Summary
Apresenta-se um protocolo para funcionalizar vidro com manchas proteicas nanométricas rodeado por uma bicamada lipídica fluida. Estes substratos são compatíveis com microscopia óptica avançado e espera-se para servir como plataforma para estudos de adesão celular e de migração.
Abstract
Actualmente há um grande interesse em criar matrizes ordenadas de ilhas de proteínas adesivas num mar do superficial passivada para estudos de biologia celular. Nos últimos anos, tornou-se cada vez mais claro que as células vivas responder, não só para a natureza bioquímica das moléculas que lhes são apresentados, mas também à maneira como essas moléculas são apresentados. Criando proteína micro-padrões é, portanto, agora um padrão em muitos laboratórios de biologia; nano-padrões também são mais acessíveis. No entanto, no contexto de interacções célula-célula, existe uma necessidade de padrão não só proteínas, mas também bicamadas lipídicas. Tal padronização dupla proteo-lipídica até agora não tem sido facilmente acessível. Oferecemos uma técnica fácil para criar proteínas nano-pontos suportados em vidro e propor um método para aterrar o espaço inter-ponto com uma bicamada lipídica suportado (SLB). A partir de foto-branqueamento de traçador lipídios fluorescentes incluídos no SLB, demonstramos que a bicamada exibe considerável-plfluidez ane. Funcionalização os pontos de proteínas com grupos fluorescentes nos permite imagem los e mostrar que eles são ordenados em uma rede hexagonal regular. O tamanho típico ponto é de cerca de 800 nm e o espaçamento aqui demonstrada é de 2 micra. Estes substratos são esperados para servir como plataformas úteis para a adesão celular, a migração e estudos mecano-sensores.
Introduction
A adesão celular tem lugar através de moléculas de adesão de células especializadas (CAMs), proteínas presentes na membrana de células que são capazes de se ligar a sua contraparte na matriz extra celular ou noutra célula. Em culas aderentes, a maioria das moléculas de adesão incluindo a integrina ubíqua e caderina, encontram-se na forma de agregados 1. A interacção dos linfócitos T (células T) com as células apresentadoras de antígenos (APCs) fornece uma ilustração particularmente notável da importância dos aglomerados de receptores formados na interface entre as duas células - muitas vezes chamada uma sinapse imunológica. Após a formação do primeiro contacto com os receptores de células APC, T (TCRs) sobre a superfície dos agregados de escala forma célula micron T que servem de sinalização plataformas 2, 3, 4, e, eventualmente, são centralizados para formar um agrupamento supramolecular central maior (cSMAC )lass = "xref"> 5, 6, 7. Recentemente, foi mostrado que no lado do APC, os ligandos de TCR também estão agrupados 8.
No contexto de células T-APC interacção, a implementação de sistemas híbridos, onde o APC é mimetizado por uma superfície artificial funcionalizadas com proteínas relevantes, avançou significativamente a nossa compreensão da interface sináptica 2, 3, 4, 5, 6, 7 . Neste contexto, é altamente relevante para desenhar superfícies miméticos APC que capturam um ou mais aspectos da célula alvo. Por exemplo, se os ligandos são enxertados em bicamadas lipídicas com suporte, que pode difundir-se no plano da bicamada, mimetizar a situação na superfície da APC e ao mesmo tempo permitir que a formação dacSMAC 6, 7. Da mesma forma, os aglomerados sobre o APC foram imitada através da criação de ilhas de ligandos num mar de polímeros 9, 10, 11, 12, 13, 14. No entanto, estas duas características têm até agora não foram combinados.
