Summary
אנו מציגים פרוטוקול functionalize זכוכית עם טלאי חלבון ננומטריים המוקפים bilayer שומנים נוזל. מצעים אלו עולים בקנה אחד עם מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת וצפויים להוות פלטפורמה ללימודי הדבקה ו נדידת תאים.
Abstract
כיום ישן עניין רב ביצירת מערכי הורה איי חלבון דבק בים של משטח פסיבציה ללימודי תא ביולוגיים. בשנים האחרונות, זה הפך להיות ברור יותר ויותר כי תאי חיים מגיבים, לא רק לאופי ביוכימיים של המולקולות שהוצגו בפניהם, אלא גם דרך מולקולות אלה מוצגות. יצירת מיקרו-דפוסי חלבון ולכן עכשיו תקן במעבדות הביולוגיה רבים; דפוסים-ננו הם גם יותר נגישים. עם זאת, בהקשר של אינטראקציות תא-תא, יש צורך הדפוס לא רק חלבונים אלא גם bilayers שומנים. דפוסים proteo-lipidic כפול כזה עד כה לא היה נגיש. אנו מציעים טכניקה קלילה ליצור נקודות ה- Nano חלבון נתמכות על זכוכית ולהציע שיטה לבצע מילוי חוזר של החלל הבין-הנקודה עם bilayer שומנים נתמך (SLB). מ-הלבנת תמונה של נותב ניאון שומנים כלולים SLB, אנו מדגימים כי bilayer מציג ניכר-PLנזילות Ane. Functionalizing נקודות החלבון עם קבוצות פלורסנט מאפשרת לנו לדמות אותם וכדי להראות שהם מסודרים סריג משושה רגיל. גודל הנקודה הטיפוסי הוא כ 800 ננומטר לבין המרווח הפגין כאן הוא 2 מיקרון. מצעים אלו צפויים לשמש פלטפורמות שימושיות כמו הידבקות תא, גירה ולימודים-חישת mechano.
Introduction
הידבקות התא מתבצעת באמצעות מולקולות הדבקה תא מתמחה (מצלמות), חלבונים המצויים על גבי קרום התא המסוגלים מחייב עמיתו שלהם על מטריצה חוץ-תאית או על תא אחר. על תאים דבקים, המולקולות הדבקות ביותר כולל integrin ו cadherin בכל המקום, נמצאות בצורת אשכולות 1. האינטראקציה של לימפוציטים מסוג T (תאי T) עם תאי מציגי אנטיגן (נגמ"שים) מספקת המחשה בולטת עוד יותר לחשיבות של אשכולות קולטן נוצרו על הממשק בין שני התאים - לעתים קרובות נקרא סינפסה אימונולוגית. לאחר יצירת הקשר הראשוני עם קולטנים בתא APC, T (TCRs) על פני השטח של האשכולות בקנה מידת T תא טופס מיקרון המשמשים איתות פלטפורמות 2, 3, 4, והם בסופו של דבר מרוכז כדי ליצור אשכול מולקולרי מרכזי גדול (cSMAC )נַעֲרָה = "Xref"> 5, 6, 7. לאחרונה, ניתן היה לראות כי בצד APC, הליגנדים של TCR גם מקובצים 8.
בהקשר של אינטראקצית T תא-APC, פריסת מערכות היברידיות, שבו APC היא חיקתה ידי משטח מלאכותי פונקציונלי עם חלבונים רלוונטיים, יש מאוד קדם את ההבנה שלנו של הממשק הסינפטי 2, 3, 4, 5, 6, 7 . בהקשר זה, היא רלוונטית מאוד לעצב משטחים כוזבים APC כי ללכוד אחד או יותר בהיבטים של תא המטרה. לדוגמה, אם הליגנדים הם מורכבים על bilayers השומנים נתמך, הם יכולים לפזר את המטוס של bilayer, לחקות את המצב על פני השטח APC ובאותו זמן לאפשר היווצרות של6 cSMAC, 7. בדומה לכך, באשכולות על APC כבר חיקו ידי יצירת אי של הליגנדים בים של פולימרים 9, 10, 11, 12, 13, 14. עם זאת, יש שתי תכונות אלה עד כה לא שולבו.
