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Bioengineering

एक समर्थित लिपिड bilayer में ligand नैनो-क्लस्टर सारणी

Published: April 23, 2017 doi: 10.3791/55060
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Aix-Marseille Université, CNRS, UMR 7325, CINaM, 2State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science of Jiangnan University

Summary

हम एक तरल पदार्थ लिपिड दोहरी परत से घिरा हुआ nanometric प्रोटीन पैच के साथ कांच functionalize के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इन substrates उन्नत ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ संगत कर रहे हैं और कोशिका आसंजन और प्रवास के अध्ययन के लिए मंच के रूप में सेवा करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं।

Abstract

इस समय वहाँ सेल जैविक अध्ययन के लिए passivated सतह के एक समुद्र में चिपकने वाला प्रोटीन द्वीपों का आदेश दिया सरणियों बनाने में काफी रुचि है। पिछले कुछ वर्षों में, यह तेजी से स्पष्ट है कि जीवित कोशिकाओं, जवाब उन्हें प्रस्तुत अणुओं की जैव रासायनिक प्रकृति के, लेकिन यह भी जिस तरह से इन अणुओं प्रस्तुत कर रहे हैं करने के लिए न केवल बन गया है। इसलिए अब कई जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में मानक प्रोटीन सूक्ष्म पैटर्न पैदा कर रही है; नैनो पैटर्न भी अधिक सुलभ हैं। हालांकि, सेल सेल बातचीत के संदर्भ में, वहाँ पैटर्न के लिए एक की जरूरत न केवल प्रोटीन, लेकिन यह भी लिपिड bilayers है। इस तरह की दोहरी proteo-lipídic आकृति अब तक आसानी से सुलभ नहीं किया गया है। हम एक सतही तकनीक कांच पर समर्थित प्रोटीन नैनो डॉट्स बना सकते हैं और एक समर्थित लिपिड दोहरी परत (SLB) के साथ अंतर-डॉट अंतरिक्ष बैकफ़िल के लिए एक विधि का प्रस्ताव करने की पेशकश करते हैं। ट्रेसर की तस्वीर-विरंजन से फ्लोरोसेंट लिपिड SLB में शामिल है, हम चाहते हैं कि दोहरी परत में-pl काफी दर्शाती प्रदर्शितane तरलता। फ्लोरोसेंट प्रोटीन समूहों के साथ डॉट्स functionalizing हमें उन्हें और पता चलता है कि वे एक नियमित रूप से हेक्सागोनल जाली में आदेश दिया जाता है छवि के लिए अनुमति देता है। ठेठ डॉट आकार लगभग 800 एनएम है और रिक्ति यहां प्रदर्शन किया 2 माइक्रोन है। इन substrates कोशिका आसंजन, प्रवास और mechano संवेदन के अध्ययन के लिए के रूप में उपयोगी प्लेटफार्मों की सेवा के लिए उम्मीद कर रहे हैं।

Introduction

कोशिका आसंजन विशेष कोशिका आसंजन अणु (cams), प्रोटीन कोशिका झिल्ली कि अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स पर या किसी अन्य कक्ष पर अपने समकक्ष के लिए बाध्य करने में सक्षम हैं पर उपस्थित माध्यम से होता है। पालन कोशिकाओं पर, हर जगह का इंटीग्रिन और cadherin सहित अधिकांश आसंजन अणु, समूहों 1 के रूप में पाए जाते हैं। प्रतिजन पेश कोशिकाओं के साथ टी लिम्फोसाइट्स (टी कोशिकाओं) की बातचीत (APCs) दो कोशिकाओं के बीच इंटरफेस पर गठित रिसेप्टर समूहों के महत्व का एक विशेष रूप से हड़ताली चित्र उपलब्ध कराती है - अक्सर एक प्रतिरक्षाविज्ञानी अन्तर्ग्रथन कहा जाता है। टी सेल प्रपत्र माइक्रोन पैमाने समूहों कि प्लेटफार्मों 2, 3, 4 संकेत के रूप में सेवा, और अंततः केंद्रीकृत कर रहे हैं की सतह पर एपीसी, टी सेल रिसेप्टर्स (TCRs) से पहले संपर्क बनाने एक बड़ा केंद्रीय supramolecular क्लस्टर के लिए फार्म पर (cSMAC )लड़की = "xref"> 5, 6, 7। हाल ही में, यह दिखाया गया था कि एपीसी तरफ, TCR के लाइगैंडों भी 8 गुच्छा बनाती हैं।

