Abstract
La eficacia de los tratamientos antibacterianos candidato debe ser demostrada en modelos animales de infección como parte del proceso de descubrimiento y desarrollo, de preferencia en modelos que imitan la indicación clínica deseada. Un método para inducir infecciones pulmonares robustos en ratas y ratones inmunocompetentes se describe que permite la evaluación de los tratamientos en un modelo de neumonía grave causada por S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae o A. baumannii. Los animales se anestesiaron, y un inóculo a base de agar se deposita profundamente en el pulmón a través de la intubación intratraqueal no quirúrgica. La infección resultante es consistente, reproducible, y estable durante al menos 48 h y hasta 96 h para la mayoría de los aislados. Los estudios con antibacterianos comercializados han demostrado una buena correlación entre la eficacia in vivo e in vitro de susceptibilidad, y la concordancia entre farmacocinéticos / farmacodinámicos objetivos determinadaen este modelo y los objetivos clínicamente aceptados se ha observado. A pesar de que es una inversión de tiempo inicial en el aprendizaje de la técnica, se puede llevar a cabo con rapidez y eficacia una vez que se logra el dominio. Beneficios del modelo incluyen la eliminación del requisito de neutropenia, mayor robustez y reproducibilidad, capacidad para estudiar más patógenos y aísla, una mayor flexibilidad en el diseño del estudio y el establecimiento de una infección difícil en un huésped inmunocompetente.
Introduction
La evaluación de la eficacia de los fármacos candidatos potenciales en modelos animales de infección es un componente crítico del proceso de descubrimiento de fármacos antibacterianos. Los estudios in vivo proporcionan datos importantes para la toma de decisiones en el transcurso de los esfuerzos de descubrimiento, de elucidar las relaciones estructura-actividad (SAR) y la optimización de serie química iniciativa a través de la determinación farmacocinético-farmacodinámico (PK / PD) características de los compuestos y el apoyo a la dosis para desarrollo clínico y la aprobación reglamentaria. Numerosos modelos animales de infección se describen en la literatura para estos fines. Uno de los modelos más comunes y ampliamente utilizados es la infección neutropénica muslo del ratón, el cual fue iniciado por Eagle 1, 2 y posteriormente expandido en Vogelman y Craig 3, 4. Este modelo ha sido muy valioso para apoyar la determinación de la susceptibilidad de interrupción bacterianas y para proporcionar objetivos PK / PD guía para la dosificación humana. Hay muchos examenples donde la capacidad de predicción de este modelo se ha demostrado 4-7. Sin embargo, uno de los inconvenientes del modelo de infección del muslo es la falta de relevancia directa para las infecciones pulmonares. Ahora hay un mayor énfasis en la búsqueda de la localización de la infección en modelos animales para el sitio de la infección en los seres humanos; y por lo tanto, para estudiar compuestos para el tratamiento de la neumonía, es ideal para utilizar un modelo de infección pulmonar en los animales.
Varios métodos para inducir infecciones pulmonares en los animales de laboratorio se han descrito y utilizado para los estudios de eficacia antibacteriana incluyendo inhalación intranasal, la aspiración a través de la ruta de la orofaringe, la exposición al aerosol, y la inoculación intratraqueal quirúrgica 8. En muchos casos, los animales (especialmente ratones) primero deben ser prestados neutropénica a fin de lograr una infección pulmonar robusto. A pesar de este estado gravemente inmunodeprimidos, el número de patógenos bacterianos y cepas que producen infecciones viables en roedores eslimitado. Por ejemplo, puede ser difícil de establecer con éxito Haemophilus influenzae o Acinetobacter baumannii en modelos neumonía 9, 10, e incluso más virulenta patógenos, tales como Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa y Klebsiella pneumoniae, puede plantear problemas 11-13.
En 1991, Smith describe un modelo de infección pulmonar en ratas destetadas inmunocompetentes en los que la infección se estableció mediante la instilación de bacterias directamente a los pulmones a través de un simple método de intubación intratraqueal no quirúrgica 14. Berry et al. posteriormente modificado el método para infectar a los ratones 15. El uso de un inóculo a base de agar, esta técnica de inoculación induce infecciones pulmonares robustas en tanto en ratas inmunocompetentes y ratones con S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa y A. baumannii. Es susceptible a una amplia gama de aislados, incluyendo aquellos que alberga varios resistendeterminantes ANCE y aquellos que no producen una infección viable a través de otras vías de inoculación. También permite a la eficacia que se determinará en animales inmunocompetentes, una condición que es más relevante que el modelo tradicional de ratón neutropénico para poblaciones de pacientes que no están severamente inmunocomprometidos. La consistencia y fiabilidad de este modelo a través de múltiples patógenos y aislamientos hace que sea muy adecuado para estudios de eficacia antibacteriana.
Protocol
S. pneumoniae
Todos los procedimientos están en conformidad con los protocolos aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo GSK Institucional (IACUC), y cumplen o exceden las normas de la Asociación Americana para la Acreditación de Laboratorio Animal Care (AAALAC), el Departamento de Salud y Humanos de los Estados Unidos servicios y todas las leyes locales y federales de bienestar animal.
NOTA: A menos que se especifique lo contrario, todos los procedimientos deben realizarse utilizando una técnica aséptica.
1. La cultura aislamientos bacterianos
- Preparar 3 a 6 placas de agar con S. pneumoniae o H. influenzae, como caldo de cultivo generalmente no proporciona suficiente material para la inoculación.
- Retirar un cultivo madre congelado desde el almacenamiento a -80 ° C, se descongele por completo, y la racha hasta 100 l por placa en agar de soja tríptico suplementado con sangre de oveja (S. pneumoniae) o sobre agar chocolate (H. influenzae) utilizando técnicas microbiológicas estándar. Incubar durante la noche a 37 ° C con o sin 5% de CO 2.
- Preparar caldos de cultivo con K. pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa o Acinetobacter baumannii.
- Retirar un cultivo madre congelado desde el almacenamiento a -80 ° C, se descongele por completo, y alícuota de 100 l de la población en 50 ml de infusión de cerebro y corazón caldo (BHI). Incubar durante la noche a 37 ° C con agitación suave (aproximadamente 120 rpm).
- [Opcional] Si se desea realizar un cultivo en fase logarítmica, alícuota de 1 ml del cultivo de una noche resultante en 50 ml de caldo BHI fresco. Incubar durante 3 horas a 37 ° C con agitación suave (aproximadamente 120 rpm).
2. Preparar suspensiones bacterianas Saline
- Para todos los pasos de preparación de la suspensión (2.1 a 2.3), utilizar una solución salina estéril a una temperatura entre el aire ambiente y 37 ° C. Cosecha crecimiento durante la noche de S. pneumoniae o H. influenzae en las placas de agar colonias por raspadode la superficie con un asa estéril. Transferir el material cosechado en 5 ml de solución salina estéril hasta un nublado, se obtiene la suspensión opaca y suavemente vórtice hasta homogeneidad.
