Summary
Presentiamo un protocollo per funzionalizzare vetro con macchie proteiche nanometriche circondato da un doppio strato lipidico fluido. Questi substrati sono compatibili con la microscopia ottica avanzata e si prevede di utilizzare come piattaforma per gli studi di adesione cellulare e migrazione.
Abstract
Attualmente v'è un notevole interesse per la creazione di array ordinati di isole di proteine adesive in un mare di superficie passivata per gli studi di biologia cellulare. Negli ultimi anni, è diventato sempre più chiaro che le cellule viventi rispondono, non solo per la natura biochimica delle molecole presentati a loro, ma anche per il modo in cui queste molecole sono presentati. Creazione di proteine micro-modelli è quindi ora di serie in molti laboratori di biologia; nano-modelli sono anche più accessibile. Tuttavia, nel contesto delle interazioni cellula-cellula, non v'è la necessità di modello non solo proteine, ma anche doppi strati lipidici. Tale doppia patterning proteo-lipidica, non è stato finora facilmente accessibile. Offriamo una tecnica facile per creare proteine nano-dots supportati su vetro e proporre un metodo per riempire lo spazio tra punti con un doppio strato lipidico supportato (SLB). Da fotometabolismo di tracciante lipidi fluorescenti incluse nel SLB, dimostriamo che il doppio strato presenta una considerevole in-plfluidità ane. Funzionalizzazione i puntini della proteina con gruppi fluorescenti ci permette di immagini di loro e per dimostrare che sono ordinate in modo regolare reticolo esagonale. La dimensione tipica punto è circa 800 nm e la spaziatura dimostrato qui è 2 micron. Questi substrati sono attesi per servire piattaforme utili per l'adesione cellulare, la migrazione e studi meccano-sensing.
Introduction
L'adesione cellulare avviene attraverso le molecole di adesione cellulare specializzati (CAM), proteine presenti sulla membrana cellulare che sono in grado di legarsi a loro controparte sulla matrice extracellulare o su un'altra cella. Su cellule aderite, la maggior parte delle molecole di adesione tra cui l'integrina onnipresente e caderina, si trovano in forma di cluster 1. L'interazione dei linfociti T (cellule T) con cellule presentanti l'antigene (APC) fornisce un'illustrazione particolarmente sorprendente l'importanza dei cluster recettori formata all'interfaccia tra le due cellule - spesso chiamata sinapsi immunologica. Su formare il primo contatto con i recettori delle cellule APC, T (TCR) sulla superficie dei cluster scala forma cella micron T che servono come segnalazione piattaforme 2, 3, 4, e sono eventualmente centralizzati per formare un cluster centrale supramolecolare grande (cSMAC )lass = "xref"> 5, 6, 7. Recentemente, è stato dimostrato che sul lato APC, i ligandi del TCR sono raggruppati 8.
Nel contesto di interazione cellule T-APC, l'impiego di sistemi ibridi, in cui l'APC viene imitato da una superficie artificiale funzionalizzata con proteine di interesse, ha notevolmente avanzato la nostra comprensione dell'interfaccia sinaptica 2, 3, 4, 5, 6, 7 . In questo contesto, è di grande rilevanza per la progettazione di superfici mimetiche APC che catturano uno o più aspetti della cellula bersaglio. Ad esempio, se ligandi sono innestate su bistrati lipidici supportati, possono diffondere nel piano del doppio strato, mimare la situazione sulla superficie APC e allo stesso tempo consentire la formazione dellacSMAC 6, 7. Analogamente, i cluster sulla APC sono stati imitato creando isole di ligandi in un mare di polimeri 9, 10, 11, 12, 13, 14. Tuttavia, queste due caratteristiche finora non sono stati combinati.