टी सेल-एपीसी बातचीत, संकर प्रणालियों की तैनाती है, जहां एपीसी एक कृत्रिम सतह प्रासंगिक प्रोटीन के साथ क्रियाशील द्वारा मजाक उड़ाया जाता है के संदर्भ में, synaptic इंटरफेस 2, 3, 4, 5, 6, 7 की हमारी समझ उन्नत बहुत है । इस संदर्भ में, यह अत्यधिक डिजाइन करने के लिए एपीसी अनुकरण करनेवाला सतहों कि लक्ष्य सेल के एक या अधिक पहलुओं पर कब्जा प्रासंगिक है। उदाहरण के लिए, यदि लाइगैंडों समर्थित लिपिड bilayers पर grafted रहे हैं, वे दोहरी परत के विमान में विसरित कर सकते, एपीसी सतह पर स्थिति की नकल और एक ही समय में के गठन की अनुमतिcSMAC 6, 7। इसी तरह, एपीसी पर समूहों पॉलिमर 9, 10, 11, 12, 13, 14 के एक समुद्र में लाइगैंडों के द्वीपों बनाने के द्वारा मजाक उड़ाया गया है। हालांकि, इन दो सुविधाओं अब तक संयुक्त नहीं किया गया है।

यहाँ हम विरोधी CD3 (एंटीबॉडी कि TCR जटिल लक्षित करता है) की नैनो डॉट्स diffusing लिपिड के एक लिपिड दोहरी परत से घिरा बनाने के लिए एक उपन्यास तकनीक का वर्णन। दोहरी परत Langmuir-Blodgett / Langmuir-शेफ़र तकनीक 7, 15, 16 का उपयोग कर जमा किया जाता है तथा आवश्यकता पड़ने पर, एक विशिष्ट प्रोटीन के साथ क्रियाशील किया जा सकता है - उदाहरण के लिए, टी सेल इंटीग्रिन की ligand (ICAM1 कहा जाता है)। इसके अलावा, विरोधी CD3 प्रोटीन डॉट्स could एक और एंटीबॉडी या सीएएम के साथ प्रतिस्थापित किया। हम टी कोशिका आसंजन के अध्ययन के लिए मंच के रूप में भविष्य में उपयोग के लिए प्रोटीन को चुना है, वहीं यहां विस्तृत रणनीति किसी भी प्रोटीन और यहां तक ​​कि डीएनए के लिए अनुकूलित किया जा सकता।

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Protocol

1. सफाई ग्लास कवर-स्लाइड और अवलोकन मंडलों

  1. एक बहु स्लाइड polytetrafluoroethylene (PTFE) की तरह एक निष्क्रिय सामग्री से बना ट्रे पर कांच कवर स्लाइड व्यवस्थित करें।
  2. एक पृष्ठसक्रियकारक समाधान में स्लाइड के साथ ट्रे और अवलोकन कक्ष (किसी भी उत्पाद क्वार्ट्ज cuvettes सफाई उपयुक्त है के लिए अनुशंसित) को डुबो दें।
  3. (20 और 30 डिग्री सेल्सियस के बीच) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पृष्ठसक्रियकारक समाधान में एक अल्ट्रासोनिक स्नान, अति sonicate का उपयोग करना।
  4. (18.2 MΩ.cm, 0.059 μS / सेमी) ultrapure पानी के साथ 5 बार कुल्ला।
  5. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पृष्ठसक्रियकारक समाधान में अल्ट्रा sonicate (20 और 30 डिग्री सेल्सियस के बीच)।
  6. ultrapure पानी के साथ 10 बार कुल्ला।
  7. दोहराएँ दो बार 1.5 और 1.6 कदम दूर है।
  8. अप करने के लिए एक सप्ताह के लिए कमरे के तापमान (20 और 30 डिग्री सेल्सियस के बीच) में पानी में स्टोर।