כאן אנו מתארים שיטה חדשנית ליצירת נקודות ה- Nano של אנטי CD3 (נוגדן שפוגע במתחם TCR) מוקף bilayer השומנים עם שומנים לשדר. את bilayer מופקד באמצעות לנגמיואיר-Blodgett / לנגמיואיר-שייפר טכניקה 7, 15, 16 ו אם רוצים, אפשר פונקציונליות עם חלבון מסוים - למשל, ליגנד של integrin תא T (שנקרא ICAM1). בנוסף, cou נקודות חלבון אנטי CD3ld להיות מוחלף באחר נוגדן או CAM. בעוד בחרנו את החלבונים לשימוש עתידי כפלטפורמה למחקרים דבקים של תאי T, את האסטרטגיה המפורטת כאן ניתן להתאים לכל חלבון ואפילו DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ניקוי זכוכית כיסוי-מגלשות צ'יימברס תצפית
- מסדר את כיסוי שקופיות זכוכית על מגש רב-שקופית עשוי חומר אינרטי כמו polytetrafluoroethylene (PTFE).
- לטבול את המגש עם מגלשות ובית נבחרי התצפית בתמיסה פעילה שטח (כל מוצר מומלץ לניקוי cuvettes קוורץ מתאים).
- שימוש באמבטיה קולית, אולטרה-sonicate בפתרון הפעיל השטח עבור 30 דקות בטמפרטורת חדר (בין 20 ו 30 מעלות צלזיוס).
- לשטוף 5 פעמים עם מים ultrapure (18.2 MΩ.cm, 0.059 מיקרו-שניות / ס"מ).
- אולטרה-sonicate בתמיסה פעילה שטח עבור 30 דקות בטמפרטורת חדר (בין 20 ו 30 מעלות צלזיוס).
- יש לשטוף 10 פעמים עם מי ultrapure.
- חזור על שלבי 1.5 ו 1.6 פעמים.
- חנות במים בטמפרטורת החדר (בין 20 ו 30 מעלות צלזיוס) במשך עד שבוע.
2. ייצור של נקודות ה- Nano חלבון
- בתצהיר של חרוזים
- Deposit ההשעיה של חרוזים סיליקה (נ / v 2%, 70 μL) טיפה אחר טיפה על כיסוי-שקופית (24 x 24 מ"מ, עובי 170 מיקרומטר) שנערך נטייה של 15 מעלות.
- תנו ההשעיה להפיץ כ 1 דקות תוך הפיכת הזכוכית ידי 90 ° כל 15 s.
- לאפשר לנוזלים להתאדות בתנאי סביבה.
- חנות בכוס נקייה או קאמרית PTFE בכל תנאי הסביבה של עד 2 ימים.
- בתצהיר של אלומיניום
- מניח את השקופיות (מוכן בסעיף 2.1) בתוך תדר רדיו וציוד מקרטע (RF) magnetron 8, על שולחן מסתובב במרחק של כ 105 מ"מ מתוך אלומיניום (99%): סיליקון (1%) יעד.
- משאבה למטה בתא בתצהיר 2.6 x 10 -4 Pa באמצעות משאבה טורבו-מולקולרית. שלב זה חשוב להסרת זיהומי גזים אפשריים.
- הצג אווירת ארגון טהורה (5N, 99.999%) עם שטף של 10 SCCM בלחץ של 0.8 Pa (6.6 mTorr).
- הפעילו את הגנרטור כוח RF.
הערה: הנה, מגוון טיפוסי של 400-600 וואט חשמל בתדר רדיו ב 13.56 תדירות MHz שימש. מחולל RF משמש עם רשת התאמת במצב צימוד פלזמה קיבולי. הכוח בא לידי ביטוי מנוטר ממוזער באמצעות הסתגלות הרשת. - אחרי הפלזמה הוא התייצב, גמגום עבור 2 דקות שמירה על התריס הסגור כדי להסיר זיהומים אפשריים מפני השטח של היעד.