Aqui, descrevemos uma nova técnica para criar nano-pontos de anti-CD3 (um anticorpo que tem como alvo o complexo TCR) rodeado por uma bicamada lipídica com os lípidos que se difundem. A bicamada é depositada utilizando Langmuir-Blodgett / técnica de Langmuir-Schaefer 7, 15, 16 e, se desejado, pode ser funcionalizado com uma proteína específica - por exemplo, o ligando da integrina da célula T (chamado ICAM1). Além disso, os anti-CD3 pontos proteína could ser substituído com um outro anticorpo ou CAM. Enquanto nós escolhemos as proteínas para uso futuro como plataforma para estudos de adesão de células T, a estratégia detalhado aqui pode ser adaptado para qualquer proteína e mesmo DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. A limpeza dos vidros Capa-slides e câmaras de observação
- Organizar as coberturas de lâminas de vidro sobre um tabuleiro multi-deslizante feito de um material inerte tal como o politetrafluoroetileno (PTFE).
- Mergulha-se o tabuleiro com lâminas e a câmara de observação numa solução de agente tensioactivo (qualquer produto recomendado para a limpeza de cuvetes de quartzo é apropriado).
- Utilizando um banho de ultra-sons, ultra-sonicado na solução de surfactante durante 30 min à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C).
- Lavar 5 vezes com água ultrapura (18,2 MΩ.cm, 0,059 S / cm).
- Ultra-sonicado em solução surfactante durante 30 min à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C).
- Lavagem de 10 vezes com água ultrapura.
- Repita os passos 1.5 e 1.6, duas vezes.
- Armazenar em água à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C) durante até uma semana.
2. Fabricação de proteína Nano-pontos
- Deposição de contas
- deposit a suspensão de contas de sílica (2% v / v, 70 mL) gota a gota em um-corrediça de cobertura (24 x 24 mm, espessura de 170 um), realizada com uma inclinação de 15 graus.
- Deixe a suspensão espalhada durante cerca de 1 min, enquanto que lança o vidro de 90 ° a cada 15 s.
- Permitir que o líquido se evaporar sob condições ambiente.
- Armazenar em um vidro limpo ou câmara de PTFE em condições ambientais durante até 2 dias.
- Deposição de alumínio
- Colocar as lâminas (preparada na secção 2.1) dentro de uma frequência de rádio de pulverização catódica equipamento (RF) magnetrão 8, sobre uma mesa rotativa a uma distância de cerca de 105 mm a partir de uma lata de alumínio (99%): silício (1%) alvo.
- Bombeiam para baixo a câmara de deposição de 2,6 x 10 -4 Pa através de uma bomba turbomolecular. Esta etapa é importante para a remoção de possíveis impurezas gasosas.
- Introduzir puro atmosfera de Árgon (5N, 99,999%) com um fluxo de 10 sccm a uma pressão de 0,8 Pa (6,6 mTorr).
- Ligue o gerador de energia RF.
NOTA: Aqui, foi utilizada uma gama típica de 400-600 W de energia de radiofrequência a 13,56 MHz de frequência. O gerador de RF é utilizada com uma Rede de adaptao de um modo de acoplamento do plasma capacitiva. A energia reflectida é monitorado e minimizado utilizando a adaptação da rede. - Após o plasma é estabilizado, de descarga eléctrica durante dois minutos, mantendo o obturador fechado para remover possíveis impurezas da superfície do alvo.
- Abrir o obturador e permitir a pulverização continue durante 60 min a depositar alumínio sobre a lâmina de vidro até uma espessura de 200 nm.
- Cortar o fluxo de árgon, fechar a válvula de gaveta para isolar a bomba turbomolecular a partir da câmara de deposição e ventilar a câmara com n limpoitrogen para obter a pressão ambiente. Recuperar as lâminas revestidas com alumínio. Armazenar por até um mês em uma caixa de vidro ou PTFE limpo e hermeticamente fechado em condições ambientais.
- de deposição de vapor de organossilano
- Imergir a lâmina revestida de alumínio preparado no passo 2.2.6 em água ultrapura, à temperatura ambiente e ultra-sonicação durante 30 s num banho de ultra-sons (50 W, 50/60 Hz, entre 20 e 30 ° C).
- Depósito de 0,5 mL de (3-aminopropil) -triethoxysilane (APTES) na parte inferior de um exsicador.
