Summary
Мы представляем протокол для функционализации стекла с нанометровыми белковыми пятнами, окруженными жидкостью липидного бислой. Эти субстраты совместимы с современной оптической микроскопии и, как ожидается, служить в качестве платформы для клеточной адгезии и миграции исследований.
Abstract
В настоящее время существует значительный интерес к созданию упорядоченных массивов адгезивных белков островков в море пассивирован- поверхности для биологических исследований клеток. В последние года она становится все более очевидной, что живые клетки реагируют не только на биохимическую природу молекул, представленных им, но и к тому, как представлены этим молекулам. Создание белковых микро-модели, таким образом, в настоящее время стандартом во многих биологических лабораториях; нано-структура также является более доступной. Однако, в контексте межклеточных взаимодействий, существует необходимость в шаблон не только белки, но и липидные двухслойные. Такой двойной Proteo-липидной структурирование до сих пор не было легко доступны. Мы предлагаем легкое техника для создания белковых нано-точек, нанесенных на стекле и предложить способ засыпки между точечным пространством с поддерживаемым липидным бислой (SLB). С фото-отбеливание трассера флуоресцентные липиды включены в БВУ, мы показали, что бислой обладает значительным в-плана текучесть. Функционализующих белковые точки флуоресцентных групп позволяют им изображение и показать, что они упорядочены в правильной гексагональной решетке. Типичный размер точек составляет около 800 нм, а расстояние между продемонстрирована здесь составляет 2 мкм. Эти подложки, как ожидается, чтобы служить в качестве полезных платформ для клеточной адгезии, миграции и исследований механо-зондирования.
Introduction
Адгезия клеток происходит через специализированные молекул клеточной адгезии (АМСГ), белки, присутствующие на клеточной мембране, которые способны связываться с их аналогом на внеклеточном матриксе или на другую клетку. На прилипших клетки, большинство молекул адгезии , включая повсеместные интегриный и кадгерин, находятся в виде кластеров 1. Взаимодействие Т-лимфоцитов (Т-клетки) с антиген-представляющими клетками (АРС) обеспечивает особенно яркой иллюстрацией важности кластеров рецепторов, сформированных на границе раздела между двумя клетками - часто называют иммунологический синапс. При формировании первого контакта с рецепторами клеток АРС, Т (TCR) на поверхности масштабных кластеров формы клеток микронного Т , которые служат в качестве сигнальных платформ 2, 3, 4, и, в конечном счете централизованных , чтобы сформировать больший центральный надмолекулярный кластер (cSMAC )деваха = "Xref"> 5, 6, 7. В последнее время было показано , что на стороне APC, лиганды рецептора Т - клеток, также сгруппированы 8.
В контексте Т - клеток-APC взаимодействия, развертывание гибридных систем, где АРС имитировало искусственную поверхность функционализированной с соответствующими белками, значительно продвинул наше понимание синаптического интерфейса 2, 3, 4, 5, 6, 7 , В этом контексте имеет большое значение для разработки APC мимические поверхностей, которые захватывают один или несколько аспектов клетки-мишени. Например, если лиганды привиты на поддерживаемых липидных бислоев, они могут диффундировать в плоскости бислоя, имитировать ситуацию на поверхности APC и в то же время позволяет формированиеcSMAC 6, 7. Аналогичным образом , кластеры на APC были имитировали путем создания островков лигандов в море полимеров 9, 10, 11, 12, 13, 14. Тем не менее, эти две функции до сих пор не были объединены.
Здесь мы описываем технику, чтобы создать новую нано-точек анти-CD3 (антитело, которое нацеливает комплекс TCR), окруженный липидный бислой с диффундирующими липидами. Бислой осаждают с помощью Ленгмюра-Блоджетт / Ленгмюра-Schaefer технику 7, 15, 16 и , если желательно, может быть функционализированный с определенным белком - например, лиганд клеточного интегрина Т ( так называемый ICAM - 1). Кроме того, анти-CD3 белка точек КоуLD быть заменен другим антителом или CAM. В то время как мы выбрали белки для дальнейшего использования в качестве платформы для исследований клеточной адгезии Т, стратегия подробно здесь может быть адаптирована для любого белка и даже ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Очистка стекла крышка гребни и наблюдения Камеры
- Расположить стеклянную крышку-слайды на несколько слайдов лоток, выполненный из инертного материала, как политетрафторэтилен (ПТФЭ).