2. प्रोटीन नैनो-डॉट्स के निर्माण

  1. मोती के बयान
    1. deposiटी सिलिका मोती (2% v / v, 70 μL) एक कवर स्लाइड पर ड्रॉप द्वारा ड्रॉप (24 x 24 मिमी, मोटाई 170 सुक्ष्ममापी) 15 डिग्री के झुकाव में आयोजित के निलंबन।
    2. निलंबन जबकि द्वारा 90 डिग्री हर 15 रों कांच flipping के बारे में 1 मिनट के लिए फैल करते हैं।
    3. तरल परिवेश की स्थिति के तहत लुप्त करने की अनुमति दें।
    4. एक साफ़ कांच या के लिए 2 दिनों के लिए परिवेश की स्थिति पर PTFE कक्ष में स्टोर।
  2. एल्यूमीनियम का जमाव
    1. एक एल्यूमीनियम (99%) से 105 के बारे में मिमी की दूरी पर स्लाइड (खंड 2.1 में तैयार) एक रेडियो आवृत्ति के अंदर जगह एक घूर्णन मेज पर (आरएफ) magnetron sputtering उपकरण 8,: सिलिकॉन (1%) लक्ष्य।
    2. एक टर्बो आणविक पंप का उपयोग कर 2.6 x 10 -4 पा के बयान चैम्बर नीचे पम्प। यह कदम संभव गैसीय दोष को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है।
    3. 0.8 Pa (6.6 mTorr) के एक दबाव पर 10 sccm के प्रवाह के साथ शुद्ध आर्गन वातावरण (5N, 99.999%) परिचय दें।
    4. आरएफ बिजली जनरेटर को चालू करें।
      नोट: यहाँ, 13.56 MHz आवृत्ति पर 400-600 डब्ल्यू रेडियोफ्रीक्वेंसी बिजली का एक विशिष्ट श्रेणी का उपयोग किया गया था। आरएफ जनरेटर एक संधारित्र प्लाज्मा युग्मन मोड में मेल खाने वाले नेटवर्क के साथ प्रयोग किया जाता है। परिलक्षित सत्ता पर नजर रखी और नेटवर्क अनुकूलन का उपयोग कर कम से कम है।
    5. बाद प्लाज्मा स्थिर है, 2 मिनट शटर लक्ष्य की सतह से संभव अशुद्धियों को दूर करने बंद कर दिया रखने के लिए भंग होते।
    6. शटर खोलें और 60 मिनट 200 एनएम के एक मोटाई के गिलास स्लाइड पर एल्यूमीनियम जमा करने के लिए के लिए sputtering जारी रखने के लिए अनुमति देते हैं।
    7. , आर्गन के प्रवाह कट बयान कक्ष से turbomolecular पंप अलग करने के लिए गेट वाल्व को बंद करने और स्वच्छ n के साथ चैम्बर वेंटitrogen कक्ष दबाव प्राप्त करने के लिए। एल्यूमीनियम में लिपटे स्लाइड वसूली। परिवेश की स्थिति के तहत एक साफ और भली भांति बंद करके सील कांच या PTFE बॉक्स में एक महीने तक के लिए संग्रहित करें।
  3. Organosilane की वाष्प जमाव
    1. एल्यूमीनियम में लिपटे स्लाइड कदम 2.2.6 में एक अल्ट्रासोनिक स्नान में 30 s के लिए कमरे के तापमान और अति sonicate में ultrapure पानी में तैयार (50 डब्ल्यू, 50/60 हर्ट्ज, 20 और 30 डिग्री सेल्सियस के बीच) को डुबो दें।
    2. जमा 0.5 (3-aminopropyl) -triethoxysilane (APTES) एक desiccator के तल पर की एमएल।
      चेतावनी: APTES एक organosilane, जो आसानी से वाष्पित हो और विषैला होता है है। APTES केवल एक प्रवाह हुड के नीचे और दस्ताने के साथ संभाला जाना चाहिए।
    3. एक चीनी मिट्टी ग्रिड और desiccator अंदर जगह पर कांच स्लाइड (2.3.1 में तैयार) रखो।
    4. एक झिल्ली पंप करने के लिए desiccator कनेक्ट और अधिकतम शक्ति पर चलाने के 30 मिनट के लिए एक कम निर्वात उत्पन्न करने के लिए के लिए।
    5. desiccator के वाल्व को बंद कर और पंप बंद।
    6. desiccator गरम करें1 घंटे के लिए लगभग 50 डिग्री सेल्सियस के लिए।
    7. desiccator खोलें और स्लाइड एकत्र करते हैं।
    8. कमरे के तापमान पर 48 घंटे (20 से 30 डिग्री सेल्सियस) के लिए भंडारण के लिए एक और स्वच्छ desiccator पर स्थानांतरण।
  4. प्रोटीन की पहली परत के बयान - गोजातीय सीरम albumin बायोटिन के साथ लेबल (BSA-बायोटिन)
    1. एक PTFE समर्थन पर अनुभाग 2.3 में तैयार स्लाइड में से एक रखें।
    2. जमा 1 25 माइक्रोग्राम / एमएल BSA-बायोटिन फास्फेट बफर खारा (पीबीएस) में भंग की एमएल। कमरे के तापमान (20 से 30 डिग्री सेल्सियस) पर 30 मिनट के लिए छोड़ दें।
    3. पीबीएस के साथ 10 बार कुल्ला। 4 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 24 घंटे के लिए नमूना स्टोर प्रकाश स्रोत से दूर।
  5. एल्यूमीनियम मुखौटा को हटाया
    1. एक NaOH के पीबीएस में रात भर में कमरे के तापमान (20 और 30 डिग्री सेल्सियस के बीच) पर समाधान (pH≈12 प्राप्त करने के लिए के बारे में 100 एमएल पीबीएस के लिए 1 एम NaOH के dropwise अलावा द्वारा तैयार) में स्लाइड सेते हैं।
      सावधान। NaOH संक्षारक है और दस्ताने का उपयोग कर संभाला जाना चाहिए।
    2. रिंसultrapure पानी में 10 बार।

3. समर्थित लिपिड bilayer के जमाव (SLB)

