Summary
Wir stellen ein Protokoll Glas mit nanometrischer Proteinflecken von einem Fluid Lipiddoppelschicht umgeben funktionalisieren. Diese Substrate sind kompatibel mit den fortschrittlichen optischen Mikroskopie und sollen als Plattform für die Zelladhäsion und Migration Studien dienen.
Abstract
Derzeit gibt es ein beträchtliches Interesse an in einem Meer von passivierten Oberfläche geordnete Anordnungen von Adhäsionsprotein Inseln zu schaffen für zellbiologische Untersuchungen. In den letzten Jahren hat es immer deutlicher, dass lebende Zellen reagieren, nicht nur auf die biochemische Natur der Moleküle ihnen vorgestellt, sondern auch auf die Art, wie diese Moleküle präsentiert werden. Erstellen von Protein Mikromuster wird deshalb jetzt Standard in vielen biologischen Laboratorien; Nanostrukturen sind auch zugänglich. Doch im Zusammenhang mit den Zell-Zell-Interaktionen, besteht ein Bedarf an Mustern nicht nur Proteine, sondern auch Lipid-Doppelschichten. Solche Dual proteo-lipidic Musterung ist bisher nicht leicht zugänglich. Wir bieten eine einfache Technik Protein Nanopunkte auf Glas und schlagen ein Verfahren zu schaffen unterstützten den Zwischenpunktraum mit einer unterstützten Lipiddoppelschicht (SLB) verfüllen. Vom Fotobleichen des Tracers enthalten fluoreszierende Lipide im SLB, zeigen wir, dass die Doppelschicht in-pl erhebliche aufweistane Fluidität. Funktionalisierung der Proteinpunkte mit fluoreszierenden Gruppen ermöglicht es uns, Bild sie und zu zeigen, dass sie in einem regelmäßigen hexagonalen Gitter geordnet. Die typische Punktgröße beträgt etwa 800 nm und der Abstand hier gezeigt, ist 2 um. Diese Substrate werden erwartet als nützliche Plattformen für die Zelladhäsion, Migration und mechano-Sensing-Studien dienen.
Introduction
Zelladhäsion erfolgt durch spezialisierte Zelladhäsionsmoleküle (CAMs), Proteine, die auf der Zellmembran, die zu ihrem Gegenstück der Bindung auf der extrazellulären Matrix oder auf einem anderen Zelle fähig sind. Auf adhärierten Zellen, die meisten Adhäsionsmoleküle , einschließlich der allgegenwärtigen Integrin und Cadherin, werden in Form von Clustern 1 gefunden. Die Wechselwirkung von T-Lymphozyten (T-Zellen) mit Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) stellt ein besonders treffendes Beispiel für die Bedeutung des Rezeptor-Cluster an der Grenzfläche zwischen den beiden Zellen gebildet - oft eine immunologischen Synapse bezeichnet. Bei der Bildung die erste Berührung mit dem APC, T - Zell - Rezeptoren (TCRs) auf der Oberfläche der T - Zellen - Form micron Skala Cluster , die dazu dienen , als Signalisierungsplattformen 2, 3, 4, und werden schließlich zentralisieren einen größeren zentralen supramolekularen Cluster zu bilden (cSMAC )lass = "Xref"> 5, 6, 7. Vor kurzem wurde es , dass auf der APC Seite gezeigt, die Liganden des TCR sind auch 8 gebündelt.
Im Zusammenhang mit der T - Zell-APC - Interaktion, die Bereitstellung von Hybrid - Systemen, wo der APC durch eine künstliche Oberfläche funktionalisierte mit relevanten Proteinen nachgeahmt wird, vorgerückt ist unser Verständnis der synaptischen Schnittstelle 2, 3, 4, 5, 6, 7 . In diesem Zusammenhang ist es höchst relevant APC-Mimetikum Oberflächen zu gestalten, dass ein oder mehr Aspekte der Zielzelle erfassen. Wenn beispielsweise Liganden auf unterstützte Lipiddoppelschichten aufgepfropft werden, können sie in der Ebene der Doppelschicht diffundieren, ahmen die Situation auf der APC Oberfläche und zur gleichen Zeit der Bildung des erlaubencSMAC 6, 7. Ähnlich haben die Cluster auf der APC nachgeahmt von 14 Inseln von Liganden in einem Meer von Polymeren , 9, 10, 11, 12, 13, zu schaffen. Allerdings haben diese beiden Merkmale bisher nicht kombiniert.