- פתח את התריס ולאפשר המקרטעת להימשך 60 דקות להפקיד אלומיניום בשקופית הזכוכית בעובי של 200 ננומטר.
- חותך את זרימת הארגון, לסגור את שסתום השער לבודד את משאבת turbomolecular מהאולם בתצהיר לפרוק את החדר עם n הנקיitrogen להשיג את הלחץ בחדר. שחזר את השקופיות מצופה אלומיניום. אחסן עד חודש בקופסא זכוכית או PTFE נקיה הרמטית בתנאי סביבה.
- שיקוע של organosilane
- לטבול את השקופית מצופה אלומיניום מוכן בשלב 2.2.6 במים ultrapure בטמפרטורת החדר-sonicate אולטרה עבור 30 s באמבטיה קולי (50 W, 50/60 הרץ, בין 20 לבין 30 מעלות צלזיוס).
- 0.5 הפיקדון מ"ל של (3-aminopropyl) -triethoxysilane (APTES) בתחתית ייבוש.
זהירות: APTES הוא organosilane, אשר מתאדה בקלות והוא רעיל. APTES יש לטפל רק תחת זרם-ברדס ועם כפפות. - שים את שקופיות הזכוכית (שהוכנו 2.3.1) על רשת קרמיקת מקום בתוך הייבוש.
- חבור את ייבוש משאבת קרום ולרוץ לעבר כוח מרבי עבור 30 דקות כדי ליצור ואקום נמוך.
- סגור את השסתום של הייבוש לכבות את המשאבה.
- מחמם את הייבושכ 50 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
- פתח את הייבוש ולאסוף את השקופיות.
- העברה נוספת ייבוש נקי לאחסון של עד 48 שעות בטמפרטורת החדר (20 עד 30 מעלות צלזיוס).
- בתצהיר של שכבת החלבון הראשונה - אלבומין בסרום שור שכותרתו עם ביוטין (BSA ביוטין)
- מניח באחד השקפים המוכנים בסעיף 2.3 על תמיכת PTFE.
- פיקדון 1 מ"ל של 25 מיקרוגרם / מ"ל BSA ביוטין המומסים בופר פוספט (PBS). השאירו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (20 עד 30 מעלות צלזיוס).
- יש לשטוף 10 פעמים עם PBS. חנות המדגם עד 24 שעות ב 4 ° C הרחק ממקור אור.
- הסרת מסכת אלומיניום
- דגירה השקופיות בתמיסה של NaOH ב PBS (שהוכן על ידי dropwise תוספת של 1 M NaOH לכ 100 מ"ל PBS להשיג pH≈12) במשך הלילה בטמפרטורת החדר (בין 20 ו 30 מעלות צלזיוס).
זְהִירוּת. NaOH הוא מאכל, יש לטפל באמצעות כפפות. - לִשְׁטוֹף10 פעמים במים ultrapure.
- דגירה השקופיות בתמיסה של NaOH ב PBS (שהוכן על ידי dropwise תוספת של 1 M NaOH לכ 100 מ"ל PBS להשיג pH≈12) במשך הלילה בטמפרטורת החדר (בין 20 ו 30 מעלות צלזיוס).
3. הפקדת bilayer השומנים נתמכים (SLB)
- ניקוי השוקת לנגמיואיר
- הסר את המים המתחמים PTFE של השוקת לנגמיואיר באמצעות משאבה.
- נקי במגבת המתכלים שאינם ארוגים נטולת מוך ספוגה בכלורופורם.
זְהִירוּת. כלורופורם הוא רעיל ויש לטפל באזור מאוורר היטב, עם מסכה (או תחת זרם-ברדס) ועם כפפות מתאימות. - 4 פעמים נקיות עם מים פושרים ultrapure (40 עד 50 מעלות צלזיוס).
- 6 פעמים נקיות לפחות עם מי ultrapure קרים.