  1. Langmuir गर्त सफाई
    1. एक पंप का उपयोग कर Langmuir गर्त की PTFE बाड़े में पानी निकाल दें।
    2. एक फाहा-मुक्त गैर बुना डिस्पोजेबल क्लोरोफॉर्म में भीगे तौलिए से साफ।
      सावधान। क्लोरोफॉर्म विषैला होता है और (या एक प्रवाह हुड के नीचे) एक मुखौटा के साथ और उचित दस्ताने के साथ, एक अच्छी तरह से हवादार क्षेत्र में चालाकी से किया जाना चाहिए।
    3. गुनगुना ultrapure पानी (40 से 50 डिग्री सेल्सियस) के साथ स्वच्छ 4 बार।
    4. स्वच्छ कम से कम 6 ठंड ultrapure पानी के साथ बार।
  2. पहले लिपिड परत के बयान
    1. Langmuir गर्त की PTFE बाड़े में PTFE ट्रे रखें और फिर ultrapure पानी के साथ भरें।
    2. 0 करोड़ / मी के लिए मापा दबाव सेट करने के लिए Langmuir तंत्र के नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    3. एक 1 मिलीग्राम / एमएल लिपिड समाधान के 30 μL जमा करने के लिए एक gastight गिलास / धातु सिरिंज का उपयोग करें (1, 2-dioleoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphocholine क्लोरोफॉर्म में (DOPC)) पानी की सतह पर। क्लोरोफॉर्म का वाष्पीकरण और लिपिड अणु अनायास एक monolayer फार्म।
    4. (DOPC के लिए 27 करोड़ / मीटर) वांछित दबाव तक PTFE बाधा को बंद करने तक पहुँच जाता है द्वारा लिपिड monolayer संपीड़ित करने के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    5. एक मोटर चालित क्लैंप का उपयोग कर PTFE बाड़े में खंड 2.5.2 में तैयार गिलास स्लाइड डुबकी के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    6. स्लाइड पकड़ो, क्लैंप में, एयर पानी इंटरफ़ेस करने के लिए खड़ा। , इंटरफेस के माध्यम से यह धीरे धीरे (15 मिमी / मिनट) को बढ़ाने के लिए है, जबकि 27 करोड़ / मी पर एक निरंतर दबाव बनाए रखने के नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    7. एक शुष्क वातावरण में कमरे के तापमान पर अप करने के लिए 24 घंटे (20 और 30 डिग्री सेल्सियस के बीच) या तो तत्काल उपयोग के लिए या भंडारण के लिए जगह।
  3. दूसरा लिपिड परत के बयान
    1. 27 करोड़ / मी के वांछित मूल्य पर Langmuir गर्त में सतह दबाव बनाए रखें। का उपयोग कर सेकLangmuir उपकरण और / या के नियंत्रण सॉफ्टवेयर वांछित दबाव प्राप्त करने के लिए लिपिड की एक छोटी राशि जोड़ सकते हैं।
    2. लिपिड monolayer, धारा 3.2.6 में तैयार क्षैतिज पानी की सतह पर ले जाने के कांच स्लाइड रखें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक स्लाइड एक PTFE ट्रे ऊपर तैर रहा है।
    3. कांच स्लाइड नीचे पुश, एक समय में एक स्लाइड, उसके संगत PTFE PTFE या धातु चिमटी ऐसी है कि वे पानी में डूबे हैं का उपयोग कर ट्रे में। स्लाइड झुकाव जबकि धक्का से बचें।
    4. ultrapure पानी सुनिश्चित करें कि स्लाइड हवा के संपर्क में नहीं कर रहे हैं बनाने से भरा एक Crystallizer में स्लाइड युक्त PTFE ट्रे हस्तांतरण करने के लिए PTFE या धातु चिमटी का प्रयोग करें।
    5. , हस्तांतरण करने के लिए जबकि पानी के नीचे, एक अवलोकन कक्ष में एक दोहरी परत लेपित गिलास स्लाइड काम कर PTFE या धातु चिमटी का प्रयोग करें।
      ध्यान दें: अवलोकन कक्ष Crystallizer अंदर पानी के नीचे रखा गया है। अवलोकन कक्ष कस्टम मेड और एक रबर गैसकेट एक के साथ एक PTFE अंगूठी के होते हैघ इस्पात की बॉडी है, जो एक पानी तंग चैम्बर जिसका निचली सतह पहले से लिपिड दोहरी परत के साथ लेपित गिलास स्लाइड से बनाया गया है बनाने के लिए पानी के नीचे इकट्ठे जा सकता है।
    6. चैम्बर बंद है, जबकि पानी के नीचे काम करने के लिए जारी रखने और सुनिश्चित करना है कि पानी के बारे में 1 एमएल कक्ष के अंदर फंस गया है।
    7. पानी से बाहर इकट्ठे कक्ष लो। यकीन है कि यह पानी तंग और रिसाव नहीं हो।
    8. जोड़ने और पीबीएस 10 बार के 500 μL हटाने के द्वारा पीबीएस के साथ अवलोकन कक्ष में ultrapure पानी की 1 एमएल बदलें। सुनिश्चित करें कि चैम्बर तरल की कभी नहीं रहित है।
  4. SLB अवरुद्ध कदम
    1. अवलोकन खंड 3.3.6 में तैयार स्लाइड युक्त कक्ष में 100 माइक्रोग्राम / गोजातीय सीरम albumin एमएल (BSA) का परिचय दें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट (20 और 30 डिग्री सेल्सियस के बीच) के लिए सेते हैं।
    2. हटाने और पीबीएस 10 बार के 500 μL जोड़कर दोहरी परत रिंस करें। दोहरी परत 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए रखा जा सकता है।

