Summary
Detta protokoll beskriver generering av murina orthotopic tumörer i urinblåsan i C57BL / 6J möss och övervakning av tumörtillväxt.
Abstract
Detta protokoll beskriver generering av tumörer i urinblåsan i C57BL / 6J möss med användning av murina blåscancer cellinje MB49, som har modifierats för att utsöndra human prostataspecifikt antigen (PSA), och förfarandet för bekräftelse av tumörimplantation. I korthet, möss bedövades med användning av injicerbara läkemedel och är gjorda för att lägga i den dorsala läget. Urin utryms från urinblåsan och 50 mikroliter av poly-L-lysin (PLL) långsamt instilleras med en hastighet av 10 mikroliter / 20 s med användning av en 24 G IV kateter. Det är kvar i blåsan under 20 min genom att stoppering katetern. Katetern avlägsnas och PLL är tomt med lätt tryck på blåsan. Detta följs av instillation av den murina blåscancer-cellinjen (1 x 10 5 celler / 50 | il) vid en hastighet av 10 | il / 20 s. Katetern är tillsluten för att förhindra för tidig evakuering. Efter 1 h mössen återupplivas med en återföring drog, och urinblåsan är utrymd. Den långsamma instillahastigheten är viktig,eftersom det minskar Vesico-uretär reflux, vilket kan orsaka tumörer att förekomma i de övre urinvägarna och i njurarna. Cellinjen bör vara väl återsuspenderas för att minska hopklumpning av celler, eftersom detta kan leda till ojämna tumörstorlekar efter implantation.
Denna teknik inducerar tumörer med hög effektivitet. Tumörtillväxten övervakas genom urin PSA utsöndring. PSA markör övervakning är mer tillförlitliga än ultraljud eller fluorescens avbildning för detektion av närvaron av tumörer i urinblåsan. Tumörer i möss når i allmänhet en maximal storlek som negativt påverkar hälsan med ca 3-4 veckor om de lämnas obehandlade. Genom att övervaka tumörtillväxt, är det möjligt att differentiera möss som botades från dem som inte var framgångsrikt implanteras med tumörer. Med bara slutpunkten analys kan den senare felaktigt antas ha blivit botade genom terapi.
Introduction
Målet med denna metod är att generera murina orthotopic tumörer i urinblåsan och för att övervaka de implanterade tumörerna så exakt som möjligt, så att möss utan tumör implantation inte tros ha blivit botade vid slutpunkten analys. Övergripande, den metod som visas kommer att minska behovet av ett stort antal möss för experimentell analys och säkerställer större noggrannhet vid bestämning av terapeutiska resultat.
Utvecklingen av en orthotopic modell för cancer är viktigt, eftersom implanterar tumörceller subkutant inte rekapitulera miljön i klinisk sjukdom eller möjliggöra utveckling av terapeutiska strategier. Arkitekturen av blåsan tillåter instillation av blåscancerterapier direkt in i urinblåsan med minimala systemiska effekter. Således, djurmodeller som rekapitulera denna miljö, såsom en orthotopic modell är viktigt att utvärdera nya terapier. Slutsatserna från en försöksuppställningen är dependent på de begränsningar av modellen.
Flera tekniker har utvecklats för produktion av orthotopic blåstumörer i möss. Dessa är beroende av att skada glykosaminoglykan skiktet i urinblåsan, vilket möjliggör tumörceller som skall implanteras. De tekniker som används inkluderar diatermi, vilket resulterar i en enda punkt av skada i blåsväggen, vilket leder till tumörutveckling vid en plats i blåsan 1,2. Dock är andelen framgångsrika tumörimplantation använder diatermi operatörsberoende varierar från 10 till 90%, och det innefattar risken att blåsväggen kommer att punkteras, vilket leder till tumörer utvecklas i bukhålan. Kemisk diatermi utförs med hjälp av silvernitrat, som skadar blåsväggen 3. På liknande sätt har syra använts för att skada blåsväggen 4. Trypsin har också använts för att skada urinblåsan samt 5. Dessa metoder kan resultera i utvecklingen av mer än en tumör i urinblåsan.Dessutom finns det en risk för allvarliga skador på urinblåsan, om kemikalierna är kvar i kontakt med blåsväggen för länge. Den metod som utvecklats av Ninalga et al. använder den positivt laddade poly-L-lysin (PLL) 6 molekyler till belägga blåsväggen; detta möjliggör de negativt laddade tumörcellerna att hålla sig till glykosaminoglykanen skiktet av blåsan. Denna metod resulterar i allmänhet i mer än en tumör utvecklas i urinblåsan, men tumörimplantation är 80-100% 4,7. Tekniskt sett är det också det enklaste förfarandet att utföra. För att säkerställa att de tumörer som utvecklar är ganska jämn i storlek, är det viktigt att tumörcellerna inte är grupperade i stora klumpar innan implantation.
För att utvärdera den terapeutiska effektiviteten, är det bäst att utföra denna studie på möss med ganska liknande storlek tumörer. Således är det viktigt ett bra detekteringssystem som kan kvantifiera tumörstorlek snart efter implantation. Flera strategier har been används för att utvärdera tumörer. Dessa inkluderar magnetisk resonanstomografi (MRI) 8-10, fluorescens 11, bioluminescens 12,13, ultraljud 14, och enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) 15,16. Medan MRI och ultraljud inte kräver ändringar av tumörcellerna, det finns ett behov av känslig utrustning och kontrastmedel för MRI. De fluorescence-, luminescence-, och ELISA-baserade analyser kräver modifiering av tumörcellerna för att uttrycka markörproteiner som kan detekteras med dessa metoder. För luminescens, är ett substrat som krävs för detektion av luciferas-aktivitet; således finns det en extra steg och ökad kostnad. Både luminiscens och fluorescens kräver specialutrustning. För att producera fluorescens, grönt fluorescerande protein (GFP) cyklisering, som katalyseras av molekylärt syre, som krävs. Sålunda kan GFP uttryck variera inom en tumörmassa beroende på tillgång till syre, vilket gör detta en ganska opålitlig markör
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur arbete anslutit sig till Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) riktlinjer för användning djur och hantering (Protokollnummer 084/12) vid National University of Singapore.
