A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.
Эффективность антибактериальных кандидатов лечения должно быть продемонстрировано на животных моделях инфекции в качестве составной части процесса открытия и разработки, предпочтительно в моделях, которые имитируют намеченную клинических показаний. Способ индукции устойчивых инфекций легких у иммунокомпетентных крыс и мышей описано , что позволяет для оценки лечения в модели серьезной пневмонии , вызванной S. Пневмококк, H.influenzae , , P.aeruginosa , К. А. Пневмококк или baumannii. Животных анестезировали, и на основе агара прививочный материал проникает глубоко в легкие через трахею нехирургических интубации. Полученная инфекция соответствует, воспроизводимым и стабильным в течение по крайней мере 48 часов и до 96 часов для большинства изолятов. Исследования с использованием антибактериальных на рынке продемонстрировали хорошую корреляцию между эффективностью в естественных условиях и в пробирке восприимчивости, а также соответствие между фармакокинетических / фармакодинамических целей определяетсяв этой модели и клинически принятых целей наблюдалось. Несмотря на то, есть первоначальные инвестиции времени при изучении техники, она может быть выполнена быстро и эффективно, как только знание достигается. Преимущества модели включают в себя устранение нейтропенической требования, повышенную надежность и воспроизводимость, способность к обучению более патогены и изолятов, улучшенную гибкость при проектировании исследования и создания сложных инфекции в иммунокомпетентных хозяина.
Оценка эффективности потенциальных кандидатов наркотиков в животных моделях инфекции является одним из важнейших компонентов процесса обнаружения наркотиков антибактериальной. Эффективность in vivo исследования дают важные данные для принятия решений по размаху усилий обнаружения, от выяснении отношений структура-активность (SAR) и оптимизации свинца химической серии через определяющего фармакокинетический-фармакодинамических (PK / PD) характеристики соединений и поддерживая подбор дозы для клиническое развитие и одобрение регулирующих органов. Многочисленные модели инфекции для животных описаны в литературе для этих целей. Одним из наиболее распространенных и широко используемых моделей является нейтропенией инфекция бедренная мышь, которая была впервые Eagle 1, 2 и позже расширен Vogelman и Крэйг 3, 4. Эта модель была неоценима для поддержки определения бактериальных восприимчивости контрольных точек и для обеспечения PK / PD цели для руководства человека дозирования. Есть много экзаменПлес , где прогностическая способность этой модели была доказана 4-7. Тем не менее, одним из недостатков модели инфекции бедра является отсутствие прямое отношение к легочных инфекций. Существует в настоящее время больший акцент на соответствие сайта инфекции на животных моделях к месту инфекции в организме человека; и, таким образом, для изучения соединений для лечения воспаления легких, он идеально подходит для использования инфекции модель легких у животных.
Известно несколько способов индукции инфекций легких у лабораторных животных, были описаны и использованы для антибактериальных исследований эффективности в том числе интраназального ингаляции, аспирации через ротоглотки маршрут, аэрозольной и хирургической трахею инокуляции 8. Во многих случаях животные (в частности, мыши), в первую очередь должны визуализироваться с нейтропенией, чтобы достичь надежной легочной инфекции. Несмотря на это сильно ослабленным иммунитетом государства, число бактериальных патогенов и штаммов, которые производят жизнеспособные инфекции у грызуновограниченное. Например, это может быть трудно , чтобы успешно установить гемофильной инфекции или Acinetobacter baumannii пневмонии моделей 9, 10 и даже более вирулентных патогенов, таких как Пневмококк, синегнойной палочки и Klebsiella пневмонии, могут создавать проблемы 11-13.