- Centrifugar 50 ml de la K. pneumoniae, P. aeruginosa o A. baumannii cultivos de caldo final previsto para la inoculación (por ejemplo durante la noche o log cultivos en fase) durante 5 min a 4.500 x g. Aspirar el sobrenadante con una pipeta y descarte. Resuspender el precipitado en al menos 5 ml de solución salina estéril, y suavemente vórtice para lograr una suspensión homogénea.
- Si es necesario, diluir la suspensión adicionalmente usando solución salina estéril para obtener una densidad en el rango de 8 a 9 log 10 unidades formadoras de colonias (UFC) / ml. Eliminar una alícuota para la determinación de UFC / ml. Diluir en serie y la placa de la alícuota tal como se describe en las secciones 7.5 y 7.6.
3. Preparar el inóculo a base de agar
- Prepare una botella pequeña (aproximadamente 50 ml) de nutriente agar According a las instrucciones del fabricante o derretir una botella de agar nutriente sólido que se prepara y se almacena previamente. Deje que se enfríe a aproximadamente 50 ° C.
- Transportar el agar líquido y todas las herramientas necesarias y equipos para el proceso de infección para el área del procedimiento en el que se infectaron los animales. Mantener un pequeño baño de agua a 42 ° C en la zona.
- Dejar que el agar para alcanzar una temperatura de aproximadamente 50 ° C, y luego alícuota 9 ml en un tubo estéril de tamaño apropiado para encajar en el baño de agua. Deja este tubo en el baño de agua hasta que el agar se equilibra a aproximadamente 42 ° C. Asegúrese de que el agua está a una profundidad que permita cubrir la superficie del agar en su contenedor pero no tocar el tapón o tapa.
- Añadir 1 ml de la suspensión bacteriana de solución salina desde el paso 2.3 en el tubo que contiene 9 ml de agar en el baño de agua. Tapar el tubo, invierta varias veces para mezclar, y devolverlo al baño de agua.
4. Unnesthetize, Intubar e inocular Animales
Se recomiendan 25 g - ratas libres de patógenos específicos (SPF), inmunocompetente Sprague-Dawley peso de 100 - 120 g o ratones machos CD-1 con un peso de 20: NOTA. Proporcionar a todos los animales con comida y agua ad libitum y alojarlos social de virutas de madera o otra ropa de cama absorbente con ciclos de luz-oscuridad de 12 h estándar.
- Antes de realizar cualquier experimento, obtener y esterilizar una cánula de metal y polietileno tubo del tamaño adecuado para la especie animal. Obtener 1 ml jeringas estériles desechables y agujas de calibre 25, estériles y desechables.
Precaución: Siempre deseche las jeringas y las agujas en un contenedor de objetos punzantes.- Para las ratas, compra o fabricación de una cánula de metal que es de aproximadamente 12 cm de longitud, tiene un ID de 0,9 a 1,0 mm y diámetro exterior de 1,0 a 1,2 mm, y es doblada a un aproximado de 45 ° de ángulo en un extremo. Cortar una longitud de 11 a 12 pulgadas de tubo de polietileno con un ID de 0,4 mm y de 0,8 mm de DO. (Referirse a
- Para los ratones, la compra de un tubo de alimentación de los animales # 20. Retire el balón desde el extremo del tubo, sujetándola con las pinzas y tirando bruscamente, y luego doblar suavemente el extremo de aproximadamente un ángulo de 45 °. Cortar una longitud de 11 a 12 pulgadas de tubo de polietileno con un ID de 0.28 mm y 0.61 mm de DO. También compra y esterilizar un vidrio de 100 l jeringa microinyección y una aguja de micro-inyección de metal de calibre 30. (Consulte la Figura 1B).
- Coloque la cánula de metal en un vaso de tubo con tapón de rosca y autoclave mediante métodos estándar para esterilizar. Remojo y almacenar corta longitud de la tubería de polietileno en un vaso de precipitados que contiene alcohol cubierto.
- Para las ratas, compra o fabricación de una cánula de metal que es de aproximadamente 12 cm de longitud, tiene un ID de 0,9 a 1,0 mm y diámetro exterior de 1,0 a 1,2 mm, y es doblada a un aproximado de 45 ° de ángulo en un extremo. Cortar una longitud de 11 a 12 pulgadas de tubo de polietileno con un ID de 0,4 mm y de 0,8 mm de DO. (Referirse a
- Preparar la superficie de trabajo y el dispositivo de intubación.
- Coloque un tapete desechable limpio en la superficie de trabajo, cerca del baño de agua. La transferencia de la cánula metálica, en su tubo de almacenamiento de vidrio, a esta superficie. Retire la tapa del tubo de almacenamiento y deslice el extremo "mango" de la Cannula al extremo abierto del tubo.
- El uso de pinzas estériles, retire una longitud de tubo de polietileno del vaso de precipitados y la inserta a través del interior de la cánula de metal estéril, lo que hace que se mueva libremente. Montar una aguja estéril desechable de calibre 25 (para ratas) o el esterilizada aguja de metal de calibre 30 de una jeringa de vidrio micro-inyección (para ratones) en el extremo libre del tubo de polietileno deslizando la aguja varios mm en el tubo. (Consulte la Figura 1A para la rata y la figura 1B para los ratones).
- marcas de guía Place tanto en la cánula de metal y el tubo de polietileno para indicar la profundidad de inserción en el animal siguiendo el procedimiento de intubación se describe a continuación en un solo animal sacrificado. Abrir la cavidad torácica para la observación, a continuación, colocar la cánula de metal adecuadamente y hacer avanzar el tubo de polietileno apropiada (como se describe en la Sección 4.7). El uso de tinta indeleble, marque la cánula de metal donde se encuentra con la boca del animal y el politubos de etileno donde se encuentra con la parte superior de la cánula de metal para ayudar a la colocación correcta en los animales restantes.
- Dentro de una campana de ventilación (o usando un sistema de barrido apropiado), anestesiar hasta 6 animales a la vez en una cámara cerrada suministrado con ≤5% de isoflurano en 1,5 L / min de oxígeno hasta que el reflejo de la mordaza es inhibida (aproximadamente 1 min).
NOTA: Antes de realizar cualquier experimento, establecer la dosis y tiempo de exposición seguro para isoflurano en las condiciones específicas que se utilizan (por ejemplo, tamaño / tipo de cámara y el tamaño / especie / cepa animal) para evitar la exposición letal inadvertida. - Llene una jeringa de 1 ml desechable estéril (para las ratas) con solución salina estéril mediante la colocación de la punta estéril en la solución salina y tirando hacia atrás el émbolo. Llene la jeringa de vidrio de micro-inyección estéril (para ratones) como se describe a continuación. Conectar la jeringa a la aguja montada sobre el tubo de polietileno, y enjuagar todo el volumen de solución salina a través de la tubería hasta que el syringe se vacía.
- Para llenar la jeringa micro-inyección (para ratones), eliminar por completo el émbolo de metal y la aguja (montado sobre el tubo de polietileno) de la jeringa y establecer tanto un lado.
- Llene una jeringa estéril desechable de 1 ml con solución salina estéril (como se describe más arriba) y conecte una aguja de calibre 25 estéril desechable. Insertar la aguja en la parte superior de la jeringa micro-inyección (en la que se inserta el émbolo de metal), y presione el émbolo de la jeringa desechable hasta que se llena la jeringa micro-inyección con solución salina.
