A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.
Effekten af kandidat antibakterielle behandlinger skal påvises i dyremodeller for infektion som en del af forskning og udvikling proces, helst i modeller, som efterligner den påtænkte kliniske indikation. Fremgangsmåde til induktion robuste lungeinfektioner hos immunkompetente rotter og mus er beskrevet som giver mulighed for evalueringen af behandlingerne i en model for alvorlig lungebetændelse forårsaget af S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae eller A. baumannii. Dyr bedøves, og en agar-baseret inokulum er deponeret dybt ned i lungerne via nonsurgical intratracheal intubation. Den resulterende infektion er konsistent, reproducerbar og stabil i mindst 48 timer og op til 96 timer for de fleste isolater. Undersøgelser med markedsførte antibakterielle midler har vist god korrelation mellem in vivo effekt og in vitro følsomhed, og overensstemmelse mellem farmakokinetiske / farmakodynamiske mål bestemmesi denne model og klinisk accepteret mål er blevet observeret. Selv om der er en indledende tid investering, når lære teknikken, kan den udføres hurtigt og effektivt, når færdighed er opnået. Fordele ved modellen omfatter fjernelse af neutropeni krav, øget robusthed og reproducerbarhed, evne til at studere flere patogener og isolerer, forbedret fleksibilitet i studie design og etablering af en udfordrende infektion i en immunokompetente vært.
Evaluering af effekten af potentielle lægemiddelkandidater i dyremodeller for infektion er et afgørende element i den antibakterielle lægemiddelforskning processen. In vivo effektstudier giver vigtige data for beslutningstagning i hele spektret af discovery indsats fra belyse struktur-aktivitets-relationer (SAR) og optimering af bly kemisk serie gennem fastlæggelse farmakokinetisk-farmakodynamisk (PK / PD) karakteristika for forbindelser og støtte udvælgelse dosis for klinisk udvikling og myndighedsgodkendelse. Talrige dyr infektionsmodeller er beskrevet i litteraturen til disse formål. En af de mest almindelige og udbredte modeller er den neutropenisk mus låret infektion, som blev udviklet af Eagle 1, 2 og senere udvidet af Vogelman og Craig 3, 4. Denne model har været uvurderlig til understøtning bestemmelse af bakterielle følsomhedsbreakpoints og til tilvejebringelse PK / PD-mål til at guide human dosering. Der er mange eksamenpler hvor prognosemuligheder af denne model er blevet bevist 4-7. Men en af ulemperne ved låret infektion model er den manglende direkte relevans for lungeinfektioner. Der er nu en større vægt på matchende infektionsstedet i dyremodeller til stedet for infektion hos mennesker; og således, at studere forbindelser til behandling af lungebetændelse, er det ideelt at anvende en lungeinfektion model hos dyr.
Flere metoder til at fremkalde lungeinfektioner i forsøgsdyr er blevet beskrevet og anvendt til antibakterielle effekt undersøgelser, herunder intranasal inhalation, aspiration via svælg rute, aerosol eksponering, og kirurgisk intratrakeal podning 8. I mange tilfælde skal dyrene (især mus) først gøres neutropene for at opnå en robust lungeinfektion. På trods af dette svært immunkompromitterede tilstand, antallet af bakterielle patogener og stammer, som producerer levedygtige infektioner hos gnavere erbegrænset. For eksempel kan det være vanskeligt at kunne etablere Haemophilus influenzae eller Acinetobacter baumannii i lungebetændelse modeller 9, 10 og endnu mere virulente patogener, såsom Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa og Klebsiella pneumoniae, kan give udfordringer 11-13.
I 1991 Smith beskrev en lungeinfektion model i immunkompetente fravænnede rotter, hvor infektionen blev fastlagt ved inddrypning bakterier direkte i lungerne via et enkelt kirurgisk intratracheal intubation metode 14. Berry et al. senere ændret metoden til at inficere mus 15. Ved anvendelse af en agar-baseret inokulum, denne podning teknik inducerer robuste lungeinfektioner i både immunokompetente rotter og mus med S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa og A. baumannii. Det er modtagelig for en bred vifte af isolater, herunder dem, der huser forskellige modståance determinanter og dem, der ikke producerer en levedygtig infektion via andre inokulering ruter. Det giver også effekt, der skal fastlægges i immunkompetente dyr, en tilstand, som er mere relevant end den traditionelle neutropenisk musemodel for patientpopulationer, der ikke er svært immunkompromitterede. Konsistensen og pålideligheden af denne model på tværs af flere patogener og isolater gør det velegnet til antibakterielle undersøgelser af effekten.