- Погрузите лоток с горками и наблюдательную камеру в растворе поверхностно-активного вещества (любой продукт, рекомендованный для очистки кварцевых кювет подходит).
- С помощью ультразвуковой ванне, ультра-соникатные в растворе поверхностно-активного вещества в течение 30 мин при комнатной температуре (от 20 до 30 ° C).
- Промыть 5 раз сверхчистой водой (18,2 MΩ.cm, 0,059 мкСм / см).
- Ультра-соникат в растворе поверхностно-активного вещества в течение 30 мин при комнатной температуре (от 20 до 30 ° С).
- Промыть 10 раз сверхчистой водой.
- Повторите шаги 1.5 и 1.6 раза.
- Хранить в воде при комнатной температуре (от 20 до 30 ° C) в течение одной недели.
2. Изготовление Protein Nano-точек
- Осаждение из бисера
- Deposiт суспензию диоксида кремния шариков (2% об / об, 70 мкл) по каплям на крышке горкой (24 х 24 мм, толщина 170 мкм), проводимых с наклоном 15 градусов.
- Пусть суспензия распространяется в течение примерно 1 мин, переворачивая стекло на 90 ° каждые 15 с.
- Дайте жидкости испаряются в условиях окружающей среды.
- Хранить в чистом стекла или PTFE камеры при условиях окружающей среды в течение до 2 дней.
- Отложение алюминия
- Поместите слайды (полученный в разделе 2.1) внутри радиочастоты оборудования напыления (РЧ) магнетрон 8, на поворотный стол на расстоянии около 105 мм от алюминия (99%): кремний (1%) целевой.
- Откачка камеры осаждения до 2,6 × 10 -4 Па с использованием турбо-молекулярным насосом. Этот шаг важен для удаления возможных газообразных примесей.
- Представьте атмосферу чистого аргона (5N, 99,999%) с потоком 10 станда при давлении 0,8 Па (6,6 мТорра).
- Включите генератор ВЧ-мощности.
Примечание: В данном случае был использован типичный диапазон 400-600 Вт мощности радиочастотного на частоте 13,56 МГц. РФ используется генератор с соответствующей сетью в режиме емкостной плазмы связи. Отраженная мощность контролируется и сведено к минимуму с помощью адаптации к сети. - После того, как плазма стабилизируется, распылением в течение 2 мин держать затвор закрыт, чтобы удалить возможные примеси с поверхности мишени.
- Открыть затвор и позволить напыление продолжать в течение 60 мин для осаждения алюминия на стекле до толщины 200 нм.
- Вырезать поток аргона, закрыть запорный клапан, чтобы изолировать турбомолекулярный насос от камеры осаждения и удаление воздуха из камеры с чистым пitrogen, чтобы получить давление в помещении. Восстановление слайдов алюминиевого покрытия. Хранить до одного месяца в чистых и герметично закрытых стеклянных или ПТФЭ коробков в условиях окружающей среды.
- Осаждение из паровой фазы органосилана
- Погрузите слайд алюминиевого покрытия, полученный на стадии 2.2.6 в сверхчистой воде при комнатной температуре и ультра-разрушать ультразвук в течение 30 с в ультразвуковой ванне (50 Вт, 50/60 Гц, между 20 и 30 ° С).
- Депозит 0,5 мл (3-аминопропил) -triethoxysilane (APTES) в нижней части эксикатора.
ВНИМАНИЕ: APTES представляет собой органосилан, который легко испаряется, и является токсичным. APTES следует обращаться только под проточной капюшоном и перчатками. - Поместите стеклянные слайды (полученные в разделе 2.3.1) на керамическую сетку и месте внутри эксикатора.