1. Växande MB49-PSA celler in vitro och mäta PSA utsöndring
- Bibehålla murina blåscancerceller MB49-PSA 15 i fullständigt Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mmol / L L-glutamin, och 0,05 mg / ml penicillin-streptomycin i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2. Tillsätt 200 | j, g / ml Hygromycin B för att upprätthålla selektionstrycket av PSA-utsöndrande celler.
- Att bestämma PSA sekretion, platta 1 x 10 6 celler i en 6-brunnars odlingsplatta och inkubera den vid 37 ° C i närvaro av 5% CO2 under 48 timmar.
- Två dagar senare uppsamlades den överstående vätskan för PSA-mätning.
- Med hjälp av en pasteurpipett, överföra supernatant till ett 15 ml centrifugrör.
- Centrifugera i 5 min vid 250 xg för att avlägsna flytande celler och skräp. Om PSA-analysen utförs på en annan dag, lagra supernatanten vid - 30 ° C i en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Om inte, gå vidare till nästa steg omedelbart.
- Bestäm PSA koncentrationen med hjälp av en mänsklig fritt PSA ELISA-kit 7.
- Räkna upp de strukna cellerna.
- Med användning av en pasteurpipett, tvätta cellerna försiktigt med 1 ml DMEM. Sug och helt ta bort media.
- Tillsätt 1 ml färskt medium och skrapa försiktigt med en cellskrapa för att lösgöra cellerna från brunnen.
- Överföra celler till ett mikrocentrifugrör och återsuspendera dem grundligt för att säkerställa en enkel-cellsuspension.
- Blanda lika volymer av cellsuspension och en 0,4% lösning av trypanblått. Räkna levande celler (som inte tar upp färgämnet) med hjälp av en hemocytometer.
- Beräkna PSA-uttryckning som ngPSA / ml media / 10 6 celler. PSA uttrycket av MB49-PSA-celler för implantation i möss är 80-120 ng / ml / 10 6 celler.
2. Fastställande av känslighet av PSA-mätningar med ELISA och i realtid PCR-analys
- Plate MB49-PSA-celler i komplett DMEM media i en 6-brunnsodlingsplatta med olika mängder av föräldra MB49 celler så att det är maximalt 1 x 10 6 celler per brunn (dvs 10 0, 10 1, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5 eller 10 6 MB49-PSA-celler odlas med 10 6, 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1, eller 10 0 MB49-celler, respektive).
- En dag senare, samla supernatanten för PSA mätning, som beskrivs i steg 1,3. Bestäm PSA koncentrationen med hjälp av en mänsklig fritt PSA ELISA-kit 7.
- Extrahera RNA från cellerna.
- lyseraceller direkt i plattan genom att lägga till 1 ml av RNA-extraktion reagens.
- Inkubera under 5 min vid rumstemperatur och överföra cellysatet till ett mikrocentrifugrör. Tillsätt 0,2 ml kloroform och skaka proven kraftigt i 15 sekunder. Inkubera dem i 3 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifugera proverna vid 12.000 xg under 15 min vid 4 ° C. Försiktigt överföra den övre vattenhaltiga fasen (0,5 ml) till ett nytt rör utan att störa interfasen.
- Tillsätt 0,5 ml isopropylalkohol. Inkubera i 10 min vid rumstemperatur. Centrifugera proverna vid 12.000 xg under 10 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten fullständigt, utan att störa RNA fällningen vid botten av röret.
- Tvätta pelleten en gång med 1 ml 75% etanol. Centrifugera vid 7500 xg under 5 min vid 4 ° C. Avlägsna all etanol och tillåta pelleten lufttorka i 10 min.
- Upplösa RNA i 30 pl nukleasfritt vatten. Inkubera under 5 min vid 60 ° C för att öka den sålubility.
- Kvantifiera RNA genom mätning av absorbansen med användning av ultraviolett (UV) -spektroskopi vid 260 nm (A260). För att bedöma RNA renhet, mät absorbansen vid 280 nm (A280) och beräkna A260 / A280 förhållande som bör vara över 1,6.
- Omvänd-transkribera cDNA från två mikrogram av RNA.
- Förbered reaktionsblandningen på is och överför den till 0,2 ml rör.
- centrifugera kort rören att snurra ner innehållet och för att eliminera luftbubblor.
- Ladda i rören i termocyklern och utför omvänd transkription vid följande betingelser: 60 minuter vid 37 ° C följt av 5 min vid 95 ° C. När körningen är färdig, att hålla de cDNA-prover vid 4 ° C.
- Lagra proverna vid - 30 ° C under långtidsförvaring.
- Utför en realtids-PCR-analys för PSA och cytoplasmisk beta aktin. Beta aktin används för att normalisera proven. Utföra analysen på 100 ng av omvänt-transkriberat RNA i en 96-brunnars plate. Analysera alla prover i tre exemplar. Utföra 40 cykler med följande parametrar: 2 min vid 50 ° C, 10 min vid 95 ° C, 15 s vid 95 ° C för denaturering, och en minut vid 60 ° C. Ställ in lägsta detektionsgränsen vid en cykel tröskel (CT) av 35; Således är varje prov med en CT värde utöver 35 anses inte upptäckas.
3. Att bibehålla tumorigeniciteten av MB49-PSA cellinje
OBS: Långvarig tillväxt in vitro leder till en förlust av tumörbildning. För att upprätthålla tumorigenicitet är MB49-PSA-cellinje passe genom musen åtminstone en gång var 2 år.
- Celler.
