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Biology

चूहे में एरोबिक व्यायाम से भोजी को सक्रिय

Published: February 3, 2017 doi: 10.3791/55099
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell and Molecular Biology, Northwestern University

Summary

भोजी सक्रियण रोगों के एक नंबर की रोकथाम में फायदेमंद है। शारीरिक तरीकों में से एक के लिए प्रेरित करने विवो में भोजी शारीरिक व्यायाम है। यहाँ हम कैसे एरोबिक व्यायाम से भोजी को सक्रिय करने और चूहों में भोजी के स्तर को मापने के लिए दिखा।

Introduction

भोजी एक evolutionarily संरक्षित गिरावट मार्ग, जो इस तरह भुखमरी और हाइपोक्सिया 1, 2 के रूप में विभिन्न तनाव की स्थिति के जवाब में प्रेरित किया जाता है। भोजी के दौरान, डबल झिल्ली पुटिकाओं, autophagosomes कहा जाता है, अनावश्यक या क्षतिग्रस्त subcellular घटकों को शामिल करने और उन्हें गिरावट 3 के लिए लाइसोसोम में परिवहन। बेसल भोजी सेलुलर समारोह और जीव विकास, और बिगड़ा बेसल भोजी के लिए आवश्यक neurodegeneration, tumorigenesis और टाइप 2 मधुमेह 4, 5, 6 सहित कई विकारों में फंसा हुआ है।

सबसे प्रसिद्ध मनोवैज्ञानिक भोजी inducer भुखमरी है। हालांकि, यह दो प्रमुख सीमाएँ हैं। सबसे पहले, भुखमरी चूहों में खाद्य प्रतिबंध के 48 घंटा प्रभावी रूप से पशुओं में भोजी प्रेरित करने के लिए एक लंबी अवधि लेता है, जैसे,सबसे अंगों में। दूसरा, भुखमरी मुश्किल से मस्तिष्क भोजी लाती है, मस्तिष्क में एक अपेक्षाकृत स्थिर पोषक तत्वों की आपूर्ति की वजह से। वास्तव में, यह भी छोटे अणु inducers द्वारा भोजी प्रेरण पता लगाने के लिए कई दवाओं रक्त मस्तिष्क बाधा पार नहीं कर सकता के रूप में मुश्किल है। इस प्रकार, बेहतर रोग रोगजनन में भोजी सक्रियण के समारोह का विश्लेषण करने के लिए, हमने हाल ही में पता चला व्यायाम के लिए समय 7, 8, 9 की एक छोटी अवधि में भोजी प्रेरित करने के लिए एक अधिक शक्तिशाली शारीरिक विधि है। भुखमरी के साथ तुलना में, भोजी प्रभावी ढंग से ट्रेडमिल के रूप में तेजी के रूप में 30 मिनट चल रहा है से प्रेरित है। इस प्रकार, व्यायाम स्वास्थ्य लाभ मध्यस्थता और रोगों को रोकने में भोजी की व्यवस्था का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक और शक्तिशाली शारीरिक दृष्टिकोण है।

वहाँ कई भोजी गतिविधि का पता लगाने, LC3 और p62 सहित के लिए प्रोटीन मार्करों हैं। LC3 (microtubule जुड़े प्रोटीन 1 ए / 1 बी-सी प्रकाशHain 3) एक साइटोसोलिक प्रोटीन (LC3 है-मैं के रूप में) है कि भोजी प्रेरण पर पीई (phosphatidylethanolamine) संयुग्मित है। पीई lipidated LC3 (LC3-द्वितीय फार्म) autophagosomal झिल्ली पर भर्ती की है और जब GFP के साथ लेबल autophagosomes कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। cytosol माइक्रोस्कोपी के तहत autophagosomes के ढांचे कबरा से इसकी translocation भोजी प्रेरण का एक संकेत है। p62 भोजी substrates (जैसे ubiquitination प्रोटीन के रूप में) के लिए एक मालवाहक रिसेप्टर है, और साथ ही autophagosomes में शामिल किया है। चूंकि प्रोटीन autophagosomes के साथ लाइसोसोम में अपमानित किया जाता है, अपने स्तर भोजी प्रवाह को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ हम कैसे इन मार्कर का उपयोग करने के लिए विभिन्न माउस मजबूर व्यायाम (ट्रेडमिल) और स्वैच्छिक व्यायाम (पहियों चल रहा है) सहित एरोबिक व्यायाम, से प्रेरित ऊतकों में भोजी यों तो दिखा। उसी प्रक्रिया भी अन्य inducers के उपचार के बाद भोजी के vivo माप के लिए लागू किया जा सकता है।