Hier beschreiben wir eine neuartige Technik Nano-Dots von Anti-CD3 zu erzeugen (ein Antikörper, der den TCR-Komplexes Targets) von einer Lipiddoppelschicht mit diffundierenden Lipiden umgeben. Die Bilayer wird unter Verwendung von Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schäfer - Technik abgeschieden 7, 15, 16 und , falls gewünscht, könnte mit einem bestimmten Protein funktionalisiert werden - beispielsweise der Ligand der T - Zell - Integrin (genannt ICAM1). Darüber hinaus cou die anti-CD3-Protein dotsld mit einem anderen Antikörper oder CAM ersetzt werden. Während wir die Proteine, die für die zukünftige Nutzung als Plattform für die T-Zell-Adhäsion Studien gewählt haben, detailliert die Strategie hier kann für jedes Protein und sogar DNA angepasst werden.
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Protocol
1. Reinigung Glasdeckel-Dias und Beobachtungskammern
- Ordnet die Glasabdeckung Schlitten auf einem mehr Diamagazin aus einem inerten Material wie Polytetrafluorethylen (PTFE).
- Taucht das Fach mit Rutschen und die Beobachtungskammer in einer Tensidlösung (jedes Produkt zu empfehlen für die Reinigung von Quarzküvetten ist geeignet).
- Unter Verwendung eines Ultraschallbades, ultra-beschallen in der Tensidlösung für 30 min bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C).
- Spülen Sie 5-mal mit Reinstwasser (18.2 MΩ.cm, 0,059 & mgr; S / cm).
- Ultra-Sonikat in Tensidlösung für 30 min bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C).
- Spülen Sie 10-mal mit Reinstwasser.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.5 und 1.6 zweimal.
- Speicher in Wasser bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C) für bis zu einer Woche.
2. Herstellung von Protein-Nano-Punkte
- Die Ablagerung von Perlen
- Deposit die Suspension von Silica-Kügelchen (2% v / v, 70 & mgr; l) tropft auf einem deckel Schieber (24 x 24 mm, Dicke 170 um) mit einer Neigung von 15 Grad gehalten wird.
- Lassen Sie die Suspension für ca. 1 min verteilt, während das Glas alle 15 s um 90 ° Spiegeln.
- Die Flüssigkeit unter Umgebungsbedingungen zu verdampfen.
- Speicher in einem sauberen Glas oder PTFE Kammer bei Umgebungsbedingungen für bis zu 2 Tagen.
- Abscheidung von Aluminium
- Platzieren Sie die Folien (hergestellt in Abschnitt 2.1) in einer Radiofrequenz (RF) Magnetronzerstäubungsgerät 8, auf einem Drehtisch in einer Entfernung von etwa 105 mm aus einer Aluminium (99%): Silizium (1%) vorbei.
- Abpumpen der Beschichtungskammer auf 2,6 x 10 -4 Pa eine Turbomolekularpumpe. Dieser Schritt ist wichtig für die Entfernung von gasförmigen Verunreinigungen möglich.
- Einführung von reiner Argon-Atmosphäre (5N, 99,999%) mit einem Fluss von 10 sccm bei einem Druck von 0,8 Pa (6,6 mTorr).
- Schalten Sie den HF-Leistungsgenerator.
HINWEIS: Hier wird ein typischer Bereich von 400-600 W Hochfrequenzleistung bei 13,56 MHz verwendet wurde. Der HF-Generator ist mit einem Anpassungsnetzwerk in einem kapazitiven Kopplungsmodus Plasma verwendet. Die reflektierte Leistung wird überwacht und minimiert die Netzwerkanpassung verwenden. - Nachdem das Plasma stabilisiert wird, Sputter für 2 min geschlossen, um den Verschluss zu halten mögliche Verunreinigungen von der Oberfläche des Targets zu entfernen.