В 1991 году Смит описал модель легочной инфекции у иммунокомпетентных крыс сосущих , в котором инфекция была установлена прививая бактерии непосредственно в легкие с помощью простого нехирургическим трахею методом 14 интубации. Берри и др. позже модифицировал метод заражения мышей 15. Использование агар на основе посевного материала , эта техника прививка вызывает устойчивые инфекции легких в обоих иммунокомпетентных крыс и мышей с S. Пневмококк, H.influenzae , К. Пневмококк, P.aeruginosa , и А. baumannii. Она поддается широкому спектру изолятов, в том числе различные укрывает сопротивлениеANCE детерминанты и те, которые не производят жизнеспособное инфекции с помощью других инокуляции маршрутов. Она также позволяет эффективность должна определяться в иммунокомпетентных животных, состояние, которое является более актуальной, чем традиционная нейтропенической модели мыши для групп пациентов, которые не сильно ослабленным иммунитетом. Последовательность и надежность этой модели по нескольким патогенам и изолятов делает его хорошо подходит для антибактериальных исследований эффективности.
Для оптимального успеха в воспроизведении этой модели инфекции, следующие дополнительные предложения должны быть рассмотрены. Вирулентность новых изолятов может быть повышена за счет пересева 2 – 3 раза в естественных условиях перед использованием в исследовании. Замороженные бактериальные запасы всегда должны быть получены из первичного в естественных условиях -derived источник с наименьшим количеством проходов как можно дальше от оригинала, а также замораживание или повторное использование талой запаса не рекомендуется. Использование последних клинических изолятов оправился от больных с воспалением легких, и / или подготовки культур в фазе роста журнал может также помочь улучшить создание инфекции. Пятикратное разведение в агар (например , 2 мл физиологического раствора суспензию добавляют к 8 мл охлажденного агара) , может быть использован вместо десяти раз , чтобы увеличить бактериального инокулята, а объем посевного материала можно регулировать в зависимости от размера животного (например , 200 мкл / животное обычно засевают в 250 крыс г). Перед добавлением соляной бактериальной суспензии вагар (т.е. на шаге 2.3), бактериальная плотность может быть предсказано или оцениваться путем визуального осмотра, стандартов MacFarland или измерений оптической плотности. Полезно ознакомиться с ин витро характеристиками роста для каждого изолята до проведения экспериментов в естественных условиях. Последовательность в росте и обработке позволяет наиболее точную оценку бактериальной плотности для любого данного изолята. Стандартные микробиологические методы, которые отличаются от тех, которые описаны, например, в качестве альтернативы средства массовой информации и гомогенизаторы тканей, могут быть использованы в случае необходимости для приготовления инокулята и перечислении бактерий из инфицированных тканей.
Настоятельно рекомендуется подготовить или расплавить агар день до начала эксперимента и хранить его в течение ночи в отдельной ванне воды устанавливается на 50 ° C. Это позволит упростить процесс и помочь защититься от агара слишком горячим во время инфекции. Температура 41 – 42 ° С достигает хорошего баланса между maintaiнин агар в жидком состоянии, не будучи слишком горячей для кратковременной выживаемости бактерий. В качестве возможной альтернативы питательный агар, благородный агар успешно применяется в ряде экспериментов. Одна трубка из агаровой посевного материала , обычно достаточно в течение всего эксперимента (и рекомендуется), но несколько трубок могут быть подготовлены к заражению большого количества животных (например , более 60) , или когда процесс заражать занимает больше времени , чем 30 – 45 мин Если множественные инокулята трубки необходимы, добавить солевой бактериальной суспензии в каждую пробирку агара, как это необходимо. Это снижает риск того, что выживаемость бактерий и / или пригодности будет зависеть от длительного воздействия повышенной температуры перед посевом. Следует отметить, что использование нескольких трубок инокулята также может потребовать дополнительных процедур для животных рандомизации. Всякий раз, когда это возможно, заражает всех животных из того же препарата прививочный материал. Рекомендуется адаптировать размер экспериментов к текущему уровню мастерства с тэchnique.