- Harvest exponentiellt växande celler genom att skrapa dem försiktigt med en steril cellskrapa. Blanda lika volymer av cellsuspension och en 0,4% lösning av trypanblått. Räkna de levande celler med användning av en hemocytometer. Implantera inte om mer än 20% av cellerna är döda.
- Beräkna mängden levande celler krävs (1 x 107-celler / ml) och överföra dem till en 15 ml centrifugrör. Centrifugera vid 250 xg under 5 min vid 4 ° C och kasta bort supernatanten. Återsuspendera cellpelleten i DMEM tomma media. Upprepa tvätta tre gånger för att avlägsna alla spår av FBS före implantation.
- Håll cellsuspensionen på is tills mössen är redo för implantation.
- Implantera tumörcellerna subkutant i möss på rygg flanken.
- Söva en 4- till 6-veckor gamla C57BL6 / J-mus med användning av en blandning av anestetika ketamin och medetomidin (75 mg / kg och 1 mg / kg, respektive), injicerades intraperitonealt vid 0,1 ml per 10 g kroppsvikt.
- Raka den högra flanken för att exponera huden.
- Med användning av en pincett, lyft huden för att separera den från den underliggande muskeln och injicera 0,1 ml av cellsuspensionen (1 x 10 6 celler) subkutant med en 24 G-nål. Medan nålen avlägsna, nypa injektionsstället för 5 till 10 s så att tumörcellerna göraläcker inte ut ur injektionsstället.
- Återuppliva musen med en subkutan injektion av atipamezol (1 mg / kg) vid 0,1 ml per 10 g kroppsvikt.
- Övervaka tumörtillväxt varannan dag genom att mäta tumördiameter med hjälp av skjutmått. Tumörvolymen beräknas med användning av formeln V = (ab 2) / 2, där "a" är den längsta dimensionen och "b" är den vinkelräta bredden, både i mm.
- När tumörvolymen är minst 50 mm 3 (ungefär 7 dagar), avliva musen med CO2. Skära ut tumörmassan med ett par steril pincett och sax under aseptiska betingelser och placera i DMEM.
- I en 6-brunnars odlingsplatta, finhacka tumören i små bitar med hjälp av sterila skalpeller. Använda en 1 ml sprutkolv som en "mortelstöt" för att ytterligare dela upp tumören.
- Tillsätt 3 ml fullständigt DMEM och upprätthålla cellerna i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- När cellerna vidhäfta till plate (mellan en och två dagar), avlägsna media, skräp, och icke-vidhäftande celler genom att aspirera försiktigt med en steril pasteurpipett. Tvätta två gånger med DMEM. Var noga med att inte störa cellerna.
- Tillsätt 1 ml DMEM och skörda cellerna genom skrapning dem med en cellskrapa. Att välja och expandera enstaka kolonier, räkna cellerna med användning av en hemocytometer och plattan 1 cell per brunn i en 96-brunnars odlingsplatta. Kulturceller i DMEM med 200 pg / ml Hygromycin B vid 37 ° C och 5% CO2.
- Ändra media och antibiotikum var 4 - 5 dagar. Övervaka cellerna tills de är ca 80-90% sammanflytande. Re-plattan cellerna på en 24-brunnars odlingsplatta genom pipettering för att lösgöra cellerna från brunnen.
- När cellerna i 24-brunnars odlingsplatta är konfluenta, rycker loss dem genom skrapning med en cellskrapa och plattan dem i en 6-brunnars odlingsplatta.
- Screena de olika kloner för PSA-utsöndring, såsom beskrivs i steg 1. Cryo-bevara klonen med den högsta PSA hemligajon och använda den för framtida mus experiment.
4. Implantera tumör
OBS: Varje mus implanterades med 1 x 10 5 MB49-PSA-celler i 50 | il DMEM tomma medier i blåsan. På grund av det döda utrymmet i katetern, alltid förbereda extra volym (minst 100 mikroliter extra per mus). Ett alternativt tillvägagångssätt skulle vara att använda en luftfylld spruta såsom beskrivits av Kasman et al. 5 snarare än en förfylld spruta.
- Celler.
- En dag före implantering, när cellerna är ca 80% konfluenta, passage de MB49-PSA tumörceller i komplett DMEM-medium (kompletterat med 10% FBS, 2 mmol / L L-glutamin, 0,05 mg / ml penicillin-streptomycin, och 200 | ig / ml Hygromycin B) vid 37 ° C och 5% CO2 vid en delningsförhållande av 1: 2.
- På dagen för förfarandet, skörda cellerna genom skrapning dem försiktigt med en steril cellskrapa. Blanda lika volymer av cellsuspensionen ochen 0,4% lösning av trypanblått. Räkna de levande celler med användning av en hemocytometer. Implantera inte om mer än 20% av cellerna är döda.
- Beräkna mängden levande celler krävs (2 x 10 6 celler / ml) och överföra dem till en 15 ml centrifugrör. Centrifugera vid 250 xg under 5 min vid 4 ° C och kasta bort supernatanten. Återsuspendera cellpelleten i DMEM tomma media. Upprepa tvätta tre gånger för att avlägsna alla spår av FBS före implantation.
- Håll cellsuspensionen på is tills mössen är redo för implantation.
- Göra det möjligt för 4- till 6-veckor gamla C57BL / 6J-möss för att acklimatiseras i en vecka före ingreppet. Alla djur måste utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp för att upprätthålla sterila förhållanden.
- Väga varje mus och injicera anestesi (75 mg / kg ketamin och 1 mg / kg medetomidin) intraperitonealt på 0.1 ml per 10 g kroppsvikt. Bodyweights bör vara mellan 17 och 22 g. Bekräfta anesthetization genom att observera någon RespoNSE efter en tå nypa.
- För identifiering, markera örat med hjälp av ett öra punch.
- Injicera Hartmanns lösning eller förening natriumlaktat intraperitonealt på 0,1 ml per 10 g kroppsvikt varje 1-2 h för hydrering.