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Protocol

सभी जानवरों को शामिल प्रक्रियाओं नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया।

1. माउस मॉडल

  1. व्यायाम प्रशिक्षण में 8-12 सप्ताह पुरानी चूहों का प्रयोग करें। विवो में प्रयोग प्रेरित भोजी का पता लगाने के लिए, इमेजिंग अध्ययन और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए C57BL / 6 चूहों के लिए GFP-LC3 ट्रांसजेनिक चूहों (C57BL / 6 पृष्ठभूमि) का उपयोग करें।

2. व्यायाम प्रेरित भोजी

  1. ट्रेडमिल सेटअप - मजबूर व्यायाम
    1. Acclimate और 2 दिनों के लिए एक 10 डिग्री ऊपर की ओर खुला ट्रेडमिल पर चूहों को प्रशिक्षित करना। 1 दिन, पर 5 मिनट के लिए चूहों व्यायाम 8 मीटर / मिनट, और 2 दिन, 10 मीटर की ऊंचाई पर 8 मीटर / मिनट एक और 5 मिनट के द्वारा पीछा पर 5 मिनट के लिए चूहों व्यायाम / 10 मिनट। कोमल हाथ उकसावा से चलाने के लिए चूहों को प्रोत्साहित करें।
    2. 3 दिन, चूहों 10 डिग्री ऊपर की ओर ट्रेडमिल, starti पर 90 मिनट के लिए चलाने का एक भी मुक्केबाज़ी गुजरना चलो10 मीटर / मिनट की गति से एनजी। 40 मिनट के बाद, 30 मिनट के लिए कुल 1 एम / हर 10 मिनट मिनट की दर से ट्रेडमिल की गति बढ़ाने के लिए, और उसके बाद की दर से गति को बढ़ाने के 1 एम / हर 5 मिनट मिनट तक यह तक पहुँचता है 17 मीटर / मिनट, व्यायाम के लिए समय के 90 मिनट और दूरी की दौड़ के 1,070 मीटर के कुल के लिए।
    3. एक कम तीव्रता रेंज (1.2 हर्ट्ज) पर बिजली प्रोत्साहन सेट करें, और बार-बार पैर सदमे से बचने के लिए चलाने के लिए चूहों प्रोत्साहित करते हैं।
    4. ऊतक संग्रह के लिए, isoflurane साँस लेना द्वारा चूहों, तुरंत व्यायाम के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद euthanize। अन्य अनुमोदित इच्छामृत्यु तरीकों में भी इस तरह के सीओ 2 या अन्य anesthetics के आईपी इंजेक्शन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। भोजी के स्तर इच्छामृत्यु के तरीकों से प्रभावित हो प्रतीत नहीं होता है।
  2. रनिंग व्हील सेटअप - स्वैच्छिक व्यायाम
    1. एक पिंजरे के अंदर एक माउस चल पहिया (11.4 सेमी व्यास) एक एकल रखे माउस के साथ रखें।
    2. एक मोटर साइकिल ओडोमीटर का उपयोग कर चल क्षमता की जाँच करें।358 पर पहिया पैरामीटर [दूरी (मिमी में) पहिया का पूरा रोटेशन प्रति] सेट अप (11.4 * π)। 24 घंटे के बाद मापने चल दूरी।
    3. माउस चल पहिया के साथ 2 सप्ताह के लिए स्वेच्छा से चलाते हैं। ऊतक संग्रह के लिए, चल अवधि के बाद सुबह में माउस बलिदान।