- Подключение к эксикаторе мембранного насоса и работать на максимальной мощности в течение 30 мин, чтобы генерировать низкий вакуум.
- Закройте клапан эксикатора и выключить насос.
- Нагреть эксикатордо примерно 50 & deg; С в течение 1 ч.
- Откройте эксикаторе и собрать слайды.
- Переход к другому чистому эксикаторе для хранения в течение до 48 ч при комнатной температуре (от 20 до 30 ° C).
- Нанесение первого слоя белка - бычий сывороточный альбумин меченного биотина (БС-биотин)
- Разместите один из слайдов, подготовленных в разделе 2.3 на подложке из ПТФЭ.
- Депозит 1 мл 25 мкг / мл БСА-биотин, растворенного в фосфатном буферном растворе (PBS). Оставьте в течение 30 мин при комнатной температуре (от 20 до 30 ° C).
- Полоскание 10 раз PBS. Хранить образец в течение 24 ч при 4 ° С от источника света.
- Удаление алюминиевой маски
- Инкубируйте слайды в растворе NaOH в PBS (приготовленного добавлением по каплям 1 М NaOH до приблизительно 100 мл PBS, чтобы получить pH≈12) в течение ночи при комнатной температуре (от 20 до 30 ° C).
ВНИМАНИЕ. NaOH, вызывает коррозию и должны быть обработаны с помощью перчаток. - Полоскание10 раз в сверхчистой воде.
- Инкубируйте слайды в растворе NaOH в PBS (приготовленного добавлением по каплям 1 М NaOH до приблизительно 100 мл PBS, чтобы получить pH≈12) в течение ночи при комнатной температуре (от 20 до 30 ° C).
3. Осаждение Поддерживаемое липидный бислой (SLB)
- Очистка желоба Ленгмюра
- Удалить воду в корпусе из PTFE желоба Ленгмюра с использованием насоса.
- Очистить с помощью безворсового нетканого одноразового полотенца, смоченного в хлороформе.
ВНИМАНИЕ. Хлороформ является токсичным и следует манипулировать в хорошо вентилируемом месте, с маской (или под капотом потока), и с помощью соответствующих перчаток. - Чистые 4 раза с теплой водой (сверхчистой от 40 до 50 ° C).
- Чистые, по меньшей мере 6 раз с холодной водой. Сверхчистой
- Осаждение первого липидного слоя
- Поместите подносы из ПТФЭ в корпусе из PTFE желоба Ленгмюра, а затем заполнить его сверхчистой водой.
- Используйте программное обеспечение управления устройством Лэнгмюры, чтобы установить измеренное давление до 0 мН / м.
- Используйте газонепроницаемые стекло / металл шприца внести 30 мкл 1 мг раствора / мл липидов (1, 2-dioleoyl- зп глицеро-3-фосфохолин (DOPC) в хлороформе) на поверхности воды. Хлороформ испаряется и липидные молекулы спонтанно образуют монослой.
- Используйте программное обеспечение управления, чтобы сжать липидный монослой, закрыв ПТФЭ барьер до требуемого давления (27 мН / м для DOPC) достигаются.
- Используйте программное обеспечение управления, чтобы погрузить предметное стекло, полученное в разделе 2.5.2, в корпус из ПТФЭ с использованием моторизованного зажима.
- Удерживая слайд, в зажиме, перпендикулярной к поверхности раздела воздух-вода. Используйте программное обеспечение управления, чтобы поднять ее медленно (15 мм / мин) через интерфейс, сохраняя при этом постоянное давление в 27 мН / м.
- Место в сухой среде либо для немедленного использования или для хранения до 24 ч при комнатной температуре (от 20 до 30 ° C).
- Осаждение второго липидного слоя
- Поддерживать поверхностное давление в корыте Ленгмюры на требуемом уровне 27 мН / м. Сжатие с использованиемУправляющее программное обеспечение устройства Ленгмюра и / или добавить небольшое количество липида для достижения желаемого давления.