Qui si descrive una tecnica innovativa per creare nano-dots di anti-CD3 (un anticorpo che bersaglia il complesso TCR) circondato da un doppio strato lipidico con i lipidi diffondenti. Il doppio strato viene depositato mediante Langmuir-Blodgett / tecnica Langmuir-Schaefer 7, 15, 16 e, se desiderato, potrebbe essere funzionalizzato con una proteina specifica - per esempio, il legante di integrina cellule T (chiamato ICAM1). Inoltre, gli anti-CD3 punti proteina could essere sostituito con un altro anticorpo o CAM. Mentre abbiamo scelto le proteine per uso futuro come piattaforma per gli studi di adesione cellulare T, la strategia dettagliato qui può essere adattato per qualsiasi proteina e persino il DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. pulizia del vetro Cover-diapositive e di osservazione Chambers
- Disporre il vetro di copertura-scorre su un vassoio multi-slide in materiale inerte, come politetrafluoroetilene (PTFE).
- Immergere il vassoio con scivoli e la camera di osservazione in una soluzione di tensioattivo (qualsiasi prodotto consigliato per pulizia cuvette di quarzo è adatto).
- Utilizzando un bagno ad ultrasuoni, ultra-sonicato nella soluzione di tensioattivo per 30 minuti a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C).
- Lavare 5 volte con acqua ultrapura (18,2 MΩ.cm, 0.059 mS / cm).
- Ultra-ultrasuoni in soluzione di tensioattivo per 30 min a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C).
- Risciacquare 10 volte con acqua ultrapura.
- Ripetere i punti 1.5 e 1.6 due volte.
- Conservare in acqua a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C) per un massimo di una settimana.
2. Realizzazione di proteine Nano-punti
- Deposizione di perline
- Deposit la sospensione di perline di silice (2% v / v, 70 mL) goccia a goccia su un coperchio-slitta (24 x 24 mm, spessore 170 um) tenuti con un'inclinazione di 15 gradi.
- Lasciate che la sospensione si sviluppa per circa 1 minuto, mentre sfogliando il vetro di 90 ° ogni 15 s.
- Che il liquido evapori in condizioni ambiente.
- Conservare in un bicchiere pulito o camera PTFE in condizioni ambiente per un massimo di 2 giorni.
- Deposizione di alluminio
- Porre i vetrini (preparati in sezione 2.1) all'interno una frequenza radio (RF) magnetron sputtering attrezzature 8, su una tavola rotante ad una distanza di circa 105 mm dal in alluminio (99%): silicio (1%) porta.
- Pump down della camera di deposizione a 2,6 x 10 -4 Pa utilizzando una pompa turbomolecolare. Questo passaggio è importante per la rimozione di eventuali impurezze gassose.
- Introdurre pura atmosfera di Argon (5N, 99,999%) con un flusso di 10 sccm a una pressione di 0,8 Pa (6,6 mTorr).
- Accendere il generatore di potenza RF.
NOTA: Qui, è stata utilizzata una gamma tipica di 400-600 W di potenza a radiofrequenza a frequenza 13,56 MHz. Il generatore RF viene utilizzato con una rete di adattamento in una modalità di accoppiamento capacitivo plasma. La potenza riflessa è monitorata e minimizzata utilizzando l'adattamento rete. - Dopo il plasma è stabilizzato, sputter per 2 min mantenere l'otturatore chiuso per rimuovere eventuali impurezze dalla superficie del bersaglio.
- Aprire l'otturatore e consentire lo sputtering proseguire per 60 min per depositare alluminio sul vetrino ad uno spessore di 200 nm.
- Tagliare il flusso di argon, chiudere la valvola a saracinesca per isolare la pompa turbomolecolare dalla camera di deposizione e sfiatare la camera con pulito nitrogen per ottenere la pressione ambiente. Recuperare i vetrini rivestiti di alluminio. Conservare fino a un mese in una scatola di vetro o PTFE pulito e chiuso ermeticamente in condizioni ambientali.
- deposizione a vapore di organosilano
- Immergere il vetrino rivestito di alluminio-preparata nella fase 2.2.6 in acqua ultrapura a temperatura ambiente e ultra-ultrasuoni per 30 s in bagno ad ultrasuoni (50 W, 50/60 Hz, tra 20 e 30 ° C).
- Deposito 0,5 mL di (3-amminopropil) -triethoxysilane (APTES) al fondo di un essiccatore.