3. भोजी फ्लक्स मूल्यांकन

  1. आराम और व्यायाम की शर्तों के तहत autophagic प्रवाह को मापने के लिए तीन दिन के लिए भोजी अवरोध क्लोरोक्वीन के साथ चूहों के इलाज और उन्हें पीबीएस के साथ इलाज चूहों की तुलना करें।
    1. पीबीएस (5 मिलीग्राम / एमएल) में क्लोरोक्वीन भंग, और intraperitoneally लगातार तीन दिनों के लिए 50 मिलीग्राम / किग्रा / दिन की खुराक पर चूहों में क्लोरोक्वीन इंजेक्षन। चूहों बलिदान और अंतिम इंजेक्शन के बाद ऊतकों 3 घंटा इकट्ठा।
    2. प्रयोग चूहों के लिए, 50 मिलीग्राम / किग्रा / दिन की खुराक पर लगातार दो दिनों के लिए क्लोरोक्वीन के साथ उन्हें pretreat। तीसरे दिन, क्लोरोक्वीन की ही एकाग्रता के साथ चूहों इंजेक्षन, और बाद में90 मिनट के लिए उन्हें एक और 90 मिनट के लिए ट्रेडमिल पर चलाते हैं।
    3. isoflurane साँस लेना द्वारा चूहों, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद euthanize। , तुरंत चलाने के बाद ऊतकों इकट्ठा इतना है कि क्लोरोक्वीन की कुल ऊष्मायन समय के रूप में नियंत्रण (आराम) चूहों (3 घंटा) ही है।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, माउस ऊतकों में भोजी प्रवाह निर्धारित करने के लिए क्लोरोक्वीन की एक इंजेक्शन का उपयोग करें।

4. ऊतक फसल और फिक्सेशन

  1. 7.4 के अंतिम पीएच पर पीबीएस में: ऊतक फसल से पहले फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और ताजा 4% paraformaldehyde (व्यक्तिगत सुरक्षा के लिए आवश्यक उपकरण पीएफए, सावधानी) तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर दोनों के समाधान स्टोर।
  2. (GFP-LC3 चूहों के लिए) 4% पीएफए ​​के 20 मिलीलीटर - 15 के साथ 30 मिलीलीटर सिरिंज भरें। एक 20 जी कैथेटर सुई के साथ सिरिंज कनेक्ट।
  3. व्यायाम के बाद, isoflurane साँस लेना द्वारा चूहों euthanize ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा पीछा किया।
  4. अपनी बीए पर एक स्वच्छ काम की सतह पर पशु प्लेससी.के.। कट और डायाफ्राम काटने दिल को बेनकाब करने से वक्ष गुहा खुला।
  5. जब तक फेफड़े और यकृत पूरी तरह से पीला बारी जिगर पर एक छोटा सा चीरा खून बाहर आ जाने के लिए, और धीरे धीरे कैथेटर के माध्यम से दिल के सही वेंट्रिकल में 15 मिलीलीटर 4% पीएफए ​​की कुल इंजेक्षन। अभ्यास सत्र के बाद तुरंत माउस छिड़कना, 90 मिलीग्राम / घंटा की एक निरंतर प्रवाह की दर के साथ एक सिरिंज पंप का उपयोग कर।
  6. छिड़काव के बाद सुई को हटाने और ब्याज के ऊतकों (जैसे मस्तिष्क 11 और कंकाल की मांसपेशी) इकट्ठा। कंकाल की मांसपेशी के लिए, उत्तर lateralis काटना। संक्षेप में, पैर की त्वचा को पीछे की ओर, मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए खींच quadriceps स्थानीय बनाना 12 ग्रीवा, और उत्तर lateralis, जो बाहरी ऊरु हड्डी के ऊपरी हिस्से से जुड़ी पेशी है काटना।
  7. आगे निर्धारण और निर्जलीकरण के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 4% पीएफए ​​में GFP-LC3 चूहों के ऊतकों जगह है, और फिर उन्हें 15% के लिए स्थानांतरणसुक्रोज पीबीएस 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर या जब तक ऊतकों तय हो चुका है, और फिर रात भर में 30% सूक्रोज पीबीएस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर या लंबे समय तक भंडारण के लिए। अंधेरे जितना संभव हो उतना में नमूने रखें रूप में वे मजबूत प्रकाश के प्रति संवेदनशील हो सकता है।
  8. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए तस्वीर तरल नाइट्रोजन में सीधे C57BL / 6 चूहों से ऊतकों फ्रीज, और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