For optimal succes i at reproducere denne infektion model, bør overvejes følgende yderligere forslag. Virulens af nye isolater kan forøges ved passage 2 – 3 gange in vivo før anvendelse i et forsøg. Frosne bakterielle lagre bør altid være forberedt fra en primær in vivo-afledt kilde med så få passager som muligt fra originalen, og genfrysning eller genbrug af optøet bestand frarådes. Brug af nylige kliniske isolater udvundet fra patienter med lungebetændelse, og / eller fremstilling af kulturer i den logaritmiske vækstfase kan også bidrage til at forbedre etablering af infektionen. En fem ganges fortynding i agaren (f.eks 2 ml saltvand suspension tilsat til 8 ml agar) kan anvendes i stedet for ti gange for at øge den bakterielle inokulum, og podevolumen kan justeres baseret på størrelsen af dyret (f.eks 200 pi / dyr sædvanligvis podet i 250 g rotter). Før tilsætning af saltvand bakteriesuspension iagar (dvs. i trin 2.3), kan den bakterielle tæthed forudsiges eller estimeres ved visuel inspektion, MacFarland standarder eller målinger af optisk densitet. Det er nyttigt at blive fortrolig med de in vitro-vækst for ethvert isolere før udførelse in vivo forsøg. Sammenhæng i vækst og håndtering muliggør den mest nøjagtige vurdering af den bakterielle tæthed for en given isolat. Standard mikrobiologiske metoder, der adskiller sig fra dem, der er beskrevet, såsom alternative medier og væv homogenisatorer, kan anvendes som passende til at forberede podestoffer og optælle bakterier fra inficerede væv.
Det anbefales stærkt at forberede eller smelte agaren dagen før forsøget og gemme det natten over i en separat vandbad indstillet til 50 ° C. Dette vil forenkle processen og hjælpe vagt over agaren bliver alt for varmt på tidspunktet for infektion. En temperatur på 41-42 ° C opnår en god balance mellem maintaining agar i flydende tilstand uden at være for varmt for kortsigtet bakteriel overlevelse. Som et muligt alternativ til næringsstof agar er ædel agar været anvendt med succes i nogle eksperimenter. Et rør af agar inokulum er normalt tilstrækkeligt for en hel eksperiment (og anbefales), men flere rør kan fremstilles til at inficere et stort antal dyr (fx mere end 60), eller når den inficerende proces tager længere end 30 – 45 min Hvis flere inokulum rør er påkrævet, tilsæt saltvand bakteriesuspension til hvert rør af agar, som det er nødvendigt. Dette reducerer risikoen for, at bakteriel overlevelse og / eller egnethed vil blive påvirket af forlænget udsættelse for en forhøjet temperatur før inokulering. Det skal bemærkes, at ved hjælp af flere inokulum rør også kan kræve yderligere dyr randomisering procedurer. Når det er muligt, inficere alle dyr fra samme inokulum forberedelse. Det anbefales at skræddersy størrelsen af eksperimenter til det nuværende niveau for færdigheder med technique.