ATTENZIONE: APTES è un organosilano, che evapora facilmente ed è tossico. APTES devono essere trattati solo sotto un flusso cappuccio e con i guanti. - Mettere i vetrini (preparati in 2.3.1) su una griglia ceramica e posto all'interno essiccatore.
- Collegare l'essiccatore ad una pompa a membrana e funzionare alla massima potenza per 30 min per generare un basso vuoto.
- Chiudere la valvola di essiccatore e spegnere la pompa.
- Scaldare l'essiccatorea circa 50 ° C per 1 h.
- Aprire un essiccatore e raccogliere le diapositive.
- Trasferimento ad un altro essiccatore pulito per memorizzare fino a 48 ore a temperatura ambiente (da 20 a 30 ° C).
- Deposizione di primo strato di proteine - sieroalbumina bovina marcata con biotina (BSA-biotina)
- Mettere uno dei vetrini preparati nella sezione 2.3 su un supporto in PTFE.
- Cassetta 1 ml di 25 mg / ml BSA-biotina sciolti in tampone fosfato isotonico (PBS). Lasciare agire per 30 minuti a temperatura ambiente (da 20 a 30 ° C).
- Risciacquare 10 volte con PBS. Conservare il campione fino a 24 ore a 4 ° C al riparo dalla sorgente luminosa.
- Rimozione di maschera in alluminio
- Incubare i vetrini in una soluzione di NaOH in PBS (preparato da gocce di NaOH 1 M e circa 100 ml di PBS per ottenere pH≈12) durante la notte a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C).
ATTENZIONE. NaOH è corrosivo e deve essere maneggiato con i guanti. - Sciacquare10 volte in acqua ultrapura.
- Incubare i vetrini in una soluzione di NaOH in PBS (preparato da gocce di NaOH 1 M e circa 100 ml di PBS per ottenere pH≈12) durante la notte a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C).
3. Deposizione di supportati doppio strato lipidico (SLB)
- Pulizia della depressione Langmuir
- Rimuovere l'acqua nel contenitore PTFE del trogolo Langmuir utilizzando una pompa.
- Pulito con un panno monouso non tessuto privo di lanugine imbevuto di cloroformio.
ATTENZIONE. Il cloroformio è tossico e deve essere manipolato in un'area ben ventilata, con una maschera (o sotto flusso-cappa) e con i guanti appropriati. - Pulite 4 volte con acqua ultrapura tiepida (40 a 50 ° C).
- Pulire almeno 6 volte con acqua ultrapura fredda.
- Deposizione del primo strato lipidico
- Posizionare i vassoi di PTFE nel recinto PTFE del trogolo Langmuir e poi riempirlo con acqua ultrapura.
- Utilizzare il software di controllo dell'apparato Langmuir per impostare la pressione misurata a 0 mN / m.
- Utilizzare una siringa di vetro a tenuta di gas / metallo di depositare 30 microlitri di una / soluzione lipidica mL 1 mg (1, 2-dioleoyl- sn -glycero-3-fosfocolina (DOPC) in cloroformio) sulla superficie dell'acqua. Il cloroformio evaporare e le molecole lipidiche spontaneamente formano un monostrato.
- Utilizzare il software di controllo per comprimere il monostrato lipidico chiudendo la barriera PTFE fino alla pressione desiderata (27 mN / m per DOPC) viene raggiunto.
- Utilizzare il software di controllo di immergere il vetrino preparato in sezione 2.5.2 nel contenitore di PTFE utilizzando un morsetto motorizzato.
- Tenere il vetrino, nel morsetto, perpendicolare all'interfaccia aria-acqua. Utilizzare il software di controllo di aumentare lentamente (15 mm / min) attraverso l'interfaccia, mantenendo costante la pressione a 27 mN / m.
- Posto in un ambiente secco sia per uso immediato o per la conservazione fino a 24 ore a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C).
- Deposizione del secondo strato lipidico
- Mantenere la pressione superficiale nel trogolo Langmuir al valore desiderato di 27 mN / m. Comprimere utilizzando ilsoftware di controllo del dispositivo e / o Langmuir aggiungere una piccola quantità di lipidi per ottenere la pressione desiderata.