- בתצהיר של שכבת השומנים הראשונה
- מניחים מגשים PTFE במארז PTFE של שוקת לנגמיואיר ואז למלא אותו עם מים ultrapure.
- השתמש בתוכנת השליטה במנגנון לנגמיואיר להגדיר את הלחץ נמדד 0 MN / m.
- בעזרת כוס gastight / מתכת מזרק להפקיד 30 μL של פתרון השומנים 1 מ"ג / מ"ל (1, 2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (dOPC) כלורופורם) על פני המים. כלורופורם מתאדה ואת מולקולות השומנים ספונטניות יוצרות בשכבה.
- השתמש בתוכנה המלאה לדחוס בשכבת השומנים על ידי סגירת מחסום PTFE עד הלחץ הרצוי (27 MN / m עבור dOPC) הוא הגיע.
- השתמש בתוכנה המלאה לטבול את שקופית הזכוכית מוכנה בסעיף 2.5.2 לתוך מתחם PTFE באמצעות מהדק ממונע.
- החזק את השקופית, בתוך מלחציים, בניצב ממשק מים-אוויר. השתמש בתוכנה המלאה להעלות את זה לאט (15 מ"מ / דקה) דרך הממשק, תוך שמירה על לחץ קבוע על 27 MN / m.
- מקום בסביבה יבשה לשימוש מיידי או לאחסון של עד 24 שעות בטמפרטורת חדר (בין 20 ו 30 מעלות צלזיוס).
- בתצהיר של שכבת השומנים השנייה
- לשמור על לחץ משטח בשוקת לנגמיואיר על הערך הרצוי של 27 MN / m. דחיסה באמצעותתוכנת שליטה על המנגנון לנגמיואיר ו / או להוסיף כמות קטנה של שומנים בדם כדי להשיג את הלחץ הרצוי.
- מניח את שקופיות זכוכית נושאת בשכבת השומנים, הכינה בסעיף 3.2.6, אופקי על פני המים. ודא כי כל שקופית צפה מעל מגש PTFE.
- דחוף את מגלשות הכוס, שקופית אחת בכל פעם, לתוך מגש PTFE המקביל שלה באמצעות פינצטה PTFE או מתכת כזה שהם שקועים בתוך המים. הימנע הטיית השקופיות תוך דחיפה.
- להשתמש בפינצטה PTFE או המתכת להעביר את מגשים PTFE המכיל את השקופיות לתוך crystallizer מלא מי ultrapure מוודאים כי המגלשות אינן חשופות לאוויר.
- להשתמש בפינצטה PTFE או מתכת להעביר, תוך כדי עבודה מתחת למים, שקופית זכוכית מצופה bilayer לתוך תא התצפית.
הערה: תא התצפית ממוקם מתחת למים בתוך crystallizer. תא התצפית מחוייט מורכב מטבעת PTFE עם אטם גומיתרמילי פלדה ד, אשר ניתן להרכיב מתחת למים כדי להפוך תא מים חזק אשר עשוי המשטח התחתון משקופית זכוכית מצופה בעבר עם bilayer השומנים. - סגרו את תא בעודה ממשיכה לעבוד תחת המים ולהבטיח כי כ 1 מ"ל של מים לכוד בתוך החדר.
- קח את התא התאסף מחוץ למים. ודא שזה מים חזקים ודליפה בחינם.
- החלף את 1 מ"ל של ההווה מים ultrapure בתא תצפית עם PBS ידי הוספה והסרה 500 μL של פעמים 10 PBS. ודא כי החדר הוא לא נטול נוזלי.
- צעד חסימת SLB
- הציגו 100 מיקרוגרם / מ"ל של אלבומין בסרום שור (BSA) בחדר תצפית המכיל את השקופית מוכן בסעיף 3.3.6 דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (בין 20 ו 30 מעלות צלזיוס).
- יש לשטוף את bilayer ידי הסרת והוספת 500 μL של פעמים 10 PBS. את bilayer יכול להישמר 24 שעות ב 4 ° C.