- Applicera sterilt oftalmisk salva i båda ögonen med hjälp av en steril bomulls glödlampa, eftersom den blinkande reflex försvinner under narkos och ögonen torkar ut. Återapplicera vid behov.
- Låg mössen i ryggläge på pappershanddukar på toppen av en värmepåse (aktiveras genom kontakt med luft) för att upprätthålla kroppstemperaturen och tejpa bakbenen ner.
- Med ett finger, tryck lätt till den nedre delen av buken och samla urin från blåsan in i ett 1,5-ml mikrocentrifugrör. Detta prov tjänar som basvärdet av urin PSA.
- Återkalla steril poly-L-lysin (PLL) i en 1 ml spruta och bifoga en 24-gauge IV kateter, med nålen nålen avlägsnas. Applicera smörjmedel till spetsen av katetern och insERT katetern genom urinröret in i urinblåsan med hjälp av pincett för att styra kateterisering. Stanna när motstånd känns. OBS: Forskare bör diskutera med sin veterinärpersonal om behovet av att använda en smörjande gel med bedövningsmedel till intravesikal instillationer och användning av post-förfarande analgetika.
- Ingjuta 50 mikroliter av PLL långsamt, med en hastighet av 10 mikroliter var 20 s, för att undvika Vesico-uretär reflux 18. Lämnar katetem i blåsan under 20 min med en propp för att förhindra ut-strömning.
- Efter 20 minuter, ta bort katetern och utrymma blåsan av något innehåll genom att försiktigt trycka på nedre delen av buken. Använda en tom 1 ml spruta, spola eventuella återstående innehåll av katetern.
- Blanda MB49-PSA-celler noggrant genom pipettering och dra dem i en 1 ml spruta. Fäst kateter och tillämpa smörjmedel. Ingjuta 50 mikroliter av 1 x 10 5 celler vid en långsam hastighet av 10 mikroliter var 20 s. Ersätt proppen påkatetern. Ge kontrollmöss 50 mikroliter saltlösning.
- Efter en timme, ta bort katetrar och utrymma blåsan av något innehåll. Ta bort tejpen på bakbenen och placera möss på sina ventrala sidor. Återuppliva möss genom subkutan injektions återföring läkemedel (1 mg / kg atipamezol) vid 0,1 ml per 10 g kroppsvikt.
- Övervaka möss tills motilitet observeras. Återgå mössen till sina burar.
- Efter slutförandet av en tumördetektion protokoll (avsnitt 5, 7 eller 8), avliva möss med användning av CO2. Obduktion tumördetektion beskrivs i avsnitt 6.
5. Övervakning tumörtillväxt med ELISA
OBS: Tumör närvaro och tillväxt övervakas i möss genom att mäta PSA-utsöndring i urinen. Forskare bör rådgöra med sin veterinärpersonal om övervakning djurs hälsa och välbefinnande efter tumörimplantation och humana slutpunkter.
- Det finns två metoder för att samla urin från möss.
- Samla urin under natten genom att placera en enda mus i ett enskilt metabolisk bur utformad för att separera urin från fekalt material. Om set-up inte har kylning, tillsätt en proteasinhibitor (100 | il) in i urinuppsamlingsröret för att förhindra nedbrytning av PSA över natten. Dock antalet tillgängliga metaboliska burar begränsar användbarheten av denna metod för urinuppsamling.
- Om det är logistiskt omöjligt att använda metaboliska burar (t.ex. i ABSL2 rum), samla fläck urin med hjälp av ett finger för att utöva ett lätt tryck på den nedre delen av buken medan mössen bedövas som beskrivs i steg 4.2.1. Detta görs vanligen innan terapin ingjutit. Från vår erfarenhet, kan åtminstone 150 mikroliter av urin samlas 1 h efter anestesi.
- Placera omedelbart uppsamlade urinen på is. Hematuri kan vara synlig från den andra veckan efter tumörimplantation. Mycket hemolyserade prover kan påverka ELISA-analys. Därför, urinmåste placeras på is och behandlas snabbt efter provtagningen.
- Centrifugera urin rören vid 6700 xg under 5 min vid 4 ° C för att avlägsna celler eller skräp.
- För att normalisera skillnaden i urinproduktion mellan mössen, alikvot urinen in i nya rör och förvara dem vid -30 ° C tills att utföra de analyser för PSA med användning av ett ELISA-kit 7 och kreatinin med användning av ett analyskit 7. Även om möss inte producerar PSA, det finns låga nivåer av icke-specifik bindning som detekteras med användning av ELISA. För prover som anses vara positivt, måste tröskelvärdet sättas till värden större än i normala möss + 3 standardavvikelser (SD) 15.
6. Upptäcka Tumör Närvaro med Real-time PCR
- Vid terminering, dissekera bukhålan hos musen och lokalisera blåsan. Skära blåsan och placera den i en cryovial. Frysa omedelbart i flytande kväve.
- Extrahera RNA genom homogenisering vävnaderna i en RNA-extrhandling reagens.
- Utför omvänd transkription och realtids-PCR-analys för PSA, som beskrivs ovan i avsnitt 2.
7. Övervakning tumörtillväxt med Fluorescence Imaging
- Märk 1 x 10 7 MB49-PSA-celler med en nära infraröda fluorescerande färgämne 19.
- Re-platta och skörda de märkta cellerna på dag 4, 7, 11, 14, 18 och 21 för att kontrollera om celler behålla lönsamhet och fluorescens med flödescytometri 20.
- Implantera de märkta MB49-PSA-celler i möss blåsor, som beskrivs ovan i avsnitt 4.
- Övervaka tumörtillväxt med hjälp av en fluorescensbildsystem varannan dag.
- På dagen för avbildning, väga och söva mössen med användning av en blandning av anestetika ketamin och medetomidin (75 mg / kg och 1 mg / kg, respektive), injicerades intraperitonealt vid 0,1 ml per 10 g kroppsvikt.
- Raka bukområdet att exponera huden.
- Placera möss i bildbehandling kammare och förvärvabilder av blåsor med hjälp av programvara som medföljer avbildningssystemet.
- Återuppliva möss genom subkutan injicering av en återföring läkemedel (1 mg / kg atipamezol) vid 0,1 ml per 10 g kroppsvikt.
8. Övervakning tumörtillväxt med hög frekvens ultraljud
- Implantat tumörer hos möss, som beskrivs ovan i avsnitt 4.
- Varannan dag, övervaka tumörtillväxt med hjälp av ultraljudsavbildning.
- På dagen för avbildning, väga och söva mössen med användning av en blandning av anestetika ketamin och medetomidin (75 mg / kg och 1 mg / kg, respektive), injicerades intraperitonealt vid 0,1 ml per 10 g kroppsvikt.
- Raka bukområdet att exponera huden.
- Ingjuta 100 pl steril 0,9% saltlösning i blåsan med användning av en 24-gauge intravenös kateter. Salt kommer tänja blåsan och förbättra sikten under ultraljud.
- Placera musen på ultraljuds plattform och tillämpa ledande gel till lorn buken.
- Sänk handhållna sonden till huden och förvärva B-mode bilder av blåsan på bild plattformen 21.
- Återuppliva mössen genom subkutan injicering återföring läkemedlet (1 mg / kg atipamezol) vid 0,1 ml per 10 g kroppsvikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PSA utsöndring från MB49-celler befanns variera med tillväxtmedia. MB49-PSA odlas i DMEM-medium, eftersom detta resulterar i ökad PSA sekretion (Figur 1A). För att bestämma känsligheten hos PSA ELISA och realtids-PCR, var olika antal MB49-PSA-utsöndrande celler blandades med MB49 parentala celler. PSA ELISA detekterar minst 1 x 10 5 PSA-utsöndrande celler / 1 x 10 6 celler (Figur 1B), medan realtids-PCR-analys detekterar 100 PSA-utsöndrande celler / 1 x 10 6 celler (Figur 1C). Sålunda är realtids-PCR känsligare än ELISA, men den kan endast utföras på hela blåsan. Detta begränsar dess användbarhet till slutpunkten analys. PLL metod för tumörimplantation resulterar i ett flertal tumörer (figur 2A) som utvecklas i urinblåsan. Båda natten samling av urin med hjälp av metaboliska burar (Figur 2B (Figur 2B, lägre panel) kan användas för att mäta PSA genom ELISA. För alla djurstudier är mus vikt noteras som ett mått på hälsa (figur 2C, övre panelen), och urin PSA övervakas på veckobasis (Figur 2C, lägre panelen) som ett mått på tumörtillväxt. Det är i allmänhet en god korrelation mellan mus vikt och tumörstorleken, mätt med PSA. Möss med stora tumörer börjar gå ner i vikt (figur 2C, möss 3 och 5). Vissa möss observerades i figur 2C kan ha en stor tumör, men ändå visar en normal kroppsvikt. Således är ensam kroppsvikt inte en tillräcklig åtgärd av tumörtillväxt. PSA tjänar som en bra surrogatmarkör för tumörtillväxt (Figur 3A-D). Möss avlivades ca 3-5 dagar efter urinanalys för PSA på dag 14. Bilderna i blåsan tvärsnitt visar tumörstorlek och motsvarande dag 14 PSA / kreatinin x 10 6 reading. Variationen i tumörstorleken är relaterad till behandlingen av möss erhöll. Figur 3, paneler AD representerar möss från 3 olika behandlingsarmar. En alternativ strategi för att PSA modifiering av celler är märkning av celler med ett färgämne. Denna strategi eliminerar behovet av celltransformation och urval. Märkning av MB49-PSA-celler med ett fluorescerande färgämne är lätt att utföra (Figur 4A), och in vitro övervakning visade löfte i termer av överlevnad av signalen, trots cellreplikation (figur 4B och C). Men in vivo imaging var inte framgångsrik, eftersom foder mus hade också naturlig röd fluorescens (Figur 4D), vilket resulterade i icke-specifik fluorescens i bukhålan. En jämförelse utfördes mellan ultraljud, PSA urinutsöndring, och PSA-slutpunkten analys. Ultraljudsavbildning av urinblåsan (figur 5A-H) var bra för att identifierastora tumörer, men det var inte så framgångsrik med små tumörer.