CUIDADO: APTES é um organossilano, que evapora facilmente e é tóxico. APTES deve ser manuseado apenas sob um fluxo-capuz e com luvas. - Coloque as lâminas de vidro (preparadas em 2.3.1) em uma grade de cerâmica e coloque dentro do secador.
- Ligue o exsicador para uma bomba de membrana e na potência máxima durante 30 min para gerar um vácuo baixo.
- Fechar a válvula do exsicador e desligar a bomba.
- Aquecer o secadora cerca de 50 ° C durante 1 h.
- Abra o exsicador e recolher os slides.
- Transferir para outro exsicador limpo para armazenamento de até 48 horas à temperatura ambiente (20 a 30 ° C).
- Deposição de primeira camada de proteína - albumina de soro bovino marcada com biotina (BSA-biotina)
- Coloque uma das lâminas preparadas na seção 2.3 sobre um suporte de PTFE.
- Depósito 1 mL de 25 ug / mL de BSA-biotina dissolvida em tampão fosfato salino (PBS). Deixar durante 30 minutos à temperatura ambiente (20 a 30 ° C).
- Enxaguar 10 vezes com PBS. Armazenar a amostra durante até 24 h a 4 ° C para longe da fonte de luz.
- Remoção de máscara de alumínio
- Incubar as lâminas numa solução de NaOH em PBS (preparado por adição gota a gota de NaOH 1 M a cerca de 100 mL de PBS para se obter pH≈12) durante a noite à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C).
CUIDADO. NaOH é corrosivo e deve ser manuseado com luvas. - Rinse10 vezes em água ultrapura.
- Incubar as lâminas numa solução de NaOH em PBS (preparado por adição gota a gota de NaOH 1 M a cerca de 100 mL de PBS para se obter pH≈12) durante a noite à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C).
3. A deposição de Compatível Lipid Bilayer (SLB)
- Limpeza da calha Langmuir
- Remover a água no compartimento de PTFE da calha de Langmuir utilizando uma bomba.
- Limpo com uma toalha descartável não tecido que não solte fiapos embebido em clorofórmio.
CUIDADO. O clorofórmio é tóxico e deve ser manipulada numa área bem ventilada, com uma máscara (ou sob um fluxo-capa) e com luvas apropriadas. - Limpos 4 vezes com água ultrapura morna (40-50 ° C).
- Limpas pelo menos 6 vezes com água ultrapura frio.
- A deposição da primeira camada de lípido
- Coloque bandejas de PTFE no recinto de PTFE da calha de Langmuir e depois enchê-lo com água ultrapura.
- Usar o software de controlo do aparelho de Langmuir para definir a pressão medida a 0 mN / m.
- Usar uma seringa estanque a gases de vidro / metal a depositar 30 uL de uma solução de lípidos de 1 mg / mL (1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) em clorofórmio) sobre a superfície da água. O clorofórmio e evapora-se as moléculas de lípidos formam espontaneamente uma monocamada.
- Usar o software de controlo para comprimir a monocamada de lípidos, fechando a barreira de PTFE até que a pressão desejada (27 mN / m para DOPC) é alcançado.
- Usar o software de controlo para mergulhar a lâmina de vidro preparado na secção 2.5.2 para dentro do invólucro de PTFE utilizando uma braçadeira motorizado.
- Segurar a corrediça, na braçadeira, perpendicular à interface ar-água. Usar o software de controlo para elevá-lo lentamente (15 mm / min) através da interface, enquanto se mantém uma pressão constante a 27 mN / m.
- Lugar num ambiente seco, quer para uso imediato ou para armazenamento até 24 horas à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C).
- A deposição da segunda camada lipídica
- Manter a pressão de superfície na tina de Langmuir no valor desejado de 27 mN / m. Comprimir usando osoftware do aparelho de Langmuir e / ou controlo de adicionar uma pequena quantidade de lípido para alcançar a pressão desejada.
- Colocar as lâminas de vidro que transportam a monocamada de lípidos, preparada na secção 3.2.6, na horizontal sobre a superfície da água. Assegure-se que cada lâmina está a flutuar por cima de um tabuleiro de PTFE.
- Empurrar as lâminas de vidro para baixo, uma lâmina de cada vez, para a sua bandeja de PTFE correspondente utilizando PTFE ou metal pinça de tal modo que eles são imersos na água. Evite inclinar os slides enquanto empurra.
- Use PTFE ou metal pinças para transferir as bandejas de PTFE contendo os deslizamentos em um cristalizador preenchido com água ultrapura certificando-se de que as lâminas não são expostas ao ar.
- Use PTFE ou metal pinças para transferir, durante o trabalho debaixo de água, uma bicamada revestido lâmina de vidro para uma câmara de observação.
NOTA: A câmara de observação é colocado debaixo de água no interior do cristalizador. A câmara de observação é feito sob medida e consiste de um anel de PTFE com um uma junta de borrachainvólucros de aço d, que podem ser montados debaixo de água para fazer uma câmara estanque à água, cuja superfície inferior é feita a partir da lâmina de vidro revestida previamente com a bicamada lipídica. - Fechar a câmara, continuando a trabalhar com água e assegurando que cerca de 1 mL de água é preso no interior da câmara.
- Levar a câmara montada fora da água. Certifique-se de que ele é livre à prova de água e vazamento.
- Substituir o 1 ml de água ultrapura presente na câmara de observação com PBS por adição e remoção de 500 ul de PBS 10 vezes. Assegurar que a câmara nunca é desprovida de líquido.
- etapa de bloqueio SLB
- Introduzir 100 ug / mL de albumina de soro bovino (BSA) na câmara de observação contendo a corrediça preparada na secção 3.3.6 e incubar durante 30 min à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C).
- Lavar a camada dupla por eliminação e adição de 500 ul de PBS 10 vezes. A bicamada pode ser mantido 24 horas a 4 ° C.
4. A funcionalização com ligantes
- Adicionar fluorescente ou não fluorescente neutravidina (NAV, uma versão desglicosilada de avidina não carregado a pH 7) a 2 ug / mL para a câmara contendo a corrediça preparada na secção 3.4.2, durante 30 min à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C).
- Lavar por adição e remoção de 500 ul de PBS 10 vezes.
- Adicionar biotinilado anti-CD3 a 2 ug / mL para a câmara que contém a corrediça preparada na secção 3.4.2. Para dupla funcionalização do SLB e os pontos, adicionar Fc-ICAM1 His-tag, a 5 ug / ml (aqui, a bicamada é feita de DOPC + 1% de ácido nitrilotriacético (NTA) lípidos). Deixar durante 30 minutos à temperatura ambiente (entre 20 e 30 ° C).
- Lavar por adição e remoção de 500 ul de PBS 10 vezes
- Substituir o PBS com meio celular (PBS + BSA a 0,1%) por adição e remoção de 500 mL do meio de células 10 vezes.
- Deixar 200 uL de meio de células no chamber com a corrediça.
- Coloque a câmara durante 10 minutos a 37 ° C antes da adição de células.
5. Célula de deposição (ver referência 7 para detalhes)
- depositar cuidadosamente 400 ul da suspensão de células para dentro da câmara. Incubar as culas durante 30 min a 37 ° C.
- Fixar a célula com 2% de paraformaldeído (PFA) durante 15 min a 37 ° C. Substituir o PFA com PBS por remoção repetida e a adição de 500 uL de PBS.
6. Observação
- Proteo-lipídico Nano-padrão e SLB fluidez
- Usar um microscópio de fluorescência para a imagem do padrão de proteínas no modo de epi-fluorescência usando comprimento de onda apropriado iluminação (639 nm) e cubos de filtro (por exemplo, aqui, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688).
NOTA: A intensidade do sinal pode ser quantificada para estimar a quantidade de proteína dentro e fora do ponto. Usar um comprimento de onda apropriado iluminação (330 nm) e fcubo ILTER a imagem da bicamada (BP 365/12, FT 395, LP 397), que aparece brilhante com buracos escuros. - Use foto contínuo de branqueamento (CEC) técnica 13, 15 para medir a constante de difusão de lípidos de traçador na bicamada. Esta observação é, de preferência feito apenas após a deposição SLB.
NOTA: De modo a quantificar a constante de difusão, dois parâmetros são medidos durante o processo de CEC: o tempo de branqueamento específica do corante (tenso) e o comprimento de decaimento do perfil fluorescente do halo formado em torno da área branqueada (taud). O primeiro é obtido através da representação gráfica da evolução no tempo da intensidade de fluorescência no centro do campo iluminado durante o processo de CPB. A segunda é obtido por traçado do perfil de intensidade na borda da zona iluminada (média de mais de 12 linhas e 5 depois as imagens em estado estacionário é atingido). As curvas são montados para obter tenso e taud. A constante de difusão é dada por tauD 2 / tenso (D =
).
- Usar um microscópio de fluorescência para a imagem do padrão de proteínas no modo de epi-fluorescência usando comprimento de onda apropriado iluminação (639 nm) e cubos de filtro (por exemplo, aqui, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688).
). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
As imagens de fluorescência foram analisados para medir o espaçamento e o tamanho dos pontos. Espaçamento típico verificou-se ser 1,900 ± 80 nm e dot-tamanho típico foi de 600 ± 100 nm (Figura 1 g). O espaçamento é definido pelo tamanho das contas utilizadas para a máscara. O ponto de tamanho é definido pelo, bem como condições de deposição do grânulo de tamanho. O SLB é depositada unicamente em torno dos pontos de proteína e não sobre elas (Figura 2), com complementaridade perfeita entre os furos visto no canal de imagiologia SLB e os pontos visto no canal de imagiologia NAV. Análise de dados foto branqueamento contínuo mostra que os lípidos em bicamada modelado permanecer fluido e tem uma constante de difusão típico de 5 μm² / s (Figura 3).
Figura 1: Representação esquemática das etapas de fabricação. (a -7 Torr, árgon fluxo 10 sccm, pressão de processo de 6,2 mTorr, fotografado de voltagem de aceleração de 5 kV. As imagens confirmam a observação feita com um microscópio óptico (imagem não incluído) antes de deposição de alumínio que as esferas são dispostas numa monocamada de rede hexagonal centrada no vidro-corrediça. (B) máscara secundário de alumínio criado pela deposição por pulverização catódica após remoção do friso-máscara primário. (C) Deposição de organossilano e BSA-biotina embora a máscara secundário. (D) Remoção do alumínio revelando nano-pontos de BSA-biotina. (E) Deposição de SLB. (F) A ligao VLP a BSA-biotina. (G) Binding anti-CD3 para NaV. Inserção mostra imagem de epi-fluorescência das matrizes nano-pontos. Aqui, o NAV é fluorescente etiquetado. ponto de tamanho típico é de 600 ± 100 nm e espaçamento típico é 1900 ± 80 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A complementaridade do nano-ponto e padrão SLB. (A, b) as imagens de epi-fluorescência de fluorescentes NAV nano-pontos e de SLB com lípidos traçadores fluorescentes. (C) Imagem composta dos pontos NAV (vermelho) no mar de SLB (verde) mostra a complementaridade perfeita do VPL e SLB. imagem Rápida de Fourier Transform (FFT) na inserção indica ordem de longo alcance. Barra de escala: 4? m.rge.jpg" target = '_ blank'> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação de difusão de lípidos no SLB. (A) Imagem de epi-fluorescência de um SLB antes do branqueamento. Os pontos de proteína mostrar-se como orifícios escuros em um mar brilhante de lípidos. O campo-diafragma limita a área iluminada. (B) de epi-fluorescência de SLB depois do branqueamento continuamente durante 50 s. O halo visível dentro da região delimitada pelo campo de diafragma indica que os lípidos são móveis. Barra de escala: 10? m. (C) o perfil médio da intensidade ao longo da aresta do campo de diafragma (topo) e o decaimento de intensidade ao longo do tempo durante o processo de encalhe (parte inferior). Esta informação é analisada para extrair a constante de difusão, que é, tipicamente, 5 μm² / s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os passos críticos dentro do