En dygtig videnskabsmand kan intubere og pode et dyr på mindre end 30 s og pode op til 5 – 6 dyr pr parti (dvs. med en sprøjte fyldt med agar inokulum). For dem, der lærer teknikken, hastighed er vigtigt, da agaren vil begynde at størkne; imidlertid nøjagtig placering af inokulummet er vigtigere. Begynd med 1 eller 2 dyr pr parti, og øger som teknikken bliver mere fortrolig. Dyrene fortsat trække vejret under intubation; således, tidsvinduet til podning afhænger af, hvor hurtigt dyret kommer sig isofluran, som bør være ca. 2 – 3 i min. Dyr, der vækker under processen kan genbruges bedøvet og forsøgte en anden gang, men det anbefales ikke at gøre det gentagne gange. Vellykket podning i første forsøg forventes i næsten 100% af dyrene, når færdigheder er opnået. Bemærk, at det er lettere at lære teknikken ved anvendelse rotter først; mus er mere sarte og den mindre forls er mere tilbøjelige til blokering med størknet agar hvis ikke manipuleres hurtigt. Pre-opvarmning sprøjter, slanger og saltholdige samt holde intubation enhed på en varm (ikke varmt) overflade, såsom en varmepude på lav indstilling, kan hjælpe med at forhindre størkning af agaren. Når man lærer teknikken, er det også nyttigt at praktisere korrekt placering af inoculum anvendelse af en mørk farvet farvestof (såsom koncentreret methylenblåt) i stedet for den bakterielle suspension i agar. Udføre proceduren som beskrevet, men aflive dyret umiddelbart efter inokulation af farvestoffet (ikke tillader dyret kan komme mellem anæstesi og eutanasi). Dissekere at bestemme, hvor farvestoffet er blevet placeret, og justere teknik i overensstemmelse hermed.
Det primære endepunkt i denne model er CFU fra inficerede lunger. Overlevelse er ikke en god indikator for bakteriel byrde og er ikke en anbefalet endpoint. For undersøgelser af effekten, den foreslåede N er 5 – 6 dyr pr gruppe, da dette er predicted at detektere ≥1 log10 CFU forskelle mellem grupper med mindst 90% kraft. Dyr kan inficeres i grupper, således at bur hjælpere blive sammen, eller en sand randomisering proces kan følges. Bemærk, at hvis grupper er tildelt af buret, bør grupperne være inficeret i en tilfældig rækkefølge med end-of-studie vækst kontroller inficeret sidste (at bekræfte, at bakteriel overlevelse / fitness blev ikke påvirket af den tid udsættes for en forhøjet temperatur i vandbad). Ingen data Censur metoder bør være nødvendig, og ingen anbefales med undtagelse af øjeblikkelig fjernelse af ethvert dyr, der har været åbenbart mis-inokulerede ved begyndelsen af undersøgelsen (før initiering af nogen behandlinger). Dyr, der aflivet inden afslutningen af undersøgelsen bør udtages prøver og resultater indgår i datasættet, medmindre en gyldig grund til udelukkelse blev identificeret prospektivt (dvs. en begivenhed relateret til infektion eller behandling). Drug fremførsel kan affect nogle prøver og er en vigtig overvejelse for alle in vivo infektion modeller. Hvis en forbindelse er givet hyppigt, tæt på tidspunktet for eutanasi eller har en lang halveringstid, kan den være til stede i vævshomogenatet ved en høj nok koncentration til fortsat at dræbe bakterier ex vivo under den bakterielle optælling proces (fortynding og udpladning af de prøver eller på agarpladerne under inkubation natten over). For at forhindre dette, aktivt kul og / eller et additiv, som nedbryder det aktive molekyle uden at skade de bakterielle celler kan sættes til før homogenisering af prøven. Andre metoder omfatter centrifugering af prøverne for at fjerne størstedelen af den aktive forbindelse (som bør forblive i supernatanten) og anvender forskellige fortynding og udpladning ordninger til tilstrækkelig fortynde den aktive forbindelse til en ikke-inhiberende koncentration.