4. लाइगैंडों साथ functionalization

  1. 2 माइक्रोग्राम / एमएल पर फ्लोरोसेंट या गैर फ्लोरोसेंट neutravidin (एनएवी, avidin के एक deglycosylated संस्करण 7 पीएच पर शुल्क नहीं) जोड़ें स्लाइड कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए खंड 3.4.2 में तैयार (20 और 30 डिग्री के बीच युक्त कक्ष में सी)।
  2. जोड़ने और पीबीएस 10 बार के 500 μL हटाने के द्वारा रिंस करें।
  3. खंड 3.4.2 में तैयार स्लाइड युक्त कक्ष के 2 माइक्रोग्राम / एमएल पर biotinylated विरोधी CD3 जोड़ें। SLB और डॉट्स के दोहरे functionalization के लिए, 5 माइक्रोग्राम / एमएल (यहाँ, दोहरी परत nitrilotriacetic एसिड (NTA) लिपिड के + 1% DOPC से बना है) पर एफसी-ICAM1 उनका-टैग को जोड़ने। कमरे के तापमान पर 30 मिनट (20 और 30 डिग्री सेल्सियस के बीच) के लिए छोड़ दें।
  4. जोड़ने और 10 बार पीबीएस के 500 μL निकाल कर कुल्ला
  5. जोड़ने और 10 बार सेल मध्यम के 500 μL हटाने के द्वारा सेल माध्यम के साथ पीबीएस (पीबीएस + 0.1% BSA) बदलें।
  6. chambe में सेल मध्यम के 200 μL छोड़ दोस्लाइड के साथ आर।
  7. कोशिकाओं को जोड़ने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए चैम्बर रखें।

5. सेल जमाव (विवरण के लिए संदर्भ 7 देखें)

  1. ध्यान से चेंबर में सेल निलंबन के 400 μL जमा। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए (पीएफए) paraformaldehyde के 2% के साथ सेल को ठीक करें। बार-बार हटाने और पीबीएस के 500 μL के अलावा द्वारा पीबीएस के साथ पीएफए ​​बदलें।

6. अवलोकन

  1. Proteo-lipídic नैनो-पैटर्न और SLB तरलता
    1. उचित रोशनी तरंगदैर्ध्य (639 एनएम) और फिल्टर क्यूब्स का उपयोग कर एपि-प्रतिदीप्ति मोड में प्रोटीन पैटर्न छवि के लिए एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करें (यहां जैसे, पूर्व TBP 483 + 564 + 642; बी एस TFT 506 + 582 + 659; ईएम TBP 526 + 601 688)।
      नोट: संकेत की तीव्रता के अंदर और बाहर डॉट प्रोटीन की मात्रा का अनुमान लगाने के मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। एक उचित रोशनी तरंग दैर्ध्य (330 एनएम) और च का उपयोग करेंछवि के लिए İlter घन दोहरी परत (बीपी 365/12, एफटी 395, एल.पी. 397) है, जो अंधेरे छेद के साथ उज्ज्वल दिखाई देता है।
    2. निरंतर तस्वीर विरंजन (CPB) तकनीक 13, 15 का प्रयोग करें दोहरी परत में ट्रेसर लिपिड के प्रसार निरंतर मापने के लिए। इस अवलोकन अधिमानतः सिर्फ SLB बयान के बाद किया जाता है।
      नोट: आदेश प्रसार निरंतर यों करने के लिए, दो पैरामीटर CPB प्रक्रिया के दौरान मापी जाती हैं: डाई (तना हुआ) और प्रभामंडल प्रक्षालित क्षेत्र (tauD) के आसपास का गठन की फ्लोरोसेंट प्रोफ़ाइल के क्षय लंबाई के विशिष्ट विरंजन समय। पहले CPB प्रक्रिया के दौरान प्रबुद्ध क्षेत्र के केंद्र में प्रतिदीप्ति तीव्रता के समय विकास की साजिश रचने के द्वारा प्राप्त की है। दूसरा प्रबुद्ध क्षेत्र (के बाद स्थिर राज्य तक पहुँच जाता है 12 लाइनों और 5 छवियों से अधिक औसत) के किनारे पर तीव्रता प्रोफाइल की साजिश रचने के द्वारा प्राप्त की है। घटता तना हुआ और tauD प्राप्त करने के लिए लगाया जाता है। प्रसार निरंतर टा द्वारा दिया जाता हैउद 2 / तना हुआ (डी = समीकरण )।

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Representative Results

प्रतिदीप्ति छवियों रिक्ति और डॉट्स के आकार को मापने के लिए विश्लेषण किया गया। ठेठ रिक्ति हो पाया था 1900 ± 80 एनएम और ठेठ डॉट आकार 600 ± 100 एनएम (चित्रा 1g) था। रिक्ति मुखौटा के लिए इस्तेमाल किया मोती के आकार द्वारा निर्धारित है। डॉट आकार मनका आकार के साथ ही बयान की स्थिति द्वारा निर्धारित है। SLB उन पर (चित्रा 2), छेद SLB इमेजिंग चैनल में देखा और डॉट्स एनएवी इमेजिंग चैनल में देखा के बीच सही संपूरकता के साथ प्रोटीन डॉट्स के आसपास विशिष्ट और नहीं जमा किया जाता है। निरंतर तस्वीर विरंजन डेटा के विश्लेषण से पता चलता है कि पैटर्न वाली दोहरी परत में लिपिड तरल पदार्थ रहते हैं और 5 μm² / एस (चित्रा 3) का एक विशिष्ट प्रसार निरंतर है।