5. GFP-LC3 puncta की इमेजिंग विश्लेषण

  1. ऊतक प्रक्रिया
    1. इस तरह के एक छोटे से लेबल पेट्री डिश में कुछ मिनट के लिए "इष्टतम काटने के तापमान यौगिक" (अक्टूबर) के रूप में मध्यम embedding में ऊतकों (पहले पीएफए ​​में तय की और 30% sucrose में संग्रहित) पूर्व का इलाज।
    2. एक लेबल cryomold पर्याप्त ताजा अक्टूबर युक्त ऊतक को कवर करने में ऊतक स्थानांतरण। ओरिएंट cryomold के नीचे की ओर सेक्शनिंग सतह (उत्तर के लिए क्रॉस सेक्शन अर्ध-मस्तिष्क के लिए मांसपेशियों और बाण खंड lateralis)। बुलबुले के गठन से बचें।
    3. freसूखी बर्फ से भरा एक कवर फोम कूलर में कुछ मिनट के लिए cryomold रखकर नमूने Èze जब तक अक्टूबर सफेद बदल जाता है। लेबल पन्नी में अलग-अलग नमूने लपेटें, उन्हें एक प्लास्टिक की थैली में सील, और उन पर -80 डिग्री सेल्सियस रात भर या उससे अधिक समय की दुकान।
    4. एक cryostat का प्रयोग स्लाइड पर 10 माइक्रोन की मोटाई पर नमूना वर्गों में कटौती करने के लिए, और माउंट वर्गों। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड्स स्टोर, और हमेशा जब भी संभव प्रकाश से दूर रखने के स्लाइड।
  2. स्लाइड तैयारी
    1. फ्रीजर से स्लाइड निकालें और उन्हें कमरे के तापमान पर पिघलना। DAPI के साथ बढ़ते मीडिया की एक बूंद के साथ ऊतक अनुभाग को कवर। शीर्ष पर उचित आकार की एक coverslip जगह और बुलबुला गठन से बचें।
    2. , Coverslip के किनारों को सील करने के लिए नेल पॉलिश कमरे के तापमान पर अंधेरे में सूखे के लिए अनुमति देते हैं, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकाश तंग कंटेनर में स्लाइड्स की दुकान, या GFP-LC3 puncta के इमेजिंग पकड़ने के साथ आगे बढ़ना नेल पॉलिश का प्रयोग करें।
  3. <strong> GFP की मात्रा - प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा LC3 puncta
    1. epifluorescence माइक्रोस्कोपी सभी नमूनों के लिए (जोखिम और सेटिंग्स) एक ही हालत में चित्रों पर कब्जा प्रदर्शन करना। GFP के लिए, 525 एनएम के एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें; DAPI के लिए, 490 एनएम का उपयोग करें। उत्तर lateralis के लिए एक 60x उद्देश्य और मस्तिष्क के ललाट प्रांतस्था क्षेत्र का उपयोग नमूना प्रति कम से कम दस छवियों मोल।
    2. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए प्रत्येक छवि में 2,500 माइक्रोन 2 के एक ऊतक क्षेत्र, प्रयोगात्मक समूहों के लिए अंधा में GFP-LC3 puncta की संख्या यों। प्रत्येक नमूने की 10 छवियों से औसत संख्या की गणना, के "वस्तु गणना" स्वत: माप समारोह का उपयोग। उत्तर के लिए सेटिंग्स lateralis मांसपेशियों रहे हैं: दहलीज एल = 10, एच = 200; 2X चिकनी; 1X साफ है, और मस्तिष्क ललाट प्रांतस्था के लिए सेटिंग्स हैं: दहलीज एल = 11, एच = 200; 2X चिकनी; 1X साफ।