4. Functionalization עם הליגנדים
- להוסיף פלורסנט או לא פלורסנט neutravidin (NAV, גרסה deglycosylated של avidin אינה טעונה ב- pH 7) בשעה 2 מיקרוגרם / מ"ל לתוך תא המכיל את השקופית מוכן בסעיף 3.4.2 עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר (בין 20 ו 30 מעלות C).
- יש לשטוף באמצעות הוספה והסרה 500 μL של פעמים 10 PBS.
- להוסיף biotinylated אנטי CD3 ב 2 מיקרוגרם / מ"ל לתא המכיל את השקופית מוכן בסעיף 3.4.2. עבור functionalization הכפול של SLB והנקודות, להוסיף FC-ICAM1 התג שלו ב 5 מיקרוגרם / מיליליטר (כאן, את bilayer עשוי dOPC + 1% של חומצת nitrilotriacetic (נ.ת.ע) ליפידים). השאירו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (בין 20 ו 30 מעלות צלזיוס).
- יש לשטוף באמצעות הוספה והסרה 500 μL של PBS 10 פעמים
- החלף את PBS עם המדיום הסלולרי (PBS + 0.1% BSA) על ידי הוספה והסרה 500 μL של המדיום הסלולרי 10 פעמים.
- השאירו 200 μL של המדיום הסלולרי של chamber עם שקופיות.
- מניחים את החדר עבור 10 דקות ב 37 ° C לפני הוספת תאים.
5. הפקדת Cell (ראה התייחסות 7 לפרטים נוספים)
- בזהירות להפקיד 400 μL של ההשעיה תא לתא. דגירת התאים למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- תקן את התא עם 2% של paraformaldehyde (PFA) עבור 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. החלף את PFA עם PBS על ידי הסרת חוזרות והוספה של 500 μL של PBS.
תצפית 6.
- Proteo-lipidic-דפוס ננו ובזרימה SLB
- השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי לתמונת דפוס החלבון במצב EPI-קרינה באמצעות גל תאורה מתאים (639 ננומטר) וקוביות מסננות (למשל כאן, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688).
הערה: עוצמת האות ניתן לכמת לאמוד את כמות החלבון בתוך ומחוץ הנקודה. השתמש גל תאורה מתאים (330 ננומטר) ו- Fקוביית ilter לתמונה bilayer (BP 365/12, 395 FT, LP 397), אשר מופיע בהיר עם חורים כהים. - השתמש הלבנת תמונה רציפה (CPB) טכניקה 13, 15 כדי למדוד את הדיפוזיה של ליפידים נותב ב bilayer. תצפית זו רצויה עשתה רק לאחר הפקדת SLB.
הערה: על מנת לכמת את הדיפוזיה, שני פרמטרים נמדדים במהלך תהליך CPB: בפעם ההלבנה הספציפית של הצבע (המתוח) ואת אורך הריקבון של הפרופיל פלורסנט של ההילה נוצרה מסביב לאזור המולבן (tauD). הראשון מתקבל על ידי התוויית ההתפתחות בזמן של עוצמת הקרינה במרכז השדה המואר במהלך תהליך CPB. השני מתקבל על ידי התוויית הפרופיל בעצמה בקצה האזור המואר (בממוצע לכל 12 קווים 5 תמונות לאחר יציב הוא הגיע). העקומות מצויד להשיג מתוח tauD. הדיפוזיה ניתנת על ידי taא.ד. 2 / מתוח (D =
).
- השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי לתמונת דפוס החלבון במצב EPI-קרינה באמצעות גל תאורה מתאים (639 ננומטר) וקוביות מסננות (למשל כאן, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688).
). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תמונות הקרינה נותחו על מנת למדוד את המרווח וגודל הנקודות. מרווח אופייני נמצא 1900 ± 80 ננומטר ו-גודל נקודה טיפוסי היה 600 ± 100 ננומטר (1G איור). המרווח נקבע על ידי גודל של חרוזים המשמשים את המסכה. The-גודל הנקודה מוגדר על ידי גודל החרוז כמו גם תנאים בתצהיר. SLB מופקד באופן ייחודי סביב הנקודות חלבון ולא עליהם (איור 2), עם השלמה מושלמת בין חורים הנראים ערוץ הדמיה SLB והנקודות ראיתי בערוץ הדמיה NAV. ניתוח של נתוני הלבנת תמונה רציפים מראה כי שומני bilayer בדוגמת נשארים נוזלים ויש לי הדיפוזיה אופייני 5 μm² / s (איור 3).
איור 1: ייצוג סכמטי של שלבי ייצור. (א -7 Torr, ארגון שטף 10 SCCM, לחץ תהליך 6.2 mTorr, מצולמים בו מתח אץ של 5 קילו. התמונות לאשר תצפיות שנעשו במיקרוסקופ אופטי (תמונה לא כלול) לפני בתצהיר אלומיניום כי חרוזים מסודרים סריג משושה מרוכז בשכבה על-שקופית זכוכית. (ב) מסכה של אלומיניום משני נוצר על ידי הגמגום בתצהיר לאחר הסרת החרוז-המסיכה העיקרית. (ג) הפקדה של ביוטין BSA organosilane ולמרות המסכה המשנית. (ד) הסרת אלומיניום חושף ננו-נקודות של ביוטין BSA. (ה) בתצהיר של SLB. (ו) כריכה NAV ל-ביוטין BSA. (ז) כריכה אנטי CD3 כדי NAV. הבלעה מראה תמונת קרינה-EPI של מערכים-נקודות ננו. כאן NAV מתויג fluorescently. נקודה בגודל טיפוסי הוא 600 ± 100 ננומטר וריווח טיפוסי הוא 1900 ± 80 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: השלמה של-dot ננו ותבנית SLB. (א, ב) תמונות קרינת Epi של נקודות ה- Nano NAV ניאון של SLB עם שומנים נותבו ניאון. (ג) תמונה מורכבת של נקודות NAV (אדום) בים של SLB (ירוק) מראה משלים מושלם של ה- NAV וכן SLB. Transform פורייה מהירה (FFT) תמונה הבלעה מציין סדר טווח-ארוך. בר סולם: 4 מיקרומטר.rge.jpg" target = '_ blank'> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: כימות דיפוזיה שומני SLB. (א) תמונת Epi-קרינה של SLB לפני ההלבנה. נקודות החלבון להופיע כמו חורים שחורים בתוך ים בהיר של ליפידים. השדה-הסרעפת מגבילה את השטח המואר. (ב) Epi-הקרינה של SLB אחרי הלבנה ברציפות במשך 50 s. ההילה הגלויה בתוך האזור המופרד באמצעות השדה-הסרעפת עולה כי השומנים הם ניידים. בר סולם: 10 מיקרומטר. (ג) פרופיל עצמה ממוצע לאורך הקצה של סרעפת השדה (למעלה) ואת הדעיכה של עוצמת לאורך זמן בתהליך beaching (התחתון). נתונים אלה נותחו כדי לחלץ את הדיפוזיה, שהוא בדרך כלל 5 μm² / s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלבים הקריטיים בתוך הפרוטוקול שתואר לעיל קשורים להיווצרות של נקודות ה- Nano חלבון או האחורי-ומילוי השטח סביב הנקודות ידי bilayer שומנים נתמך. השלב הקריטי הראשון ביחס ונקודות ננו חלבון הוא הכנת החרוז-המסכה. הניקוי של הכיסוי שקופית הוא קריטי. השקופיות צורכות לנקות או בתמיסת ניקוי כי מומלצת לניקוי cuvettes קוורץ, או עם פלזמת חמצן. טכניקות ניקוי אחרים כמו טבילה באתנול או טיפול-פרופנול ISO אינם מעבדים את הזכוכית מספיק הידרופילי ולכן אינם תומכים היווצרות monolayer חרוז גדול כיסוי. במקביל, פני השטח של השקופית צריך להיות תואם את השלב הבא של היווצרות של SLB ידי לנגמיואיר-Blodgett טכניקה 7, 15, 16. השלב הקריטי הבא הוא בתצהיר והסרה שלluminum. אם בתצהיר הוא באמצעות טכניקה מקרטעת, כפי שנעשה כאן, המטרה צריכה להיות מסוממת עם סיליקון (ב 1%). אחרת, אם היעד הוא עשוי אלומיניום טהור, השכבה שהופקדה קשה להסיר עם הפתרון הידרוקסיד אלקלי כמתואר לעיל, ככל הנראה בשל ההיווצרות של תחמוצת אלומיניום הדדי בין שכבת אלומיניום שהופקדה ו מצע שקופיות זכוכית. המשך בתצהיר מקובע את הגודל של נקודות החלבון 9, אולם, כאן עבדנו עם זמן בתצהיר בודד ולכן גודל נקודה בודד. המדגם יכול להיות מאוחסן בתנאי סביבה למשך מספר חודשים לאחר הפקדת אלומיניום במשך כשבוע לאחר ההפקדה-ביוטין BSA.