Som det fremgår af de i figur 2 viste eksempler, denne model med succes induces lungeinfektioner hos gnavere med en lang række af organismer, herunder dem, der ikke vokser godt i andre modeller (f.eks H. influenzae). Disse infektioner er konsekvent og reproducerbar, hvilket reducerer sandsynligheden for, at forsøgene skal blive gentaget på grund af model svigt og / eller dårlige resultater med en given isolat. Selvom dyrene er immunokompetente, er de ikke i stand til hurtigt at løse infektion, hvis overhovedet. Dette giver mulighed for øget fleksibilitet i studie længde, så mange isolater opretholde en levedygtig infektion gennem mindst 96 timer uden behov for gentagne injektioner for at opretholde neutropeni. Den potentielle fordel ved at studere antibakteriel effekt i immunkompetente dyr er tidligere blevet bemærket 20, 21, og der er tegn på, at for nogle forbindelser (f.eks oxazolidinoner), kan data fra ikke-neutropene gnavere mere præcist forudsige mål human eksponering sammenlignet med dem, afsmeltet neutropeni fem. Den multi-purpose anvendeligheden af than model er demonstreret i figur 3 og 4 og tabel 1 og 2. Disse undersøgelser er en del af en stor samling af offentliggjorte eller ikke offentliggjorte data, der er genereret med denne model til at støtte bly optimering indsats 16, 17, 22-24, til sammenligning og bekræftelse af foreslåede human doseringsregimer 19, 25-29 og for PK / PD karakterisering 18, 30-32 .Mens denne model er oprindeligt mere kompliceret at udføre i forhold til den intranasale inhalation metode, der er mange fordele som beskrevet ovenfor. Med praksis og rutinemæssig brug, bør de teknikker bliver ligetil at udføre.
Det kan bemærkes i nogle undersøgelser, at den bakterielle belastning ved baseline var lavere end typisk målrettet i andre lungeinfektion modeller. Dette skyldes for en stor del til den ønskede fortynding i agar og det lille udfordring volumen, især i mus. Imidlertid bør det også bemærkes,at bakteriel vækst blev set i alle tilfælde, selv når den oprindelige byrde var forholdsvis lav. Målet baseline bakterielle belastning er på 6 til 6.5 log 10 CFU / lunger (6,8 til 7,3 log 10 CFU / g væv i mus baseret på den gennemsnitlige lungevægte) svarende til densiteter estimeret i humane patienter med svær lungebetændelse 33. En højere baseline byrde kan opnås ved yderligere koncentrering af den bakterielle inokulum eller ved at forsinke starten af forbindelse administration at tillade yderligere bakterievækst; dog øge udfordringen belastning for meget kan føre til unormalt alvorlig og akut sygdom (dvs. død i mindre end 24 timer), som er refraktære over for alle antibakterielle behandlinger uanset modtagelighed. Selvom inoculum i første omgang placeres fortrinsvis i den venstre lunge af dyret, generelt spreder infektionen hele begge lunger. Progressiv lungesygdom, formidling af bakterierne til andre organer, og eventuel sygelighed er ofte observed med S. pneumoniae, K. pneumoniae og P. aeruginosa. Af interesse, infektioner med H. influenzae og A. baumannii er normalt mere indeholdt og sjældent føre til døden på den foreskrevne bakterielle podestoffer.
Effekt resultater fra denne model har korreleret godt med in vitro modtagelighed profiler samt defineret PK / PD-mål. Reduktioner i bakteriebyrden rutinemæssigt observeres for isolater betragtes som modtagelige for midlet, der testes, mens dem, der anses resistente udviser ingen ændring eller bakterievækst over basislinien 16, 17, 19, 24-29. Forsøg med rotter evaluering to quinoloner og et makrolid ved hjælp af denne model 32 har vist, at PK / PD target kræves for en 1-log 10 reduktion i S. pneumoniae sammenlignet med baseline korreleret med målet bestemmes i neutropene mus og, endnu vigtigere, med kliniske mål for erhvervet uden bakteriel PneumOnia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, en ny mekanisme antibiotikum, blev testet mod flere S. pneumoniae og krævede en lignende PK / PD mål for en 1-log 10 reduktion i denne lungeinfektion model 31 som der kræves for en 1-log 10 reduktion i neutropenisk låret model 36 når lunge penetration blev taget hensyn til (data på filen). Tilsvarende PK / PD-mål bestemt i mus for GSK2251052 mod P. aeruginosa var konsistente for stasis, 1- og 2-log 10 reduktioner i CFU mellem dette lunge model 30 og den neutropene låret infektion model, når lunge penetration blev betragtet 37, 38 . Korrelation med en neutropenisk lungeinfektion model ved hjælp af intranasal inokulation var dårlig; dog havde GSK2251052 ikke producere mere end en statisk respons i denne undersøgelse 38. Dette kan skyldes den højere bakterielle inokulum, som var 8 log 10 CFU / mus sammenlignet med 6 log <sub> 10 CFU / mus i neutropenisk låret 37 og intratrakeal intubation 30 modeller. Indsamling af data såsom det er kritisk for benchmarking, da det giver mulighed for direkte sammenligning med de eksisterende modeller og korrelation med kliniske data til at vurdere translationel prædiktiv kapacitet. Mere udbredt anvendelse af den intratrakeal intubation lungeinfektion model vil tilvejebringe yderligere data for disse typer af analyser.