- Öffnen des Verschlusses und ermöglichen dem Sputter weiterhin für 60 min Aluminium auf der Glasträger mit einer Dicke von 200 nm abzuscheiden.
- Schneiden Sie die Strömung von Argon, schließen Sie das Torventil die Turbomolekularpumpe aus der Abscheidungskammer und die Entlüftungsöffnung in die Kammer mit reinem n zu isolierenitrogen den Raumdruck zu erhalten. Wiederherstellen der aluminiumbeschichteten Folien. Speicher für bis zu einem Monat in einer sauberen und hermetisch verschlossenen Glas oder PTFE-Box unter Umgebungsbedingungen.
- Dampfabscheidung von Organosilan
- Tauchen Sie die Aluminium-beschichteten Objektträger, hergestellt in Schritt 2.2.6 in Reinstwasser bei Raumtemperatur und ultra-Sonikat für 30 s in einem Ultraschallbad (50 W, 50/60 Hz, zwischen 20 und 30 ° C).
- Deposit 0,5 ml (3-Aminopropyl) triethoxysilan (APTES) am Boden eines Exsikkators.
ACHTUNG: APTES ist ein Organosilan, das leicht verdampft und ist giftig. APTES sollte nur unter einer strömungs Kapuze und mit Handschuhen angefasst werden. - Setzen Sie die Objektträger aus Glas (hergestellt in 2.3.1) auf einem Keramik-Gitter und im Inneren der Exsikkator.
- Schließen Sie den Exsikkator mit einer Membranpumpe und läuft bei maximaler Leistung für 30 min mit einem niedrigen Vakuum zu erzeugen.
- Schließen Sie das Ventil des Exsikkator und schaltet die Pumpe ab.
- Heizen Sie den Exsikkatorauf etwa 50 ° C für 1 h.
- Öffnen Sie den Exsikkator und sammeln Sie die Dias.
- Übertragung auf ein anderes sauberes Exsikkator zur Lagerung bis zu 48 Stunden bei Raumtemperatur (20 bis 30 ° C).
- Ablagerung der ersten Schicht von Protein - Rinderserumalbumin, markiert mit Biotin (BSA-Biotin)
- Legen Sie eine der hergestellten Folien in Abschnitt 2.3 auf einem PTFE-Träger.
- Deposit 1 ml 25 ug / ml BSA-Biotin, gelöst in Phosphat-gepufferter Saline (PBS). Lassen Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur (20 bis 30 ° C).
- Spülen 10 mal mit PBS. Lagern Sie die Probe für bis zu 24 h bei 4 ° C entfernt von der Lichtquelle.
- Die Entfernung der Aluminiummaske
- Inkubieren den Objektträger in einer Lösung von NaOH in PBS (hergestellt durch tropfenweise Zugabe von 1 M NaOH auf etwa 100 ml PBS pH≈12 zu erhalten) über Nacht bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C).
VORSICHT. NaOH ist ätzend und sollte mit Handschuhen angefasst werden. - Spülen10-mal in Reinstwasser.
- Inkubieren den Objektträger in einer Lösung von NaOH in PBS (hergestellt durch tropfenweise Zugabe von 1 M NaOH auf etwa 100 ml PBS pH≈12 zu erhalten) über Nacht bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C).
3. Die Ablagerung von Lipid Bilayer Stützter (SLB)
- Reinigen des Langmuir-Trog
- Entfernen des Wassers in dem PTFE Gehäuse der Langmuir-Trog mit einer Pumpe.
- Reinigen Sie mit einem fusselfreien Vlies Einweg-Handtuch in Chloroform getränkt.
VORSICHT. Chloroform ist giftig und soll in einem gut belüfteten Bereich manipuliert werden, mit einer Maske (oder unter einer Strom-Haube) und mit geeigneten Handschuhen. - Sauber 4mal mit lauwarmem Reinstwasser (40 bis 50 ° C).
- Reinigen Sie mindestens 6 mal mit kaltem Reinstwasser.