Опытный ученый может интубации и прививать животное менее чем за 30 секунд и прививают до 5 – 6 животных в каждой партии (т.е. с одного шприца полный агар инокулята). Для тех, кто изучает технику, скорость важна, как агар начнет затвердевать; Тем не менее, точное размещение посевного материала является более важным. Начинают с 1 или 2-х животных в каждой партии, а также увеличить как техника становится более знакомым. Животных продолжают дышать во время интубации; Таким образом, временной интервал для прививки зависит от того, как быстро животное восстанавливается из изофлуран, которая должна быть примерно на 2 – 3 мин. Животные, которые пробуждают в ходе процесса может быть повторно анестезировали и попытался второй раз, но это не рекомендуется делать это повторно. Успешная прививка с первой попытки, как ожидается, почти 100% животных, как только знание достигается. Обратите внимание, что легче изучать технику с использованием крыс в первую очередь; Мыши более чувствительны и меньше тожеLs более склонны к закупорке с затвердевшего агара, если не манипулировать быстро. Предварительного нагрева, шприцы, шланги, трубки и солевые, а также держать устройство интубации на теплой (не горячей) поверхности, например, грелку на низкой установке, может помочь предотвратить затвердевание агара. При изучении техники, это также полезно практиковать правильное размещение посевного материала с использованием темного цвета красителя (например, сосредоточенной метиленовым синим) вместо бактериальной суспензии в агар. Выполните процедуру, как описано, но эвтаназии животных сразу же после инокуляции красителя (не позволяя животным восстанавливаться между анестезией и эвтаназии). Проанализируйте, чтобы определить, где краситель был помещен, и корректировать технику соответственно.
Первичной конечной точкой в этой модели КОЕ из зараженных легких. Выживание не является хорошим показателем бактериальной нагрузки и не является рекомендуемой конечной точки. Для исследования эффективности, предложенный N 5 – 6 животных в каждой группе, как это predicted для обнаружения ≥1 log 10 КОЕ различий между группами по крайней мере , на 90% мощности. Животные могут быть заражены в таких группах, что клетка товарищей остаются вместе, или истинный процесс рандомизации может следовать. Обратите внимание, что если группы назначаются клетки, группы должны быть заражены в случайной последовательности с контролем роста отслуживших исследования инфицированных в прошлом (чтобы подтвердить, что выживаемость бактерий / фитнес не зависела от продолжительности времени подвергается воздействию повышенной температуры в водяной бане). Нет методы цензурирования данных не должно быть необходимым, и ни один не рекомендуется за исключением немедленного удаления любого животного, которое было явно неправильно засеянные в начале исследования (до начала каких-либо процедур). Животные , которые умерщвляют до окончания исследования должны быть отобраны и результаты включены в набор данных , если действительная причина для исключения не было выявлено перспективно (то есть событие , не связанного с инфекцией или лечения). унос лекарственный препарат может АРРЭСТ некоторые образцы и является важным фактором для всех моделей в естественных условиях инфекции. Если соединение дается часто, близко к тому времени , эвтаназии или имеет длительный период полураспада, он может присутствовать в гомогенате ткани при достаточно высокой концентрации , чтобы продолжать убивать бактерии исключая виво в процессе бактериального счетном (разведение и металлизация образцы или на агара во время инкубации в течение ночи). Чтобы предотвратить это, активированный уголь и / или добавку, ухудшающее активной молекулы без повреждения клетки бактерий могут быть добавлены к пробе перед гомогенизацией. Другие методы включают центрифугирование пробы, чтобы удалить большую часть активного соединения (которое должно оставаться в надосадочной жидкости) и использованием различных разведении и металлизации схем достаточно разбавлен, активное соединение с неэволю- ингибирующей концентрации.
Как видно из примеров , показанных на рисунке 2, эта модель успешно яnduces инфекций легких у грызунов с широким спектром микроорганизмов , включая те , которые не растут в других моделях (например , H.influenzae , ). Эти инфекции являются последовательными и воспроизводимым, уменьшая вероятность того, что эксперименты нужно будет повторяться из-за сбоя модели и / или плохой работы с данной изолята. Хотя животные иммунокомпетентными, они не в состоянии быстро решить инфекцию, если вообще. Это позволяет увеличить гибкость в длине исследуемой, так как многие изоляты поддерживать жизнеспособный инфекцию через, по меньшей мере, 96 часов, без необходимости повторные инъекции, чтобы поддерживать нейтропении. Потенциальные преимущества изучения антибактериальную эффективность в иммунокомпетентных животных было отмечено выше 20, 21, и есть доказательства того, что для некоторых соединений (например , Оксазолидиноны), данные из не-нейтропенией грызунов могут более точно прогнозировать цели воздействия на человека по сравнению с теми , оказываемых нейтропенией 5. Многоцелевой полезность тон модель демонстрируется на рисунках 3 и 4 и таблицах 1 и 2. Эти исследования являются частью большой коллекции опубликованных и неопубликованных данных , которые были сгенерированы с этой моделью для поддержки усилий по оптимизации свинца 16, 17, 22-24, для сравнения и подтверждение предлагаемого человека дозировки препаратов 19, 25-29 и для ПК / PD характеристики 18, 30-32 .WHILE эта модель изначально более сложным провести по сравнению с методом интраназальной ингаляции, существует множество преимуществ , как описано выше. С практикой и повседневного использования, методы должны стать простым для выполнения.
