapeur d'organosilane
- Immerger la lame revêtue d'aluminium préparé dans l'étape 2.2.6 dans l'eau ultra-pure à la température ambiante et ultra-sonication pendant 30 s dans un bain à ultrasons (50 W, 50/60 Hz, entre 20 et 30 ° C).
- Dépôt de 0,5 ml de (3-aminopropyl) -triéthoxysilane (APTES) au fond d'un dessiccateur.
ATTENTION: APTES est un organosilane, qui s'évapore facilement et est toxique. APTES doivent être manipulés que sous une hotte à flux et avec des gants. - Placer les lames de verre (préparé en 2.3.1) sur une grille en céramique et place à l'intérieur du dessiccateur.
- Connecter le dessiccateur à une pompe à membrane et de fonctionner à la puissance maximale pendant 30 min pour produire un vide faible.
- Fermez la vanne du dessicateur et éteindre la pompe.
- Chauffer le dessicateurà environ 50 ° C pendant 1 h.
- Ouvrez le dessicateur et recueillir les diapositives.
- Transfert à un autre dessicateur propre pour le stockage jusqu'à 48 h à la température ambiante (20 à 30 ° C).
- Le dépôt de la première couche de protéine - sérum-albumine bovine marquée à la biotine (BSA-biotine)
- Placez l'une des lames préparées à la section 2.3 sur un support en PTFE.
- Dépôt de 1 ml de 25 pg / ml de BSA-biotine dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Laisser pendant 30 min à température ambiante (20 à 30 ° C).
- Rincer 10 fois avec du PBS. Stocker l'échantillon pendant 24 h à 4 ° C à une distance de la source lumineuse.
- Retrait du masque en aluminium
- Incuber les lames dans une solution de NaOH dans du PBS (préparé par addition goutte à goutte de NaOH 1 M à environ 100 mL de PBS pour obtenir pH≈12) à la température ambiante pendant une nuit (entre 20 et 30 ° C).
MISE EN GARDE. NaOH est corrosif et doit être manipulée avec des gants. - Rincer10 fois dans l'eau ultra pure.
- Incuber les lames dans une solution de NaOH dans du PBS (préparé par addition goutte à goutte de NaOH 1 M à environ 100 mL de PBS pour obtenir pH≈12) à la température ambiante pendant une nuit (entre 20 et 30 ° C).
3. Dépôt de prise en charge lipidique en deux couches (SLB)
- Nettoyage de la cuvette de Langmuir
- Retirer l'eau dans l'enceinte de PTFE de la cuve de Langmuir en utilisant une pompe.
- Nettoyer avec une serviette jetable non-tissé non pelucheux trempé dans du chloroforme.
MISE EN GARDE. Le chloroforme est toxique et doit être manipulé dans une zone bien ventilée, avec un masque (ou un sous-hotte à flux) et avec des gants appropriés. - Nettoyer 4 fois avec de l'eau ultrapure tiède (40 à 50 ° C).
- Nettoyer au moins 6 fois avec de l'eau froide ultrapure.
- Le dépôt de la première couche lipidique
- Placez les plateaux de PTFE dans l'enceinte de PTFE de la cuve de Langmuir puis le remplir avec de l'eau ultrapure.
- Utiliser le logiciel de commande de l'appareil de Langmuir pour régler la pression mesurée à 0 mN / m.
- Utiliser une seringue en verre étanche au gaz / métal à déposer 30 ul d'une solution de lipides de 1 mg / mL (1, 2-dioleoyl- sn - glycéro-3-phosphocholine (DOPC) dans du chloroforme) sur la surface de l'eau. Le chloroforme et évapore les molécules lipidiques se forment spontanément une monocouche.
- Utiliser le logiciel de commande pour comprimer la monocouche lipidique par la fermeture de la barrière de PTFE jusqu'à la pression désirée (27 mN / m pour DOPC) est atteinte.
- Utiliser le logiciel de commande pour tremper la lame de verre préparée dans la section 2.5.2 dans l'enceinte PTFE à l'aide d'une pince motorisée.