भोजी मार्करों पर 6. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण

  1. <strong> ऊतक प्रक्रिया
    1. lysis बफर तैयार: 50 मिमी Tris एचसीएल; 150 मिमी NaCl; 1 मिमी EDTA; 1% ट्राइटन X-100; protease अवरोध और फॉस्फेट अवरोध करनेवाला (हौसले से जोड़ा)।
    2. -80 से C57BL / 6 चूहों के ऊतक निकालें सी भंडारण °। एक रेजर ब्लेड निम्न प्रक्रिया से पहले साथ छोटे टुकड़ों में मांसपेशियों के ऊतकों में कटौती। 800 μl (अर्ध-मस्तिष्क के लिए) या नमूना के लिए ठंडा lysis बफर के 500 μl (उत्तर lateralis के लिए) जोड़ें। एक मध्यम गति से एक homogenizer के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना homogenize।
    3. पूरी तरह से रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक और 30 मिनट के लिए homogenized मिश्रण lyse।
    4. नीचे 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 XG पर homogenate स्पिन गोली त्यागें, और एक नया ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
  2. भोजी विश्लेषण
    1. निर्माता विनिर्देशों के अनुसार बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग ऊतक lysates के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण। प्रत्येक नमूना मानक के अनुसारएक ही एकाग्रता के लिए।
    2. एक 1 पर 2x Laemmli नमूना बफर के साथ नमूना गठबंधन: 1 के अनुपात, 5 के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर यह फोड़ा - 10 मिनट, और इस तरह के p62 (एंटी-p62 एंटीबॉडी के रूप में भोजी पर पश्चिमी धब्बा विश्लेषण 13 मार्कर, 14 के साथ आगे बढ़ना है, 1: 500 कमजोर पड़ने) और LC3 (विरोधी LC3 एंटीबॉडी, 1: 500 कमजोर पड़ने)। तुरंत नमूना बफर के अलावा के बाद नमूनों उबाल लें, के रूप में बर्फ पर अब ऊष्मायन LC3 के कई अपमानित बैंड उत्पन्न हो सकता है।
    3. ImageJ का उपयोग densitometry विश्लेषण द्वारा p62 और LC3 बैंड यों, और इसी actin बैंड के लिए मूल्य मानक के अनुसार।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल के दो अलग अलग तरीकों का वर्णन एरोबिक व्यायाम द्वारा माउस ऊतकों में भोजी प्रेरित करने के लिए: एक बहु-लेन ट्रेडमिल दशानुकूलन के दो दिनों से रवाना पर मजबूर व्यायाम के 90 मिनट की कुल; या एकल रखे चूहों द्वारा इस्तेमाल के लिए चल रहे एक पहिया पर स्वैच्छिक व्यायाम के दो सप्ताह के। एक अभ्यास के प्रोटोकॉल में, हम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और विभिन्न अंगों में पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा भोजी प्रवाह उपाय कर सकते हैं।

हम एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन एक संवाददाता प्रणाली व्यायाम 1 से भोजी पर नजर रखने के रूप में GFP टैग LC3 व्यक्त किया करते थे। भोजी प्रेरण पर, LC3 कबरा संरचनाओं में autophagosome को cytosol से translocates। सेक्शनिंग के बाद, GFP-LC3 puncta के गठन सीधे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1 ए) द्वारा देखे जा सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, autophagosome संरचनाओं के लिए भी एक LC3 एंटीबॉडी द्वारा immunostained जा सकती हैइमेजिंग। या तो ट्रेडमिल व्यायाम के 90 मिनट या स्वैच्छिक चलाने का 2 सप्ताह दोनों कंकाल की मांसपेशी (उत्तर lateralis) और सेरेब्रल कॉर्टेक्स में GFP-LC3 puncta की संख्या में वृद्धि हुई है, आराम की हालत (चित्रा 1 बी) की तुलना में। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ललाट प्रांतस्था क्षेत्र मस्तिष्क में प्रमुख क्षेत्र है जहां भोजी स्पष्ट रूप से अब तक या तो विधि से प्रेरित है किया गया है। व्यायाम भी लिपिड संयुग्मित फॉर्म (LC3-II) साइटोसोलिक फॉर्म (LC3-आई), जो पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (चित्रा 1 सी) द्वारा पता लगाया जा सकता से LC3 के रूपांतरण के लिए प्रेरित किया।

autophagosomes (LC3-द्वितीय और GFP-LC3 puncta द्वारा प्रतिनिधित्व) के व्यायाम प्रेरित वेतन वृद्धि एक ऊंचा autophagic प्रवाह की वजह से है, बल्कि autophagosome गिरावट में एक ब्लॉक, इस तरह के bafilomycin A1 या क्लोरोक्वीन के रूप में लाइसोसोमल गिरावट के अवरोधकों के उपयोग द्वारा मूल्यांकन की तुलना । यहाँ हम एक पूर्व के रूप में autophagic माल रिसेप्टर p62 की गिरावट मापापर्याप्त। व्यायाम (ट्रेडमिल के 90 मिनट) आराम हालत है, जो क्लोरोक्वीन प्रायर के साथ इंजेक्शन द्वारा बचाया गया था (चित्रा 2) व्यायाम करने से कंकाल की मांसपेशी में p62 के एक उच्च गिरावट का कारण बना। इसी तरह के परिणाम भी पहियों चलाने के द्वारा स्वैच्छिक व्यायाम के साथ मनाया जाता है। इस प्रकार, ट्रेडमिल या चल पहियों द्वारा एरोबिक व्यायाम विवो में भोजी, LC3 के स्थिर राज्य स्तर और p62 की गिरावट से मापा लाती है।