Можно отметить, в некоторых исследованиях, что бактериальная нагрузка исходно была ниже, чем обычно ориентированы на других моделях легочной инфекции. Это связано в значительной степени необходимого разведения в агаре и небольшого объема проблемой, особенно у мышей. Тем не менее, следует также отметить,что бактериальный рост наблюдался во всех случаях, даже если первоначальная нагрузка была относительно низкой. Целевой базовой линии бактериальной нагрузки составляет от 6 до 6,5 log 10 КОЕ / легкие ( от 6,8 до 7,3 log 10 КОЕ / г ткани у мышей на основе среднего веса легких) , что соответствует плотности оценочном у больных людей с тяжелой формой пневмонии 33. Более высокая базовая линия нагрузка может быть достигнута путем дальнейшего концентрирования бактериального инокулята или путем задержки начала введения соединения, чтобы обеспечить дополнительный рост бактерий; Тем не менее, увеличение нагрузки вызов слишком много может привести к аномально тяжелой и острой болезни (т.е. смерть менее чем за 24 ч) , что огнеупорный ко всем антибактериальным лечения независимо от восприимчивости. Несмотря на то, прививочный материал вначале помещают преимущественно в левое легкое животного, инфекция, как правило распространяется по всему обоих легких. Прогрессирование заболевания легких, распространение бактерий к другим органам, и в конечном итоге заболеваемость часто Observред с С. К. Пневмококк Пневмококк и P.aeruginosa , . Интересно, что инфекции с H. гриппа и А. baumannii, как правило , более редко и содержали привести к смерти в предписанное бактериального инокулята.
Результаты оценки эффективности , полученные из этой модели хорошо коррелируют с профилями в пробирке восприимчивости, а также определенных целей / PD PK. Снижение бактериальной нагрузки обычно наблюдается изолятов считаются восприимчивыми к агенту тестируется, в то время как те , которые считаются резистентной экспоната без изменений или бактериального роста выше базовой линии 16, 17, 19, 24-29. Исследования на крысах , оценивающих два хинолоны и макролиды с использованием этой модели 32, показали , что целевой PK / PD требуется для 1-log 10 снижение S.pneumoniae , по сравнению с исходным уровнем коррелировало с мишенью , определенной в нейтропенией мышей и, что более важно, с клинические цели для бактериальной пневм внебольничнойOnia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, новый механизм антибиотик был испытан против множественной S.pneumoniae , и требует аналогичной цели PK / PD для 1-log 10 снижения этой инфекции легких модели 31 , как это требуется для 1-log 10 снижения в модели нейтропенической бедренной 36 , когда проникновение легких было принято во внимание (данные в файле). Аналогичным образом , PK / PD мишени тестировано на мышах для GSK2251052 против P.aeruginosa , были последовательными для стаза, 1- и 2-log 10 уменьшение КОЕ между этой моделью 30 легких и нейтропенией модели инфекции бедренной , когда проникновение легких рассматривалось 37, 38 , Корреляция с нейтропенией модели инфекции легких с использованием интраназальной инокуляции бедных; Однако GSK2251052 не производят больше , чем статический ответ в этом исследовании 38. Это может быть связано с более высокой бактериальной посевного материала , который был 8 log 10 КОЕ / мышь по сравнению с 6 журнала <sub> 10 КОЕ / мышь в нейтропеническая бедренной кости 37 и трахею интубации 30 моделей. Сбор данных, таких как это имеет решающее значение для сравнительного анализа, поскольку это позволяет прямое сравнение с существующими моделями и корреляции с клиническими данными для оценки трансляционной возможности прогнозирования. Более широкое использование трахею интубации легких модели инфекции будет предоставлять дополнительные данные для этих типов анализов.