Figur 1. PSA utsöndring från MB49-PSA-celler och bestämning av Detektionsgräns Använda ELISA och Real-time PCR-analys. (A) 1 x 10 6 MB49-PSA-celler odlades i olika tillväxtmedia, och PSA-utsöndring i supernatanten detekterades 2 dagar senare genom ELISA. Tillväxt media var: RPMI med FBS- (RPMI), RPMI med Premium FBS (RPMI (P)), RPMI med en alternativ FBS (RPMI (H)), och DMEM med FBS (DMEM). MB49-PSA-celler odlas i DMEM media hade högre PSA sekretion. (B) MB49-PSA-celler (10 6 celler till 1 cell) blandades med paren MB49-celler (en cell till 10 6 celler) och ströks ut i 24 timmar. PSA-ELISA utfördes på supernatanten, och RNA extraherades från cellerna. Ett minimum av 1 x 10 5 6 celler kunde detekteras genom ELISA. (C) 100 PSA-utsöndrande celler / 1 x 10 6 celler kunde detekteras genom realtids-PCR-analys. Y-axeln värden representerar medelvärdet RQ (relativ kvantifiering) ± standardavvikelse. RQ värden är relativa förändringar veck, som erhålls genom att normalisera C T-värden för PSA beta aktin-genen och jämfördes med en kontrollgrupp blåsa som är satt till 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Blåstumörtillväxt och Detection. (A) Histologisk undersökning av en blåsa 13 dagar efter tumörimplantation. Den paraffininbäddade blåsa sektionerades och färgades med hematoxylin (mörkblå), vilket stains kärnorna, och eosin (rosa), som färgar de återstående cellkomponenter. PSA / kreatinin x 10 6 värde för urinblåsan på dagarna 5 och 13 visas som 7/2688. Förstoringen är 44.8X. Skalstrecket representerar 1 mm. (B) Urin uppsamlades genom antingen placera möss i metaboliska burar över natten och överföring av urin från uppsamlingsröret in 2 ml rör (övre panel) eller genom on-the-spot urinsamling från bedövade möss (nedre panelen) i 1,5 ml rör , som överfördes sedan till 0,6 ml rör. (C) efter tumörimplantation fick möss vikt övervakades två gånger i veckan (övre panelen). Urin PSA mättes för att övervaka tumörimplantation och tillväxt i möss (nedre panelen). Y-axeln PSA / Crea representerar urin PSA normaliserat till kreatinin x 10 6. Möss avslutades när det var en förlust på mer än 20% av kroppsvikten. Notera: PSA-genuttryck detekterades i blåsan av mus 2 vid dag 40, när det var termi nat, trots att det hade låg urin PSA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. PSA och Bladder Tumör Growth. (AD) Histologiska sektioner av möss blåsor skördas på dag 19 (A och B), dag 17 (C) och dag 13 (D) efter tumörimplantation. Dagen 4 och dag 13 eller dag 14 urin PSA / kreatinin x 10 6-värden för varje blåsa visas på den högra sidan av varje bild i formatet dag 4 / dag 13 eller 14. Urin PSA / kreatininvärden ökar med tumörstorlek . Mössen i bilder AD fick olika behandlingar står för tumörstorlek skillnaderna. Förstoringen är 41.4X. Skalstrecket representerar 1 mm."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55078/55078fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Profil för MB49-PSA-celler märkta med ett fluorescerande färgämne. (A) Färgade celler analyserades genom flödescytometri före plätering. Märkta celler skördades med några dagars mellanrum för att analysera intensiteten av det fluorescerande färgämnet. (B) Procent av märkta MB49-PSA celler i P2 port från (A) vid angivna dagar post- märkning. (C) Intensitet av det fluorescerande färgämnet mäts genom medelfluorescensintensiteten (MFI) av signalen. (D) Bilder från möss 10 dagar efter implantation med märkta MB49-PSA-celler med hjälp av en in vivo imaging systemet visade icke-specifik fluorescens i bukhålan.Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. ultraljudsbilder av murina blåsor. Möss blåsor (a) före tumörimplantation och (B) 8 dagar efter tumörimplantation. (C) till (H) är ultraljudsbilder av möss blåsor två veckor efter implantation. PSA / crea: urin PSA normaliserad till kreatinin (10 6). PSA-genen: genuttryck av PSA i blåsoma (log RQ) visas för varje urinblåsan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| urin PSA | fluorescens Imaging | ultraljud Imaging | |
| Stegen (tid som krävs) | Söva möss. Samla 110 mikroliter urin. (~ 1 h) Utför PSA ELISA (total inkubationstid: 2 tim 30 min) Kreatininanalys (inkubationstid: 5 min) | Söva möss. Raka päls på bukhålan. Utföra avbildning. | Söva möss. Raka päls på bukhålan. ANVÄNDA KATETER och ingjuta 100 pl saltlösning in i urinblåsan. Applicera ledande gel för att nedre delen av buken och ultraljudsbilder. |
| specialiserad utrustning | ELISA-plattläsare (vid våglängd av 450 nm och 510 nm) | Imaging System | Ultraljud Imaging System |
| Modifiering av tumörceller | required (uttrycker PSA) | Krävs (fluorescens) | Inte nödvändig |
| fördelar | Pålitlig | Enkel och snabb | Kan upptäcka stora tumörer |
| begränsningar | Kanske inte får tillräckligt med urin Ett negativt värde betyder inte frånvaro av tumör (PSA genuttryck analys ökar känsligheten, men är begränsad till slutpunkten analys) | Det krävs noggrant urval av fluorescens färgämne för att förhindra hög bakgrund. | Det går inte att upptäcka små tumörer. En mus åt gången. |
Tabell 1. Jämförelse av metoder för övervakning tumörtillväxt i mus blåsor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiska stegen i protokollet är en) framgångsrikt upprätthålla tumorigeniciteten av cellinje; 2) garanterar att mätbara PSA sekre före tumörcell implantering i möss; 3) alstra en enkelcellsuspension för implantering för att reducera variationen i tumörstorlek; och 4) att ingjuta celler i långsam takt för att förhindra Vesico-uretär reflux, vilket resulterar i tumörcell implantation i njuren.
Efter långvarig passage in vitro, kan MB49 / MB49-PSA-celler förlorar sin tumorigenicitet, vilket framgår av deras oförmåga att producera tumörer i möss. Detta kan vara en confounding faktor som huruvida möss botade efter behandlingen. I frånvaro av tumörer, är det inte möjligt att differentiera möss härdade genom terapi från möss härdade spontant på grund av immunogena tumörer eller från möss med inga tumörer alls eftersom cellinjen är oförmögen att bilda tumörer. Ett sätt att motverka detta är att åter passage cellerna i möss genom att producera sub-kutana tumörer. Om denna nya passage sker alltför ofta är alltför aggressiva tumörer genereras. Det behövs en bra balans för att bestämma när cellerna behöver återpasse. I allmänhet, innan en stor serie av experiment, är cellinjen återupplivade och sedan implanteras i möss subkutant för att bekräfta deras förmåga att bilda tumörer. Tumörerna övervakas under flera veckor för att säkerställa att det inte finns några spontana botemedel. Men om spontana botemedel observeras, bör utföras då protokollet i steg 3. På samma sätt bör förmågan hos MB49-PSA-celler för att producera PSA alltid bekräftas innan cellerna används för tumörimplantation.