- Abscheiden der ersten Lipidschicht
- Platzieren PTFE Tabletts in dem PTFE Gehäuse der Langmuir-Trog und dann füllt sie mit Reinstwasser.
- Verwenden, um die Steuersoftware der Langmuir Vorrichtung den gemessenen Druck auf 0 mN / m einzustellen.
- Verwenden, um eine gasdichte Glas / Metall-Spritze 30 ul einer 1 mg / ml Lipidlösung abzuscheiden (1, 2-Dioleoyl - sn - glycero-3-phosphocholin (DOPC) in Chloroform) auf der Oberfläche des Wassers. Das Chloroform verdampft und die Lipidmoleküle spontan eine Monoschicht bilden.
- Verwenden, um die Steuersoftware der Lipid-Monoschicht durch Schließen der PTFE Barriere bis zum gewünschten Druck (27 mN / m für DOPC) zu komprimieren, erreicht ist.
- Verwenden, um die Steuersoftware des Glasobjektträger in dem Abschnitt mit Hilfe eines motorisiertes Klemme 2.5.2 in das PTFE-Gehäuse bereit zu tauchen.
- Halten der Folie in der Klemme, die senkrecht zu der Luft-Wasser-Grenzfläche. Mit der Steuer-Software es langsam zu erhöhen (15 mm / min) über die Schnittstelle, während einen konstanten Druck auf 27 mN / m gehalten wird.
- In einer trockenen Umgebung entweder für die sofortigen Gebrauch oder für die Speicherung von bis zu 24 h bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C).
- Abscheidung der zweiten Lipidschicht
- Aufrechterhaltung des Oberflächendruckes in dem Langmuir-Trog auf dem gewünschten Wert von 27 mN / m. Komprimieren Sie die Verwendung vonSteuersoftware der Langmuir-Vorrichtung und / oder eine geringe Menge an Lipid fügen den gewünschten Druck zu erreichen.
- Platzieren Sie die Glasobjektträger tragen, die Lipid-Monoschicht, hergestellt in Abschnitt 3.2.6, horizontal auf der Oberfläche des Wassers. Stellen Sie sicher, dass jede Folie über einer PTFE-Schale schwimmt.
- Schieben die Glasobjektträger nach unten, eine Folie zu einem Zeitpunkt, in sein entsprechendes Fach PTFE verwendet PTFE oder Metallpinzette, so dass sie in das Wasser eingetaucht sind. Vermeiden Sie die Folien Kippen während schieben.
- Verwenden PTFE oder Metallpinzette, die PTFE Böden enthalten die Objektträger in einen Kristallisator mit Reinstwasser sicherstellen gefüllt zu übertragen, dass die Schieber nicht der Luft ausgesetzt sind.
- Verwenden PTFE oder Metallpinzette zu übertragen, während unter Wasser arbeiten, ein zweischichtige beschichteten Glasobjektträger in eine Beobachtungskammer.
HINWEIS: Die Beobachtungskammer wird unter Wasser in dem Kristallisator gegeben. Die Beobachtungskammer ist nach Maße und besteht aus einem PTFE-Ring mit einer Gummidichtung einesd Stahlgehäuse, die unter Wasser zusammengesetzt werden können, um eine wasserdichte Kammer, deren Bodenfläche der zuvor von dem Glasobjektträger mit der Lipiddoppelschicht beschichtet ist, hergestellt zu machen. - Schließen die Kammer während sie weiterhin unter Wasser zu arbeiten, und um sicherzustellen, dass ca. 1 ml Wasser wird in der Kammer gefangen.
- Nehmen Sie die zusammengesetzte Kammer aus dem Wasser. Stellen Sie sicher, dass es wasserdicht und leckagefrei.
- Setzen Sie die 1 ml ultrareinem Wasser, die in der Beobachtungskammer mit PBS durch Hinzufügen und Entfernen von 500 ul 10-fach PBS. Stellen Sie sicher, dass die Kammer nie frei von Flüssigkeit ist.
- SLB Blockierungsschritt
- Einführung von 100 ug / ml Rinderserumalbumin (BSA) in der Beobachtungskammer die Folie, hergestellt in Abschnitt 3.3.6 und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C) enthält.
- Spülen Sie die Bilayer durch Entfernen und Hinzufügen von 500 ul 10-fach PBS. Die Bilayer kann 24 h bei 4 ° C aufbewahrt werden.
4. Funktionalisierung mit Liganden
- Hinzufügen fluoreszierende oder nicht fluoreszierende Neutravidin (NAV, eine deglykosylierte Version von Avidin nicht bei pH 7 geladen) bei 2 & mgr; g / ml in die Kammer, um die Folie in Abschnitt 3.4.2 für 30 min bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° hergestellt, enthaltend C).
- Spülen durch Hinzufügen und Entfernen von 500 ul 10-fach PBS.
- Hinzufügen biotinylierten anti-CD3 bei 2 ug / ml in die Kammer, um den Schieber in Abschnitt 3.4.2 enthält, hergestellt. Bei Doppel Funktionalisierung des SLB und die Punkte, fügt Fc-ICAM-1 His-Tag bei 5 & mgr; g / mL (hier die Doppelschicht aus DOPC + 1% Nitrilotriessigsäure (NTA) Lipiden hergestellt wird). Lassen Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur (zwischen 20 und 30 ° C).
- Spülen durch Hinzufügen und Entfernen von 500 ul PBS 10mal
- Ersetzen der PBS mit Zellmedium (PBS + 0,1% BSA) durch Zugabe und 500 & mgr; l des Zellmediums 10 mal entfernt wird.
- Lassen Sie 200 ul Zellmedium in der chambeR mit der Folie.
- Platzieren Sie die Kammer für 10 min bei 37 ° C vor der Zugabe von Zellen.
5. Zellablage (Referenz 7 für Details)
- deponieren vorsichtig 400 ul der Zellsuspension in die Kammer. Inkubieren der Zellen für 30 min bei 37 ° C.
- Fix die Zelle mit 2% Paraformaldehyd (PFA) für 15 min bei 37 ° C. Ersetzen des PFA mit PBS durch wiederholte Entfernung und Zugabe von 500 & mgr; l PBS.
6. Beobachtung
- Proteo-lipidischen Nanomuster und SLB Fluidität
- Verwenden eines Fluoreszenzmikroskops dem Bild das Proteinmuster im Auflicht-Fluoreszenz - Modus geeignete Beleuchtungswellenlänge (639 nm) und Filterwürfel (zB hier EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 +688).
HINWEIS: Die Intensität des Signals kann die Menge an Protein innerhalb und außerhalb des Punktes abzuschätzen quantifiziert werden. Verwenden, um eine geeignete Beleuchtungswellenlänge (330 nm) und Filter Würfel Bild mit der Doppelschicht (BP 365/12, FT 395, LP 397), die mit dunkelen Löchern hell erscheint. - Verwenden kontinuierliche Fotobleich (CPB) -Technik 13, 15 , um die Diffusionskonstante des Tracers Lipide in der Doppelschicht zu messen. Diese Beobachtung wird vorzugsweise kurz nach der SLB Abscheidung hergestellt.
ANMERKUNG: Um die Diffusionskonstante, zwei Parameter gemessen, während CPB Prozess zu quantifizieren: die spezifische Bleichzeit des Farbstoffs (Taut) und die Abklinglänge des Fluoreszenzprofil des Halo um die gebleichte Fläche (Taud) gebildet ist. Die erste ist durch Aufzeichnen der Zeitentwicklung der Fluoreszenzintensität in der Mitte des beleuchteten Feldes während des CPB Verfahrens erhalten. Das zweite ist, die durch Auftragen der Intensitätsprofil am Rand des ausgeleuchteten Zone (gemittelt über 12 Zeilen und 5 Bilder nach dem stationären Zustand erreicht ist) erhalten. Die Kurven sind ausgestattet Taut und Taud zu erhalten. Die Diffusionskonstante wird durch ta gegebenuD 2 / Taut (D =
).