आकृति 1
चित्र 1: निर्माण चरणों के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (क -7 Torr, आर्गन 10 sccm, प्रक्रिया दबाव 6.2 mTorr, 5 केवी के त्वरण वोल्टेज में imaged प्रवाह प्रारंभिक दबाव में बयान दिया। छवियों एल्यूमीनियम बयान से पहले ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी (शामिल नहीं छवि) कि मोती एक monolayer केंद्रित गिलास स्लाइड पर हेक्सागोनल जाली में व्यवस्थित होते हैं के साथ किए गए अवलोकन की पुष्टि करें। (ख) प्राथमिक मनका-मास्क को हटाने के बाद बयान धूम द्वारा बनाई एल्यूमीनियम के माध्यमिक मुखौटा। (ग) organosilane और बीएसए-बायोटिन हालांकि माध्यमिक नकाब के जमाव। (घ) एल्यूमीनियम का हटाने का खुलासा बीएसए-बायोटिन की नैनो डॉट्स। (ई) SLB का जमाव। (च) बीएसए-बायोटिन को एनएवी बाइंडिंग। (छ) बाइंडिंग विरोधी CD3 एनएवी करने के लिए। इनसेट नैनो डॉट्स सरणियों के एपि-प्रतिदीप्ति छवि को दर्शाता है। यहाँ एनएवी fluorescently लेबल है। ठेठ डॉट आकार 600 ± 100 एनएम है और ठेठ रिक्ति 1900 ± 80 एनएम है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: नैनो-डॉट और SLB पैटर्न की संपूरकता। (क, ख) फ्लोरोसेंट एनएवी नैनो डॉट्स के और फ्लोरोसेंट ट्रेसर लिपिड के SLB के एपी-प्रतिदीप्ति छवियों। (ग) SLB (हरा) के समुद्र में एनएवी डॉट्स (लाल) की समग्र छवि एनएवी और SLB का सही संपूरकता को दर्शाता है। इनसेट में फास्ट फूरियर रूपांतरण (FFT) छवि लंबी दूरी के क्रम इंगित करता है। स्केल बार: 4 सुक्ष्ममापी।rge.jpg "target =" _ blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र 3: SLB में लिपिड प्रसार की मात्रा। विरंजन से पहले एक SLB की (क) एपी-प्रतिदीप्ति छवि। प्रोटीन डॉट्स लिपिड के एक उज्ज्वल समुद्र में के रूप में अंधेरे छेद दिखाई देते हैं। क्षेत्र डायाफ्राम प्रबुद्ध क्षेत्र सीमित करता है। (ख) 50 s के लिए लगातार ब्लीचिंग के बाद SLB के एपी-प्रतिदीप्ति। प्रभामंडल क्षेत्र क्षेत्र डायाफ्राम से सीमांकित अंदर दिखाई इंगित करता है कि लिपिड मोबाइल हैं। स्केल बार: 10 सुक्ष्ममापी। (ग) क्षेत्र डायाफ्राम (ऊपर) और beaching प्रक्रिया (नीचे) के दौरान समय के साथ तीव्रता के क्षय के किनारे के साथ औसत तीव्रता प्रोफ़ाइल। इस डेटा प्रसार निरंतर है, जो आमतौर पर 5 μm² / s है निकालने के लिए विश्लेषण किया जाता है।

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Discussion

प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित के भीतर महत्वपूर्ण कदम एक समर्थित लिपिड दोहरी परत द्वारा प्रोटीन नैनो डॉट्स या डॉट्स के आसपास अंतरिक्ष के पीछे भरने के गठन से संबंधित हैं। प्रोटीन नैनो डॉट्स के संबंध में पहले महत्वपूर्ण कदम मनका-मास्क की तैयारी है। कवर स्लाइड की सफाई महत्वपूर्ण है। स्लाइड या तो एक डिटर्जेंट समाधान है कि, या ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ क्वार्ट्ज cuvettes की सफाई के लिए सिफारिश की है के साथ साफ करने की जरूरत है। इथेनॉल या आईएसओ propanol उपचार में विसर्जन की तरह अन्य सफाई तकनीक गिलास पर्याप्त हाइड्रोफिलिक प्रस्तुत करना नहीं है और इसलिए एक बड़े कवरेज मनका monolayer के गठन का समर्थन नहीं करते। इसी समय, स्लाइड की सतह Langmuir-Blodgett तकनीक 7, 15, 16 से SLB के गठन के बाद के कदम के साथ संगत की जरूरत है। अगले महत्वपूर्ण कदम बयान और एक को हटाने हैluminum। बयान sputtering तकनीक के माध्यम से है, के रूप में यहाँ किया, लक्ष्य (1% पर) सिलिकॉन के साथ doped किया जाना चाहिए। अन्यथा, अगर लक्ष्य शुद्ध एल्यूमीनियम का बना है, जमा परत कठिन क्षार हाइड्रॉक्साइड समाधान के साथ दूर करने के लिए के रूप में ऊपर शायद एल्यूमीनियम ऑक्साइड और जमा एल्यूमीनियम परत और गिलास स्लाइड सब्सट्रेट के बीच interpenetration के गठन की वजह से वर्णित है, है। बयान की अवधि प्रोटीन डॉट्स 9, तथापि, यहाँ हम एक ही बयान समय और इसलिए एकल डॉट आकार के साथ काम किया है के आकार निर्धारित करता है। नमूना बीएसए-बायोटिन के बयान के बाद एक सप्ताह के बारे में एल्यूमीनियम बयान के बाद कई महीनों के लिए परिवेश की स्थिति के तहत और के लिए भंडारित किया जा सकता है।