protocolo descrito acima estão relacionadas com a formação da proteína nano-pontos ou a parte de trás de enchimento do espaço em torno dos pontos por uma bicamada lipídica suportado. O primeiro passo crítico com respeito a proteína nano-pontos é a preparação do grânulo-máscara. A limpeza da tampa a corrediça é crítica. As lâminas têm de ser limpas, quer com uma solução de detergente que é recomendado para a limpeza de cuvetes de quartzo, ou com plasma de oxigénio. Outras técnicas de limpeza como imersão em etanol ou tratamento de iso-propanol não tornam o vidro suficientemente hidrofílica e, por conseguinte, não são compatíveis com a formação de um grânulo monocamada em larga cobertura. Ao mesmo tempo, a superfície da lâmina tem de ser compatível com o passo subsequente de formação da SLB pela técnica de Langmuir-Blodgett 7, 15, 16. O próximo passo crítico é a deposição e remoção de umluminum. Se a deposição é através de técnica de pulverização catódica, como é feito aqui, o alvo deve ser dopado com silício (em 1%). Caso contrário, se o alvo é feito de alumínio puro, a camada depositada é difícil de remover com a solução de hidróxido alcalino, tal como descrito acima, provavelmente devido à formação de óxido de alumínio e interpenetração entre a camada de alumínio depositado e substrato de lâmina de vidro. A duração da deposição determina o tamanho dos pontos de proteína 9, no entanto, aqui temos trabalhado com um único tempo de deposição e tamanho, portanto, único ponto. A amostra pode ser armazenada sob condições ambientes durante vários meses após a deposição de alumínio e durante cerca de uma semana após a deposição de BSA-biotina.
O segundo passo crucial diz respeito a deposição do SLB. Limpeza da tampa-lâmina de vidro é novamente um ponto crucialmente importante. Como é o caso de qualquer trabalho de deposição de Langmuir-Blodgett, todo o material utilizado deverá ser feito de vidro ou Polytetrafluoroethylene (PTFE) e deve ser escrupulosamente limpo. Após a deposição da primeira monocamada de lípidos, as coberturas de lâminas podem ser armazenadas por um par de dias, mas após a deposição da segunda monocamada, eles precisam de ser usado imediatamente.
Embora se tenha demonstrado o protocolo para a criação de anti-CD3 nano-pontos para utilização em estudos de adesão de linfócitos T 9, 13, o processo é altamente flexível e pode ser adaptada para qualquer proteína biotinilada. A composição da bicamada lipídica pode ser facilmente alterada e pode ser adicionalmente funcionalizado, se desejado. Um ponto importante a considerar é a possível absorção inespecífica de proteínas, especialmente na bicamada lipídica em torno dos pontos.
A principal limitação da técnica surge da utilização de coloidal-grânulo auto-montagem para a máscara primário. Sendo uma técnica de baixo para cima, que partilha alguns dos problemas de todas essas abordagenspor exemplo, a falta de flexibilidade e de controlo total sobre a forma padrão. A estrutura padrão reflete necessariamente a simetria da máscara talão e é, portanto, sempre hexagonal. A forma do motivo padrão é um círculo e é determinada por uma combinação de grânulo de tamanho e a duração da deposição de alumínio 9, 13. Técnicas alternativas para controlar o tamanho do ponto, também foram sugeridas 14, 17, 18.
Substratos nano-padrões com proteínas, proteína-fragmentos ou péptidos têm sido extensivamente usados no passado para sondar as interacções da superfície celular, especialmente a adesão e migração de 19 20. Trabalho pioneiro tem mostrado que as células formadoras de tecido falhar para espalhar sobre os padrões com um passo maior do que um dado limiar de 21, e ainda mais sho investigação qua que o comprimento escala deste fenómeno é definido pelo tamanho da Talins, que são instrumentais na ligação de receptores de integrina para o citoesqueleto de actina 22. No entanto, em todos estes estudos, as proteínas foram ligados a nano-partículas de ouro, os quais foram eles mesmos imobilizados em vidro.