- Deseche la jeringa y la aguja desechable que se utiliza para llenar la jeringa micro-inyección en un contenedor de objetos punzantes. Vuelva a colocar la aguja micro-inyección de metal (montado sobre el tubo de polietileno) a la punta de la jeringa micro-inyección y volver a insertar el émbolo de metal, presionando hasta que todo el volumen de solución salina ha sido drenada a través de la jeringa y el tubo.
- Llene la jeringa con el inóculo a base de agar from el recipiente en el baño de agua, y agar al ras a través del tubo justo hasta que el tubo está preparado (por ejemplo, completamente lleno con el agar).
- Para las ratas, retire la aguja de calibre 25 (montado en el tubo de polietileno) de la jeringa desechable. Desechar la jeringa usada en un contenedor de objetos punzantes. Llenar un nuevo, desechable 1 ml jeringa estéril con el inóculo a base de agar desde el recipiente en el baño de agua mediante la colocación de la punta estéril en el inóculo y tirando hacia atrás del émbolo. Vuelva a colocar la aguja (montado sobre el tubo de polietileno) y agar al ras a través del tubo presionando el émbolo justo hasta que el tubo está completamente lleno de agar.
- Para los ratones, retire la aguja de metal microinyección (montado sobre el tubo de polietileno) y el émbolo de la jeringa de metal de la microinyección y dejar de lado. El uso de un desechable 1 ml jeringa y aguja estériles de calibre 25 desechable estéril, llenar la jeringa micro-inyección con el inóculo a base de agar desde el recipiente en elbaño de agua usando el procedimiento de llenado se describe en la Sección 4.4. Vuelva a colocar la aguja micro-inyección de metal (montado sobre el tubo de polietileno), inserte el émbolo metal, y agar al ras a través del tubo justo hasta que el tubo está completamente lleno de agar.
- Retire uno de los animales de la cámara de anestesia. Colocar el animal en posición supina en la estera desechable con la cabeza hacia la derecha y la cola a la izquierda como se muestra en la Figura 1C.
- Uso del dispositivo de intubación (es decir, la cánula de metal equipada con un tubo de polietileno), intubar al animal e inserte la cánula en el gran lóbulo del pulmón izquierdo (véase la Figura 1D).
- Insertar el extremo libre de la cánula de metal en la boca del animal. Girar la cánula de manera que el extremo libre está en ángulo hacia arriba y suavemente avanzar en la tráquea, sin pasar cuidadosamente las estructuras de la laringe con un ligero movimiento de giro. Confirmar la inserción en la tráquea en lugar de laesófago deslizando suavemente la cánula ligeramente hacia adelante y hacia atrás varias veces mientras se palpa los anillos traqueales con el dedo índice izquierdo como se muestra en la Figura 1C.
- Cuando la cánula llega a la bifurcación, donde la tráquea se divide en los bronquios izquierdo y derecho, hacer un ligero movimiento de giro hacia el lado izquierdo del animal para asegurar que la cánula se inserta en el bronquio izquierdo. Avanzar la cánula de metal hasta el final está a la mitad a tres cuartos hacia abajo el pulmón izquierdo, utilizando la marca de la guía colocado previamente para confirmar que la profundidad apropiada se ha alcanzado.
- Con la cánula de metal en su lugar, hacer avanzar el tubo de polietileno de varios milímetros. Usar la marca de guía previamente colocado en la tubería para asegurar que se hace avanzar sólo lo suficiente para salir del extremo de la cánula de metal y no perforar el pulmón.
- Con los dos cánulas en su lugar, utilizar la jeringa conectada a inculcar 100 l (para ratas) o 20 l (para ratones) de la SUSPE agarnsion profundamente en el gran lóbulo del pulmón izquierdo (véase la Figura 1D). Se retira por varios mm de la tubería de polietileno, y luego retire con cuidado el dispositivo de intubación intacta. Ajuste de nuevo en el tubo de almacenamiento de vidrio, y mover al animal en una jaula nueva para recuperarse.
- Continuar anestesiar, la intubación y la inoculación de los animales restantes.
- Entre lotes de animales anestesiados, retire la aguja (montado sobre el tubo) de la jeringa. Para las ratas, desechar la jeringa desechable usado en un contenedor de objetos punzantes y llenar una nueva jeringa desechable, estéril desde el inóculo en el baño de agua. Para los ratones, rellenar el mismo vaso jeringa micro-inyección del inóculo en el baño de agua utilizando la técnica de llenado se describe en la Sección 4.4.
- Si el agar comience a espesar en el dispositivo de intubación, lave todos agar restante a través de la tubería. Retire la aguja de la jeringa (dejando la aguja montada sobre el tubo de polietileno). Siga los procedimientos descritosen la Sección 4.4 para vaciar caliente solución salina, estéril a través del dispositivo de intubación, repitiendo como sea necesario para borrar por completo cualquier bloqueo. Vacío todo salina de la jeringa y preparar el inóculo agar nuevo como se describe en la Sección 4.5.
- Calcular el inóculo bacteriano final por animal, mediante la CFU determinado a partir de la suspensión de solución salina (véase la Sección 2.3), el factor de dilución final de la suspensión salina en agar (por ejemplo, diez veces), y el volumen infundido en los animales (por ejemplo, 100 l durante ratas o 20 l para ratones).
5. Evaluar los animales por un potencial Mis-inoculación u otros eventos adversos
- Observe cuidadosamente todos los animales durante la intubación, la instilación del agar y la recuperación de la anestesia para evaluar el potencial de errores de la inoculación. eutanasia inmediatamente (según las directrices locales IACUC) cualquier animal que sangra, presenta respiración anormal (por ejemplo, dificultad para respirar o jadeo), no se muevenormalmente alrededor de la jaula, o no aparece con los ojos brillantes y sanos tras la recuperación de la anestesia.
- Si el cese de la respiración espontánea se produce (por lo general cuando el inóculo no está colocada lo más profundo y bloquea las vías respiratorias), confirmar la muerte por la observación y llevar a cabo un método secundario de la eutanasia (como dislocación cervical o toracotomía).
- Minimizar la longitud de tiempo que los animales están expuestos a isoflurano, como anestesia sólo se requiere para varios minutos para llevar a cabo el procedimiento. Si se utilizan anestésicos inyectables, garantizar que los animales se encuentran en observación hasta que esté completamente despierto. Coloque los animales, especialmente los ratones, en un ambiente calentado para la recuperación cuando se utilizan anestésicos inyectables.
- Observar a los animales al menos dos veces al día durante el período de estudio de los siguientes signos de enfermedad respiratoria: la respiración pronunciada, piloerección, reducción de la actividad y la reducción de la temperatura corporal. Inmediatamente eutanasia (de acuerdo con las directrices locales IACUC) cualquier animal que está moribundo, experierencias dificultad respiratoria o dificultad respiratoria, tiene una temperatura corporal notablemente reducida durante la manipulación, es incapaz o no está dispuesto a moverse, o que no pueden llegar a los alimentos y el agua.
6. Tratamientos de prueba Administrar
- Preparar y administrar los tratamientos de prueba de acuerdo con el diseño del estudio planeado. Comience la administración de tratamientos en 1 o 2 infección h post (o retrasar el tratamiento más si se desea una carga bacteriana de referencia superior). Los detalles específicos para la preparación y administración de tratamientos de prueba no se pueden dar ya que depende del objetivo del estudio, así como las propiedades de cada tratamiento individual. (Consulte la Figura 3 como ejemplo.)
- Ponga a un lado un grupo de infectados, los animales no tratados para servir como controles de referencia. Enumerar la carga bacteriana en los pulmones de estos animales en el momento que se inicia el tratamiento para los otros grupos, siguiendo los procedimientos descritos en la Sección 7.
- Para los análisis de PK / PD, evaluarel perfil farmacocinético del tratamiento (s) se administra en la sangre y / o tejidos de los animales infectados. Los procedimientos específicos para los estudios farmacocinéticos están fuera del alcance de este artículo.
7. Enumerar bacterias viables desde los pulmones
- La eutanasia a un grupo de animales no tratados en el momento el tratamiento se inicia para los otros grupos (línea de base) y todos los animales restantes al final del periodo de estudio (por lo general 24, 48 o 96 h después de la infección) por la exposición por inhalación a la creciente gradualmente niveles de carbono dióxido de dentro de una cámara cerrada o un método alternativo según lo recomendado por las directrices locales IACUC. Comprobar la muerte por la observación, y llevar a cabo un método secundario de la eutanasia (como dislocación cervical o toracotomía).
- Colocar los animales en una posición supina en una estera desechable limpio, y mojar a fondo la piel sobre el pecho con alcohol.
- Con unas tijeras estériles, cortar a través de la piel, la capa muscular y la caja torácica subyacenteparalela al esternón para abrir la cavidad torácica. agarrar suavemente los pulmones con pinzas estériles y tire a eliminar, el uso de las tijeras para separarlos de la tráquea si es necesario. Coloque los pulmones en una gasa estéril para absorber el exceso de sangre. Si el corazón también se ha eliminado, diseccionar a la basura y descartar.
- Hacer pequeños recortes en los pulmones con tijeras estériles para exponer las secciones interiores y utilizar pinzas estériles para colocar los pulmones (más cualquier piezas que se cortan con tijeras inadvertidamente apagado) en el fondo de una bolsa de laboratorio licuadora. Brevemente rodar un objeto redondo grueso (tal como un bolígrafo o un marcador) sobre el exterior de la bolsa para triturar el tejido. Pipeta de 1 ml de solución salina estéril en la bolsa, la bolsa se coloca en un mezclador de laboratorio, y ejecutar el mezclador de laboratorio a alta velocidad durante 2 min.
- Transferir las muestras homogeneizó de las bolsas de mezcla en tubos o placas utilizando una pipeta. Diluir el homogeneizado de diez veces por alícuotas 1-parte homogeneizado en 9-partes de solución salina (por ejemplo, 100 l de homogeneizado en 900 l Salinmi). Se diluye la suspensión resultante por diez veces de nuevo de una manera similar. Continuar diluyendo cada nueva suspensión resultante por otro factor de diez veces hasta al menos 6 diluciones en serie se han preparado a partir del homogenado inicial.
- Pipeta alícuotas por triplicado de 20 l cada una de todas las diluciones sobre las placas de agar tripticasa de soja suplementado con sangre de oveja (S. pneumoniae, K. pneumoniae, P. aeruginosa o A. baumannii) o sobre placas de agar de chocolate (H. influenzae). Incubar durante la noche a 37 ° C con o sin CO 2. (Véase la Figura 1E para un ejemplo de una placa resultante.)
- Contar las colonias de cada una de las tres repeticiones en la primera dilución que contiene un número "contable" (es decir, no demasiadas colonias para obtener de forma razonable). Calcular el valor medio de las tres repeticiones. Determinar el UFC por pulmones multiplicando el valor medio de 50 (a la cuenta para el recubrimiento de 20 l de la total 1 mlhomogeneizado) y la factorización en el factor de dilución final del homogenado original por el que se contaron las colonias.
Representative Results
Las herramientas necesarias, la orientación del animal, y la profundidad de intubación se muestran en la Figura 1. También se muestra un ejemplo representativo de colonias que crecen en una placa de agar después de la dilución en serie y el chapado por triplicado de una muestra de homogeneizado de pulmón. Un aumento de la carga bacteriana de varios log 10 CFU por encima de los controles de línea de base se observa típicamente en los pulmones infectados para aislamientos bacterianos más, incluso a 96 h después de la infección, y la variabilidad entre los animales es baja (Figura 2). Para algunos H. influenzae, puede haber poco crecimiento; Sin embargo, la infección no debe comenzar a la libre determinación dentro de un período de tiempo de 48 o 96 h (Figura 2B). Este modelo de infección pulmonar se puede utilizar durante la optimización de la serie química de plomo para apoyar SAR, como se muestra en la Figura 3 para los compuestos representativos de dos series diferentes 16, 17. Proporciona una constante y reproducible se reunióartesa para la evaluación de PK / PD en animales inmunocompetentes y se utilizó para determinar esa zona libre de drogas bajo la curva de concentración-tiempo sobre la concentración inhibitoria mínima (Fauc / MIC) correlacionado con la eficacia de un nuevo polipéptido desformilasa (PDF) inhibidor frente a S. pneumoniae y H. influenzae (Figura 4). Además, los objetivos / MIC Fauc para la inmovilización y un 1-log 10 UFC de reducción de los controles de línea de base se determinaron a través de 11 S. pneumoniae y 5 aislamientos de H. influenzae (tabla 1) 18. El acoplamiento de este modelo de infección con un sistema de administración de fármacos para volver a crear perfiles farmacocinéticos humanos en ratas crea una poderosa herramienta para la evaluación de los regímenes de dosificación humanos antes de los estudios clínicos. Un ejemplo de esto se resume en la Tabla 2, lo que demuestra que una formulación de liberación prolongada de la amoxicilina-clavulanato fue más eficaz que los regímenes de dosis existentes para los organismos con ElevaTed MIC 19 valores.