दूसरा महत्वपूर्ण कदम SLB के बयान से संबंधित है। कांच कवर स्लाइड की सफाई फिर से एक अत्यंत महत्वपूर्ण स्थान है। किसी भी Langmuir-Blodgett बयान काम के लिए मामला है, सभी सामग्री का इस्तेमाल किया गिलास या पो के प्रयास किए जाने चाहिएlytetrafluoroethylene (PTFE) और राजनीति को साफ किया जाना चाहिए। पहले लिपिड monolayer के बयान के बाद, कवर स्लाइड कुछ दिनों के लिए भंडारित किया जा सकता है लेकिन दूसरी monolayer के बयान के बाद, वे तुरंत इस्तेमाल किया जा करने की जरूरत है।

हम टी लसीका आसंजन पढ़ाई में उपयोग के लिए विरोधी CD3 नैनो डॉट्स बनाने के लिए प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया है जबकि 9, 13, प्रक्रिया अत्यधिक लचीला है और किसी भी biotinylated प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। लिपिड दोहरी परत की संरचना को आसानी से बदला जा सकता है और इसे आगे अगर वांछित क्रियाशील किया जा सकता है। एक महत्वपूर्ण बात पर विचार करने के लिए विशेष रूप से डॉट्स आसपास के लिपिड दोहरी परत पर, प्रोटीन के संभावित unspecific अवशोषण है।

तकनीक का मुख्य सीमा प्राथमिक मुखौटा के लिए कोलाइडयन-मनका स्वयं विधानसभा के उपयोग से उत्पन्न होती है। एक नीचे-ऊपर तकनीक होने के नाते, यह इस तरह के सभी तरीकों में से समस्याओं में से कुछ शेयरोंउदाहरण के लिए, लचीलापन और पैटर्न आकार पर पूरा नियंत्रण की कमी है। पैटर्न जाली जरूरी मनका मुखौटा की समरूपता को दर्शाता है और इसलिए हमेशा हेक्सागोनल है। पैटर्न मूल भाव के आकार एक चक्र है और मनका आकार का एक संयोजन और एल्यूमीनियम बयान 9, 13 की अवधि के द्वारा निर्धारित किया जाता। डॉट आकार को नियंत्रित करने के लिए वैकल्पिक तकनीकों को भी 14 सुझाव दिया गया है, 17, 18।

प्रोटीन, प्रोटीन-टुकड़े या पेप्टाइड्स के साथ substrates नैनो पैटर्न बड़े पैमाने पर कोशिका-सतह बातचीत, विशेष रूप से आसंजन 19 और प्रवास 20 की जांच करने के लिए अतीत में इस्तेमाल किया गया है। अग्रणी काम दिखा दिया है कि ऊतक बनाने कोशिकाओं एक दी गई सीमा से 21 से अधिक पिच, और आगे की जांच पड़ताल थानेदार के साथ पैटर्न पर प्रसार करने के लिए असफल शादी कि इस घटना की लंबाई पैमाने पर talins, जो 22 cytoskeleton actin के इंटीग्रिन रिसेप्टर्स को जोड़ने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई हैं के आकार द्वारा निर्धारित है। हालांकि, इन सभी अध्ययनों में, प्रोटीन सोने नैनो कणों, जो खुद को शीशे पर स्थिर रहे थे से जुड़े थे।

टी कोशिकाओं, proteo-lipídic झिल्ली, आम तौर पर कोशिकाओं पेश प्रतिजन नकल उतार के संदर्भ में, बड़े पैमाने पर टी कोशिका के कार्य 6 के बुनियादी पहलुओं को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया है। सरल नैनो-आकृति तकनीक धातु बाधाओं को अलग प्रोटीन क्रियाशील SLB पैच, जो संरचना और टी सेल / एपीसी इंटरफ़ेस 23 की कनेक्टिविटी में अंतर्दृष्टि प्रदान की है के साथ बाड़े बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है। नैनो-आकृति इस तरह की लेकिन प्रोटीन नैनो डॉट्स यहाँ प्रस्तावित से बहुत अलग है। हाल ही में, नैनो समूहों प्रोटीन क्रियाशील लिपिड के रासायनिक संबंध का उपयोग कर बनाया गया थाएस एस = "xref"> 3 है, जो रिसेप्टर क्लस्टरिंग के परिणाम पर प्रकाश डाला। लाभ यह है कि, वर्तमान मामले के विपरीत, समूहों सिद्धांत रूप में खुद को मोबाइल हो सकता था। हालांकि, इस तरह अनायास का गठन समूहों जरूरी कम अच्छी तरह से पूर्व का गठन प्रोटीन नैनो डॉट्स यहाँ वर्णित आकार और घनत्व के मामले में नियंत्रित कर रहे हैं।