- Porre i vetrini trasportano il monostrato lipidico, preparato in sezione 3.2.6, orizzontalmente sulla superficie dell'acqua. Assicurarsi che ciascuna slitta galleggia sopra un vassoio PTFE.
- Spingere i vetrini giù, una diapositiva alla volta, nel suo vassoio di PTFE corrispondente con PTFE o metallo pinzette tale che sono immersi in acqua. Evitare di inclinare le diapositive mentre si spinge.
- Utilizzare PTFE o metallo pinzetta per trasferire i vassoi di PTFE contenenti i vetrini in un cristallizzatore riempito con acqua ultrapura assicurandosi che i vetrini non sono esposti all'aria.
- Utilizzare PTFE o metallo pinzette per trasferire, mentre lavora sott'acqua, un doppio strato rivestito vetrino in una camera di osservazione.
NOTA: La camera di osservazione è posto sotto acqua all'interno del cristallizzatore. La camera di osservazione è personalizzato e costituito da un anello in PTFE con una guarnizione in gommaintelaiature d'acciaio d, che possono essere assemblati subacqueo per fare una camera stagna la cui superficie inferiore è realizzato dal vetrino precedentemente rivestito con il doppio strato lipidico. - Chiudere la camera pur continuando a lavorare sott'acqua e assicurando che circa 1 mL di acqua è intrappolato all'interno della camera.
- Prendere la camera assemblato fuori dall'acqua. Assicurarsi che è libero a tenuta d'acqua e perdite.
- Sostituire i 1 ml di acqua ultrapura presente nella camera di osservazione con PBS aggiungendo e rimuovendo 500 microlitri di PBS per 10 volte. Assicurarsi che la camera non è mai priva di liquido.
- SLB passo blocco
- Introdurre 100 ug / ml di albumina di siero bovino (BSA) nella camera di osservazione contenente il vetrino preparato in sezione 3.3.6 e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C).
- Risciacquare bistrato rimuovendo e aggiungendo 500 pl di PBS per 10 volte. Il doppio strato può essere mantenuta 24 ore a 4 ° C.
4. Funzionalizzazione con ligandi
- Aggiungere fluorescente o neutravidina non fluorescente (VPN, una versione deglicosilata di avidina non caricata a pH 7) a 2 ug / ml nella camera contenente il vetrino preparato in sezione 3.4.2 per 30 min a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C).
- Risciacquare aggiungendo e rimuovendo 500 microlitri di PBS per 10 volte.
- Aggiungere biotinilato anti-CD3 a 2 ug / mL alla camera contenente il vetrino preparato in sezione 3.4.2. Per doppia funzionalizzazione della SLB e puntini, aggiungere Fc-ICAM1 His-tag a 5 mg / ml (qui, il doppio strato è fatto di DOPC + 1% di acido nitrilotriacetico NTA) lipidi (). Lasciare agire per 30 minuti a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C).
- Risciacquare aggiungendo e rimuovendo 500 microlitri di PBS 10 volte
- Sostituire la PBS con mezzo di cella (PBS + 0,1% BSA) aggiungendo e rimuovendo 500 microlitri del mezzo cellulare 10 volte.
- Lasciare 200 ml di media cella nel Chamber con la slitta.
- Posizionare la camera per 10 min a 37 ° C prima di aggiungere le cellule.
5. cellulare Deposizione (rinvio 7 per i dettagli)
- depositare accuratamente 400 microlitri della sospensione cellulare nella camera. Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C.
- Fissare la cella con il 2% di paraformaldeide (PFA) per 15 min a 37 ° C. Sostituire il PFA con PBS mediante rimozione ripetuta e l'aggiunta di 500 ml di PBS.
6. osservazione
- Proteo-lipidico Nano-modello e la fluidità SLB
- Utilizzare un microscopio a fluorescenza per l'immagine del profilo proteico in modalità epi-fluorescenza utilizzando appropriata lunghezza d'onda di illuminazione (639 nm) e cubi filtro (p.es. qui, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688).