Есть несколько ограничений этой модели иммунокомпетентных пневмонии. Во-первых, он не очень хорошо подходит для оценки возникновения спонтанной резистентности, так как высокая бактериального инокулята как правило, требуется для таких исследований приводит к слишком тяжелой инфекции. После попытки достичь бактериальных бремени 7 или 8 log 10 КОЕ на исходном уровне, наблюдается быстрое заболеваемость (т.е. животных становятся умирающий менее чем за 24 часа) , несмотря на тщательной промывки посевного материала для удаления ранее существовавших токсинов (данные на файле). Этоможет быть возможным, чтобы преодолеть эту проблему с помощью более крупных грызунов. Крысы, особенно тяжелые крыс (> 250 г), по всей видимости, лучше переносить более высокие инокулята, по сравнению с мышами, и могут быть пригодны для этих типов исследований. Второе ограничение состоит в том, что использование агар в качестве инфекционно-энхансер может предотвратить с помощью модели оценки определенного хоста: патоген взаимодействий. Полагают, что агар обеспечивает защищенный координационный центр, пока инфекция не будет полностью установлена в легких. Можно поставить прививочный материал в физиологическом растворе, а не агар, чтобы помочь преодолеть эту проблему; Тем не менее, следует отметить, что это будет производить только инфекцию с некоторыми изолятов. В-третьих, есть крутой кривой обучения требуется, чтобы стать специалистами в технике. Эта процедура может быть деликатным, особенно у мышей. Легко ошибочно поместить металлическую канюлю в пищевод, а чрезмерное усилие может привести к проколу либо пищевода или трахеи. Тщательное размещение посевного материала такжетребуется или животные могут либо не восстанавливать или не может быть адекватно заражен. Тем не менее, с терпением и упорством, можно стать очень опытными и выполнять технику быстро, плавно и точно.
Удаляя требования к нейтропения, повышение надежности и воспроизводимости, что позволяет исследователям изучить больше патогенных микроорганизмов и изоляты, улучшая гибкость экспериментального проектирования и обеспечивая сложные инфекции характеризовать фармакодинамику пневмонии, эта иммунокомпетентных модель инфекции легких добавляет существенную ценность к открытию антибиотика сообщества. Более широкое использование этой модели дополнительных исследователей поможет обеспечить необходимый сравнительный анализ для того, чтобы получить более широкое признание и продолжать оказывать вспомогательную информацию для соответствующей интерпретации.
The authors have nothing to disclose.
JH хотел бы выразить признательность и поблагодарить наставника, друга и бывший менеджер Валери Берри для первого учит нас эту модель; и Гари Woodnutt, который научил нас основам и вдохновлял нашу приверженность области антибактериальной PK / PD. Все авторы хотели бы поблагодарить Дэвида Пэйна за его поддержку и признательность за нашу науку. Мы хотели бы отметить наш бывший в естественных условиях коллегами микробиологических , которые внесли вклад в тело данных , полученных с помощью этих методов, особенно Пит Демарш, Роб STRAUB, Рони страницу и Nerissa Саймон. И, наконец, мы благодарим наших коллег микробиологических в пробирке за их помощь, особенно для обеспечения всех МИК мы спрашиваем (Линн McCloskey, Джош Уэст и Шарон мин); и для нашей команды клинической микробиологии, который предоставляет экспертные консультации и поддержку (Линда Миллер, Николь Scangarella-Оман и Дебора Батлер).
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
30 ml free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
50 ml Polypropylene Conical Tube 30 x115mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
1 ml TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
Animal feeding needle – straight 20×3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand – Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
75 TN 5.0ul syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
Pyrex tube, culture 25×150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |