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Cancer Research

एक murine Orthotopic मूत्राशय ट्यूमर मॉडल और ट्यूमर का पता लगाने प्रणाली

Published: January 12, 2017 doi: 10.3791/55078
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Surgery, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, National University Health System, 2Department of Urology, National University Hospital

Summary

इस प्रोटोकॉल महिला C57BL / 6J चूहों और ट्यूमर के विकास की निगरानी में murine ओर्थोटोपिक मूत्राशय ट्यूमर की पीढ़ी का वर्णन है।

Abstract

इस प्रोटोकॉल murine मूत्राशय कैंसर कोशिका लाइन MB49 है, जो मानव प्रोस्टेट विशिष्ट प्रतिजन (पीएसए) स्रावित करने के लिए संशोधित किया गया है का उपयोग कर मादा चूहों C57BL / 6J में मूत्राशय ट्यूमर की पीढ़ी का वर्णन है, और ट्यूमर आरोपण की पुष्टि के लिए प्रक्रिया। संक्षेप में, चूहों इंजेक्शन दवाओं का उपयोग anesthetized हैं और पृष्ठीय स्थिति में रखना करने के लिए बना रहे हैं। मूत्र मूत्राशय से खाली है और पाली एल लाइसिन (पीएलएल) के 50 μL धीरे धीरे एक 24 जी चतुर्थ कैथेटर का उपयोग कर 10 μL / 20 एस की दर से डाले है। यह कैथेटर stoppering से 20 मिनट के लिए मूत्राशय में छोड़ दिया है। कैथेटर हटा दिया जाता है और पीएलएल मूत्राशय पर कोमल दबाव द्वारा खाली है। इस murine मूत्राशय कैंसर कोशिका लाइन 10 μL / 20 एस की दर से (1 x 10 5 कोशिकाओं / 50 μL) की टपकाना द्वारा पीछा किया जाता है। कैथेटर समय से पहले निकासी को रोकने के लिए stoppered है। 1 घंटे बाद, चूहों एक उलट दवा के साथ पुनर्जीवित कर रहे हैं, और मूत्राशय खाली है। धीमी गति से टपकाना दर महत्वपूर्ण है,यह vesico-ureteral भाटा, जो ट्यूमर के ऊपरी मूत्र पथ में और गुर्दे में घटित करने के लिए पैदा कर सकता है कम कर देता है। सेल लाइन ठीक है, कोशिकाओं की clumping को कम करने के रूप में इस आरोपण के बाद असमान ट्यूमर के आकार को जन्म दे सकता है फिर से निलंबित किया जाना चाहिए।

इस तकनीक में उच्च दक्षता के साथ ट्यूमर लाती है। ट्यूमर के विकास को मूत्र पीएसए स्राव द्वारा नजर रखी है। पीएसए मार्कर निगरानी अल्ट्रासाउंड या मूत्राशय में ट्यूमर की मौजूदगी का पता लगाने के लिए प्रतिदीप्ति इमेजिंग की तुलना में अधिक विश्वसनीय है। अगर अनुपचारित छोड़ दिया 4 सप्ताह - चूहों में ट्यूमर आम तौर पर लगभग 3 से अधिकतम आकार कि नकारात्मक प्रभावों स्वास्थ्य पहुँचने। ट्यूमर के विकास की निगरानी करके, यह चूहों कि उन है कि सफलतापूर्वक ट्यूमर के साथ प्रत्यारोपित नहीं किया गया से ठीक हो रहे थे अंतर करने के लिए संभव है। केवल अंत बिंदु विश्लेषण के साथ, बाद गलती से चिकित्सा द्वारा इलाज किया गया है करने के लिए माना जा सकता है।

Introduction

इस पद्धति का लक्ष्य murine ओर्थोटोपिक मूत्राशय ट्यूमर उत्पन्न करने के लिए और, प्रत्यारोपित ट्यूमर की निगरानी के लिए सही रूप में संभव के रूप में तो ट्यूमर आरोपण के बिना है कि चूहों अंत बिंदु विश्लेषण पर ठीक किया गया है सोचा नहीं कर रहे हैं। कुल मिलाकर, विधि प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए चूहों की बड़ी संख्या के लिए जरूरत को कम करने और चिकित्सीय परिणामों को निर्धारित करने में अधिक से अधिक सटीकता सुनिश्चित करेगा दिखाया गया है।

दाखिल ट्यूमर कोशिकाओं subcutaneously नैदानिक ​​रोग का माहौल पुनरावृत्ति नहीं करता है या चिकित्सीय रणनीतियों के विकास को सक्षम कैंसर के लिए एक orthotopic मॉडल के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। मूत्राशय की वास्तुकला सीधे न्यूनतम प्रणालीगत प्रभाव के साथ मूत्राशय में मूत्राशय कैंसर के उपचार के टपकाना परमिट। इस प्रकार, पशु मॉडल, इस तरह के एक मॉडल के रूप में ओर्थोटोपिक कि इस माहौल पुनरावृत्ति, नए उपचारों का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। निष्कर्ष किसी भी प्रयोगात्मक सेट-अप से तैयार कर रहे हैं dependenमॉडल की सीमाओं पर टी।

कई तकनीकों चूहों में orthotopic मूत्राशय ट्यूमर के उत्पादन के लिए विकसित किया गया है। ये मूत्राशय की ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन परत को नुकसान पहुँचाए, ट्यूमर कोशिकाओं को सक्रिय करने के प्रत्यारोपित किया जा करने के लिए पर भरोसा करते हैं। इस्तेमाल की तकनीक electrocautery, जो मूत्राशय की दीवार में नुकसान का एक बिंदु में यह परिणाम है, मूत्राशय 1,2 में एक साइट पर ट्यूमर के विकास के लिए अग्रणी शामिल हैं। हालांकि, विद्युतदहनकर्म का उपयोग कर ट्यूमर आरोपण की सफलता की दर ऑपरेटर पर निर्भर 10 से बदलती है - 90%, और यह खतरा यह है कि मूत्राशय दीवार की हवा निकाल दी जाएगी शामिल पेरिटोनियल गुहा में विकासशील ट्यूमर के लिए अग्रणी। रासायनिक दाग़ना चांदी नाइट्रेट, जो नुकसान मूत्राशय दीवार 3 का उपयोग किया जाता है। इसी तरह, एसिड मूत्राशय दीवार 4 नुकसान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। Trypsin भी अच्छी तरह के रूप में 5 मूत्राशय को नुकसान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इन विधियों मूत्राशय में एक से अधिक ट्यूमर के विकास में परिणाम हो सकता है।इसके अलावा, वहाँ मूत्राशय को गंभीर नुकसान का खतरा है, तो रसायन भी लंबे समय के लिए मूत्राशय दीवार के साथ संपर्क में छोड़ दिया जाता है। विधि Ninalga एट अल द्वारा विकसित की है। सकारात्मक आरोप लगाया पाली एल लाइसिन (पीएलएल) कोट मूत्राशय की दीवार को 6 अणुओं का उपयोग करता है; इस नकारात्मक आरोप लगाया ट्यूमर कोशिकाओं मूत्राशय की ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन परत करने के लिए छड़ी करने के लिए सक्षम बनाता है। इस विधि को आम तौर पर एक से अधिक ट्यूमर मूत्राशय में विकसित करने में परिणाम है, लेकिन ट्यूमर आरोपण 80 पर है - 100% 4,7। तकनीकी तौर पर, यह भी आसान प्रक्रिया का प्रदर्शन करने के लिए है। यह सुनिश्चित करें कि ट्यूमर है कि विकसित काफी भी आकार में हैं, यह महत्वपूर्ण है कि ट्यूमर कोशिकाओं आरोपण से पहले बड़े गुच्छों में वर्गीकृत नहीं कर रहे हैं।