- Maintenir la glissière, dans la pince, perpendiculairement à l'interface air-eau. Utiliser le logiciel de commande pour le porter lentement (15 mm / min) à travers l'interface, tout en maintenant une pression constante à 27 mN / m.
- Placer dans un environnement sec soit pour une utilisation immédiate ou pour le stockage jusqu'à 24 h à température ambiante (entre 20 et 30 ° C).
- Le dépôt de la seconde couche lipidique
- Maintenir la pression de surface dans la cuve de Langmuir à la valeur désirée de 27 mN / m. Compresser en utilisant laun logiciel de commande de l'appareil de Langmuir et / ou ajouter une petite quantité de lipides pour obtenir la pression souhaitée.
- Placer les lames de verre portant la monocouche lipidique, préparé dans la section 3.2.6, horizontalement sur la surface de l'eau. Assurez-vous que chaque lame est flottant au-dessus d'un plateau de PTFE.
- Appuyez sur les lames de verre vers le bas, une lame à la fois, dans son bac de PTFE correspondant en utilisant des pinces en PTFE ou en métal de telle sorte qu'ils sont immergés dans l'eau. Évitez d'incliner les diapositives tout en poussant.
- Utiliser des pinces en PTFE ou en métal pour transférer les plateaux de PTFE contenant les lames dans un cristallisoir rempli d'eau ultrapure faire en sorte que les lames ne sont pas exposés à l'air.
- Utiliser des pinces en PTFE ou en métal pour transférer, tout en travaillant sous l'eau, une lame de verre revêtue de deux couches dans une chambre d'observation.
REMARQUE: La chambre d'observation est placée sous l'eau à l'intérieur du cristalliseur. La chambre d'observation est fait sur mesure et se compose d'une bague de PTFE avec un joint en caoutchoucd boîtiers en acier, qui peuvent être assemblés sous l'eau pour faire une chambre étanche à l'eau dont la surface inférieure est réalisée à partir de la lame de verre préalablement revêtu avec la bicouche lipidique. - Fermez la chambre tout en continuant à travailler sous l'eau et veiller à ce que environ 1 ml d'eau est piégé dans la chambre.
- Prendre la chambre assemblé hors de l'eau. Assurez-vous que ce soit et sans fuite étanche à l'eau.
- Remplacer les 1 ml d'eau présente ultrapure dans la chambre d'observation avec du PBS en ajoutant et en enlevant 500 ul de PBS 10 fois. Assurez-vous que la chambre est jamais dépourvue de liquide.
- étape de blocage SLB
- Introduire 100 ug / ml d'albumine de sérum bovin (BSA) dans la chambre d'observation contenant la lame préparée dans la section 3.3.6 et incuber pendant 30 min à température ambiante (entre 20 et 30 ° C).
- Rincer la bicouche en supprimant et en ajoutant 500 ul de PBS 10 fois. La bicouche peut être conservé 24 h à 4 ° C.
4. fonctionnalisation avec Ligands
- Ajouter fluorescent ou non fluorescent neutravidine (NAV, une version de l'avidine déglycosylée pas chargée à un pH de 7) à 2 ug / mL dans la chambre contenant le coulisseau préparé dans la section 3.4.2 pendant 30 min à température ambiante (entre 20 et 30 ° C).
- Rincer en ajoutant et en supprimant 500 ul de PBS 10 fois.
- Ajouter anti-CD3 biotinylé à 2 ug / mL à la chambre contenant le coulisseau préparé dans la section 3.4.2. Pour une double fonctionnalisation du SLB et les points, ajoutez Fc-ICAM1 marqueur His à 5 ug / ml (lipides ici, la double couche est faite de DOPC + 1% d'acide nitrilotriacétique (NTA)). Laisser reposer pendant 30 min à température ambiante (entre 20 et 30 ° C).
- Rincer en ajoutant et en supprimant 500 ul de PBS 10 fois
- Remplacer le PBS avec du milieu cellulaire (PBS + BSA à 0,1%) en ajoutant et en enlevant 500 ul du milieu cellulaire 10 fois.
- Laisser 200 pi de milieu cellulaire dans la chamber avec le coulisseau.
- Placer la chambre pendant 10 min à 37 ° C avant d'ajouter les cellules.