Urin PSA kan användas för att övervaka tillväxten av tumörer i urinblåsan fastställts med hjälp MB49-PSA-celler. Men en negativ eller "normal" urin PSA-värde inte nödvändigtvis betyda en frånvaro av tumörceller, men endast att mindre än 1 x 10 5 celler är närvarande. Som urin PSA bestäms omkring dag 4till dag 7, möss som verkar ha någon tumör, baserat på värdet av normala möss + 3 SD, kan tas bort från experimentet. Vissa av dessa möss kan utveckla en tumör vid en senare tidpunkt. Ta bort möss utan tumörer gör att tumörer är mycket lika i storlek innan du påbörjar någon terapi. Detta reducerar variation beroende på tumörstorlek som svar på terapi. En viktig orsak till tumörstorlek variation är hopklumpning av celler före implantering, så ansträngningar bör göras för att återsuspendera cellerna före implantation.
Men när ett litet antal möss används, kan det vara nödvändigt att hålla alla möss i studien, även om tumörerna är inte mätbar av dagar 4 - 7. Genom att övervaka PSA dag 11, kan det fortfarande vara möjligt att kategorisera dessa möss som har haft små tumörer, och slutpunkten analys kan utföras med avseende på den ursprungliga tumörstorleken (baserat på förekomsten av mätbara urin PSA på dagarna 4 - 7 kontra dag 11). Fördelen med att kunna kvantifiera tumörermed olika PSA-värden är att alla möss kan ingå i studien, och svaret på behandlingen kan fastställas baserat på deras PSA / kreatininvärden med avseende på den ursprungliga tumörstorleken. En annan källa till oro är Vesico-uretär reflux. Detta kan resultera i tumörutveckling i njurarna. Att minska den volym som ska ingjutit från 100 mikroliter till 50 mikroliter och utför instilla minskar långsamt sannolikheten för att detta inträffar.
Ett problem med urinbaserade analyser är det reducerade urinuppsamlings observeras som orthotopic tumörer växer i urinblåsan. Även urin kan lätt samlas in från möss under de första veckorna efter implantation, med tiden, volymen av urin kan inte vara tillräcklig för PSA och kreatininmätningar. Minimivolymen av urin behövs är 110 mikroliter, men mer är bättre. Således kan PSA avläsningar inte är tillgängliga för alla möss vid senare tidpunkter. Dessutom ger lys av röda blodkroppar i urinen falskthöga värdet på PSA ELISA. En icke-urin-baserad analys kunde övervinna detta problem. Men tyvärr fluorescens avbildning är enkel att använda, fann vi att matar musen hade röd fluorescens också. Detta gav en hög bakgrund mot vilken blåsan inte lätt kunde ses. Det är möjligt att med hjälp av en grön fluorescerande färg eller protein kan övervinna detta problem, såsom beskrivs av Sweeney et al. 10 För både fluorescens och ultraljud, möss måste rakas på den ventrala ytan.
Ultraljudsbilder verkar vara lika bra som PSA genuttryck lokalisera tumörer. Emellertid är nackdelen med ultraljudsavbildning att blåsan skall utspänd under avbildning för att få bra tumör visualisering. Medan bilderna är tydliga när blåsan tumören är stor, är det svårt att skilja små tumörer i möss från frånvaro av tumörer. Det har rapporterats att ultraljud kan upptäcka tumörer i närheten av 1,5 mm i diameter 22, men på dag 4efter implantation, tumörer är mycket mindre än detta. Således kan denna metod inte vara bra för detektering av tumörer på dag 4. Tabell 1 jämför de 3 olika tumör övervakningssystem; PSA ELISA är det enklaste att använda och inte kräver små djur bildsystem, som inte finns på alla djuranläggningar.
Med tanke på den större känsligheten hos realtids-PCR-analys av PSA-genexpression, kan den användas i stället för immunohistokemi för att bekräfta om möss botades när experimentet avslutades. Med immunohistokemi, en tumör i 0,2 - 0,3 mm detekterbara dag 4 efter implantation 15. Detta är dock ett slut-punktsanalys metod som inte kan användas för att övervaka tumörimplantation. I denna studie var MRI inte utvärderats, men det har rapporterats att kunna identifiera förekomsten av tumörer vid dag 10 efter implantation 8. Genom att modifiera cellerna för att uttrycka den gröna fluorescerande protein (GFP), det iär möjligt att bekräfta tumörimplantation vid dag 7. En kombination av tidig urin PSA att detektera tumörimplantation och realtids-PCR-analys vid terminering erbjuder bekräftelse av tumörimplantation och terapeutisk effekt mellan olika behandlingsgrupper.
En nackdel med våra protokoll är främst att ELISA-analysen inte kan bekräfta förekomsten av tumörer när antalet celler som är närvarande är mindre än 10 5-celler. Således mer känsliga analyser måste utvecklas liksom snabbare analyser för att minska den tid som krävs för PSA detektering. ELISA tar flera timmar att utföra. En snabb metod såsom kreatininanalysen som är baserad på den Jaffe-metoden 23 och tar ca 5 min att utföra skulle i hög grad förenkla övervakning av tumörtillväxt. För detta ändamål har en enzymbaserad metod för att upptäcka PSA aktivitet utvärderas, men det var inte framgångsrik. Användningen av kolloidalt guld och nanopartikelbaserade analyssystem skulle kunna minska den tid det tar att utföra analysen ennd öka känsligheten 24. I detta avseende har elektrodbaserade sensorer och elektro baserade sensorer som använder nanopartiklar utvecklats för att analysera människors PSA 25-27 och om kostnaden är rimlig kan vara tillämplig på djurmodell. Analyssystemet skulle också kunna förbättras genom användning av ett annat protein-sekretionssystemet, såsom GFP eller luciferas, där analysen utförs under optimala betingelser in vitro snarare än beroende på avbildning in vivo som är beroende av vävnadssyresättning.