Figura 1: La intubación intratraqueal no quirúrgica. Herramientas se muestran para la intubación de la rata (A) y el ratón (B). Una vez anestesiado, el animal debe ser colocada como se muestra en C, con la cabeza hacia la derecha y la cola a la izquierda si la persona que realiza la técnica es diestro. Coloque el dedo índice izquierdo suavemente en la garganta para ayudar a palpar los anillos traqueales para la confirmación de la colocación de la cánula correcta. El inóculo debe ser colocado profundamente en el pulmón izquierdo, como se muestra en la vista ventral de un pulmón de rata (D). Las colonias que crecen en agar después de dilución en serie y el chapado de una muestra debe ser similar al que se muestra en E. Figura 1D, Copyright © Gill Smith [Animales de Laboratorio, Volumen 25 (1991), G. Smith, Amétodo no quirúrgico simple de la instilación intrabronquial para el establecimiento de infecciones respiratorias en la rata, páginas 46 - 49] 14. Reproducido con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ejemplos representativos de crecimiento bacteriano en los pulmones de los animales infectados. La media ± desviación datos CFU estándar de N = 5 animales / grupo se muestra por diversas cepas de S. pneumoniae (A), H. influenzae (B), P. aeruginosa (C), K. pneumoniae (D) y A. baumannii (E). La primera barra de cada par (gris claro) es la línea de base bacterial carga en 1 o 2 horas después de la infección, mientras que la segunda barra es el control del crecimiento al final de su estudio a las 48 h después de la infección (gris oscuro) o después de la infección 96 h (negro). No se aplicaron métodos de censura de datos; Por lo tanto, estos resultados incluyen datos de los 5 animales por grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Evaluación de la eficacia de diversas Serie de Productos Químicos en la optimización de plomo. modelos de infección de pulmón utilizando las técnicas descritas se utilizaron para explorar las relaciones estructura-actividad como parte del programa de topoisomerasa de tipo II no bacteriana. Compuestos prometedores 7 y 1 se evaluaron frente a las quinolonas susceptibles (A) 16 o resistente a las quinolonas(B) 17 aislamientos de S. pneumoniae, respectivamente. Cada símbolo representa CFU determina a partir de los pulmones de una rata con líneas que representan el grupo media y desviación estándar. Límite inferior de cuantificación (CII) fue de 1,7 log10 UFC / pulmones. Los compuestos se pesaron (56 ó 112 mg de molécula parental libre pura), se disolvió en 9 ml de agua estéril, se diluye 3 ml en 3 ml de agua (1: 1) y se administra por sonda oral de 1 ml / 125 g de rata dos veces al día ( 6 - 7 horas de diferencia) durante 2 días, a partir de 1 h después de la infección. los controles no tratados (NTC) fueron muestreados a 1 h después de la infección de la línea de base o tratados con solución salina y se tomaron muestras al final del estudio (48 h) para los controles de crecimiento. Figura 3A reimpreso de Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volumen 21, TJ Miles et al, Novel ciclohexil amidas como potentes agentes antibacterianos tipo de orientación bacteriana AI topoisomerasas, páginas 7483 -. 7488, Derechos de Autor (2011) 16, con permiso de Elsevier.Figura 3B reimpreso de Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volumen 26, TJ Miles et al, tricíclicos novedosos (por ejemplo GSK945237) como potentes inhibidores de tipo bacteriana AI topoisomerasas, Páginas 2464 -. 2469, Derechos de Autor (2016) 17, con permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: PK / PD Caracterización de un inhibidor de PDF Novel. Emax modelos fueron creados usando dosis que varía datos de eficacia en ratones inmunocompetentes con infección en el pulmón con aislamientos de S. pneumoniae (A) o H. influenzae (B) para determinar los objetivos de PK / PD para un nuevo inhibidor de PDF 18. círculosrepresentar la carga bacteriana media 4-5 ratones / grupo tratado con dosis variables de compuesto. Los análisis se realizaron para correlacionar con eficacia sin fármacos 24 h AUC (círculos abiertos) o ABC / CIM (círculos rellenos). Reproducido con permiso, Copyright © Sociedad Americana de Microbiología, [Agentes Antimicrobianos y Quimioterapia, volumen 60, 2016, páginas 180 - 189] 18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Estasis | 1-log 10 de reducción | ||||||
| Organismo | MIC (g / ml) | R 2 para línea de fit (%) | Fauc | Fauc / MIC | Fauc | Fauc / MIC | Max matanza (log 10 de reducción) |
| S. pneumoniae | |||||||
| 10127 | 0.25 | 99.9 | 2.0 | 8.1 | 3.6 | 14.4 | 2.8 |
| 1316009S | 0.25 | 96.1 | 6.5 | 26.0 | 15.1 | 60.3 | 1.8 |
| ATCC10813 | 0,5 | 100 | 8.4 | 16.9 | 22.2 | 44.5 | 1.2 |
| 1307007S | 1 95.8 | 16.1 | 16.1 | 20.1 | 20.1 | 2.7 | |
| ATCC6303 | 1 | 99.8 | 19.8 | 19.8 | 24.8 | 24.8 | 2.8 |
| 1629 | 2 | 100 | 15.8 | 7.9 | 21.2 | 10.6 | 2.4 |
| 298.443 | 2 | 99.9 | 26.5 | 13.2 | 31.0 | 15.5 | 2.3 |
| 336.808 | 2 | 86 | 8.2 | 4.2 | 19.0 | 9.5 | 2.6 |
| 338.860 | 2 | 99.5 | 2.9 | 1.5 | 6,7 | 3.4 | 2.8 |
| & #160; 340449 | 2 | 94.6 | 8.0 | 4.0 | 14.9 | 7.4 | 2.1 |
| L11259 | 2 | 100 | 7.1 | 3.5 | 9.0 | 4.5 | 2.0 |
| Media ± SD | NA una | N / A | 11,0 ± 7,5 | 11,0 ± 7,9 | 17,0 ± 8,2 | 19,5 ± 17,8 | 2,3 ± 0,5 |
| Mediana | N / A | N / A | 8.2 | 8.1 | 19.0 | 14.4 | 2.4 |
| H. influenzae | |||||||
| 1998-100-126H | 1 | 99.7 | 7.3 | 7.3 | 13.4 | 13.4 | 2.9 |
| 503-008H | 1 | 99.8 | 7.1 | 7.1 | 13.9 | 13.9 | 2.7 |
| 08003H | 2 | 99.9 | 14.5 | 7.2 | 16.7 | 8.3 | 2.7 |
| H128 | 2 | 96.6 | 15.3 | 7.6 | 26.0 | 13.0 | 2.7 |
| 19001H | 4 | 91.9 | 14.8 | 3.7 | 37.3 | 9.3 | 3.0 |
| Media ± SD | N / A | N / A | 11,8 ± 4,2 | 6,6 ± 1,6 | 21,5 ± 10,2 | 11,6 ± 2,6 | 2,8 ± 0,1 |
| Mediana | N / A | N / A | 14.5 | 7.2 | 16.7 | 13.0 | 2.7 |
| una NA, no aplicable. | |||||||
Tabla 1: Objetivos de PK / PD para un inhibidor PDF Novel frente a S. pneumoniae y H. influenzae aislados. AUC libre de drogas y AUC / MIC objetivos para la inmovilización y un 1-log 10 reducción de UFC desde el nivel basal se determinaron para el 11 de S. pneumoniae y H. influenzae 5 en ratones inmunocompetentes con infección en el pulmón y tratados con el compuesto 18. el DATuna se utilizó para ayudar a las dosis humanas selectos para un desarrollo clínico. Esta tabla ha sido adaptado y reimpreso con el permiso, Copyright © Sociedad Americana de Microbiología, [Agentes Antimicrobianos y Quimioterapia, volumen 60, 2016, páginas 180 - 189] 18.