आदेश चिकित्सीय प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए, यह काफी समान आकार के ट्यूमर के साथ चूहों पर यह अध्ययन प्रदर्शन करने के लिए सबसे अच्छा है। इस प्रकार, एक अच्छा पता लगाने प्रणाली है कि आरोपण के बाद जल्द ही ट्यूमर के आकार यों कर सकते हैं महत्वपूर्ण है। कई रणनीतियों मधुमक्खी हैn ट्यूमर का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया। ये चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) 8-10, प्रतिदीप्ति 11, 12,13 bioluminescence, अल्ट्रासाउंड 14, और एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) 15,16 शामिल हैं। एमआरआई और अल्ट्रासाउंड ट्यूमर कोशिकाओं के संशोधन की आवश्यकता नहीं है, एमआरआई के लिए संवेदनशील उपकरण और विपरीत एजेंटों के लिए एक की जरूरत है। , Fluorescence- luminescence-, और एलिसा आधारित assays मार्कर प्रोटीन है कि इन तरीकों से पता लगाया जा सकता है व्यक्त करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं के संशोधन की आवश्यकता है। luminescence के लिए, एक सब्सट्रेट luciferase गतिविधि का पता लगाने के लिए आवश्यक है; इस प्रकार, वहाँ एक जोड़ा कदम और लागत में वृद्धि हुई है। दोनों luminescence और प्रतिदीप्ति विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। प्रतिदीप्ति का उत्पादन करने के लिए, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) चक्रगति, जो आणविक ऑक्सीजन द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है, की आवश्यकता है। इस प्रकार, GFP अभिव्यक्ति ऑक्सीजन के लिए उपयोग के आधार पर एक ट्यूमर मास के भीतर चर हो सकता है, यह एक नहीं बल्कि अविश्वसनीय मार्कर बनाने 15,16 छिपाना के रूप में एक किराए मार्कर एक और रणनीति है। इन मार्करों भी प्रयोग की समाप्ति पर ट्यूमर मौजूदगी की पुष्टि के लिए उन्हें immunohistochemistry के लिए एक विकल्प बनाने का एक वैकल्पिक साधन उपलब्ध कराते हैं। इस अध्ययन ओर्थोटोपिक ट्यूमर आरोपण की पीएलएल विधि की रिपोर्ट है और ट्यूमर का पता लगाने प्रणालियों, अर्थात् एलिसा, प्रतिदीप्ति, और अल्ट्रासाउंड इमेजिंग की तुलना प्रस्तुत करता है।

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Protocol

सभी जानवर काम सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय में पशु उपयोग और हैंडलिंग (प्रोटोकॉल नंबर 084/12) पर संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के दिशा-निर्देशों का पालन किया।

1. MB49-पीएसए कोशिकाओं से बढ़ इन विट्रो में और मापने पीएसए स्राव

  1. बनाए रखें murine मूत्राशय कैंसर की कोशिकाओं को MB49-पीएसए 15 पूरा Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक, 2 mmol / एल एल glutamine में, और 37 पर एक मशीन में 0.05 मिलीग्राम / एमएल पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2। 200 माइक्रोग्राम / एमएल hygromycin बी पीएसए स्रावित कक्षों के चयन का दबाव बनाए रखने के लिए जोड़ें।
  2. पीएसए स्राव, प्लेट 1 एक्स 10 6 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में कोशिकाओं का निर्धारण और 48 घंटे के लिए 5% सीओ 2 की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर यह सेते हैं।
  3. दो दिन बाद, पीएसए माप के लिए सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
    1. एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, समर्थन के लिए स्थानांतरणएक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब ernatant।
    2. 250 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र अस्थायी कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए। एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 30 डिग्री सेल्सियस - पीएसए परख एक अलग दिन पर किया जाता है, तो सतह पर तैरनेवाला की दुकान। यदि नहीं, तो तुरंत अगले कदम के लिए आगे बढ़ें।
    3. पीएसए एकाग्रता एक मानव-मुक्त पीएसए एलिसा किट 7 का उपयोग कर का निर्धारण करते हैं।
  4. चढ़ाया कोशिकाओं की गणना करें।
    1. एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, धीरे DMEM के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें। महाप्राण और पूरी तरह से मीडिया को दूर।
    2. ताजा मीडिया के 1 एमएल जोड़ें और एक सेल खुरचनी के साथ धीरे परिमार्जन अच्छी तरह से कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए।
    3. एक microcentrifuge ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण और उन्हें अच्छी तरह से एक एकल कोशिका निलंबन सुनिश्चित करने के लिए फिर से निलंबित।
    4. सेल निलंबन और एक 0.4% trypan नीले समाधान के बराबर मात्रा मिलाई। जीवित कोशिकाओं (जो डाई नहीं लेते हैं) एक hemocytometer का उपयोग गिनती।
  5. एनजी के रूप में पीएसए अभिव्यक्ति की गणनापीएसए के / मीडिया के एमएल / 10 6 कोशिकाओं। 120 एनजी / एमएल / 10 6 कोशिकाओं - चूहों में आरोपण के लिए MB49-पीएसए कोशिकाओं की पीएसए अभिव्यक्ति 80 है।

2. एलिसा और वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण द्वारा पीएसए माप की संवेदनशीलता का निर्धारण

  1. माता पिता का MB49 कोशिकाओं के विभिन्न मात्रा के साथ 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में पूरा DMEM मीडिया में प्लेट MB49-पीएसए कोशिकाओं अच्छी तरह से प्रति 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं (यानी, 10 0, 10 1, 10 2, 10 की एक अधिकतम है कि इस तरह के 3, 10 4, 10 5, या 10 6 MB49-पीएसए कोशिकाओं, 10 6 के साथ सुसंस्कृत हैं 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1, या 10 0 MB49 कोशिकाओं, क्रमशः)।
  2. एक दिन बाद, 1.3 चरण में वर्णित के रूप में पीएसए माप के लिए सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा। पीएसए एकाग्रता एक मानव-मुक्त पीएसए एलिसा किट 7 का उपयोग कर का निर्धारण करते हैं।
  3. कोशिकाओं से शाही सेना निकालें।
    1. lyseशाही सेना निष्कर्षण अभिकर्मक के 1 एमएल जोड़कर थाली में सीधे कोशिकाओं।
    2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं और एक microcentrifuge ट्यूब सेल lysate हस्तांतरण। क्लोरोफॉर्म की 0.2 एमएल जोड़ें और 15 एस के लिए सख्ती नमूने भंवर। उन्हें कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए सेते हैं।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र। ध्यान से अंतरावस्था परेशान करने के बिना एक ताजा ट्यूब ऊपरी जलीय चरण (0.5 एमएल) हस्तांतरण।
    4. isopropyl शराब के 0.5 एमएल जोड़ें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से निकालें, ट्यूब के नीचे आरएनए वेग को परेशान किए बिना।
    5. 75% इथेनॉल के 1 एमएल के साथ एक बार गोली धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 7500 XG पर अपकेंद्रित्र। सभी इथेनॉल निकालें और 10 मिनट के लिए शुष्क हवा गोली अनुमति देते हैं।
    6. nuclease मुक्त पानी के 30 μL में शाही सेना भंग। 60 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं इसलिए बढ़ाने के लिएlubility।
    7. absorbance को मापने के 260 एनएम (A260) पर पराबैंगनी (यूवी) स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके आरएनए quantitate। आरएनए पवित्रता का आकलन करने के लिए, 280 एनएम (A280) पर absorbance मापने के लिए और A260 / A280 अनुपात जो 1.6 से ऊपर होना चाहिए गणना।
  4. शाही सेना के 2 माइक्रोग्राम से रिवर्स टाइप सीडीएनए।
    1. बर्फ पर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें और 0.2 एमएल ट्यूबों को हस्तांतरण।
    2. संक्षेप में ट्यूबों अपकेंद्रित्र सामग्री नीचे स्पिन करने के लिए और हवा के बुलबुले को खत्म करने।
    3. थर्मल cycler में ट्यूब लोड और रिवर्स प्रतिलेखन प्रदर्शन के बाद की स्थिति पर: 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के द्वारा पीछा किया। एक बार चलाने के पूरा हो गया है, 4 डिग्री सेल्सियस पर सीडीएनए नमूने रखें।
    4. लंबी अवधि के भंडारण के लिए 30 डिग्री सेल्सियस - पर नमूने संग्रहित करें।
  5. पीएसए और cytoplasmic बीटा actin के लिए एक वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण करते हैं। बीटा actin के नमूने मानक के अनुसार किया जाता है। एक 96 अच्छी तरह से पीएलए में रिवर्स लिखित शाही सेना के 100 एनजी पर परख प्रदर्शनते। तीन प्रतियों में सभी नमूनों परख। निम्नलिखित मानकों के साथ 40 चक्र को पूरा करें: 50 डिग्री सेल्सियस, 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट पर 2 मिनट, विकृतीकरण के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 15, और 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट। एक चक्र सीमा 35 वर्ष की (सीटी) में पता लगाने के निम्नतम सीमा निर्धारित करें; इस प्रकार, 35 से परे एक सीटी मूल्य के साथ किसी भी नमूने पता लगाने योग्य नहीं माना जाता है।

3. MB49-पीएसए सेल लाइन के tumorigenicity को बनाए रखने

नोट: इन विट्रो में लंबे समय तक विकास tumorigenicity का एक नुकसान होता है। tumorigenicity बनाए रखने के लिए, MB49-पीएसए सेल लाइन में कम से कम एक बार हर 2 साल माउस के माध्यम से passaged है।

  1. प्रकोष्ठों।
    1. हार्वेस्ट तेजी से उन्हें एक बाँझ सेल खुरचनी के साथ धीरे scraping द्वारा कोशिकाओं बढ़ रहा है। सेल निलंबन और एक 0.4% trypan नीले समाधान के बराबर मात्रा मिलाई। एक hemocytometer का उपयोग जीवित कोशिकाओं की गणना करें। प्रत्यारोपण यदि कोशिकाओं के 20% से अधिक मर चुके हैं मत करो।
    2. आवश्यक (1 एक्स 10 जीवित कोशिकाओं की राशि की गणना7 कोशिकाओं / एमएल) और उन्हें एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब को हस्तांतरण। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। DMEM खाली मीडिया में सेल गोली फिर से निलंबित। धोने तीन बार दोहराएँ आरोपण से पहले FBS के सभी निशान हटाने के लिए।
    3. जब तक चूहों आरोपण के लिए तैयार कर रहे हैं बर्फ पर सेल निलंबन रखें।
  2. subcutaneously पृष्ठीय पार्श्व पर चूहों में ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यारोपण।
    1. एक 4 से 6 सप्ताह पुराने C57BL6 / जम्मू माउस anesthetics ketamine के एक मिश्रण है और medetomidine (75 मिलीग्राम / किग्रा और 1 मिलीग्राम / किग्रा, क्रमशः) का उपयोग कर, प्रति वजन के 10 ग्राम 0.1 एमएल पर intraperitoneally इंजेक्शन anesthetize।
    2. त्वचा को बेनकाब करने के लिए सही दिशा दाढ़ी।
    3. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग, अंतर्निहित मांसपेशियों से अलग और सेल निलंबन (1 x 10 6 कोशिकाओं) का 0.1 एमएल इंजेक्षन करने के लिए subcutaneously एक 24 जी सुई के साथ त्वचा उठा। सुई हटाने के दौरान 5 से 10 S के लिए इंजेक्शन साइट चुटकी इतना है कि ट्यूमर कोशिकाओं करनाइंजेक्शन साइट के बाहर लीक नहीं।
    4. प्रति वजन के 10 ग्राम 0.1 एमएल atipamezole (1 मिलीग्राम / किग्रा) के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन के साथ माउस जिला।
  3. ट्यूमर व्यास नली का व्यास का उपयोग कर मापने के द्वारा हर दो दिन में ट्यूमर के विकास को मॉनिटर। ट्यूमर मात्रा सूत्र वी = (एबी) 2/2, जहां 'ए', सबसे लंबे समय तक आयाम और "बी" सीधा चौड़ाई है दोनों मिमी में उपयोग कर की गणना की जाती है।
  4. जब ट्यूमर की मात्रा कम से कम 50 मिमी 3 (लगभग 7 दिन) है, सीओ 2 के साथ माउस euthanize। DMEM में सड़न रोकनेवाला की शर्तों के तहत बाँझ संदंश और कैंची की एक जोड़ी और जगह के साथ ट्यूमर जन आबकारी।
  5. 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में, बाँझ नलियां का उपयोग कर छोटे टुकड़ों में ट्यूमर कीमा। एक "मूसल" के रूप में एक 1 एमएल सिरिंज सवार का प्रयोग करें और आगे ट्यूमर disaggregate करने के लिए।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में पूरा DMEM के 3 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं को बनाए रखने और 5% सीओ 2।
  7. एक बार कोशिकाओं बेनी का पालनई (एक और दो दिनों के बीच), एक बाँझ पाश्चर विंदुक के साथ धीरे श्वास द्वारा मीडिया, मलबे, और गैर पक्षपाती कोशिकाओं को हटा दें। DMEM के साथ दो बार धोएं। कोशिकाओं को परेशान नहीं करने के लिए ध्यान रखना।
  8. DMEM के 1 एमएल जोड़ने और उन्हें एक सेल खुरचनी के साथ scraping द्वारा कोशिकाओं फसल। चयन और एकल कालोनियों का विस्तार करने के लिए, एक 96 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में एक hemocytometer और अच्छी तरह से प्रति प्लेट 1 सेल का उपयोग कोशिकाओं की गिनती। 37 डिग्री सेल्सियस पर 200 माइक्रोग्राम / एमएल hygromycin बी के साथ DMEM में संस्कृति कोशिकाओं और 5% सीओ 2।
  9. मीडिया को बदलें और हर 4 एंटीबायोटिक - 5 दिन। कोशिकाओं पर नजर रखने के लिए जब तक वे 80-90% के बारे में मिला हुआ होता है। पुन प्लेट pipetting द्वारा 24 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली पर कोशिकाओं में अच्छी तरह से कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए।
  10. एक बार जब 24 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में कोशिकाओं मिला हुआ हैं, उन्हें एक सेल खुरचनी के साथ scraping द्वारा जगह देना और उन्हें 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में थाली।
  11. पीएसए स्राव के लिए अलग क्लोन स्क्रीन, चरण 1 में वर्णित के रूप में उच्चतम पीएसए गुप्त के साथ क्लोन क्रायो की रक्षाआयन और भविष्य माउस प्रयोगों के लिए इस्तेमाल करते हैं।

4. ट्यूमर दाखिल

नोट: प्रत्येक माउस 50 DMEM के μL मूत्राशय में रिक्त मीडिया में 1 एक्स 10 5 MB49-पीएसए कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया जाता है। कैथेटर में मृत अंतरिक्ष के कारण, हमेशा के लिए अतिरिक्त मात्रा (कम से कम 100 μL माउस प्रति अतिरिक्त) तैयार करें। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में Kasman एट अल द्वारा वर्णित एक हवा भरी सिरिंज का उपयोग करने के लिए किया जाएगा। 5 बल्कि एक भरा सिरिंज से।

  1. प्रकोष्ठों।
    1. आरोपण से पहले एक दिन, जब कोशिकाओं लगभग 80% मिला हुआ, मार्ग पूरा DMEM मीडिया में MB49-पीएसए ट्यूमर कोशिकाओं रहे हैं (10% FBS, 2 mmol / एल एल glutamine, 0.05 मिलीग्राम के साथ पूरक / एमएल पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 200 माइक्रोग्राम / एमएल hygromycin बी) 37 डिग्री सेल्सियस पर और 5% सीओ 2 1 के एक विभाजन के अनुपात में: 2।
    2. प्रक्रिया के दिन, उन्हें एक बाँझ सेल खुरचनी के साथ धीरे scraping द्वारा कोशिकाओं फसल। सेल निलंबन के बराबर मात्रा मिलाई औरएक 0.4% trypan नीले समाधान। एक hemocytometer का उपयोग जीवित कोशिकाओं की गणना करें। प्रत्यारोपण यदि कोशिकाओं के 20% से अधिक मर चुके हैं मत करो।
    3. आवश्यक (2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल) जीवित कोशिकाओं की राशि की गणना और उन्हें एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब को हस्तांतरण। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। DMEM खाली मीडिया में सेल गोली फिर से निलंबित। धोने तीन बार दोहराएँ आरोपण से पहले FBS के सभी निशान हटाने के लिए।
    4. जब तक चूहों आरोपण के लिए तैयार कर रहे हैं बर्फ पर सेल निलंबन रखें।
  2. 4 से 6 सप्ताह पुराने महिला C57BL / 6J चूहों प्रक्रिया से पहले एक सप्ताह के लिए जलवायु के अनुकूल बनाना करने की अनुमति दें। सभी जानवर काम बाँझ स्थिति बनाए रखने के लिए एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
    1. प्रत्येक माउस वजन और प्रति वजन के 10 ग्राम 0.1 एमएल संज्ञाहरण (75 मिलीग्राम / किग्रा ketamine और 1 मिलीग्राम / किग्रा medetomidine) इंजेक्षन intraperitoneally। Bodyweights 17 और 22 ग्राम के बीच होना चाहिए। कोई respo देख कर anesthetization की पुष्टिएनएसई एक पैर की अंगुली चुटकी के बाद।
    2. पहचान के लिए, कान एक कान पंच का उपयोग निशान।
    3. हाइड्रेशन के लिए 2 एच - प्रति वजन के 10 ग्राम हर 1 0.1 एमएल पर intraperitoneally हार्टमैन का समाधान या यौगिक सोडियम लैक्टेट इंजेक्षन।
    4. एक बाँझ कपास बल्ब का उपयोग कर दोनों आंखों के लिए बाँझ नेत्र मरहम लागू के बाद से निमिष पलटा संज्ञाहरण के तहत खो दिया है और आँखें बाहर सूखी। पुन: लागू जब आवश्यक है।
    5. एक गर्मी पैक (हवा के साथ संपर्क से सक्रिय) शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए के शीर्ष पर कागज तौलिए पर लापरवाह स्थिति में चूहों निर्धारित करना और नीचे पिछले पैरों टेप।
  3. एक उंगली के साथ, पेट के निचले हिस्से क्षेत्र के लिए कोमल दबाव लागू करते हैं और एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में मूत्राशय से मूत्र इकट्ठा। यह नमूना मूत्र पीएसए के बेसल मूल्य के रूप में कार्य करता है।
  4. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में बाँझ पाली एल लाइसिन (पीएलएल) वापस लेने और एक 24 गेज चतुर्थ कैथेटर देते हैं, सुई ख़ंजर से हटा दिया है। कैथेटर और इन की टिप करने के लिए स्नेहक लागू करेंसंदंश का उपयोग कैथीटेराइजेशन मार्गदर्शन करने के मूत्राशय में मूत्रमार्ग के माध्यम से कैथेटर ईआरटी। बंद करो जब प्रतिरोध महसूस किया है। नोट: शोधकर्ताओं intravesical instillations के लिए संवेदनाहारी और बाद प्रक्रिया दर्दनाशक दवाओं के उपयोग के साथ एक चिकनाई जेल के उपयोग के लिए जरूरत के बारे में उनकी पशु चिकित्सा कर्मचारियों के साथ चर्चा करनी चाहिए।
  5. पीएलएल के 50 μL टपकाना धीरे-धीरे, 10 μL हर 20 एस की दर से, vesico-भाटा ureteral 18 से बचने के लिए। एक डाट के साथ 20 मिनट के लिए छोड़ दें मूत्राशय में कैथेटर बाहर प्रवाह को रोकने के लिए।
  6. 20 मिनट के बाद, कैथेटर को हटाने और धीरे कम पेट क्षेत्र पर दबाव द्वारा किसी भी सामग्री के मूत्राशय खाली। एक खाली 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, कैथेटर के बाहर किसी भी शेष सामग्री को फ्लश।
  7. MB49-पीएसए कोशिकाओं pipetting द्वारा अच्छी तरह मिक्स और उन्हें एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में वापस ले लें। कैथेटर देते हैं और स्नेहक लागू होते हैं। 10 μL हर 20 एस की एक धीमी दर से 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं के 50 μL टपकाना। डाट पर बदलेंकैथेटर। चूहों पर नियंत्रण खारा के 50 μL दीजिए।
  8. 1 घंटे के बाद, कैथेटर को हटाने और किसी भी सामग्री के मूत्राशय खाली। पिछले पैरों पर टेप निकालें और उनके उदर पक्षों पर चूहों जगह है। प्रति वजन के 10 ग्राम 0.1 एमएल में उत्क्रमण दवा (1 मिलीग्राम / किग्रा atipamezole) इंजेक्शन लगाने subcutaneously द्वारा चूहों को जिला।
  9. चूहों पर नजर रखने के लिए जब तक गतिशीलता मनाया जाता है। अपने पिंजरों में चूहों लौटें।
  10. एक ट्यूमर का पता लगाने प्रोटोकॉल (वर्गों 5, 7, या 8), सीओ 2 का उपयोग चूहों euthanize के पूरा होने पर। पोस्टमार्टम ट्यूमर का पता लगाने धारा 6 में वर्णित है।

एलिसा के साथ 5. निगरानी ट्यूमर के विकास

ध्यान दें: ट्यूमर की उपस्थिति और विकास मूत्र में पीएसए के स्राव को मापने के द्वारा चूहों में नजर रखी है। शोधकर्ताओं ने पशुओं के स्वास्थ्य और भलाई के बाद ट्यूमर आरोपण और मानवीय समापन की निगरानी पर अपने पशु चिकित्सा कर्मचारियों के साथ परामर्श करना चाहिए।

  1. वहाँ चूहों से मूत्र इकट्ठा करने के लिए दो तरीके हैं।
    1. मल मूत्र सामग्री से अलग करने के लिए बनाया गया एक व्यक्ति चयापचय पिंजरे में एक माउस रखकर मूत्र रात भर लीजिए। सेट-अप प्रशीतन नहीं है, पीएसए के क्षरण को रोकने के लिए रात भर मूत्र संग्रह ट्यूब में एक protease अवरोध (100 μL) जोड़ें। हालांकि, उपलब्ध चयापचय पिंजरों की संख्या मूत्र संग्रह की इस पद्धति की उपयोगिता को सीमित करता है।
    2. यह कहाँ (जैसे ABSL2 कमरे के रूप में) चयापचय पिंजरों का उपयोग करने के logistically असंभव है, कम पेट क्षेत्र पर कोमल दबाव डालती है, जबकि चूहों कदम 4.2.1 में वर्णित के रूप में anesthetized हैं एक उंगली का उपयोग करके स्थान मूत्र इकट्ठा। यह आमतौर पर पहले चिकित्सा डाले है किया जाता है। हमारे अनुभव से, मूत्र की कम से कम 150 μL एकत्र किया जा सकता संज्ञाहरण के बाद 1 घंटे।
  2. तुरंत बर्फ पर एकत्र मूत्र जगह है। रक्तमेह ट्यूमर आरोपण के बाद दूसरे सप्ताह से दिख रहा हो सकता है। अति hemolyzed नमूने एलिसा विश्लेषण प्रभावित कर सकता है। इसलिए, मूत्रबर्फ पर रखा गया है और संग्रह के बाद जल्दी से कार्रवाई की जानी चाहिए।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 6700 XG पर मूत्र ट्यूबों अपकेंद्रित्र कोशिकाओं या मलबे को हटाने के लिए।
  4. चूहों के बीच मूत्र उत्पादन, विभाज्य में अंतर नए ट्यूबों में मूत्र मानक के अनुसार और एक परख किट 7 का उपयोग कर पीएसए एक एलिसा किट 7 का उपयोग और क्रिएटिनिन के लिए विश्लेषण प्रदर्शन कर जब तक -30 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें स्टोर करने के लिए। हालांकि चूहों पीएसए की उपज नहीं है, वहां गैर विशिष्ट के निम्न स्तर एलिसा का उपयोग कर पाया बाध्यकारी हैं। नमूने सकारात्मक विचार किया जा करने के लिए, सीमा सामान्य चूहों + 3 मानक विचलन (एसडी) 15 में से अधिक से अधिक मूल्यों पर स्थापित किया जाना चाहिए।

वास्तविक समय पीसीआर के साथ 6. का पता लगाने के ट्यूमर की उपस्थिति

  1. समाप्ति पर, माउस के उदर गुहा काटना और मूत्राशय का पता लगाने। मूत्राशय आबकारी एवं एक cryovial में जगह। तरल नाइट्रोजन में तुरंत रुक।
  2. एक शाही सेना extr में ऊतकों homogenizing द्वारा शाही सेना निकालेंकार्रवाई अभिकर्मक।
  3. धारा 2 में ऊपर वर्णित है, पीएसए के लिए रिवर्स प्रतिलेखन और वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण करते हैं।

प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ 7. निगरानी ट्यूमर के विकास

  1. एक निकट अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक 19 से 1 10 x 7 MB49-पीएसए कोशिकाओं लेबल।
  2. पुन: थाली और दिन 4, 7, 11, 14, 18 पर लेबल कोशिकाओं फसल, और 21 यदि कोशिकाओं को 20 प्रवाह cytometry द्वारा व्यवहार्यता और प्रतिदीप्ति बनाए रखने के लिए जाँच करें।
  3. धारा 4 में ऊपर वर्णित है, चूहों मूत्राशय में लेबल MB49-पीएसए कोशिकाओं के प्रत्यारोपण।
  4. एक प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करते हुए हर दो दिन में ट्यूमर के विकास को मॉनिटर।
  5. इमेजिंग के दिन, वजन और anesthetics ketamine के एक मिश्रण है और medetomidine (75 मिलीग्राम / किग्रा और 1 मिलीग्राम / किग्रा, क्रमशः), प्रति वजन के 10 ग्राम 0.1 एमएल पर intraperitoneally इंजेक्शन का प्रयोग चूहों anesthetize।
  6. पेट क्षेत्र दाढ़ी त्वचा को बेनकाब करने के लिए।
  7. इमेजिंग कक्ष में चूहों प्लेस और अधिग्रहणइमेजिंग प्रणाली के साथ प्रदान की सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मूत्राशय की छवियों।
  8. प्रति वजन के 10 ग्राम 0.1 एमएल में एक उलट दवा (1 मिलीग्राम / किग्रा atipamezole) इंजेक्शन लगाने subcutaneously द्वारा चूहों को जिला।

उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के साथ 8. निगरानी ट्यूमर के विकास

  1. चूहों में ट्यूमर प्रत्यारोपण, के रूप में धारा 4 में ऊपर वर्णित है।
  2. हर दो दिन, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग का उपयोग ट्यूमर के विकास की निगरानी।
  3. इमेजिंग के दिन, वजन और anesthetics ketamine के एक मिश्रण है और medetomidine (75 मिलीग्राम / किग्रा और 1 मिलीग्राम / किग्रा, क्रमशः), प्रति वजन के 10 ग्राम 0.1 एमएल पर intraperitoneally इंजेक्शन का प्रयोग चूहों anesthetize।
  4. पेट क्षेत्र दाढ़ी त्वचा को बेनकाब करने के लिए।
  5. मूत्राशय एक 24 गेज चतुर्थ कैथेटर का उपयोग करने में बाँझ 0.9% खारा के 100 μL टपकाना। खारा मूत्राशय फैलाना और अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के दौरान दृश्यता में सुधार होगा।
  6. अल्ट्रासाउंड मंच पर माउस प्लेस और एल के लिए प्रवाहकीय जेल लागूower पेट।
  7. त्वचा के लिए हाथ में जांच के निचले हिस्से और इमेजिंग मंच पर 21 मूत्राशय की बी मोड छवियों का अधिग्रहण।
  8. प्रति वजन के 10 ग्राम 0.1 एमएल subcutaneously इंजेक्शन उलट दवा (1 मिलीग्राम / किग्रा atipamezole) द्वारा चूहों को जिला।

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Representative Results

MB49 कोशिकाओं से पीएसए स्राव विकास मीडिया के साथ अलग अलग करने के लिए मिला था। क्योंकि इस वृद्धि पीएसए स्राव (चित्रा 1 ए) में यह परिणाम MB49-पीएसए DMEM मीडिया में उगाया जाता है। आदेश पीएसए एलिसा और वास्तविक समय पीसीआर की संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए, MB49-पीएसए स्रावित कोशिकाओं की संख्या अलग MB49 पैतृक कोशिकाओं के साथ मिलाया गया। पीएसए एलिसा, 1 एक्स 10 5 पीएसए स्रावित कोशिकाओं / 1 x 10 6 कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) की एक न्यूनतम का पता लगाता है, जबकि वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण 100 पीएसए स्रावित कोशिकाओं / 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं (चित्रा 1 सी) का पता लगाता है। इस प्रकार, वास्तविक समय पीसीआर एलिसा तुलना में अधिक संवेदनशील है, लेकिन यह केवल पूरे मूत्राशय पर प्रदर्शन किया जा सकता है। यह अंत बिंदु विश्लेषण करने के लिए इसकी उपयोगिता को सीमित करता है। कई ट्यूमर (2A चित्रा) मूत्राशय में विकसित करने में ट्यूमर आरोपण परिणामों के पीएलएल विधि। मूत्र का उपयोग चयापचय पिंजरों के दोनों रात भर संग्रह (चित्रा 2 बी (चित्रा 2 बी, कम पैनल) एलिसा द्वारा पीएसए को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सभी जानवरों के अध्ययन के लिए, माउस वजन स्वास्थ्य (चित्रा -2 सी, ऊपरी पैनल) के एक उपाय के रूप में विख्यात है, और मूत्र पीएसए एक साप्ताहिक आधार (चित्रा -2 सी, कम पैनल) ट्यूमर के विकास का एक उपाय के रूप में पर नजर रखी है। वहां आम तौर पर माउस वजन और ट्यूमर के आकार के बीच एक अच्छा संबंध है, के रूप में पीएसए के द्वारा मापा जाता है। बड़े ट्यूमर के साथ चूहे अपना वजन कम करने के लिए (चित्रा -2, चूहों 3 और 5) शुरू करते हैं। कुछ चूहों चित्रा -2 में मनाया एक बड़े ट्यूमर हो सकता है, लेकिन अभी भी एक सामान्य वजन प्रदर्शित करते हैं। इस प्रकार, अकेले वजन ट्यूमर के विकास के लिए पर्याप्त उपाय नहीं है। पीएसए ट्यूमर के विकास (चित्रा 3 ए-डी) का एक अच्छा किराए मार्कर के रूप में कार्य करता है। चूहे के बारे में 3 euthanized थे - 14 दिन पर पीएसए के लिए 5 दिन मूत्र विश्लेषण के बाद मूत्राशय पार वर्गों की छवियों ट्यूमर के आकार और इसी दिन 14 पीएसए / क्रिएटिनिन एक्स 10 6 इसकी वजह बताते हैंडिंग। ट्यूमर के आकार में बदलाव के उपचार चूहों प्राप्त करने के लिए संबंधित है। चित्रा 3, पैनल ई 3 अलग उपचार हथियारों से चूहों का प्रतिनिधित्व करते हैं। कोशिकाओं के पीएसए संशोधन के लिए एक वैकल्पिक रणनीति एक डाई के साथ कोशिकाओं की लेबलिंग है। इस रणनीति सेल परिवर्तन और चयन के लिए की आवश्यकता समाप्त। एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ MB49-पीएसए कोशिकाओं की लेबलिंग प्रदर्शन करने के लिए आसान (चित्रा 4 ए) है, और इन विट्रो निगरानी में संकेत के अस्तित्व के मामले में वादा दिखाया, सेल प्रतिकृति (चित्रा 4 बी और सी) के बावजूद। हालांकि, vivo इमेजिंग में सफल नहीं था, क्योंकि माउस चारा भी प्राकृतिक लाल प्रतिदीप्ति (चित्रा 4D) है, जो पेट क्षेत्र में गैर विशिष्ट प्रतिदीप्ति में हुई थी। एक तुलना अल्ट्रासाउंड इमेजिंग, पीएसए मूत्र स्राव, और पीएसए अंत बिंदु विश्लेषण के बीच किया गया था। मूत्राशय (चित्रा 5 ए-एच) के अल्ट्रासाउंड इमेजिंग की पहचान करने के लिए अच्छा थाबड़े ट्यूमर है, लेकिन यह छोटा सा ट्यूमर के साथ इतनी सफल नहीं था।

आकृति 1
चित्रा 1. MB49-पीएसए कोशिकाओं से पीएसए स्राव और पता लगाने सीमा एलिसा और वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण का उपयोग का निर्धारण। (ए) 1 एक्स 10 6 MB49-पीएसए कोशिकाओं की सतह पर तैरनेवाला में विभिन्न विकास मीडिया, और पीएसए स्राव में बड़े हो रहे थे 2 दिन बाद एलिसा द्वारा खोजा गया था। विकास मीडिया थे: RPMI FBS- (RPMI), प्रीमियम FBS (RPMI (पी)), RPMI एक वैकल्पिक FBS के साथ (RPMI (एच)) के साथ RPMI, और DMEM FBS के साथ (DMEM) के साथ। MB49-पीएसए कोशिकाओं DMEM मीडिया में उगाई उच्च पीएसए स्राव था। (बी) MB49-पीएसए कोशिकाओं (1 सेल के लिए 10 6 कोशिकाओं) पैतृक MB49 कोशिकाओं (1 10 6 कोशिकाओं के लिए सेल) के साथ मिलाया जाता है और 24 घंटे के लिए चढ़ाया गया। पीएसए एलिसा सतह पर तैरनेवाला पर प्रदर्शन किया गया था, और आरएनए कोशिकाओं से निकाला गया था। 1 एक्स 10 5 का एक न्यूनतम 6 कोशिकाओं एलिसा द्वारा पहचाने जाने थे। (सी) 100 पीएसए स्रावित कोशिकाओं / 1 x 10 6 कोशिकाओं वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण द्वारा detectable थे। वाई अक्ष मूल्यों मतलब RQ (सापेक्ष मात्रा का ठहराव) ± मानक विचलन प्रतिनिधित्व करते हैं। RQ मूल्यों रिश्तेदार गुना परिवर्तन, बीटा actin के जीन को पीएसए के सी टी मूल्यों को सामान्य बनाने के द्वारा प्राप्त की और एक नियंत्रण मूत्राशय जो 1 पर सेट किया जाता है के साथ तुलना में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. मूत्राशय ट्यूमर के विकास और जांच। (ए) एक मूत्राशय 13 दिन ट्यूमर आरोपण के बाद के histological परीक्षा। आयल एम्बेडेड मूत्राशय sectioned किया गया था और hematoxylin (गहरे नीले रंग की) है, जो स्टेशन के साथ दागनाभिक इन, और eosin (गुलाबी) है, जो शेष सेलुलर घटकों दाग। पीएसए / क्रिएटिनिन दिन 5 और 13 पर इस मूत्राशय के लिए एक्स 10 6 मूल्य 7/2688 के रूप में दिखाया जाता है। बढ़ाई 44.8X पर है। पैमाने पर पट्टी 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) के मूत्र चयापचय पिंजरों में या तो रखने चूहों द्वारा रात भर एकत्र किया गया था और 2 मिलीलीटर ट्यूब (ऊपरी पैनल) या में संग्रह ट्यूब से मूत्र के हस्तांतरण से मौके पर ही मूत्र संग्रह 1.5 एमएल ट्यूबों में anesthetized चूहों (कम पैनल) से है, जो तब 0.6 एमएल ट्यूबों के लिए स्थानांतरित कर दिया गया। (सी) ट्यूमर आरोपण के बाद, चूहों के वजन में दो बार साप्ताहिक (ऊपरी पैनल) नजर रखी थी। मूत्र पीएसए ट्यूमर आरोपण और चूहों में वृद्धि (कम पैनल) की निगरानी के लिए मापा गया था। वाई अक्ष पीएसए / बनाने की प्रक्रिया मूत्र पीएसए क्रिएटिनिन एक्स 10 6 के लिए सामान्यीकृत प्रतिनिधित्व करता है। चूहे एक बार समाप्त किया गया bodyweight के 20% से अधिक का नुकसान हुआ था। नोट: पीएसए जीन अभिव्यक्ति, 40 दिन में माउस 2 के मूत्राशय में पता चला था जब यह termi था NATed, भले ही यह कम मूत्र पीएसए था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. पीएसए और मूत्राशय ट्यूमर के विकास। (ई) 19 दिन (ए और बी) पर काटा चूहों मूत्राशय, दिन 17 (सी) और ट्यूमर आरोपण के बाद दिन 13 (डी) के histological वर्गों। 4 दिन और 13 दिन या 14 दिन मूत्र पीएसए / क्रिएटिनिन प्रत्येक मूत्राशय के लिए एक्स 10 6 मूल्यों प्रारूप दिन में प्रत्येक छवि के दाईं ओर दिखाया गया है 4 / दिन 13 या 14. मूत्र पीएसए / क्रिएटिनिन मूल्यों ट्यूमर के आकार को बढ़ाने के साथ । छवियों ईस्वी में चूहों में ट्यूमर आकार मतभेद के लिए लेखांकन विभिन्न उपचारों प्राप्त किया। बढ़ाई 41.4X पर है। पैमाने पर पट्टी 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है।"Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55078/55078fig3large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. एक फ्लोरोसेंट रंजक के साथ लेबल MB49-पीएसए प्रकोष्ठों की प्रोफाइल। (ए) दाग कोशिकाओं cytometry चढ़ाना पहले प्रवाह से विश्लेषण किया गया। लेबल की कोशिकाओं फ्लोरोसेंट डाई की तीव्रता का विश्लेषण करने के लिए हर कुछ दिनों काटा गया। (बी) लेबल MB49-पीएसए कोशिकाओं के p2 के फाटक के भीतर (ए) से निर्दिष्ट दिनों बाद लेबलिंग पर प्रतिशत। (सी) फ्लोरोसेंट मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) द्वारा मापा संकेत की डाई की तीव्रता। (डी) चूहों 10 दिनों एक vivo इमेजिंग प्रणाली का उपयोग लेबल MB49-पीएसए कोशिकाओं के साथ आरोपण के बाद की छवियाँ पेट क्षेत्र में गैर विशिष्ट प्रतिदीप्ति दिखाया।यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. Murine Bladders की अल्ट्रासाउंड छवियों। चूहे मूत्राशय (ए) ट्यूमर आरोपण और (बी) के 8 दिन ट्यूमर आरोपण के बाद से पहले। (ग) से (एच) चूहों के अल्ट्रासाउंड छवियों आरोपण के बाद दो सप्ताह Bladders हैं। पीएसए / बनाने की प्रक्रिया: मूत्र पीएसए क्रिएटिनिन के लिए सामान्यीकृत (10 6)। पीएसए जीन: मूत्राशय (लॉग RQ) में पीएसए के जीन की अभिव्यक्ति प्रत्येक मूत्राशय के लिए दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मूत्र पीएसए प्रतिदीप्ति इमेजिंग अल्ट्रासाउंड इमेजिंग
कदम (समय) की आवश्यकता चूहों anesthetize।
110 μL मूत्र लीजिए। (~ 1 ज)
पीएसए एलिसा (कुल ऊष्मायन समय: 2 घंटे 30 मिनट) निष्पादित करें
क्रिएटिनिन परख (ऊष्मायन समय: 5 मिनट) 		चूहों anesthetize।
पेट क्षेत्र पर फर दाढ़ी।
इमेजिंग प्रदर्शन। 		चूहों anesthetize।
पेट क्षेत्र पर फर दाढ़ी।
कैथीटेराइज़ और मूत्राशय में खारा के 100 μL टपकाना।
प्रवाहकीय जेल पेट के निचले हिस्से और अल्ट्रासाउंड छवियों को प्राप्त करने के लिए लागू करें।
विशेष उपकरणों एलिसा प्लेट पाठक (450 एनएम और 510 एनएम के तरंग दैर्ध्य में) इमेजिंग प्रणाली अल्ट्रासाउंड इमेजिंग प्रणाली
ट्यूमर कोशिकाओं का संशोधन requirएड (व्यक्त पीएसए) आवश्यक (प्रतिदीप्ति) की जरूरत नहीं है
फायदे विश्वसनीय सरल और त्वरित बड़े ट्यूमर का पता लगा सकते हैं
सीमाओं पर्याप्त मूत्र नहीं मिल सकता है
नकारात्मक मान ट्यूमर की अनुपस्थिति (पीएसए जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण संवेदनशीलता बढ़ जाती है, लेकिन अंत बिंदु विश्लेषण करने के लिए सीमित है) मतलब यह नहीं है 		प्रतिदीप्ति डाई का चयन सावधानी से उच्च पृष्ठभूमि को रोकने की जरूरत है। छोटे ट्यूमर का पता नहीं लगा सकते हैं।
एक बार में एक माउस।

तालिका 1. माउस Bladders में ट्यूमर के विकास को निगरानी के लिए तरीकों की तुलना करें।

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Discussion

1) सफलतापूर्वक सेल लाइन के tumorigenicity को बनाए रखने के प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं; 2) चूहों में ट्यूमर सेल आरोपण से पहले दर्जे का पीएसए स्राव सुनिश्चित करना; 3) के रूप में तो ट्यूमर के आकार में भिन्नता को कम करने के आरोपण के लिए एक एकल कोशिका निलंबन पैदा; और 4) गुर्दे में ट्यूमर सेल आरोपण, जिसके परिणामस्वरूप vesico-ureteral भाटा को रोकने के लिए एक धीमी दर पर कोशिकाओं instilling।

इन विट्रो में लंबे समय तक पारित होने के बाद, MB49 / MB49-पीएसए कोशिकाओं के रूप में अपनी असमर्थता द्वारा प्रदर्शन चूहों में ट्यूमर का उत्पादन करने के लिए उनके tumorigenicity खो सकते हैं। यह एक confounding कारक हो सकता है या नहीं, के रूप में चूहों उपचार के बाद ठीक हो रहे हैं। ट्यूमर के अभाव में, यह बिल्कुल immunogenic ट्यूमर के कारण या कोई ट्यूमर के साथ चूहों से अनायास ठीक चूहों से चिकित्सा द्वारा इलाज चूहों को अलग करने के लिए है क्योंकि सेल लाइन ट्यूमर के रूप में करने में असमर्थ है संभव नहीं है। एक तरह से यह मुकाबला करने के लिए फिर से पारित होने के लिए सु का निर्माण करके चूहों में कोशिकाओं हैबी-त्वचीय ट्यूमर। यह फिर से passaging भी अक्सर किया जाता है, तो पीढ़ी आक्रामक ट्यूमर उत्पन्न कर रहे हैं। एक अच्छा संतुलन का निर्धारण करने के लिए जब कोशिकाओं को फिर से passaged करने की आवश्यकता की जरूरत है। आम तौर पर, प्रयोगों की एक बड़ी श्रृंखला से पहले, सेल लाइन को पुनर्जीवित किया जाता है और उसके बाद चूहों में प्रत्यारोपित subcutaneously ट्यूमर फार्म के लिए उनकी क्षमता की पुष्टि करें। ट्यूमर कई हफ्तों के लिए निगरानी कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए कोई सहज इलाज कर रहे हैं। हालांकि, अगर सहज इलाज मनाया जाता है, तो चरण 3 में प्रोटोकॉल प्रदर्शन किया जाना चाहिए। इसी तरह, MB49-पीएसए कोशिकाओं की क्षमता पीएसए निर्माण करने के लिए हमेशा पहले कोशिकाओं ट्यूमर आरोपण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं पुष्टि की जानी चाहिए।

मूत्र पीएसए MB49-पीएसए कोशिकाओं का उपयोग कर स्थापित मूत्राशय ट्यूमर के विकास पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, एक नकारात्मक या "सामान्य" मूत्र पीएसए मूल्य जरूरी ट्यूमर कोशिकाओं की अनुपस्थिति का मतलब यह नहीं है, लेकिन केवल कम से कम 1 x 10 5 कोशिकाओं में मौजूद हैं। मूत्र पीएसए 4 दिन के आसपास के रूप में चुना गया है7 दिन के लिए, चूहों कोई ट्यूमर दिखाई देते हैं, के सामान्य चूहों + 3 एसडी मूल्य के आधार पर, प्रयोग से हटाया जा सकता है। इन चूहों में से कुछ एक बाद की तारीख में एक ट्यूमर विकसित हो सकता है। कोई ट्यूमर के साथ चूहों को हटाने सुनिश्चित करता है कि ट्यूमर किसी भी चिकित्सा शुरू होने से पहले आकार में बहुत समान हैं। इस थेरेपी के जवाब में ट्यूमर के आकार के कारण भिन्नता कम कर देता है। ट्यूमर के आकार भिन्नता का एक प्रमुख कारण आरोपण से पहले कोशिकाओं के clumping है, तो प्रयासों फिर से निलंबित आरोपण से पहले कोशिकाओं के लिए किया जाना चाहिए।

हालांकि, जब चूहों की कम संख्या का उपयोग किया जाता है, यह आवश्यक अध्ययन में सभी चूहों को रखने के लिए, भले ही ट्यूमर दिन 4 से औसत दर्जे का नहीं हो सकता है - 7. 11 दिन पर पीएसए निगरानी करके, यह अभी भी इन वर्गीकृत करने के लिए संभव हो सकता है छोटे ट्यूमर था, और अंत बिंदु विश्लेषण प्रारंभिक ट्यूमर के आकार (- 7 11 दिन बनाम दिन 4 पर औसत दर्जे का मूत्र पीएसए की उपस्थिति के आधार पर) के लिए सम्मान के साथ किया जा सकता है के रूप में चूहों। ट्यूमर यों करने में सक्षम होने का लाभअलग पीएसए मूल्यों के साथ कि सभी चूहों को अध्ययन में शामिल किया जा सकता है, और चिकित्सा के जवाब मूल ट्यूमर के आकार के संबंध में उनकी पीएसए / क्रिएटिनिन मूल्यों के आधार पर निर्धारित किया जा सकता है। चिंता का एक अन्य बिंदु vesico-भाटा ureteral है। यह गुर्दे में ट्यूमर के विकास में परिणाम कर सकते हैं। मात्रा 100 μL से 50 μL के लिए डाले जा करने के लिए कम करने और टपकाना प्रदर्शन धीरे-धीरे होने वाली इस की संभावना कम कर देता है।

मूत्र आधारित assays के साथ जुड़े एक समस्या कम मूत्र संग्रह के रूप में मनाया ओर्थोटोपिक ट्यूमर मूत्राशय में हो जाना है। मूत्र आसानी से आरोपण के बाद पहले कुछ हफ्तों के दौरान चूहों से एकत्र किया जा सकता है, जबकि समय के साथ, एकत्र पीएसए और क्रिएटिनिन मापन के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता मूत्र की मात्रा। मूत्र की न्यूनतम मात्रा की जरूरत 110 μL है, लेकिन अधिक बेहतर है। इस प्रकार, पीएसए रीडिंग बाद में समय बिंदुओं पर सभी चूहों के लिए उपलब्ध नहीं हो सकता है। इसके अलावा, मूत्र में लाल रक्त कोशिकाओं के सेल झूठा देता हैपीएसए एलिसा पर उच्च पढ़ने। एक गैर-मूत्र आधारित परख इस समस्या को दूर कर सकता है। दुर्भाग्य से, हालांकि प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग करने के लिए सरल है, हमने पाया है कि माउस चारे के रूप में अच्छी तरह से लाल प्रतिदीप्ति था। यह एक उच्च पृष्ठभूमि के खिलाफ जो मूत्राशय आसानी से नहीं देखा जा सकता दे दी है। यह रूप में स्वीनी एट अल द्वारा वर्णित है कि एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट डाई या प्रोटीन का उपयोग कर इस समस्या को दूर कर सकते हैं, संभव है। 10 दोनों प्रतिदीप्ति और अल्ट्रासाउंड के लिए, चूहों उदर की सतह पर मुंडा किए जाने की जरूरत है।

अल्ट्रासाउंड छवियों ट्यूमर का पता लगाने में पीएसए जीन अभिव्यक्ति के रूप में अच्छा होना दिखाई देते हैं। हालांकि, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग का नुकसान यह है कि मूत्राशय अच्छा ट्यूमर दृश्य पाने के लिए इमेजिंग के दौरान distended किया जाना चाहिए। छवियों स्पष्ट कर रहे हैं, वहीं जब मूत्राशय ट्यूमर बड़ी है, यह ट्यूमर के अभाव से चूहों में छोटे ट्यूमर में अंतर करना मुश्किल है। यह बताया गया है कि अल्ट्रासाउंड ट्यूमर व्यास 22 में चारों ओर 1.5 मिमी पता लगा सकते हैं, लेकिन 4 दिनआरोपण के बाद, ट्यूमर इस से बहुत छोटे होते हैं। इस प्रकार, इस विधि के दिन पर ट्यूमर का पता लगाने के लिए अच्छा नहीं हो सकता 4. तालिका 1 3 अलग ट्यूमर निगरानी प्रणाली तुलना; पीएसए एलिसा सरलतम का उपयोग करने के लिए है और छोटे पशु इमेजिंग सिस्टम है, जो सभी पशु सुविधाएँ उपलब्ध नहीं हो सकता की आवश्यकता नहीं है।

पीएसए जीन अभिव्यक्ति की वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण के अधिक से अधिक संवेदनशीलता को देखते हुए यह पुष्टि करने के लिए कि क्या चूहों जब प्रयोग समाप्त हो गया था ठीक हो रहे थे immunohistochemistry के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता है। Immunohistochemistry के साथ, 0.2 का एक ट्यूमर - 0.3 मिमी आरोपण के बाद 15 दिन में 4 से detectable है। बहरहाल, यह एक अंत बिंदु विश्लेषण विधि है कि ट्यूमर आरोपण निगरानी के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। इस अध्ययन में, एमआरआई मूल्यांकन नहीं किया गया था, लेकिन यह आरोपण 8 के बाद 10 दिन से ट्यूमर की उपस्थिति की पहचान करने में सक्षम होने की सूचना दी गई है। कोशिकाओं को संशोधित करने के लिए हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP), यह मैं व्यक्त करने के द्वारासंभव है 7. दिन से ट्यूमर आरोपण पुष्टि करने के लिए जल्दी मूत्र पीएसए का एक संयोजन का पता लगाने के समाप्ति पर ट्यूमर आरोपण और वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण ट्यूमर आरोपण और अलग उपचार समूहों के बीच चिकित्सीय प्रभावकारिता की पुष्टि प्रदान करता है।

हमारे प्रोटोकॉल का एक दोष मुख्य रूप से है कि एलिसा परख ट्यूमर की उपस्थिति की पुष्टि नहीं कर सकते मौजूद कोशिकाओं की संख्या कम से कम 10 5 कोशिकाओं है जब है। इस प्रकार अधिक संवेदनशील assays तेजी assays समय पीएसए का पता लगाने के लिए की जरूरत को कम करने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विकसित किए जाने की जरूरत है। एलिसा कई घंटे लगते हैं करने के लिए। एक त्वरित तरीका क्रिएटिनिन परख जो Jaffe विधि 23 पर आधारित है और बहुत ट्यूमर के विकास की निगरानी को आसान बनाने में अच्छा प्रदर्शन करने के बारे में 5 मिनट लगते हैं के रूप में इस तरह के। यह अंत करने के लिए, पीएसए गतिविधि का पता लगाने के लिए एक एंजाइम आधारित पद्धति मूल्यांकन किया गया था, लेकिन यह सफल नहीं था। कोलाइडयन सोने और nanoparticle आधारित परख प्रणाली के उपयोग के समय परख एक प्रदर्शन करने के लिए ले जाया सकता है कमएन डी संवेदनशीलता 24 वृद्धि हुई है। इस संबंध में इलेक्ट्रोड आधारित सेंसर और विद्युत आधारित सेंसर नैनोकणों का उपयोग मानव पीएसए 25-27 परख करने के लिए विकसित किया गया है और लागत पशु मॉडल को लागू किया जा सकता है अगर उचित। परख प्रणाली को भी इस तरह के GFP या luciferase जहां परख नहीं बल्कि vivo इमेजिंग जो ऊतक oxygenation पर निर्भर है पर निर्भर करता है की तुलना में इन विट्रो में इष्टतम शर्तों के तहत किया जाता है के रूप में एक अलग प्रोटीन का स्राव प्रणाली का उपयोग करके सुधार किया जा सकता है।

जबकि चूहों में रासायनिक कैंसरजनन म्यूटेशन 28 के संदर्भ में मानव कैंसर के लिए समानता के साथ ट्यूमर को उत्पन्न करता है, वे उत्पादन करने के लिए लंबे समय तक लेने और जानवरों के बीच आकार में के रूप में तुलना नहीं कर रहे हैं, चूहों जो प्रयोग की लागत बढ़ जाती है की बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है। जब लक्षित कर मानव प्रोटीन को पहचानने एजेंटों मूल्यांकन किया जाना है, मानव xenografts नग्न या गंभीर संयुक्त इम्यूनो में subcutaneously प्रत्यारोपित(एस.सी.आई.डी) चूहों एकमात्र विकल्प है। हालांकि इन मॉडलों एंटीबॉडी मान्यता की अवधारणा के सबूत उपलब्ध कराने, एक अक्षुण्ण प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी प्रतिरक्षा सक्रियण के आकलन hinders। मानव xenografts 29 का उपयोग कर मूत्राशय के कैंसर के लिए एक humanized माउस मॉडल का हाल ही में विकास, कुछ प्रतिरक्षा अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, लेकिन रूप में कोशिकाओं को प्रत्यारोपित कर रहे हैं subcutaneously यह वास्तव में मानव रोग पर्यावरण पुनरावृत्ति नहीं है। यह तकनीकी रूप से प्रतिरक्षा कमी चूहों में ट्यूमर ओर्थोटोपिक के उत्पादन के लिए मुश्किल है। इस प्रकार अपनी सीमाओं के बावजूद syngeneic ओर्थोटोपिक मॉडल अभी भी आकलन और चिकित्सा के विकास के मूत्राशय के कैंसर के लिए के लिए एक अच्छा मॉडल है, क्योंकि यह नैदानिक ​​स्थिति और मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने की क्षमता मॉडलिंग उपचार के लिए नियंत्रित जोखिम को सक्रिय करने के लिए सही ऊतक स्थान प्रदान करता है कैंसर के उपचार के दौरान। यह सब चूहों में तेजी से ट्यूमर के विकास और एक लागत प्रभावी मॉडल में ट्यूमर के विकास को परिणाम की निगरानी करने की क्षमता के साथ संयुक्त।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
MB49-PSA cells N/A N/A ref (Wu QH, 2004)
RPMI 1640 media HyClone SH30027.01 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media Biowest L0102
Fetal Bovine Serum (FBS) South American Biowest S1810
Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium Biowest S181B
Fetal Bovine Serum (FBS) HyClone SH30088.03 
L-glutamine Biowest X0550
Penicillin-Streptomycin Biowest L0022
Hygromycin B Invitrogen 10687-010
free PSA (Human) ELISA kit Abnova KA0209
TRIzol Reagent for RNA extraction  Ambion 15596026
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor Applied Biosystems 4374967
TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb Applied Biosystems 4331182 Mm00607939_s1
TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 Applied Biosystems 4331182 Hs00426859_g1
C57BL/6J female mice In Vivos 4 - 6 wk old
Anesthesia (75 mg/kg Ketamine and 1 mg/kg Medetomidine) Local pharmacy
Reversal drug (1 mg/kg Atipamezole) Local pharmacy
Ear punch Electron Microscopy Sciences 72893-01
Hartmann's solution or Compound sodium lactate B Braun
Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointment Alcon
Heat pack - HotHands handwarmers Heatmax Inc
Introcan Certo IV catheter B Braun 4251300 24 G x 3/4″
Aquagel Lubricating jelly Local pharmacy
Poly-L-lysine solution, 0.01%, Sigma P4707
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001
Quantichrom Creatinine Assay Kit BioAssay Systems DICT-50 
Fluorescent dye - VivoTrack 680 Perkin Elmer NEV12000 
RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution Ambion 4427575
Name Company Catalog number Comments
Equipment and Software
7500 Realtime PCR System Applied Biosystems
7500 Software v2.3 Applied Biosystems
Metabolic Cage Tecniplast  Vertical type rack for 12 cages
BD FACSCanto I system  BD Biosciences
BD FACSDiva software v7 BD Biosciences
IVIS SpectrumCT in vivo imaging system  Caliper Life Sciences 
Living Image Software v3.1 Caliper Life Sciences 
Vevo 2100 imaging system  VisualSonics 

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References

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कैंसर रिसर्च अंक 119 मूत्राशय ट्यूमर चूहों ओर्थोटोपिक मॉडल का पता लगाने मूत्र
एक murine Orthotopic मूत्राशय ट्यूमर मॉडल और ट्यूमर का पता लगाने प्रणाली
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Tham, S. M., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System. J. Vis. Exp. (119), e55078, doi:10.3791/55078 (2017).

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