NOTA: L'intensità del segnale può essere quantificata per stimare la quantità di proteine dentro e fuori il punto. Utilizzare opportuna lunghezza d'onda di illuminazione (330 nm) ed fcubo ilter all'immagine bistrato (BP 365/12, FT 395, LP 397), che appare luminoso con fori scuri. - Usare la tecnica continua fotobleaching (CPB) 13, 15 per misurare la costante diffusione dei lipidi traccianti nel doppio strato. Questa osservazione è preferibilmente realizzato subito dopo la deposizione SLB.
NOTA: Al fine di quantificare la costante di diffusione, due parametri sono misurati durante CPB processo: il tempo sbianca specifica del colorante (teso) e la lunghezza di caduta del profilo fluorescente dell'alone formata intorno alla zona sbiancato (TAUD). Il primo è ottenuto tracciando l'evoluzione temporale della fluorescenza al centro del campo illuminato durante il processo di CPB. La seconda è ottenuta tracciando il profilo di intensità ai margini della zona illuminata (media su 12 linee e 5 immagini dopo il raggiungimento dello stato stazionario). Le curve sono montati avere tesa e TAUD. La costante diffusione è dato da tauD 2 / teso (D =
).
- Utilizzare un microscopio a fluorescenza per l'immagine del profilo proteico in modalità epi-fluorescenza utilizzando appropriata lunghezza d'onda di illuminazione (639 nm) e cubi filtro (p.es. qui, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688).
). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le immagini di fluorescenza sono stati analizzati per misurare la distanza e la dimensione dei puntini. Spaziatura tipico è risultato essere 1.900 ± 80 nm e tipico dot-size era 600 ± 100 nm (Figura 1g). La spaziatura viene impostato dalla dimensione dei granuli utilizzati per la maschera. Dot-dimensioni è impostato dal tallone-size e condizioni di deposizione. La SLB è depositato unicamente attorno ai punti proteine e non sulla loro (figura 2), con perfetta complementarietà tra i fori osservati in canali di imaging SLB ei punti visti nel canale di imaging NAV. Analisi dei dati continui fotobleaching mostra che i lipidi nel doppio strato modellato rimanere fluida e avere una costante diffusione tipica su 5 μm² / s (Figura 3).
Figura 1: Rappresentazione schematica di fasi di fabbricazione. (un -7 Torr, Argon Flusso 10 sccm, pressione di processo 6.2 mTorr, ripreso in tensione di accelerazione di 5 kV. Le immagini confermano osservazione fornito con microscopia ottica (immagine escluso) prima deposizione di alluminio che le sfere sono disposte in un monostrato centrata reticolo esagonale sul vetro-scivolo. (B) maschera secondaria dell'alluminio creato dalla deposizione per polverizzazione catodica dopo la rimozione del primario tallone maschera. (C) deposizione di organosilani e BSA-biotina se la maschera secondaria. (D) La rimozione di alluminio rivelare nano-dots di BSA-biotina. (E) Deposizione di SLB. (F) rilegatura NAV per BSA-biotina. (G) Binding anti-CD3 al NAV. immagine epi-fluorescenza delle matrici nano-dots inserto mostra. Qui il NAV è fluorescente. Tipico dot-dimensioni è di 600 ± 100 nm e la spaziatura tipico è 1,900 ± 80 nm. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: complementarità del nano-dot e modello SLB. (A, b) immagini Epi-fluorescenza di fluorescenti NaV nano-puntini e di SLB con lipidi traccianti fluorescenti. (C) l'immagine Composite dei puntini NaV (rosso) nel mare di SLB (verde) indica perfetta complementarità del NAV e SLB. immagini veloce di Fourier Transform (FFT) nel cestello indica ordine a lungo raggio. barra della scala: 4 micron.rge.jpg" target = '_ blank'> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Quantificazione di lipidi diffusione nel SLB. (A) un'immagine Epi-fluorescenza di uno SLB prima sbianca. I punti di proteine mostrano buchi scuri in un mare luminoso di lipidi. Il campo-diaframma limita l'area illuminata. (B) Epi-fluorescenza SLB dopo sbiancamento continuamente per 50 s. L'alone visibile all'interno della regione delimitata dal campo diaframma indica che i lipidi sono mobili. barra della scala: 10 micron. (C) il profilo medio di intensità lungo il bordo del campo-membrana (in alto) e il decadimento di intensità nel tempo durante il processo