- Поместите стеклянные слайды, несущие липидный монослой, подготовленный в разделе 3.2.6, в горизонтальном положении на поверхности воды. Убедитесь, что каждый слайд плавает над лотком PTFE.
- Нажмите стеклянные слайды вниз, один слайд в то время, в его соответствующий лоток PTFE с использованием PTFE или металла пинцетом таким образом, что они погружены в воду. Избегайте наклон слайдов, нажимая.
- Используйте PTFE или металлические пинцеты для передачи лотков из ПТФЭ, содержащих слайды в кристаллизатор, наполненный сверхчистая вода, убедившись, что слайды не подвергаются воздействию воздуха.
- Используйте PTFE или металлические пинцеты для передачи, во время работы под водой, двухслойное покрытием предметного стекла в камеру наблюдения.
Примечание: Наблюдение камера находится под водой внутри кристаллизатора. Камеры наблюдения на заказ и состоит из ПТФЭ кольца с резиновой прокладкой апD стальные кожухи, которые могут быть собраны под водой, чтобы сделать камеру водонепроницаемой которой нижней поверхность выполнена из предметного стекла, предварительно покрытое липидного бислой. - Закройте камеру, продолжая работать под водой и обеспечение того, чтобы около 1 мл воды в ловушке внутри камеры.
- Возьмите собранную камеру из воды. Убедитесь, что водонепроницаемый и утечка бесплатно.
- Заменить 1 мл сверхчистой воды, присутствующей в камере наблюдения с PBS путем добавления и удаления 500 мкл PBS, в 10 раз. Убедитесь в том, что камера никогда не лишена жидкости.
- SLB этап блокирования
- Введение 100 мкг / мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) в смотровой камере, содержащей слайд, полученный в разделе 3.3.6, и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре (от 20 до 30 ° C).
- Ополосните бислой путем удаления и добавления 500 мкл PBS, в 10 раз. Бислой может храниться 24 ч при 4 ° С.
4. Функционализация с лигандами
- Добавить флуоресцентное или нефлуоресцентного neutravidin (NAV, дегликозилированной версия авидин не заряжается при рН 7) при 2 мкг / мл в камеру, содержащую слайд, полученный в разделе 3.4.2 в течение 30 мин при комнатной температуре (от 20 до 30 ° С).
- Промыть путем добавления и удаления 500 мкл PBS, в 10 раз.
- Добавить биотинилированного анти-CD3 по 2 мкг / мл в камеру, содержащую слайд, полученный в разделе 3.4.2. Для двойной функционализации SLB и точками, добавить Fc-ICAM-1 His-метки при 5 мкг / мл (в данном случае, бислой изготовлен из DOPC + 1% нитрилтриуксусная кислоты (NTA) липидов). Оставьте в течение 30 мин при комнатной температуре (от 20 до 30 ° C).
- Промыть путем добавления и удаления 500 мкл PBS в 10 раз
- Заменить PBS с клеточной средой (PBS + 0,1% BSA) путем добавления и удаления 500 мкл клеточной среды в 10 раз.
- Оставьте 200 мкл клеточной среды в Chambeг с ползуном.
- Поместите камеру в течение 10 мин при 37 ° С перед добавлением клеток.
5. Осаждение клеток (см ссылки 7 для деталей)
- Осторожно внести 400 мкл клеточной суспензии в камеру. Инкубируйте клетки в течение 30 мин при 37 ° С.
- Зафиксировать ячейку с 2% параформальдегида (PFA) в течение 15 мин при 37 ° С. Заменить PFA с PBS путем повторного удаления и добавления 500 мкл PBS.
6. Наблюдение
- Proteo-липидная нано-модель и SLB Текучесть
- С помощью флуоресцентного микроскопа с изображением шаблона белка в режиме эпи-флуоресценции с использованием соответствующего освещения длины волны (639 нм) и фильтра кубов (например , здесь, EX ТБФ 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; Е. М. ТБФ 526 + 601 +688).