| Grupo de tratamiento una | El promedio diario de 10 S. pneumoniae (UFC / pulmón) b ± SD para la cepa (AMX / CA MIC): | |||||||
| 05010S (2 mg / ml) | c 16001S (4 mg / ml) | 16001S (4 mg / ml) | 30005S (4 mg / ml) | 20009S (4 mg / ml) | 05003S (8 mg / ml) | 404.053 (8 mg / ml) | 47003S (8 mg / ml) | |
| Controlar | 7,3 ± 0,4 | 7,0 ± 0,8 | 5,7 ± 1,2 | 7.1 ± 0.7 | 7.1 ± 0.4 | 6,4 ± 0,6 | 6,8 ± 0,4 | 6,0 ± 0,3 |
| AMX / CA | ||||||||
| 2.000 / 125 mg dos veces (relación 16: 1) | ≤ 1,7 ** | 2,8 ± 1,2 ** | 2,2 ± 0,8 ** | 2,3 ± 0,9 ** | 2,5 ± 0,9 ** | 2,0 ± 0,9 ** | 3,8 ± 1,4 ** | 1,8 ± 0,2 ** |
| 1.000 / 125 mg tid (relación 8: 1) | Nuevo Testamento | Nuevo Testamento | 2,8 ± 0,5 ** | 2,7 ± 1,3 ** | 3,3 ± 0,9 ** | 4,9 ± 0,5 ** | 6,6 ± 1,3 | 4,7 ± 0,7 ** |
| Nuevo Testamento | Nuevo Testamento | 3.0 ± 1.3 * | 2,1 ± 0,7 ** | 3,2 ± 0,4 ** | 5,2 ± 0,9 * | 6,4 ± 0,6 | 4,9 ± 0,4 ** | |
| 875/125 mg dos veces (relación de 7: 1) | Nuevo Testamento | Nuevo Testamento | 4.5 ± 1.2 * | 5.6 ± 1.3 * | 5,2 ± 0,7 ** | 6,3 ± 0,7 | 6,4 ± 0,7 | 5,5 ± 0,4 |
| 500/125 mg tid (relación 4: 1) | 3,1 ± 1,3 ** | 4,5 ± 0,9 ** | Nuevo Testamento | Nuevo Testamento | Nuevo Testamento | Nuevo Testamento | Nuevo Testamento | Nuevo Testamento |
| La azitromicina, 1.000 / 500 mg od | Nuevo Testamento | Nuevo Testamento | Nuevo Testamento | 5.8 ± 2.0 | 7.1 ± 0.9 | 3,1 ± 1,0 ** | 6,6 ± 0,4 | 6.07; 0,6 |
| Levofloxacina, 500 mg od | Nuevo Testamento | Nuevo Testamento | 4,2 ± 0,8 * | 5,7 ± 0,8 * | 4,9 ± 0,8 ** | 3,0 ± 1,3 ** | 3,5 ± 0,2 ** | 3,9 ± 0,8 ** |
| Grupo de Tratamiento d | El promedio diario de 10 H. influenzae (UFC / pulmón) ± SD para la cepa: | |||||||
| H128 (β-lactamasa positivo) | Sofá (β-lactamasa negativo, resistente a la ampicilina) | |||||||
| Controlar | 6,4 ± 0,6 | 6,7 ± 0,6 | ||||||
| AMX / CA | ||||||||
| 2.000 / 125 mg dos veces (relación 16: 1) | 2,0 ± 0,7 ** | 3,1 ± 0,9 ** | ||||||
| 1.000 / 125 mg tid (relación 8: 1) | 2.1 ± 1.0 ** | 3,6 ± 1,1 ** | ||||||
| 875/125 mg tid (relación 7: 1) | 2,8 ± 1,3 ** | 3,8 ± 1,3 ** | ||||||
| 875/125 mg dos veces (relación de 7: 1) | 2,0 ± 0,8 ** | 5,1 ± 1,1 ** | ||||||
| La azitromicina, 1.000 / 500 mg od | 3.2 ± 1.7 * | 5.8 ± 1.1 | ||||||
| Levofloxacina, 500 mg od | ≤ 1,7 ** | ≤ 1,7 ** | ||||||
| un AMX / CA, amoxicilina-ácido clavulánico; oferta, dos veces al día; tid., tres veces al día; od, una vez al día. | ||||||||
| b El límite de detección fue de <1,7; *, Significativamente diferentes del control (P ≤ 0,05); **, Significativamente diferentes del control (P ≤ 0,01); NT, no se ha probado. | ||||||||
| c cepa 16001S se probó en dos experimentos separados. | ||||||||
| d amoxicilina-ácido clavulánico 500/125 mg (4: 1) tres veces al día no fue probado contra las cepas de H. influenzae. | ||||||||
Tabla 2: Eficacia de los perfiles de exposición Recreated plasma humano para diferentes amoxicilina / clavulanato regímenes de dosificación. Los datos generados en ratas inmunocompetentes con infección en el pulmón con aislamientos de S. pneumoniae o H. influenzae utilizando este modelo demostraron que una formulación mejorada de amoxicilina-ácido clavulánico (2, 000/125 mg dos veces al día) fue más eficaz que los regímenes de dosificación estándar frente a aislados con elevada susceptibilidad in vitro 19. Esta tabla ha sido adaptado y reimpreso con el permiso, Copyright © Sociedad Americana de Microbiología, [Agentes Antimicrobianos y Quimioterapia, volumen 49, 2005, páginas 908 - 915] 19.
Discussion
Para obtener resultados óptimos en la reproducción de este modelo de infección, se deben considerar las siguientes sugerencias adicionales. La virulencia de los nuevos aislados se puede mejorar haciendo pasar 2 - 3 veces en vivo antes de la utilización en un estudio. Poblaciones bacterianas congeladas siempre deben prepararse a partir de una fuente primaria -derivado in vivo con el menor número de pases como sea posible a partir de la original, y volver a congelar o reutilización de Stock descongelado no se recomienda. El uso de aislados clínicos recientes recuperados de pacientes con neumonía y / o preparación de los cultivos en fase logarítmica de crecimiento también puede ayudar a mejorar el establecimiento de la infección. Una dilución de cinco veces en el agar (por ejemplo, 2 ml de suspensión salina añadió a 8 ml de agar) se puede utilizar en lugar de diez veces para aumentar el inóculo bacteriano, y el volumen de inóculo se puede ajustar en función del tamaño del animal (por ejemplo, 200 l / animal generalmente se inocularon en 250 g de ratas). Antes de la adición de la suspensión bacteriana solución salina en elagar (es decir, en el paso 2.3), la densidad bacteriana se puede predecir o estimar mediante inspección visual, las normas de MacFarland o mediciones de densidad óptica. Es útil para familiarizarse con las características de crecimiento in vitro para cada aislamiento antes de realizar los experimentos in vivo. La consistencia en el crecimiento y la manipulación permite la estimación más precisa de la densidad bacteriana de cualquier muestra dada. métodos microbiológicos estándar que difieren de los descritos, tales como los medios de comunicación y homogeneizadores de tejidos alternativa, se pueden utilizar según sea apropiado para la preparación de inóculos y la enumeración de las bacterias a partir de tejidos infectados.