No contexto de células T, as membranas Proteo-lipídica, tipicamente mimetizando as células que apresentam antigénio, têm sido extensivamente utilizados para compreender os aspectos fundamentais da função das células T 6. Técnicas de nano-padronização engenhosas têm sido usados para criar currais com barreiras de metal separando proteína manchas SLB funcionalizados, que forneceram uma visão sobre a estrutura e a conectividade do / interface de APC de células T 23. Este tipo de nano-padronização é, contudo, muito diferente das proteínas nano-pontos propostos aqui. Recentemente, nano- agrupamentos foram criados utilizando ligação química dos lípidos proteína funcionalizadass = "refex"> 3, que lançar luz sobre a consequência de agrupamento de receptores. A vantagem era que, ao contrário do presente caso, os clusters poderia, em princípio, ser eles mesmos móvel. No entanto, esses agregados espontaneamente formados são, necessariamente, menos bem controlada em termos de tamanho e densidade do que nano-pontos de proteína pré-formadas descritas aqui.
Prevemos que a proteína SLBS decorados nano-dot apresentado aqui pode ser usado para investigar diferentes aspectos da adesão celular. Uma pergunta óbvia que se coloca é se, tal como descrito acima para o tecido que formam as células 19, os linfócitos também têm um comprimento escala intrínseca associada com a aderência. Os resultados preliminares parecem indicar que, pelo menos, quando a aderência é mediada pelo complexo TCR, a densidade de ligandos em vez de espaçamento é o parâmetro de definição para espalhar e de activação 10, 11, 12
As duas principais vantagens destes padrões Proteo-lipídico são a compatibilidade dos substratos com microscopia óptica avançada e a facilidade de preparação que os torna compatível com aplicações uso e de lance. Subsequentemente à deposição de alumínio, todos os passos de preparação pode ser realizada em um banco de wet-lab padrão. No futuro, pode prever-se que o vidro e suportado-Bead-máscaras produzidas numa instalação especializada são transferidos e armazenados em laboratórios de biologia para utilização como e quando necessário revestido com alumínio. Com isto em vista, acreditamos que estes substratos têm o potencial para se tornar a plataforma de escolha para estudar a interação das células com membranas Proteo-lipídico-padrão nano controladas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos Laurent Limozin, Pierre Dillard e Astrid Wahl para continuar discussões frutíferas sobre aplicações celulares. Agradecemos também Frederic Bedu de instalação de sala limpa PLANETE por sua ajuda com as observações SEM. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Conselho Europeu de Investigação através da concessão No. 307.104 FP / 2007-2013 / ERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | ||
| Observation chamber | Home made | ||
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 | |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | ||
| Desiccator | Labbox | ||
| Crystallizer | Shott | ||
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 | |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 | |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | ||
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 | |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 | |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C | |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 | |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 | |
| Film balance | NIMA | Medium | |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system | |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | ||
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
References
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York. (2002).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Kaizuka, Y., et al. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
- Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).
- Grakoui, A., et al. The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation. Science. 285, 221-228 (1999).
- Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells. Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).
- Lu, X., et al. Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).
- Pi, F., Dillard, P., et al. Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells. Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).
- Deeg, J., et al. T cell activation is determined by the number of presented antigens. Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).
- Delcassian, D., et al. Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells. Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).
- Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays. Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).
- Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization. Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).
- Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies. Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).
- Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion. Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).
- Sengupta, K., et al. Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid. Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).
- Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography. Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).
- Massou, S., et al. Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates. Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).
- Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion. Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).
- Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Schvartzman, M., et al. Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level. Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).
- Mossman, K., Groves, J. Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse. Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).
- Furlan, G., et al. Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters. J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).
- Hsu, C. J., et al. Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation. PloS One. 7 (2), e32398 (2012).
- Yu, C., et al. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).