Примечание: Интенсивность сигнала может быть определено количественно оценить количество белка внутри и за пределами точки. Используйте соответствующее освещение длину волны (330 нм) и пМСДЭНИ куб с изображением бислой (BP 365/12, FT 395, LP 397), который появляется светлая с темными дырами. - Используйте метод непрерывного фотообесцвечивание (КПБ) 13, 15 для измерения коэффициента диффузии меченых липидов из в бислой. Это наблюдение предпочтительно сделано только после осаждения SLB.
Примечание: Для того, чтобы количественно оценить коэффициент диффузии, два параметра измеряется в процессе КПБА: определенное время отбеливания красителя (тугой) и длины затухания флуоресцентного профиля гало, образованном вокруг беленой области (TAUD). Первый получается путем построения графика временной эволюции интенсивности флуоресценции в центре освещенного поля во время процесса CPB. Второй получаются путем построения профиля интенсивности на крае освещенной зоны (в среднем за 12 линий и 5 изображений после того, как будет достигнут стационарный). Кривые приспособлены для получения тугой и TAUD. Коэффициент диффузии даются темUD 2 / тугим (D =
).
- С помощью флуоресцентного микроскопа с изображением шаблона белка в режиме эпи-флуоресценции с использованием соответствующего освещения длины волны (639 нм) и фильтра кубов (например , здесь, EX ТБФ 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; Е. М. ТБФ 526 + 601 +688).
). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Флуоресцентные изображения были проанализированы, чтобы измерить расстояние и размер точек. Типичный интервал было установлено, что 1 900 ± 80 нм и типичная точка-размер был 600 ± 100 нм (рис 1 г). Интервал устанавливается по размеру гранул, используемых для маски. Точка-размер устанавливается шарик размером, а также условий осаждения. SLB осаждается однозначно вокруг белковых точек , а не на них (рисунок 2), с совершенной комплементарностью между отверстиями видели в канале формирования изображения SLB и точками видели в канале СЧ формирования изображения. Анализ непрерывного фотообесцвечивание данных показывает , что липиды в узорной бислой остаются жидкости и имеют типичную диффузионную проницаемость 5 μm² / с (рисунок 3).
Рисунок 1: Схематическое представление этапов изготовления. (а -7 торр, Аргона потока 10 SCCM, давление процесса 6.2 мТорра, изображенном на ускоряющем напряжении 5 кВ. Изображения подтверждают наблюдение, сделанное с оптической микроскопией (изображение не входит) до осаждения алюминия, что шарики расположены в центре монослоя гексагональной решетки на стекле горки. (Б) Вторичная маска из алюминия , созданного осаждение распыления после удаления первичной бисерной-маски. (С) Осаждение кремнийорганического и БСА-биотин , хотя вторичной маски. (Д) удаление из алюминия выявления нано-точек БСА-биотин. (Е) осаждение SLB. (Е) связывание NaV с БСА-биотин. (Г) Binding анти-CD3 для NaV. Вставки показывают эпи-флуоресцентное изображение из нано-точек массивов. Здесь СЧ флуоресцентно меченных. Типичная точка-размер составляет 600 ± 100 нм, а типичное расстояние составляет 1900 ± 80 нм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: комплементарность нано-точки и SLB узора. (А, б) Эпи-флуоресцентные изображения флуоресцентных NaV нано-точек и из SLB с флуоресцентными меченых липидов. (С) Композитный изображение СЧА точек (красный) в море SLB (зеленый) показывает совершенную комплементарность NaV и SLB. Быстрое преобразование Фурье (БПФ) изображения на вставке указывает на дальний порядок. Шкала бар: 4 мкм.rge.jpg»целевых =„_blank“> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Количественное диффузии липидов в SLB. (А) Эпи-флуоресценция изображение SLB , прежде чем отбеливания. Белковые точки показывают как темные дыры в ярком море липидов. Поле диафрагма ограничивает освещенную зону. (Б) Эпи-флуоресценция SLB после отбеливания непрерывно в течение 50 с. Гало видны внутри области, ограниченной полевой диафрагмы указывает на то, что липиды являются мобильными. Шкала бар: 10 мкм. (С) Средняя профиль интенсивности вдоль края поля-диафрагмы (вверху) и при распаде интенсивности с течением времени в ходе процесса вытаскивания (внизу). Эти данные анализируются, чтобы извлечь коэффициент диффузии, который обычно 5 μm² / с.