5. Le dépôt de cellules (voir la référence 7 pour les détails)
- déposer délicatement 400 ul de la suspension de cellules dans la chambre. Incuber les cellules pendant 30 min à 37 ° C.
- Fixer la cellule avec 2% de paraformaldehyde (PFA) pendant 15 min à 37 ° C. Remplacer le PFA avec du PBS par élimination répétée et addition de 500 ul de PBS.
6. Observation
- Proteo-lipidique motif de Nano et la fluidité SLB
- Utiliser un microscope à fluorescence à l' image du motif de protéine en mode épifluorescence en utilisant une longueur d' onde d'illumination appropriée (639 nm) et cubes de filtre (par exemple ici, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 +688).
NOTE: L'intensité du signal peut être quantifiée pour estimer la quantité de protéine à l'intérieur et à l'extérieur du point. Utiliser une longueur d'onde d'illumination appropriée (330 nm) et fcube ilter à l'image de la double couche (BP 365/12, FT 395, 397 LP), qui apparaît lumineux avec des trous noirs. - Utiliser une technique de blanchiment photographique continu (CPB) 13, 15 pour mesurer la constante de diffusion des lipides de traceur dans la bicouche. Cette observation est de préférence faite juste après le dépôt SLB.
Remarque: Afin de quantifier la constante de diffusion, deux paramètres sont mesurés pendant le processus de CPB: le temps de blanchiment spécifique du colorant (tendue) et la longueur de décroissance du profil de fluorescence du halo formé autour de la zone blanchie (Taud). La première est obtenue en traçant l'évolution temporelle de l'intensité de fluorescence au centre du champ lumineux au cours du processus CPB. La seconde est obtenue en traçant le profil d'intensité au niveau du bord de la zone éclairée (moyenne sur 12 lignes et 5 images après l'état d'équilibre est atteint). Les courbes sont montées pour obtenir et Taut taud. La constante de diffusion est donnée par tauD 2 / tendu (D =
).
- Utiliser un microscope à fluorescence à l' image du motif de protéine en mode épifluorescence en utilisant une longueur d' onde d'illumination appropriée (639 nm) et cubes de filtre (par exemple ici, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 +688).
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Representative Results
Les images de fluorescence ont été analysés pour mesurer l'espacement et la taille des points. Espacement typique a été trouvé que 1 900 ± 80 nm et typiquement la taille des points est de 600 ± 100 nm (figure 1g). L'espacement est défini par la taille des billes utilisées pour le masque. Le point de taille est fixé par le bourrelet de taille, ainsi que des conditions de dépôt. Le SLB est déposé uniquement autour des points de protéines et pas sur eux (figure 2), avec une complémentarité parfaite entre les trous observés dans le canal de formation d'image SLB et les points observés dans le canal de formation d'image de la VL. L' analyse des données de blanchiment photographique continu montre que les lipides dans la bicouche à motifs reste fluide et avoir une constante de diffusion typique de 5 μm² / s (figure 3).
Figure 1: Représentation schématique des étapes de fabrication. (a -7 Torr, Argon flux 10 sccm, pression de traitement de 6,2 mTorr, imagé à la tension d'accélération de 5 kV. Les images confirment l'observation faite en microscopie optique (image non compris) avant le dépôt d'aluminium que les billes sont disposées en un réseau hexagonal centré monocouche sur la lame de verre. (B) de masque secondaire d'aluminium créé par le dépôt par pulvérisation après l' enlèvement du bourrelet masque primaire. (C) dépôt d'organosilane et BSA-biotine si le masque secondaire. (D) élimination de l' aluminium révélant des nano-points de BSA-biotine. (E) Dépôt de SLB. (F) Liaison de navigation pour BSA-biotine. (G) Reliure anti-CD3 à nav. Encart montre l'image épifluorescence des tableaux nano-points. Ici, le nav est marqué par fluorescence. dot-taille typique est de 600 ± 100 nm et l'espacement typique est 1900 ± 80 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: complémentarité des nano-points et le motif SLB. (A, b) des images Epi-fluorescence des nano-points fluorescents nav et des SLB avec des lipides traceurs fluorescents. (C) image composite des points de nav (rouge) dans la mer de SLB (vert) montre une parfaite complémentarité du SLB et NaV. l'image transformée de Fourier rapide (FFT) dans l'encart indique l'ordre à longue portée. Barre d'échelle: 4 pm.rge.jpg » target = « _ blank »> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Quantification de la diffusion des lipides dans le SLB. (A) l' image d' épifluorescence du SLB avant le blanchiment. Les points de protéines apparaissent comme des trous noirs dans une mer brillante des lipides. Le champ diaphragme limite la zone éclairée. (B) Epi-fluorescence de SLB après le blanchiment en continu pendant 50 s. Le halo visible à l'intérieur de la région délimitée par le diaphragme de champ indique que les lipides sont mobiles. Barre d'échelle: 10 um. (C) du profil d'intensité moyenne le long du bord du champ de diaphragme (haut) et la décroissance de l' intensité au fil du temps au cours du processus de mise à terre (en bas). Ces données sont analysées pour extraire la constante de diffusion, qui est typiquement 5 μm² / s.