- Verwenden eines Fluoreszenzmikroskops dem Bild das Proteinmuster im Auflicht-Fluoreszenz - Modus geeignete Beleuchtungswellenlänge (639 nm) und Filterwürfel (zB hier EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 +688).
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Representative Results
Die Fluoreszenzbilder wurden analysiert, um den Abstand und die Größe der Punkte zu messen. Typische Abstände wurden gefunden 1.900 ± 80 nm und typischer Punktgrßenauswahlmittel sein betrug 600 ± 100 nm (Figur 1g). Der Abstand wird durch die Größe der Perlen für die Maske verwendet, eingestellt. Die Punktgröße wird durch die sickenGröße sowie Abscheidebedingungen eingestellt. Der SLB ist eindeutig um die Protein - Punkte und nicht auf sie (Figur 2), mit perfekter Komplementarität zwischen den in SLB Abbildungskanal und die Punkte in dem NAV Abbildungskanal gesehen Löcher abgeschieden. Analyse der fortlaufenden Fotobleich Daten zeigen , daß die Lipide in der gemusterten Bilayer bleiben flüssig und haben eine typische Diffusionskonstante von 5 um² / s (Abbildung 3).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Herstellungsschritte. (a -7 Torr, 10 sccm Argon flux, 6,2 mTorr, abzubildenden Prozessdruck bei einer Beschleunigungsspannung von 5 kV abgesetzt. Die Bilder bestätigen Beobachtung mit optischer Mikroskopie (Bild nicht enthalten), bevor die Aluminiumabscheidung, die die Kügelchen in einer Monoschicht zentriert hexagonalen Gitter auf dem Glas-Objektträger angeordnet sind. (B) Sekundärmaske von Aluminium durch die Sputter - Abscheidung nach der Entfernung der primären bead-Maske erzeugt. (C) Abscheidung von Organosilan und BSA-Biotin , obwohl die Sekundärmaske. (D) Entfernung von Aluminium offenbart Nanopunkte BSA-Biotin. (E) Ablagerung von SLB. (F) Bindung an BSA-NaV Biotin. (G) Die Bindung anti-CD3 NIW. Inset zeigt epi-Fluoreszenzbild der Nanopunkte-Arrays. Hier ist der NIW fluoreszierend markiert. Typische Punktgröße ist 600 ± 100 nm und typischer Abstand beträgt 1.900 ± 80 nm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Komplementarität der nano-Punkt und SLB Muster. (A, b) Epi-Fluoreszenzbilder von fluoreszierenden Nano NaV Punkte und von SLB mit fluoreszierenden Tracers Lipiden. (C) zusammengesetzte Bild des NaV Punktes (rot) in dem Meer von SLB (grün) zeigt perfekte Komplementarität der NaV und SLB. Fast-Fourier-Transformation (FFT) Bild in der Einfügung anzeigt Fernordnung. Maßstabsbalken: 4 um.rge.jpg“target =‚_ blank‘> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Quantifizierung des Lipids Diffusion in der SLB. (A) Epi-Fluoreszenzbild eines SLB vor dem Bleichen. Die Protein-Punkte zeigen, wie dunkle Löcher in einem hellen Meer von Lipiden auf. Die Feldblende begrenzt den beleuchteten Bereich. (B) Epi-Fluoreszenz von SLB Nach 50 s kontinuierlich Bleichen. Der Halo sichtbar innerhalb der Region durch die Feldblende begrenzt zeigt an, dass die Lipide mobil sind. Maßstabsbalken: 10 & mgr; m. (C) Durchschnittsintensitätsprofil entlang der Kante des Feldblende (oben) und den Verfall der Intensität über die Zeit während des Prozesses beaching (unten). Diese Daten werden analysiert, um die Diffusionskonstante zu extrahieren, die in der Regel 5 um² / s ist.