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в рамках протокола, описанном выше, связаны с образованием белковых нано-точек или задним заполнением пространства вокруг точек с помощью поддерживаемого липидного бислой. Первый важный шаг в отношении белкового нано-точка является подготовкой борта-маска. Чистка крышки-ползун имеет решающее значение. Слайды должны быть либо очищены с помощью моющего раствора, который рекомендуется для очистки кварцевых кювет, или с помощью кислородной плазмы. Другие методы очистки, такие как погружение в этаноле или обработке изо-пропаноле не оказывают стекла достаточно гидрофильными и, следовательно, не поддерживают образование большого покрытия борта монослоя. В то же время, поверхность скольжения должна быть совместима с последующей стадии формирования SLB с помощью Лэнгмюра-Блоджетт техники 7, 15, 16. Следующим важнейшим шагом является осаждение и удалениеluminum. Если осаждение происходит через распыления техники, как это сделано здесь, мишень должна быть легированный кремний (на 1%). В противном случае, если мишень выполнена из чистого алюминия, осажденный слой трудно удалить с раствором гидроксида щелочным, как описано выше, вероятно, связанно с образованием оксида алюминия и взаимопроникновения между осажденным слоем алюминия и стеклом подложкой. Продолжительность осаждения определяет размер белковых точек 9, однако, здесь мы работали с одним временем осаждения и , следовательно , размером одной точки. Образец можно хранить в условиях окружающей среды в течение нескольких месяцев после осаждения алюминия и примерно через неделю после осаждения БСА-биотин.
Второй важный шаг относится к осаждению SLB. Очистка стеклянной крышки горкой снова является принципиально важным моментом. Как и в случае для любого осаждения работы Лэнгмюра-Блоджетт, весь материал, используемый должны быть изготовлены из стекла или Polytetrafluoroethylene (ПТФЭ) и должен быть скрупулезно чистым. После нанесения первого липидного монослоя, покрывающие гребни могут храниться в течение нескольких дней, но после нанесения второго монослоя, они должны быть использованы немедленно.
В то время как мы показали протокол для создания анти-CD3 нано-точек для использования в исследованиях Т - лимфоцит адгезии 9, 13, процедура является очень гибкой и может быть адаптирована для любого биотинилированного белка. Состав липидного бислой может быть легко изменен, и он может быть дополнительно функционализированным при желании. Один важный момент, чтобы рассмотреть это возможно неспецифическое поглощение белков, особенно на липидный бислой окружающих точек.
Основное ограничение методы возникает из-за использование коллоидно-бисерной самосборки для первичной маски. Будучи методом снизу вверх, он разделяет некоторые из проблем всех таких подходовнапример, отсутствие гибкости и полного контроля над формой рисунка. Решетки шаблона обязательно отражает симметрию маски шарика и, следовательно, всегда гексагональные. Форма узора мотива представляет собой окружность , и определяется с помощью комбинации бисерного размера и продолжительности осаждения алюминия 9, 13. Альтернативные методы управления точечную размера также были предложены 14, 17, 18.
Субстраты нано-модель с белками, белком-фрагментами или пептидами, широко использовалась в прошлом для исследования клеточной поверхности взаимодействия, особенно адгезии и миграции 19 20. Новаторская работа показала , что ткани , образующие клетки не распространяются на образцах с шагом большей , чем заданное пороговое значение 21, и дальнейшее исследование шо ср что длина шкалы этого явления задается размером talins, которые играют важную роль в связывании рецепторов интегрина с актином цитоскелета 22. Однако во всех этих исследованиях, белки были связаны с золотыми наночастицами, которые сами по себе были иммобилизованных на стекле.