हम परिकल्पना है कि प्रोटीन नैनो डॉट सजाया SLBs यहाँ प्रस्तुत सेल कोशिका आसंजन के विभिन्न पहलुओं की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। एक स्पष्ट सवाल है कि उठता है कि क्या, के रूप में ऊतक के गठन कोशिकाओं 19 के लिए ऊपर वर्णित है, भी एक आंतरिक लंबाई पैमाने पर आसंजन के साथ जुड़े है लिम्फोसाइटों है। प्रारंभिक परिणाम से संकेत मिलता है कि कम से कम जब आसंजन TCR जटिल द्वारा सहायता मिलती है लगता है, बल्कि अंतर से लाइगैंडों के घनत्व 12 प्रसार और सक्रियण 10, 11, के लिए परिभाषित करने पैरामीटर है 13। चाहे आसपास के SLB प्रभावों इस अवलोकन और कैसे मोबाइल और स्थिर अंशों एक साथ काम करने में मोबाइल लाइगैंडों के शामिल किए जाने के एक संभव सवाल है, जो आंशिक रूप से आत्म इकट्ठे SLB बाध्य समूहों 24 का उपयोग कर संबोधित किया है। एक और दिलचस्प आवेदन mechano संवेदन के संदर्भ में किया जाएगा जहां कोशिका आसंजन / मोबाइल और स्थिर लाइगैंडों पर सक्रियण टी कोशिकाओं 7, 25 के लिए, लेकिन यह भी कोशिकाओं है कि आदतन अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स 26 का पालन के लिए न केवल अलग होना दिखाया गया था।

इन proteo-lipídic पैटर्न के दो मुख्य लाभ उन्नत ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी और तैयार करने की कितनी आसानी से उन लोगों के साथ प्रयोग और फेंक अनुप्रयोगों संगत बना देता है साथ substrates की अनुकूलता कर रहे हैं। एल्यूमीनियम बयान के बाद, सभी तैयारी कदम एक मानक गीला-प्रयोगशाला बेंच पर किया जा सकता है। भविष्य में, यह परिकल्पना की जा सकती है कि एल्यूमीनियम में लिपटे और कांच समर्थित मनका-मास्क एक विशेष सुविधा में उत्पादित स्थानांतरित कर रहे हैं और के रूप में उपयोग के लिए जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में संग्रहीत और जरूरत पड़ने पर। ध्यान में रखते हुए इस के साथ, हम मानते हैं कि इन substrates संभावित नियंत्रित नैनो नमूनों proteo-lipídic झिल्ली के साथ कोशिकाओं की बातचीत के अध्ययन के लिए पसंद का मंच बन गया है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम सेलुलर अनुप्रयोगों के बारे में उपयोगी विचार विमर्श जारी रखने के लिए लॉरेंट Limozin, पियरे डिलार्ड और एस्ट्रिड वाहल धन्यवाद। हम यह भी SEM टिप्पणियों के साथ अपनी मदद के लिए PLANETE cleanroom सुविधा से फ़्रेडरिक बेडू धन्यवाद। इस काम के लिए आंशिक रूप से अनुदान सं 307,104 एफपी / 2007-2013 / ईआरसी के माध्यम से यूरोपीय अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass coverslips Assistent, Karl Hecht KG 
Observation chamber Home made
Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) Hella Analytics 9-307-011-4-507
Ultra-sonicator ThermoFisher
Desiccator Labbox
Crystallizer  Shott
Neutravidine Thermo Fischer Scientifique 84607
PBS  Sigma-aldrich P3813
Water MQ  ELGA, Veolia France
Silica beads Corpuscular Inc 147114-10
APTES Sigma-aldrich A3648
BSA-Biotin Sigma-aldrich A8549
DOPC Avanti Polar Lipids 850375C
Dansyl-PE Avanti Polar Lipids 810330C
Chloroform Sigma-aldrich 650471
Gastight syringe  Dominique Dustcher , France 74453
Film balance NIMA Medium
Microscope Zeiss, Germany TIRF-III system
Aluminium Target  Kurt J. Lesker Compagny, USA
Radio Frequency Magnetron sputtering Système  modified SMC 600 tool by ALCATEL , France

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References

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Benard, E., Pi, F., Ozerov, I., Charrier, A., Sengupta, K. Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer. J. Vis. Exp. (122), e55060, doi:10.3791/55060 (2017).

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