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Discussion
Les étapes critiques dans le protocole décrit ci-dessus sont liées à la formation des points de nano-protéines ou de l'arrière-remplissage de l'espace autour des points par une bicouche lipidique supportée. La première étape critique par rapport à des points de nano-protéine est la préparation du bourrelet masque. Le nettoyage du couvercle de glissière est critique. Les lames doivent être soit nettoyée avec une solution de détergent qui est recommandé pour le nettoyage des cuvettes en quartz, ou avec un plasma d'oxygène. D'autres techniques de nettoyage telles que l'immersion dans l'éthanol ou l'iso-propanol traitement ne rendent pas le verre suffisamment hydrophile et par conséquent, ne supportent pas la formation d'une monocouche de perles de grande couverture. Dans le même temps, la surface de la lame doit être compatible avec l'étape ultérieure de formation du SLB par la technique de Langmuir-Blodgett 7, 15, 16. La prochaine étape critique est le dépôt et le retrait d'unluminum. Si le dépôt se fait par technique de pulvérisation cathodique, comme cela se fait ici, la cible doit être dopée avec du silicium (à 1%). Dans le cas contraire, si la cible est constituée d'aluminium pur, la couche déposée est difficile à enlever avec la solution d'hydroxyde alcalin tel que décrit ci-dessus, probablement en raison de la formation d'oxyde d'aluminium et l'interpénétration entre la couche d'aluminium déposée et le substrat de lame de verre. La durée de dépôt détermine la taille des points de protéines 9, cependant, ici nous avons travaillé avec un temps de dépôt et , par conséquent seule la taille des points. L'échantillon peut être stocké dans des conditions ambiantes pendant plusieurs mois après le dépôt de l'aluminium et pendant environ une semaine après le dépôt de BSA-biotine.
La deuxième étape cruciale concerne le dépôt du SLB. Nettoyage du couvercle-lame de verre est à nouveau un point d'une importance cruciale. Comme cela est le cas pour tous les travaux de dépôt de Langmuir-Blodgett, tout le matériel utilisé doit être en verre ou Polytetrafluoroethylene (PTFE) et doit être scrupuleusement propre. Après le dépôt de la première monocouche lipidique, les diapositives de couverture-peuvent être stockés pendant deux ou trois jours, mais après le dépôt de la seconde monocouche, ils doivent être utilisés immédiatement.
Alors que nous avons mis en évidence le protocole pour la création de points de nano-anti-CD3 pour utilisation dans les études d'adhérence des lymphocytes T 9, 13, la procédure est très flexible et peut être adapté à toute protéine biotinylée. La composition de la bicouche lipidique peut facilement être modifié et il peut encore être fonctionnalisés si on le souhaite. Un point important à considérer est l'absorption possible des protéines non spécifiques, en particulier sur la bicouche lipidique entourant les points.