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Discussion
Die kritischen Schritte in dem oben beschriebenen Protokoll werden zur Bildung der Nano dots Protein verwandt oder der Hinterfüllen des Raumes um die Punkte, die durch einen unterstützten Lipiddoppelschicht. Der erste kritische Schritt in Bezug auf Protein-Nanopunkten ist die Herstellung der Wulstes-Maske. Die Reinigung des Deckelschlitten ist kritisch. Die Folien müssen entweder mit einer Reinigungslösung gereinigt werden, die für die Reinigung von Quarzküvetten, oder mit einem Sauerstoffplasma wird empfohlen. Andere Reinigungstechniken wie Eintauchen in Ethanol oder iso-Propanol Behandlung nicht machen das Glas nicht ausreichend hydrophil, und daher nicht die Bildung einer große Abdeckung bead einschichtigen unterstützen. Zur gleichen Zeit muss die Oberfläche der Folie mit dem nachfolgenden Schritt der Bildung des SLB von Langmuir-Blodgett - Technik 7, 15, 16 kompatibel sein. Der nächste entscheidende Schritt ist die Abscheidung und Entfernung von einemluminum. Wenn die Abscheidung über Sputtertechnik ist, wie hier geschehen, soll das Ziel mit Silicium dotiert werden (bei 1%). Andernfalls, wenn das Ziel aus reinem Aluminium hergestellt ist, ist die aufgebrachte Schicht hart mit der Alkalihydroxid-Lösung zu entfernen, wie oben beschrieben, wahrscheinlich wegen der Bildung von Aluminiumoxid und Dringen zwischen dampften Aluminiumschicht und Glasobjektträgern-Substrat. Die Dauer der Ablagerung bestimmt die Größe der Proteinpunkte 9 aber hier sind wir mit einer einzigen Abscheidungszeit und damit einzelner Punktgröße gearbeitet haben. Die Probe kann unter Umgebungsbedingungen für mehrere Monate nach der Aluminiumabscheidung und für etwa eine Woche nach der Ablagerung von BSA-Biotin gespeichert werden.
Der zweite entscheidende Schritt betrifft die Abscheidung des SLB. Die Reinigung der Glasabdeckung-Schlitten ist wiederum ein entscheidender wichtiger Punkt. Wie sollte der Fall für jeden Langmuir-Blodgett Ablagerung Arbeit, die alle das verwendete Material aus Glas oder Po werdenlytetrafluoroethylene (PTFE) und sollte peinlich sauber sein. Nach dem Abscheiden der ersten Lipid-Monoschicht können die deckel Folien für ein paar Tage gelagert werden, aber nach der Ablagerung der zweiten einschichtigen, müssen sie sofort verwendet werden.
Während wir das Protokoll für die Erstellung von Anti-CD3 - Nanopunkten zur Verwendung in T - Lymphozyten - Adhäsion Studien 9, 13 gezeigt haben, ist das Verfahren sehr flexibel und kann für jedes biotinylierte Protein angepasst werden. Die Zusammensetzung der Lipid-Doppelschicht lassen sich leicht verändert, und es kann ferner, falls gewünscht funktionalisiert werden. Ein wichtiger Punkt ist die mögliche unspezifische Absorption von Proteinen, insbesondere an der Lipid-Doppelschicht, die Punkte umgeben.
Die Haupteinschränkung der Technik ergibt sich aus der Verwendung von kolloidalem bead-Selbstorganisation für die primäre Maske. Als eine Bottom-up-Technik, teilt es einige der Probleme aller dieser Ansätzezum Beispiel Mangel an Flexibilität und volle Kontrolle über die Musterform. Das Muster Gitter reflektiert notwendigerweise die Symmetrie der Wulst Maske und ist daher immer hexagonal. Die Form des Musters Motiv ist ein Kreis und wird durch eine Kombination von sicken Größe und die Dauer der Aluminiumabscheidung 9, 13 bestimmt. Alternative Techniken für die Steuerung der Punktgröße haben auch 14 vorgeschlagen worden, 17, 18.