di alaggio (in basso). Questi dati vengono analizzati per estrarre la costante di diffusione, che è tipicamente 5 μm² / s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le fasi critiche nel protocollo sopra descritto sono legati alla formazione della proteina nano-punti o back-riempimento dello spazio intorno ai punti da un bistrato lipidico supportato. Il primo passo critico rispetto alle proteine nano-dots è la preparazione del cordone maschera. La pulizia del coperchio-scivolo è critica. I vetrini devono essere sia pulito con una soluzione detergente che è raccomandato per pulizia cuvette di quarzo, o con plasma di ossigeno. Altre tecniche di pulizia come immersione in etanolo o trattamento iso-propanolo non rendono il vetro sufficientemente idrofila e quindi non supportano la formazione di un cordone monostrato grande copertura. Allo stesso tempo, la superficie del vetrino deve essere compatibile con la successiva fase di formazione della SLB da Langmuir-Blodgett tecnica 7, 15, 16. Il passo successivo è critica la deposizione e la rimozione di unluminum. Se la deposizione avviene tramite sputtering, come fatto qui, il bersaglio deve essere drogato con silicio (all'1%). Altrimenti, se il bersaglio è in alluminio puro, lo strato depositato è difficile da rimuovere con la soluzione di idrossido alcalino come descritto sopra, probabilmente a causa della formazione di ossido di alluminio e compenetrazione tra lo strato di alluminio depositato ed il substrato vetrino. La durata della deposizione determina la dimensione dei punti proteici 9, tuttavia, qui abbiamo lavorato con un singolo tempo di deposizione e dimensione pertanto singolo punto. Il campione può essere conservato in condizioni ambiente per diversi mesi dopo la deposizione di alluminio e per circa una settimana dopo la deposizione di BSA-biotina.
Il secondo passo cruciale riguarda la deposizione dello SLB. Pulizia del vetro di copertura-scivolo è di nuovo un punto cruciale importanza. Come è il caso per qualsiasi lavoro deposizione Langmuir-Blodgett, tutto il materiale utilizzato deve essere di vetro o di Polytetrafluoroethylene (PTFE) e dovrebbe essere scrupolosamente puliti. Dopo la deposizione del primo monostrato lipidico, i copri-vetrini possono essere conservati per un paio di giorni, ma dopo la deposizione del secondo monostrato, hanno bisogno di essere utilizzato immediatamente.
Mentre abbiamo dimostrato il protocollo per la generazione di anti-CD3 nano-dots per l'uso in studi linfociti T adesione 9, 13, la procedura è molto flessibile e può essere adattato per qualsiasi proteina biotinilata. La composizione del doppio strato lipidico può essere facilmente cambiata e può essere ulteriormente funzionalizzata se desiderato. Un punto importante da considerare è l'eventuale assorbimento non specifico di proteine, in particolare sul doppio strato lipidico che circonda i puntini.
La limitazione principale della tecnica deriva dall'uso di colloidale-bead auto-assemblaggio per la maschera principale. Essendo una tecnica bottom-up, condivide alcuni dei problemi di tutti questi approcciper esempio, la mancanza di flessibilità e il pieno controllo della forma del modello. Il reticolo reticolo riflette necessariamente la simmetria della maschera tallone ed è quindi sempre esagonale. La forma del modello motivo è un cerchio ed è determinato dalla combinazione del cordone di dimensioni e la durata della deposizione di alluminio 9, 13. Tecniche alternative per il controllo della dimensione dei punti sono stati anche suggerito 14, 17, 18.
Substrati nanomodelli con proteine, proteine-frammenti o peptidi sono stati ampiamente utilizzati in passato per sondare interazioni cellula-superficie, specialmente adesione 19 e migrazione 20. Pionieristica ha dimostrato che le cellule del tessuto formante riescono a diffondersi sui modelli con un passo maggiore di una certa soglia 21, e in seguito sho indagini mer che la lunghezza scala di questo fenomeno è impostata dalla dimensione del Talins, strumentali nel collegare recettori di integrina alla actina citoscheletro 22. Tuttavia, in tutti questi studi, le proteine sono state legate a oro nano-particelle, esse pure immobilizzato su vetro.