Es muy recomendable para preparar o fundir el agar el día antes del experimento y almacenarla durante la noche en un baño de agua separada se establece en 50 ° C. Esto simplificará el proceso y ayudar a proteger contra el agar ser demasiado caliente en el momento de la infección. Una temperatura del 41 - 42 ° C logra un buen equilibrio entre el manteniNing el agar en estado líquido sin ser demasiado caliente para la supervivencia bacteriana a corto plazo. Como una posible alternativa a agar nutritivo, agar noble se ha utilizado con éxito en algunos experimentos. Un tubo de inóculo agar es por lo general suficiente para todo un experimento (y se recomienda), pero múltiples tubos se puede preparar para infectar un gran número de animales (por ejemplo, más de 60) o cuando el proceso de infectar tarda más de 30 - 45 min Si se requieren múltiples tubos de inóculo, agregar la suspensión bacteriana solución salina a cada tubo de agar como se necesita. Esto reduce el riesgo de que la supervivencia y / o idoneidad bacteriana se verán afectados por la exposición prolongada a una temperatura elevada antes de la inoculación. Cabe señalar que el uso de múltiples tubos de inóculo también pueden requerir procedimientos adicionales de animales de aleatorización. Siempre que sea posible, infectar a todos los animales de la misma preparación del inóculo. Se recomienda para adaptar el tamaño de experimentos para el nivel actual de competencia con el technique.
Un científico experto puede intubar e inocular un animal en menos de 30 s y inocular hasta 5 - 6 animales por lotes (es decir, con una jeringa llena de inóculo agar). Para aquellos que están aprendiendo la técnica, la velocidad es importante, ya que el agar se empezará a solidificar; sin embargo, la colocación exacta del inóculo es más importante. Comience con 1 o 2 animales por lote, y aumentar a medida que la técnica se hace más familiar. Los animales continúan a respirar durante la intubación; Por lo tanto, la ventana de tiempo para la inoculación depende de la rapidez con que el animal se recupere de isoflurano, que debe ser de aproximadamente 2 - 3 min. Los animales que despiertan durante el proceso pueden ser re-anestesiados e intentaron una segunda vez, pero no se recomienda hacerlo en varias ocasiones. Se espera que la inoculación con éxito en el primer intento en casi el 100% de los animales una vez que se logra el dominio. Tenga en cuenta que es más fácil para aprender la técnica usando ratas primera; Los ratones son más delicados y cuanto menor sea demasiadols son más propensos a la obstrucción con agar solidificado si no manipulado rápidamente. jeringas pre-calentamiento, tubos y salinas, así como mantener el dispositivo de intubación en una superficie tibia (no caliente), tal como una almohadilla térmica a baja temperatura, pueden ayudar a prevenir la solidificación del agar. Cuando el aprendizaje de la técnica, también es útil para practicar la colocación adecuada del inóculo usando un colorante de color oscuro (tal como azul de metileno concentrado) en lugar de la suspensión bacteriana en agar. Realizar el procedimiento como se describe, pero la eutanasia a los animales inmediatamente después de la inoculación del colorante (no permitir que el animal se recupere entre la anestesia y la eutanasia). Diseccionar para determinar donde el colorante se ha colocado, y ajustar en consecuencia la técnica.
El criterio de valoración principal de este modelo es CFU de los pulmones infectados. La supervivencia no es un buen indicador de la carga bacteriana y no es un punto final recomendado. Para los estudios de eficacia, la N sugerido es de 5 - 6 animales por grupo, ya que es predicted para detectar ≥1 log 10 CFU diferencias entre los grupos con poder por lo menos 90%. Los animales pueden ser infectados en grupos de tal manera que sus compañeros de jaula permanecen juntos, o un verdadero proceso de asignación al azar pueden ser seguidos. Tenga en cuenta que si los grupos son asignados por jaula, los grupos deben ser infectados en una secuencia aleatoria con los controles de crecimiento de fin de estudio infectadas último (para confirmar que la supervivencia bacteriana / aptitud no se vio afectada por la longitud de tiempo de exposición a una temperatura elevada en el baño de agua). No hay métodos de censura datos deben ser necesario, y ninguno se recomiendan con la excepción de la eliminación inmediata de cualquier animal que ha sido obviamente mis-inoculadas en el comienzo del estudio (antes del inicio de cualquier tratamiento). Los animales que son sacrificados antes del final del estudio se tomarán muestras y los resultados incluidos en el conjunto de datos a menos que una razón válida para la exclusión se identificó de forma prospectiva (es decir, un evento no relacionado con la infección o tratamiento). arrastre medicamento puede affect algunas muestras y es una consideración importante en todos los modelos de infección in vivo. Si se administra un compuesto de frecuencia, cerca del momento de la eutanasia o tiene una larga vida media, puede estar presente en el homogeneizado de tejido en una concentración lo suficientemente alta para continuar matar las bacterias ex vivo durante el proceso de enumeración de bacterias (dilución y el chapado de las muestras o en las placas de agar durante la incubación durante la noche). Para evitar esto, carbón activado y / o un aditivo que degrada la molécula activa sin dañar las células bacterianas se pueden añadir a la muestra antes de la homogeneización. Otros métodos incluyen la centrifugación de las muestras para eliminar la mayoría del compuesto activo (que debe permanecer en el sobrenadante) y el empleo de diferente dilución y chapado esquemas para diluir suficientemente el compuesto activo a una concentración no inhibidora.
Como lo demuestran los ejemplos que se muestran en la Figura 2, este modelo de éxito induces infecciones pulmonares en los roedores con una amplia gama de organismos, incluidos los que no crecen bien en otros modelos (por ejemplo, H. influenzae). Estas infecciones son consistentes y reproducibles, lo que reduce la probabilidad de que tendrán que repetirse debido a la falta de modelo y / o de bajo rendimiento con un aislado concreto experimentos. Aunque los animales son inmunocompetentes, no son capaces de resolver rápidamente la infección, en todo caso. Esto permite una mayor flexibilidad en la longitud del estudio, como muchos aislados mantienen una infección viable a través de al menos 96 h sin la necesidad de inyecciones repetidas para mantener la neutropenia. El beneficio potencial de estudiar la eficacia antibacteriana en animales inmunocompetentes se ha señalado anteriormente 20, 21, y hay pruebas de que, para algunos compuestos (por ejemplo, oxazolidinonas), los datos de los roedores no neutropénicos pueden predecir con mayor precisión los objetivos de exposición humana en comparación con los neutropénicos prestados 5. La utilidad de usos múltiples de tque el modelo se demuestra en las figuras 3 y 4 y las Tablas 1 y 2. Estos estudios son parte de una gran colección de los datos publicados y no publicados que se ha generado con este modelo para apoyar los esfuerzos de optimización de plomo 16, 17, 22-24, para la comparación y la confirmación de la dosificación humana propuesto regímenes de 19, 25 a 29 y para la caracterización de PK / PD 18, 30-32 .While este modelo es inicialmente más complejo para llevar a cabo en comparación con el método intranasal inhalación, hay muchas ventajas como se describió anteriormente. Con la práctica y el uso rutinario, las técnicas deberían ser fáciles de realizar.