В контексте Т - клеток, протеобактерий-липидной мембраны, как правило , имитирующих антиген представляющих клеток, широко используются , чтобы понять основные аспекты функции Т - клеток 6. Изобретательные методы нано-паттерн были использованы для создания загонов с металлическими барьерами разделения белковых функционализированных пластырями SLB, которые обеспечили понимание структуры и связность / интерфейса 23 APC Т - клеток. Этот вид нано-структурирование, однако, очень отличается от белковых нано-точек, предложенных здесь. В последнее время, нано- кластеры были созданы с использованием химической связи белковых функционализированный липидовсс = «Xref»> 3, что пролить свет на следствие кластеризации рецепторов. Преимущество в том, что, в отличие от настоящего случая, кластеры могли бы быть в принципе самих мобильных устройств. Тем не менее, такие спонтанно образовавшиеся скопления обязательно менее хорошо контролируются с точки зрения размера и плотности, чем предварительно сформированных белковых нано-точек, описанных здесь.
Мы предполагаем, что белок нано-точечный декорированные SLBS, представленные здесь может быть использован для изучения различных аспектов межклеточной адгезии. Один очевидный вопрос , который возникает , является ли, как описано выше для тканевых клеток , образующих 19, лимфоциты тоже имеет характеристическую длину масштаб , связанный с адгезией. Предварительные результаты , как представляется , показывают , что , по крайней мере , когда адгезия опосредуется комплексом TCR, плотность лигандов , а не интервал является определяющим параметром для распространения и активации 10, 11, 12
Два основных преимущество этих протеобактерий-липидных узоры совместимость подложек с современной оптической микроскопией и легкостью приготовления, что делает их совместимыми с потребительными и перекидными приложениями. После осаждения алюминия, все этапы подготовки может быть осуществлено на стандартном влажном лабораторном столе, В будущем, оно может быть предусмотрено, что с алюминиевым покрытием и стеклянная поддерживаемой бусинка-маска, полученная в специализированном учреждении, передается и хранятся в биологии лабораториях для использования в качестве и в случае необходимости. С этой точки зрения, мы считаем, что эти субстраты имеют потенциал, чтобы стать платформой для изучения взаимодействия клеток с контролируемым нано узором протеобактерий-липидной мембраной.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Лоран Limozin, Пьер Диллард и Астрид Валь для продолжения плодотворной дискуссии по поводу приложений сотовой связи. Мы также благодарим Фредерика Беду от PLANETE чистых помещений объекта за его помощь с наблюдениями SEM. Эта работа была частично финансируется Европейским исследовательским советом по грант № 307104 FP / 2007-2013 / ERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | ||
| Observation chamber | Home made | ||
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 | |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | ||
| Desiccator | Labbox | ||
| Crystallizer | Shott | ||
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 | |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 | |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | ||
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 | |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 | |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C | |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 | |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 | |
| Film balance | NIMA | Medium | |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system | |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | ||
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
References
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York. (2002).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Kaizuka, Y., et al. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
- Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).
- Grakoui, A., et al. The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation. Science. 285, 221-228 (1999).
- Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells. Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).
- Lu, X., et al. Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).
- Pi, F., Dillard, P., et al. Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells. Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).
- Deeg, J., et al. T cell activation is determined by the number of presented antigens. Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).
- Delcassian, D., et al. Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells. Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).
- Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays. Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).
- Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization. Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).
- Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies. Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).
- Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion. Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).
- Sengupta, K., et al. Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid. Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).
- Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography. Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).
- Massou, S., et al. Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates. Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).
- Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion. Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).
- Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Schvartzman, M., et al. Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level. Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).
- Mossman, K., Groves, J. Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse. Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).
- Furlan, G., et al. Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters. J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).
- Hsu, C. J., et al. Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation. PloS One. 7 (2), e32398 (2012).
- Yu, C., et al. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).