आकृति 1
चित्रा 1. एरोबिक व्यायाम माउस ऊतकों में भोजी लाती है। प्रतिनिधि छवियाँ (ए) और कंकाल की मांसपेशी में GFP-LC3 puncta की मात्रा का ठहराव (बी) (उत्तर lateralis) और नियंत्रण हालत (आराम) के तहत GFP-LC3 ट्रांसजेनिक चूहों के मस्तिष्क (ललाट प्रांतस्था), के बाद मजबूर व्यायाम के 90 मिनट (ट्रेडमिल ) या स्वैच्छिक व्यायाम (पहिया) के 2 हफ्तों के बाद। परिणाममाउस प्रति 10 चित्रों का ± SEM मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं। एन = 5 चूहों। निम्न उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य इस्तेमाल किया गया: GFP - 525 एनएम; DAPI - 490 एनएम। (सी) कंकाल की मांसपेशी (उत्तर lateralis) में LC3 के पश्चिमी धब्बा का पता लगाने के लिए विश्राम किया और (ट्रेडमिल) के द्वारा प्रयोग चूहों से। मात्रा का ठहराव डेटा LC3-द्वितीय के स्तर actin (बाएं) और LC3-द्वितीय के अनुपात LC3-मैं करने के लिए (दाएं) के लिए सामान्यीकृत प्रतिनिधित्व करते हैं। एन = 3 चूहों। आँकड़ा नियंत्रण नमूना करने के लिए प्रत्येक मूल्य की तुलना है। परिणाम मतलब ± SEM *, पी <0.05 प्रतिनिधित्व करते हैं; **, पी <0.01; ***, पी <0.001, टी परीक्षण। स्केल बार, 25 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. व्यायाम माउस कंकाल की मांसपेशी में भोजी प्रवाह बढ़ जाता। (ए) पश्चिमी धब्बाउपस्थिति या लाइसोसोमल अवरोधकों क्लोरोक्वीन की अनुपस्थिति में विश्राम किया और प्रयोग चूहों से उत्तर lateralis में p62 का पता लगाने। (बी) (बाएं) p62 इसी actin बैंड के लिए सामान्यीकृत की मात्रा विश्लेषण। (सही) p62 प्रवाह क्लोरोक्वीन इलाज p62 के उस से पीबीएस इलाज p62 की सामान्यीकृत densitometric मूल्य घटाकर द्वारा निर्धारित किया जाता है। परिणाम मतलब ± SEM एन = 3 चूहों प्रतिनिधित्व करते हैं। *, पी <0.05, टी परीक्षण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

भोजी एक catabolic प्रक्रिया है कि ऊर्जा प्रदान करता है और कोशिका द्रव्य घटकों या क्षतिग्रस्त अंगों की लाइसोसोमल गिरावट से cytotoxicity कम कर देता है। पढ़ रही भोजी सेलुलर homeostasis का विनियमन और तनाव की प्रतिक्रिया के तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। नए मॉडल और तरीके में अनुसंधान के क्षेत्र में 15 में उभर रहे हैं, का अध्ययन करने के लिए कैसे बिगड़ा भोजी कई रोग प्रक्रियाओं 16, 17 के लिए योगदान देता है।

पोषक तत्वों के अभाव (भुखमरी) और औषधीय प्रेरण आमतौर पर इन विट्रो और इन विवो में भोजी प्रेरित करने के तरीकों का इस्तेमाल किया जाता है। इन विधियों, विशेष रूप से पशु मॉडल के लिए, प्रतिकूल प्रभाव है कि समग्र परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं दिखा सकते हैं। उदाहरण के लिए, के बाद से यह भुखमरी के कम से कम 48 घंटा की आवश्यकता है भोजी की एक detectable स्तर के लिए प्रेरित करने, पशु ऊर्जा नियमित रूप से मोटर गतिविधि के लिए आवश्यक नहीं हो सकता है जोकई बाद व्यवहार के अध्ययन के परिणाम को प्रभावित करता है। फिर भी औषधीय inducers भी भोजी मार्ग के लिए विशिष्टता की कमी के कारण साइड इफेक्ट हो सकता है। प्रमुख भोजी inducer rapamycin और उसके डेरिवेटिव mTOR गतिविधि को दबाने और चयापचय रोग और प्रतिरक्षादमन 18, 19, 20, जो लंबे समय तक इलाज के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन में ध्यान में रखा जाना चाहिए कारण। इस प्रकार, हम पशु मॉडल में भोजी क्रियान्वयन के लिए अधिक शारीरिक और मजबूत तरीके पर काम कर रहा है।

के रूप में हाल ही में हम और दूसरों की पहचान की है व्यायाम एक प्रभावी, तेजी से और इन विवो 7, 8, 9 में सुरक्षित भोजी inducer। ट्रेडमिल और स्वैच्छिक व्यायाम से दोनों मजबूर व्यायाम पहिया चलाने के द्वारा भोजी एक पर व्यायाम के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैctivation, व्यायाम की अवधि और तीव्रता 21, 22 में बदलाव के साथ। उदाहरण के लिए, ट्रेडमिल के एक घंटे चल रहा है (40 एम / मिनट की एक अधिकतम करने के लिए 10 मीटर / मिनट की गति से शुरू) लाती कंकाल की मांसपेशी 21 में प्रचुर मात्रा में LC3 lipidation, और लंबी अवधि के स्वैच्छिक पहिया 3 महीने या 4 के लिए चल रहा है - 5 हफ्तों बेसल भी भोजी बढ़ जाती है और कंकाल की मांसपेशी 21, 22 में भोजी प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बढ़ाता है।

यहाँ हम वर्णित है और चूहों व्यायाम करने के लिए दो तरीकों (ट्रेडमिल और चल पहिया) की तुलना में, और भोजी प्रेरण में उच्च दक्षता के साथ कम प्रोटोकॉल अनुकूलित प्रस्तुत किया। प्रत्येक दृष्टिकोण पेशेवरों और बुरा है। ट्रेडमिल पर मजबूर व्यायाम के 90 मिनट की एक एकल मुक्केबाज़ी कंकाल की मांसपेशी और दिमाग में भोजी प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है। हम ट्रेडमिल व्यायाम 7 के एक समय के पाठ्यक्रम किया है, और है कि exerci पायाएसई यहाँ वर्णित शर्तों माउस कंकाल की मांसपेशी, जो भी दूसरों 23 द्वारा मान्य है में भोजी के अधिकतम स्तर को प्रेरित। इन शर्तों के तहत, चूहों एरोबिक व्यायाम से गुजरना; जैसा कि पहले बताया, एरोबिक व्यायाम, लंबे समय तक एक ट्रेडमिल 24, 25, 26 पर गति में क्रमिक वृद्धि के साथ चल रहा है से प्रेरित है जबकि अवायवीय हालत उच्च तीव्रता व्यायाम की एक छोटी अवधि, जो मांसपेशियों बढ़ जाती है, लेकिन जरूरी नहीं है कि व्यायाम बढ़ाने के द्वारा प्राप्त की है धीरज 27, 28। इसके अलावा, चलने की गति इस प्रोटोकॉल में यहां बताया सकारात्मक ऑक्सीजन की खपत क्षमता के साथ, एरोबिक क्षमता 29 का आकलन करने के लिए संबद्ध अप्रत्यक्ष तरीकों से। इसलिए, एक ट्रेडमिल पर एरोबिक व्यायाम एक तेजी से और प्रभावी भोजी प्रेरित करने के लिए एक रास्ता है।

हालांकि, forcएड एक बंद जगह में चल रहे चूहों को तनाव लागू हो सकती है। इस प्रकार, जानवरों के लिए अतिरिक्त तनाव देने से बचने के लिए, हम, उंगली nudges या तार tassels का प्रयोग कर एक विधि के रूप में के बजाय चूहों चालू रखने के लिए निर्मित में बिजली के झटके। ट्रेडमिल की तुलना में, चल पहिया के उपयोग के कई फायदे हैं। यह कम तनावपूर्ण है, 'शोधकर्ताओं ने अवलोकन समय की आवश्यकता नहीं है, और भोजी सक्रियण के दीर्घकालिक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सुविधाजनक है। फिर भी चल रहे एक पहिया पर व्यायाम स्वैच्छिक है और इस प्रकार विभिन्न चूहों या अलग अलग दिनों पर ही माउस के बीच दूरी और गति से चल रहा है के संदर्भ में परिवर्तनशीलता उत्पन्न करता है। इसलिए, यह समय के लिए (जैसे, कई हफ्तों) व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता को कम करने की एक विस्तारित अवधि के लिए एक पहिया पर चूहों को चलाने के लिए आवश्यक है। महत्वपूर्ण बात है, दृष्टिकोण भी है कि माउस वास्तव में चल रहा है सत्यापित करने के लिए रात में एक ओडोमीटर का उपयोग कर की आवश्यकता है। हम 2 सप्ताह की अवधि में जंगली प्रकार C57BL / 6 चूहों की औसत दूरी की दौड़ मापा जाता है, और पाया कि वे अनुमानित चलानेmately 1 किमी / प्रशिक्षण की शुरुआत में रात दिन (1) और करने के लिए 8 तक चला सकते हैं - 14. कुल मिलाकर दिन में 10 किमी / रात, चल पहिया, सबसे अंगों में भोजी प्रोत्साहित करने के लिए एक प्रभावी तरीका है, हालांकि, यह कठिन है कंकाल की मांसपेशी में autophagosome संचय कब्जा करने के लिए ट्रेडमिल का उपयोग करने के लिए की तुलना में। कारण कंकाल की मांसपेशी एक उच्च autophagic प्रवाह और एक तेजी से गिरावट autophagosome दर है, जो GFP-LC3 puncta माप द्वारा भोजी प्रेरण पता लगाने के लिए चलाने के बाद तत्काल ऊतक कटाई की आवश्यकता है कि है। या तो प्रोटोकॉल, तेजी से पीएफए ​​छिड़काव और पशु इच्छामृत्यु के बाद ऊतकों के निर्धारण में प्रक्रिया के एक महत्वपूर्ण कदम autophagosome संरचनाओं कि अन्यथा आसानी से विच्छेदन के दौरान अपमानित कर रहे हैं की रक्षा करने के लिए है।

इस प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे मस्तिष्क और कंकाल की मांसपेशी सहित माउस ऊतकों में भोजी प्रोत्साहित करने के लिए एरोबिक व्यायाम का उपयोग करें। इन विधियों मीटर में भोजी मार्ग के तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताऐसे mitochondrial रखरखाव 23 के रूप में ऊतक समारोह के aintenance, और व्यवहार और ऐसे cannabinoids 9 के एनाल्जेसिक प्रभाव को बढ़ाने के रूप में पशु रोग मॉडल, के स्वास्थ्य के नियमन पर भोजी प्रेरण के दीर्घकालिक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए। दोनों ट्रेडमिल और चल पहिया तरीकों भोजी का एक अच्छा स्तर प्रेरित; अभी तक यह जब सबसे अच्छा तरीका अलग अनुसंधान के लक्ष्यों को पूरा करने के लिए चुनने के लिए अपने मतभेदों पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Treadmill Columbus Instruments 150-RM Exer 3/6
Mouse running wheel Super Pet 100079365 diameter 11.4 cm
Odometer Bell DASHBOARD 100
Syringe pump KD Scientific KDS100
Fluorescence microscope Nikon Model: inverted microscope ECLIPSE
Cryostat Leica CM 1850UV
Homogenizer IKA 003737001 / Model: T10 Basic S1
Chloroquine CAYMAN CHEMICAL COMPANY 14194
Parafolmaldehye SIGMA-ALDRICH P6148 Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer.
Mounting media Vector Laboratories H-1200
p62 antibody BD Biosciences 610833
LC3 antibody Novus Biologicals NB100-2220
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad Laboratories 161-0737
ImageJ NIH

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 120 भोजी व्यायाम LC3 मस्तिष्क मांसपेशियों क्लोरोक्वीन माइक्रोस्कोपी माउस
चूहे में एरोबिक व्यायाम से भोजी को सक्रिय
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Rocchi, A., He, C. Activating… More

Rocchi, A., He, C. Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice. J. Vis. Exp. (120), e55099, doi:10.3791/55099 (2017).

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