Se puede observar en algunos estudios que la carga bacteriana al inicio del estudio fue inferior a la que generalmente se busca en otros modelos de infección pulmonar. Esto se debe en gran parte a la dilución requerida en agar y el pequeño volumen desafío, particularmente en ratones. Sin embargo, también hay que señalarque el crecimiento de bacterias se observó en todos los casos, incluso cuando la carga inicial fue relativamente baja. La carga bacteriana de línea de base de destino es 6-6,5 log 10 CFU / pulmones (6,8 a 7,3 log 10 CFU / g de tejido en ratones en base a pesos de los pulmones promedio) que corresponde a densidades estimadas en pacientes humanos con neumonía grave 33. Una carga de línea de base más alta se puede lograr mediante la concentración aún más el inóculo bacteriano o retrasando el inicio de la administración del compuesto para permitir el crecimiento bacteriano adicional; Sin embargo, el aumento de la carga de interrogación en exceso puede conducir a la enfermedad anormalmente grave y aguda (es decir, la muerte en menos de 24 h) que es refractario a todos los tratamientos antibacterianos independientemente de la susceptibilidad. Aunque el inóculo se coloca inicialmente preferentemente en el pulmón izquierdo del animal, la infección generalmente se extiende a lo largo de ambos pulmones. La enfermedad progresiva pulmonar, la difusión de las bacterias a otros órganos, y la eventual morbilidad suele ser observed con S. pneumoniae, K. pneumoniae y P. aeruginosa. De interés, las infecciones por H. influenzae y A. baumannii son por lo general más contenida y rara vez conducen a la muerte en el inóculos bacterianos prescrito.
Los resultados de eficacia obtenidos a partir de este modelo se correlaciona bien con los perfiles de sensibilidad in vitro, así como objetivos PK / PD definidos. Las reducciones en la carga bacteriana se observan rutinariamente para aislamientos considerados susceptibles al agente que se está probando, mientras que las exposiciones resistente considerado ningún cambio o el crecimiento bacteriano de línea de base por encima de 16, 17, 19, 24-29. Los estudios en ratas que evalúan dos quinolonas y un macrólido usando este modelo 32 han demostrado que el objetivo PK / PD requerido para un 1-log 10 reducción de S. pneumoniae en comparación con la línea base correlacionado con el objetivo determinado en ratones neutropénicos y, más importante, con objetivos clínicos para pneum bacteriana adquirida en la comunidadOnia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, un novedoso mecanismo de antibióticos, se ensayó frente a S. pneumoniae y múltiple requiere un objetivo PK / PD similar para una reducción de 10 1-log en este modelo de infección pulmonar 31 como la requerida para una reducción de 10 1-log en el modelo del muslo neutropénico 36 cuando la penetración de pulmón fue tomada en cuenta (datos en archivo). Del mismo modo, los objetivos de PK / PD determinados en ratones para GSK2251052 contra P. aeruginosa fueron consistentes para la estasis, 1- y 2-log 10 reducciones de CFU entre este modelo de pulmón 30 y el modelo de infección del muslo neutropénico cuando la penetración de pulmón se consideró 37, 38 . Correlación con un modelo de infección pulmonar neutropenia mediante inoculación intranasal era pobre; sin embargo, GSK2251052 no produjo más de una respuesta estática en ese estudio 38. Esto puede ser atribuible a la inóculo bacteriano superior, que era 8 log 10 CFU / ratón, en comparación con 6 log
Existen varias limitaciones de este modelo de neumonía inmunocompetentes. En primer lugar, no está bien adaptado a la evaluación de emergencia de la resistencia espontánea debido a la alta inóculo bacteriano requiere generalmente para este tipo de estudios resulta en una infección demasiado severa. Después de intentos para lograr cargas bacterianas de 7 u 8 log 10 UFC al inicio del estudio, la morbilidad rápida se ha observado (es decir, los animales se conviertan moribunda en menos de 24 h) a pesar de un lavado a fondo de los inóculos para eliminar toxinas pre-existente (datos en archivo). Esopuede ser posible superar este problema mediante el uso de los roedores más grandes. Las ratas, las ratas especialmente más pesados (> 250 g), parecen tolerar mejor superior inóculos en comparación con los ratones y pueden ser adecuados para este tipo de estudios. Una segunda limitación es que el uso de agar como una infección potenciador puede impedir usando el modelo para la evaluación de determinadas host: patógeno. Se cree que el agar proporciona un punto focal protegida hasta que la infección está plenamente establecida dentro del pulmón. Es posible administrar el inóculo en solución salina en lugar de agar para ayudar a superar este problema; sin embargo, debe tenerse en cuenta que esto sólo producirá la infección con algunas cepas. En tercer lugar, hay una curva de aprendizaje requerida para alcanzar la competencia en la técnica. El procedimiento puede ser delicado, especialmente en ratones. Es fácil de colocar por error la cánula de metal en el esófago, y la fuerza excesiva puede conducir a la punción ya sea del esófago o la tráquea. La colocación cuidadosa del inóculo es tambiénrequeridos o los animales pueden o no recuperarse o no estar infectados de manera adecuada. Sin embargo, con paciencia y perseverancia, se puede llegar a ser altamente competente y realizar la técnica con rapidez, suavidad y precisión.
Al eliminar el requisito de la neutropenia, lo que aumenta la robustez y reproducibilidad, lo que permite a los investigadores estudiar más patógenos y aislados, la mejora de la flexibilidad del diseño experimental y proporcionar una infección difícil de caracterizar la farmacodinamia de la neumonía, este modelo de infección pulmonar inmunocompetentes añade un valor sustancial para el descubrimiento de antibióticos comunidad. El mayor uso de este modelo por los investigadores adicionales ayudará a proporcionar la evaluación comparativa necesaria para que pueda obtener una mayor aceptación y continuar proporcionando información de apoyo para la interpretación apropiada.
Disclosures
Los autores son todos pagados empleados de GlaxoSmithKline Pharmaceuticals y son dueños de acciones dentro de la empresa.
Acknowledgments
JH desea reconocer y agradecer a mentor, amigo y ex gerente Valerie Berry para la primera que nos enseña este modelo; y Gary Woodnutt, que nos enseñó los fundamentos de la inspiración y nuestro compromiso con el campo de PK / PD antibacteriano. Todos los autores desean agradecer a David Payne por su apoyo y reconocimiento a nuestra ciencia. Nos gustaría reconocer a nuestro ex colegas en microbiología vivo que contribuyeron a la cantidad de datos generados usando estos métodos, especialmente Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni página y Nerissa Simon. Por último, damos las gracias a nuestros colegas de microbiología in vitro por su ayuda, especialmente para proveer a todos los países de ingresos medios que solicitamos (Lynn McCloskey, Josh West y Sharon min); y para nuestro equipo de microbiología clínica que proporciona asesoramiento y apoyo (Linda Miller, Nicole Scangarella-Omán y Deborah Butler).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
| Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
| BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
| BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
| Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
| 0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
| Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
| 30 mL free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100 mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
| Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
| 90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
| 1 mL TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| Animal feeding needle - straight 20 x 3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
| Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand - Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
| 75 TN 5.0 µL syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
| Pyrex tube, culture 25x150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
| 70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
| Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
| Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
| Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
| Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |
References
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