Medan kemisk carcinogenes hos möss genererar tumörer med likhet med humana cancerformer i form av mutationer 28, tar de längre tid att producera och är inte lika jämförbara i storlek mellan djur, som kräver ett större antal möss, vilket ökar kostnaden för experiment. När målsökande medel som känner igen mänskliga proteiner som ska utvärderas, mänskliga xenografter implanterades subkutant i nakna eller Svår kombinerad immunbrist(SCID) möss är det enda alternativet. Även om dessa modeller ger proof of concept av antikropps-igenkänning, avsaknaden av ett intakt immunsystem hindrar bedömning av immunaktivering. Den senaste tidens utveckling av en humaniserad musmodell för cancer i urinblåsan med mänskliga xenografter 29, utgör några immun insikter, men som celler implanteras subkutant det faktiskt inte rekapitulera den mänskliga sjukdomen miljö. Det är tekniskt svårt att framställa orthotopic tumörer i immun brist möss. Således syngena orthotopic modellen trots sina begränsningar är fortfarande en bra modell för utvärdering och utveckling av terapi för cancer i urinblåsan eftersom det ger rätt vävnad plats möjliggör kontrollerad exponering för behandling modellering den kliniska situationen och möjligheten att utvärdera effekterna av värdens immunceller under cancerterapi. Allt detta i kombination med en snabb tumörutveckling i möss och förmågan att övervaka tumörtillväxtresulterar i en kostnadseffektiv modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
| RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
| L-glutamine | Biowest | X0550 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
| free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
| TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
| TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
| C57BL/6J female mice | In Vivos | 4 - 6 wk old | |
| Anesthesia (75 mg/kg Ketamine and 1 mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
| Reversal drug (1 mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
| Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
| Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
| Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
| Heat pack - HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
| Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24 G x 3/4″ |
| Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
| Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
| Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
| Fluorescent dye - VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
| RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| 7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
| 7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
| Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
| BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
| IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
| Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
| Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |
References
- Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Chade, D. C., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int Braz J Urol. 34, 220-226 (2008).
- Chan, E. S., et al. Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model. J Urol. 182, 2926-2931 (2009).
- Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50181 (2013).
- Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M., Totterman, T. H. CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer. J Immunother. 28, 20-27 (2005).
- Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and Microenvironment Modification during Progression of Murine Orthotopic Bladder Cancer. Clin Dev Immunol. , 865684 (2011).
- Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. J Urol. 145, 1297-1301 (1991).
- Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. J Urol. 170, 1375-1378 (2003).
- Sweeney, S. K., Luo, Y., O'Donnell, M. A., Assouline, J. Nanotechnology and cancer: improving real-time monitoring and staging of bladder cancer with multimodal mesoporous silica nanoparticles. Cancer nanotechnology. 7, 3 (2016).
- Tanaka, M., et al. Noninvasive detection of bladder cancer in an orthotopic murine model with green fluorescence protein cytology. J Urol. 170, 975-978 (2003).
- Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101, 120-124 (2008).
- Newton, M. R., et al. Anti-interleukin-10R1 monoclonal antibody in combination with bacillus Calmette--Guerin is protective against bladder cancer metastasis in a murine orthotopic tumour model and demonstrates systemic specific anti-tumour immunity. Clin Exp Immunol. 177, 261-268 (2014).
- Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75, 799-804 (2010).
- Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin Cancer Res. 10, 6977-6984 (2004).
- Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J Urol. 172, 2414-2420 (2004).
- Coralli, C., Cemazar, M., Kanthou, C., Tozer, G. M., Dachs, G. U. Limitations of the reporter green fluorescent protein under simulated tumor conditions. Cancer Res. 61, 4784-4790 (2001).
- Biot, C., et al. Preexisting BCG-specific T cells improve intravesical immunotherapy for bladder cancer. Sci Transl Med. 4 (137), 137ra172 (2012).
- Swirski, F. K., et al. A near-infrared cell tracker reagent for multiscopic in vivo imaging and quantification of leukocyte immune responses. PLoS One. 2, 1075 (2007).
- Jozwicki, W., Brozyna, A. A., Siekiera, J., Slominski, A. T. Frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells in peripheral blood in relation to urinary bladder cancer malignancy indicators before and after surgical removal. Oncotarget. , (2016).
- Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes. J Vis Exp. , e52718 (2015).
- Rooks, V., Beecken, W. D., Iordanescu, I., Taylor, G. A. Sonographic evaluation of orthotopic bladder tumors in mice treated with TNP-470, an angiogenic inhibitor. Academic radiology. 8, 121-127 (2001).
- Folin, O., Morris, J. L. On the determination of creatinine and creatine in urine. JBC. 17, 469-473 (1914).
- Dykman, L. A., Bogatyrev, V. A., Khlebtsov, B. N., Khlebtsov, N. G. A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin. Anal Biochem. 341, 16-21 (2005).
- Shi, H. W., et al. Joint enhancement strategy applied in ECL biosensor based on closed bipolar electrodes for the detection of PSA. Talanta. 154, 169-174 (2016).
- Ma, H., et al. Electrochemiluminescent immunosensing of prostate-specific antigen based on silver nanoparticles-doped Pb (II) metal-organic framework. Biosensors & bioelectronics. 79, 379-385 (2016).
- Kavosi, B., Salimi, A., Hallaj, R., Moradi, F. Ultrasensitive electrochemical immunosensor for PSA biomarker detection in prostate cancer cells using gold nanoparticles/PAMAM dendrimer loaded with enzyme linked aptamer as integrated triple signal amplification strategy. Biosensors & bioelectronics. 74, 915-923 (2015).
- Lu, Y., et al. Cross-species comparison of orthologous gene expression in human bladder cancer and carcinogen-induced rodent models. Am J Transl Res. 3, 8-27 (2010).
- Gong, Z., et al. Establishment of a Novel Bladder Cancer Xenograft Model in Humanized Immunodeficient Mice. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 37, 1355-1368 (2015).