השלב המכריע השני נוגע בתצהיר של SLB. ניקוי של כיסוי זכוכית שקופית היא שוב נקודה בעלת חשיבות מכרעת. כפי שקורה לכל עבודה בתצהיר לנגמיואיר-Blodgett, כל החומר המשמש צריך להיות עשוי מזכוכית או פוlytetrafluoroethylene (PTFE) וצריך להיות נקי למשעי. לאחר ההפקדה בשכבת השומנים הראשונה, את הכיסוי-המגלשות ניתן לאחסן במשך כמה ימים אבל לאחר ההפקדה בשכבה השנייה, הם צריכים לשמש מייד.
למרות שאנו הדגמנו את הפרוטוקול ליצירה אנטי CD3 ננו-נקודות לשימוש במחקרים דבקים לימפוציטים T 9, 13, ההליך הוא גמיש מאוד וניתן להתאים לכל חלבון biotinylated. רכב bilayer השומנים ניתן לשנות בקלות וזה יכול להיות פונקציונלי נוסף במידת צורך. אחת נקודות חשובות שיש לקחת בחשבון היא את הספיגה הנוקבת האפשרית של חלבונים, במיוחד על bilayer השומנים שמסביב הנקודות.
המגבלה העיקרית של הטכניקה נובעת מהשימוש של הרכבה עצמית קולואידים חרוזים עבור המסכה העיקרית. להיות טכניקה מלמטה למעלה, שהיא חולקת כמה מהבעיות של כל אותן הגישותלמשל, חוסר גמישות ושליטה מלאה על צורת דפוס. דפוס הסריג בהכרח משקף את הסימטריה של המסכה חרוז ולכן הוא תמיד משושה. הצורה של מוטיב הדפוס הוא מעגל נקבעת על ידי שילוב של גודל חרוז ואת המשך בתצהיר אלומיניום 9, 13. טכניקות חלופיות עבור שליטה בגודל הנקודה גם הוצעו 14, 17, 18.
מצעים-דפוסים ננו עם חלבונים, חלבון-שברים או פפטידים שמשו בעבר בהרחבה לחקור אינטראקציות פני קרום תא, במיוחד דבק 19 והגירה 20. החלוץ לעבוד הוכיח כי תאים מייצרי רקמות מצליחים להתפשט על דפוסי עם המגרש יותר מאשר סף נתון 21, ו sho לחקירה נוספת wed כי בקנה המידה באורך של תופעה זו מוגדרת על ידי הגודל של talins, אשר כמכשיר לקישור קולטנים integrin אל תקטין ושלד 22. עם זאת, בכל המחקרים הללו, החלבונים קושרו ננו-חלקיקי זהב, שהיו משותקים עצמם על זכוכית.