Substrate Nanostrukturen mit Proteinen, Proteinfragmenten oder Peptiden , wurden in der Vergangenheit zur Sonde Zelloberflächen - Wechselwirkungen, insbesondere Adhäsion Migration 19 und 20 umfangreich verwendet. Pionierarbeit hat gezeigt , dass Gewebe bildenden Zellen nicht auf Muster mit einer Steigung größer als eine gegebene Schwelle 21 und eine weitere Untersuchung sho auszubreiten vermählen , daß die Längenskala dieses Phänomens durch die Größe der Talins eingestellt ist, der bei der Verknüpfung von Integrin - Rezeptoren an den Aktin - Zytoskelett 22 instrumental ist. in all diesen Studien wurden die Proteine jedoch an Gold-Nanoteilchen verbunden, die sich auf dem Glas immobilisiert wurden.
Im Rahmen von T - Zellen, Proteolipid - Membranen, die typischerweise Antigen - präsentierenden Zellen nachahmen, wurden grundlegende Aspekte der T - Zell - Funktion 6 ausgiebig genutzt zu verstehen. Ingenious Nanostrukturierungstechniken verwendet worden , um corrals zu schaffen , mit Metallbarrieren Trenn Proteins funktionalisierte SLB - Patches, der Einblick in die Struktur und die Konnektivität der T - Zell / APC - Schnittstelle 23 zur Verfügung gestellt hat. Diese Art von Nano-Strukturierung ist jedoch sehr verschieden von den Protein-Nanopunkten hier vorgeschlagen. Vor kurzem wurden Nanoclustern mit chemischer Bindung der Protein funktionalisierte Lipiden erstelltss = „Xref“> 3, die auf der Folge der Rezeptor clustering beleuchten. Der Vorteil war, dass, im Gegensatz zu dem vorliegenden Fall ist die Cluster im Prinzip selbst mobil sein könnten. Allerdings ist eine solche spontan gebildeten Cluster notwendigerweise weniger gut in Bezug auf Größe und Dichte als vorgeformter Protein Nano Punkte hier beschrieben gesteuert.
Wir sehen, dass das Protein Nano-Punkt verziert SLBs hier vorgestellten verwendet werden kann, verschiedene Aspekte der Zell-Zell-Adhäsion zu untersuchen. Eine offensichtliche Frage , die sich stellt , ist , ob, wie oben beschrieben , für die Gewebe bildenden Zellen 19 auch Lymphozyten eine intrinsische Längenskala mit Adhäsion verbunden. Vorläufige Ergebnisse scheinen , daß zumindest um anzuzeigen , wenn die Haftung durch den TCR - Komplex vermittelt wird, ist die Dichte der Liganden statt Abstand der definierende Parameter zum Spreizen und Aktivierung 10, 11, 12
Die beiden Hauptvorteile dieser Proteolipid-Muster sind die Kompatibilität der Substrate mit fortschrittlicher optischer Mikroskopie und den einfachen Zubereitung, die sie kompatibel mit Einsatz-and-Throw-Anwendungen macht. Im Anschluß an die Aluminiumabscheidung, alle Herstellungsschritte auf einem Standard-wet-lab durchgeführt werden kann bench. In der Zukunft kann es, daß das mit Aluminium beschichtete und Glas-gestützten bead-Masken in einer spezialisierten Einrichtung übertragen werden und wie und in biologischen Laboratorien für die Verwendung gespeichert hergestellt ins Auge gefasst werden, wenn erforderlich. In diesem Sinne sind wir der Meinung, dass diese Substrate das Potenzial haben, die Plattform der Wahl zu werden für die Untersuchung der Wechselwirkung von Zellen mit kontrollierter Nano gemusterten proteo-lipidic Membranen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Laurent Limozin, Pierre Dillard und Astrid Wahl für fruchtbare Diskussionen über zelluläre Anwendungen fort. Wir danken auch Frederic Bedu von PLANETE Reinraum für seine Hilfe bei SEM Beobachtungen. Diese Arbeit wurde teilweise durch den Europäischen Forschungsrat über Zuschuss Nr 307104 FP / 2007-2013 / ERC finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | ||
| Observation chamber | Home made | ||
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 | |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | ||
| Desiccator | Labbox | ||
| Crystallizer | Shott | ||
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 | |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 | |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | ||
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 | |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 | |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C | |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 | |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 | |
| Film balance | NIMA | Medium | |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system | |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | ||
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
References
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