Nel contesto delle cellule T, membrane Proteo-lipidico, tipicamente mimano cellule che presentano antigeni, sono stati ampiamente utilizzati per comprendere gli aspetti fondamentali della funzione delle cellule T 6. Tecniche di nano-patterning ingegnosi sono stati utilizzati per creare recinti con barriere metalliche proteine separazione patch SLB funzionalizzati, che hanno fornito comprensione della struttura e la connettività della cellula T / APC interfaccia 23. Questo tipo di nano-patterning è comunque molto diverso dalla proteina nano-punti proposti qui. Recentemente, nano cluster sono stati creati utilizzando linkage chimica delle proteine funzionalizzato lipidiss = "xref"> 3, che messo in luce la conseguenza di recettore clustering. Il vantaggio è che, a differenza del caso di specie, i cluster possono, in linea di principio essere se stessi mobili. Tuttavia, tali cluster spontaneamente formate vengono necessariamente meno ben controllati in termini di dimensioni e densità di preformati proteina nano-punti descritti qui.
Prevediamo che la proteina SLB decorate nano-dot presentati qui può essere utilizzato per indagare i diversi aspetti di adesione cellula-cellula. Una domanda ovvia che si pone è se, come descritto sopra per tessuti formanti celle 19, linfociti anche avere un intrinseca lunghezza scala associata con adesione. I risultati preliminari sembrano indicare che almeno quando l'adesione è mediata dal complesso TCR, la densità dei ligandi anziché spaziatura è il parametro di definizione per la diffusione e l'attivazione 10, 11, 12
I due vantaggi principali di questi modelli Proteo-lipidico sono la compatibilità dei substrati con microscopia ottica avanzata e la facilità di preparazione che li rende compatibili con le applicazioni uso e getta. Successivamente alla deposizione di alluminio, tutte le fasi di preparazione possono essere eseguite su un banco di wet-lab norma. In futuro, si può prevedere che il tallone e maschere vetro supportato prodotte in una struttura specializzata vengono trasferiti e memorizzati nei laboratori di biologia per uso come e quando richiesto alluminio rivestito. In questa prospettiva, riteniamo che questi substrati hanno il potenziale per diventare la piattaforma di riferimento per lo studio della interazione delle cellule con membrane Proteo-lipidico nano-fantasia controllati.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Laurent Limozin, Pierre Dillard e Astrid Wahl per continuare discussioni fruttuose su applicazioni cellulari. Ringraziamo anche Frederic Bedu dalla struttura camera bianca PLANETE per il suo aiuto con le osservazioni SEM. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal Consiglio europeo della ricerca tramite concessione n ° 307.104 FP / 2007-2013 / ERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | ||
| Observation chamber | Home made | ||
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 | |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | ||
| Desiccator | Labbox | ||
| Crystallizer | Shott | ||
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 | |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 | |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | ||
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 | |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 | |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C | |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 | |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 | |
| Film balance | NIMA | Medium | |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system | |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | ||
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
References
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York. (2002).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Kaizuka, Y., et al. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
- Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).
- Grakoui, A., et al. The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation. Science. 285, 221-228 (1999).
- Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells. Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).
- Lu, X., et al. Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).
- Pi, F., Dillard, P., et al. Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells. Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).
- Deeg, J., et al. T cell activation is determined by the number of presented antigens. Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).
- Delcassian, D., et al. Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells. Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).
- Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays. Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).
- Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization. Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).
- Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies. Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).
- Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion. Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).
- Sengupta, K., et al. Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid. Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).
- Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography. Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).
- Massou, S., et al. Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates. Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).
- Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion. Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).
- Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Schvartzman, M., et al. Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level. Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).
- Mossman, K., Groves, J. Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse. Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).
- Furlan, G., et al. Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters. J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).
- Hsu, C. J., et al. Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation. PloS One. 7 (2), e32398 (2012).
- Yu, C., et al. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).