בהקשר של תאי T, ממברנות-lipidic proteo, בדרך כלל מחקו אנטיגן הצגת תאים, נעשה שימוש נרחב כדי להבין היבטים בסיסיים של תפקוד תא T 6. גאוני טכניקות ננו-patterning שימשו ליצירת מכלאות טלאים הפרדת חלבונים פונקציונליות SLB מחסומי המתכת, אשר סיפקו תובנות לגבי מבנה וקישוריות של ממשק T תא / APC 23. סוג זה של דפוסי ננו הוא זאת שונה מאוד ננו-נקודות החלבון המוצעות כאן. לאחרונה, אשכולות ננו נוצרו באמצעות הצמדה כימית של שומני החלבון פונקציונליss = "Xref"> 3, השופכים אור על התוצאה של התקבצות הקולטן. היתרון היה כי, בניגוד למקרה הנוכחי, הצבירים יכולים עקרונית להיות עצמם ניידים. עם זאת, אשכולות ספונטניים נוצרו כאלה בהכרח פחות טובים מבוקרים מבחינת גודל וצפיפות מ ננו-נקודות חלבון מראש יצר המתוארות כאן.
אנו חוזים כי החלבון SLBs ננו-dot המעוטר המוצג כאן יכול לשמש כדי לחקור היבטים שונים של תאי תאי הידבקות. אחת שאלה מתבקשת שעולה היא האם, כפי שתואר לעיל עבור תאים ויוצרי רקמה 19, לימפוציטים יש מדים מידת אורך מהותית הקשורים דבק. תוצאות ראשוניות נראה כי לפחות כאשר ההדבקה מתווכת על ידי קומפלקס TCR, הצפיפות הליגנדים ולא מרווח הוא הפרמטר המגדיר להפצה והפעלה 10, 11, 12
שני היתרונות העיקריים של דפוסי proteo-lipidic ואלה תאימות של מצעים עם מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת ואת הקלות של הכנת מה שהופך אותם תואם עם יישומים לשימוש-ו-לזרוק. לאחר בתצהיר אלומיניום, כל השלבים בהכנה יכולים להתבצע על ספסל רגיל רטוב-מעבדה. בעתיד, זה יכול להיות שחזה כי מסכות-חרוז-מצופה אלומיניום ו-נתמך זכוכית המיוצרים במתקן מיוחד מועברות ומאוחסני מעבדות ביולוגיה לשימוש כפי וכאשר נדרשו. עם זאת לאור, אנו מאמינים כי מצעים אלה יש פוטנציאל להפוך את הפלטפורמה של בחירה לחקר האינטראקציה של תאים עם ממברנות proteo-lipidic ננו-בדוגמת נשלט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לורן Limozin, פייר דילארד אסטריד וואהל להמשך דיונים פוריים על יישומי הסלולר. אנו מודים גם פרדריק Bedu ממתקן cleanroom PLANETE על עזרתו עם תצפיות SEM. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי המועצה האירופית למחקר באמצעות מס מענק 307,104 FP / 2007-2013 / ERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | ||
| Observation chamber | Home made | ||
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 | |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | ||
| Desiccator | Labbox | ||
| Crystallizer | Shott | ||
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 | |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 | |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | ||
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 | |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 | |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C | |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 | |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 | |
| Film balance | NIMA | Medium | |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system | |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | ||
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
References
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York. (2002).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Kaizuka, Y., et al. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
- Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).
- Grakoui, A., et al. The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation. Science. 285, 221-228 (1999).
- Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells. Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).
- Lu, X., et al. Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).
- Pi, F., Dillard, P., et al. Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells. Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).
- Deeg, J., et al. T cell activation is determined by the number of presented antigens. Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).
- Delcassian, D., et al. Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells. Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).
- Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays. Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).
- Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization. Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).
- Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies. Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).
- Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion. Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).
- Sengupta, K., et al. Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid. Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).
- Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography. Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).
- Massou, S., et al. Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates. Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).
- Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion. Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).
- Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Schvartzman, M., et al. Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level. Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).
- Mossman, K., Groves, J. Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse. Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).
- Furlan, G., et al. Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters. J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).
- Hsu, C. J., et al. Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation. PloS One. 7 (2), e32398 (2012).
- Yu, C., et al. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).