La principale limitation de la technique provient de l'utilisation de l'auto-assemblage de talon colloïdale pour le masque primaire. Être une technique ascendante, il partage certains des problèmes de toutes ces approchespar exemple, le manque de flexibilité et un contrôle total sur la forme du motif. Le réseau tendance reflète nécessairement la symétrie du masque de perles et est donc toujours hexagonale. La forme du motif de motif est un cercle et est déterminé par une combinaison de perles de taille et la durée du dépôt d'aluminium 9, 13. D' autres techniques pour contrôler la taille des points ont également été suggérés 14, 17, 18.
Substrats nano-motifs avec des protéines, des protéines ou des peptides fragments ont été largement utilisés dans le passé pour sonder les interactions de la surface cellulaire, en particulier l' adhérence et la migration 19 20. Un travail de pionnier a montré que les cellules de formation de tissu ne parviennent pas à se répandre sur les modèles avec un pas supérieur à un seuil donné 21, et en outre d'enquête sho wed que la longueur à l' échelle de ce phénomène est définie par la taille de talins, qui jouent un rôle dans la liaison des intégrines récepteurs à l'actine du cytosquelette 22. Cependant, dans toutes ces études, les protéines ont été liées aux nano-particules d'or, qui se sont immobilisés sur le verre.
Dans le contexte des lymphocytes T, les membranes PROTEO-lipidique, mimant typiquement des cellules présentant l' antigène, ont été largement utilisés pour comprendre les aspects fondamentaux de la fonction des cellules T 6. Techniques ingénieuses nano-structuration ont été utilisées pour créer des enclos avec des barrières métalliques qui sépare la protéine patches SLB, fonctionnalisés, qui ont fourni un aperçu de la structure et de la connectivité de l'interface de cellule T / APC 23. Ce genre de nano-patterning est cependant très différente de la protéine nano-points proposés ici. Récemment, nano- grappes ont été créés à l'aide liaison chimique des lipides fonctionnalisés protéinesss = « xref »> 3, qui a mis en lumière les conséquences de regroupement des récepteurs. L'avantage est que, contrairement à la présente affaire, les groupes pourraient en principe être eux-mêmes mobiles. Cependant, ces groupes formés spontanément sont nécessairement moins bien contrôlés en termes de taille et de densité que les protéines préformées nano-points décrits ici.
Nous prévoyons que la protéine SLBS décorées nano-points présentés ici peut être utilisé pour étudier les différents aspects de l'adhésion cellule-cellule. Une question évidente qui se pose est de savoir si, comme décrit ci - dessus pour les cellules de formation de tissu 19, les lymphocytes ont une longueur trop dimension intrinsèque associée à l' adhérence. Les résultats préliminaires semblent indiquer que , au moins lorsque l'adhérence est médiée par le complexe TCR, la densité des ligands plutôt que l' espacement est le paramètre déterminant pour la diffusion et à l' activation 10, 11, 12
Les deux principaux avantages de ces modèles de PROTEO-sont la compatibilité lipidique des substrats avec la microscopie optique avancée et la facilité de préparation qui les rend compatibles avec les applications et l'utilisation d'un jet franc. Après le dépôt d'aluminium, toutes les étapes de préparation peuvent être réalisées sur un banc humide norme-lab. À l'avenir, on peut envisager que le aluminisé et les masques de perles soutenu verre produites dans une installation spécialisée sont transférés et stockés dans les laboratoires de biologie pour une utilisation en cas de besoin. Dans cette perspective, nous pensons que ces substrats ont le potentiel de devenir la plate-forme de choix pour étudier l'interaction des cellules avec des nano-motifs contrôlés membranes PROTEO-lipidique.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous remercions Laurent Limozin, Pierre Dillard et Astrid Wahl pour poursuivre des discussions fructueuses sur les applications cellulaires. Nous remercions également Frederic Bedu de l'installation PLANETE de salle blanche pour son aide avec les observations SEM. Ce travail a été financé en partie par le Conseil européen de la recherche par subvention n ° 307104 FP / 2007-2013 / ERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | ||
| Observation chamber | Home made | ||
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 | |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | ||
| Desiccator | Labbox | ||
| Crystallizer | Shott | ||
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 | |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 | |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | ||
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 | |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 | |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C | |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 | |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 | |
| Film balance | NIMA | Medium | |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system | |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | ||
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
References
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