Der er flere begrænsninger af denne immunkompetente lungebetændelse model. For det første er ikke velegnet til at vurdere udviklingen af spontan modstand, fordi den høje bakteriel inokulum generelt kræves for sådanne undersøgelser resulterer i alt for alvorlig en infektion. Efter forsøg på at opnå bakterielle byrder på 7 eller 8 log 10 CFU ved baseline, er blevet observeret hurtig sygelighed (dvs. dyr bliver døende på mindre end 24 timer) på trods af grundig vask af inocula at fjerne allerede eksisterende toksiner (data på filen). Detkan være muligt at afhjælpe dette problem ved at anvende større gnavere. Rotter, især tungere rotter (> 250 g), synes at bedre tåle højere podestoffer sammenlignet med mus og kan være egnet til disse typer af studier. En anden begrænsning er, at anvendelsen af agar som en infektion-enhancer kan udelukke modellen anvendes til evaluering af visse vært: patogen interaktioner. Det menes, at agaren indeholder en beskyttet brændpunkt indtil infektionen er fuldt etableret i lungen. Det er muligt at levere podestoffet i saltvand i stedet for agar til at overvinde dette problem; imidlertid skal det bemærkes, at dette kun vil producere infektion med nogle isolater. For det tredje, der er en stejl indlæringskurve kræves for at blive dygtige i teknikken. Proceduren kan være sart, især i mus. Det er let at fejlagtigt placere metalkanyle i spiserøret, og overdreven kraft kan føre til punktering af enten esophagus eller trachea. Omhyggelig placering af inoculum er ogsåpåkrævet eller dyr kan enten ikke komme sig eller ikke i tilstrækkelig grad smittet. Men med tålmodighed og udholdenhed, kan man blive meget dygtige og udfører teknikken hurtigt, smidigt og præcist.
Ved at fjerne kravet om neutropeni, øget robusthed og reproducerbarhed, så efterforskerne til at studere flere patogener og isolater, forbedre fleksibiliteten i eksperimentelle design og giver en udfordrende infektion at karakterisere farmakodynamik for lungebetændelse, dette immunkompetente lungeinfektion model tilføjer væsentlig værdi antibiotika opdagelse fællesskab. Øget brug af denne model med yderligere efterforskere vil bidrage til at give den nødvendige benchmarking for at få mere udbredt accept og fortsætte med at yde understøttende oplysninger til passende fortolkning.
The authors have nothing to disclose.
JH ønsker at anerkende og takke mentor, ven og tidligere manager Valerie Berry for første lærer os denne model; og Gary Woodnutt, der lærte os grundlaget for og inspirerede vores forpligtelse til inden for antibakterielle PK / PD. Alle forfattere vil gerne takke David Payne for hans støtte og påskønnelse for vores videnskab. Vi vil gerne anerkende vores tidligere in vivo mikrobiologi kolleger, der har bidraget til kroppen af data genereret ved hjælp af disse metoder, især Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni Side og Nerissa Simon. Endelig vores tak til vores in vitro mikrobiologi kolleger for deres bistand, især til at give alle de MIC vi anmodning (Lynn McCloskey, Josh West og Sharon Min); og for vores kliniske mikrobiologi team, der giver ekspertrådgivning og support (Linda Miller, Nicole Scangarella-Oman og Deborah Butler).
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
30 ml free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
50 ml Polypropylene Conical Tube 30 x115mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
1 ml TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
Animal feeding needle – straight 20×3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand – Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
75 TN 5.0ul syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
Pyrex tube, culture 25×150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |