Summary
attivazione autofagia è utile nella prevenzione di varie malattie. Uno degli approcci fisiologiche per indurre autofagia in vivo è l'esercizio fisico. Qui mostriamo come attivare l'autofagia da esercizi aerobici e misurare i livelli di autofagia nei topi.
Introduction
Autofagia è un percorso di degradazione evolutivamente conservato, che viene indotta in risposta a varie condizioni di stress come la fame e ipossia 1, 2. Durante l'autofagia, vescicole a doppia membrana, chiamato autofagosomi, incorporano componenti subcellulari inutili o danneggiati e trasportarli nei lisosomi per la degradazione 3. Autofagia basale è essenziale per la funzione cellulare e lo sviluppo dell'organismo, e alterata autofagia basale è implicato in molti disturbi, tra cui neurodegenerazione, tumorigenesi e diabete di tipo 2 4, 5, 6.
Il più noto autofagia induttore fisiologico è fame. Tuttavia, ha due limitazioni principali. In primo luogo, la fame richiede un lungo periodo di indurre l'autofagia in modo efficace negli animali, ad esempio, 48 ore di restrizione alimentare nei topinella maggior parte degli organi. In secondo luogo, la fame induce a malapena autofagia cervello, a causa di un apporto di sostanze nutritive relativamente stabile nel cervello. In realtà, è anche difficile da rilevare induzione autofagia dagli induttori di piccole molecole, come molti farmaci non possono passare la barriera emato-encefalica. Così, per analizzare meglio la funzione di attivazione dell'autofagia nella patogenesi della malattia, abbiamo recentemente scoperto che l'esercizio fisico è più potente metodo fisiologico per indurre autofagia in un breve periodo di tempo 7, 8, 9. Rispetto fame, autofagia è effettivamente indotta da tapis roulant in esecuzione veloce come 30 min. Pertanto, l'esercizio fisico è un approccio fisiologico comodo e potente per studiare il meccanismo di autofagia nel mediare benefici per la salute e la prevenzione delle malattie.
Ci sono diversi marcatori proteici per la rilevazione di attività autofagia, tra cui LC3 e P62. LC3 (associata ai microtubuli proteina 1A / 1B-luce cHain 3) è una proteina citoplasmatica (LC3-formo) che viene coniugato con PE (fosfatidiletanolamina) su induzione autofagia. LC3 PE-lipidated (modulo LC3-II) viene reclutato su membrane autophagosomal e può essere utilizzato per visualizzare autophagosomes quando etichettati con GFP. La sua traslocazione dal citosol puntata strutture di autophagosomes al microscopio è un'indicazione di induzione autofagia. p62 è un recettore di carico per supporti autofagia (come proteine ubiquitinazione), ed è incorporato autophagosomes pure. Poiché la proteina è degradata in lisosomi insieme autophagosomes, i suoi livelli possono essere usati per misurare il flusso autofagia. Qui mostriamo come utilizzare questi marcatori di quantificare l'autofagia in diversi tessuti di topo indotte da esercizio aerobico, compreso l'esercizio forzato (tapis roulant) e esercizio volontario (in esecuzione ruote). Le stesse procedure possono essere applicate anche alla misurazione in vivo dell'autofagia dopo il trattamento di altri induttori.
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Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida approvate dal Comitato Northwestern University istituzionale cura degli animali e Usa (IACUC).
1. modelli murini
- Utilizzare 8-12 settimane di età topi nella formazione esercizio. Per rilevare l'autofagia esercitato indotta in vivo, utilizzare il topi transgenici GFP-LC3 (C57BL / 6 di fondo) per studi di imaging e C57BL / 6 topi per le analisi biochimiche.
2. L'autofagia indotta da esercizio
- Messa a punto Treadmill - esercizio forzata
- Acclimatarsi e formare i topi in un 10 ° in salita tapis roulant aperto per 2 giorni. Il giorno 1, esercitare i topi per 5 min a 8 m / min, e il giorno 2, esercitare i topi per 5 min a 8 m / min seguito da un altro 5 min a 10 m / min 10. Incoraggiare i topi per eseguire delicatamente gomitata mano.
- Il giorno 3 °, lasciare che i topi sottoposti a un singolo attacco di corsa per 90 minuti a 10 ° in salita tapis roulant, starting alla velocità di 10 m / min. Dopo 40 min, aumentare la velocità treadmill ad una velocità di 1 m / min ogni 10 min per un totale di 30 min, e quindi aumentare la velocità alla velocità di 1 m / min ogni 5 min fino a raggiungere 17 m / min, per un totale di 90 minuti di tempo di esercizio e 1.070 metri di corsa a distanza.
- Impostare lo stimolo elettrico ad una gamma bassa intensità (1,2 Hz), e incoraggiare i topi a correre per evitare scosse piede ripetuto.
- Per la raccolta dei tessuti, eutanasia i topi per inalazione isoflurano, seguita da dislocazione cervicale immediatamente dopo l'esercizio. Altri metodi approvati eutanasia possono anche essere utilizzati, come CO2 o iniezione IP di altri anestetici. Il livello di autofagia non sembra essere influenzata da metodi di eutanasia.
- Messa a punto della ruota Running - esercizio volontario
- Posizionare una rotella del mouse-esecuzione (11,4 cm) all'interno di una gabbia con un mouse a singolo alloggiati.
- Verificare la capacità corrente con una contachilometri bicicletta.Impostare il parametro della ruota [distanza (in mm) per ogni rotazione completa della ruota] a 358 (11.4 * π). Misurare la distanza in esecuzione dopo 24 ore.
- Lasciate il mouse correre volontariamente per 2 settimane con la ruota in esecuzione. Per la raccolta dei tessuti, sacrificare il mouse al mattino dopo il periodo di esecuzione.
3. L'autofagia Flux valutazione
- Per misurare il flusso autofagica in condizioni di riposo e di esercizio, trattare i topi con la clorochina inibitore autofagia per tre giorni e confrontarle con topi trattati con PBS.
- Sciogliere clorochina in PBS (5 mg / ml), e iniettare clorochina in topi per via intraperitoneale alla dose di 50 mg / kg / giorno per tre giorni consecutivi. Sacrificio topi e raccogliere i tessuti 3 ore dopo l'ultima iniezione.
- Per i topi esercitati, li pretrattare con clorochina per due giorni consecutivi alla dose di 50 mg / kg / giorno. Il terzo giorno, iniettare i topi con la stessa concentrazione di clorochina, e dopo90 min li fanno correre sul tapis roulant per altri 90 min.
- Euthanize topi per inalazione isoflurano, seguita da dislocazione cervicale. Raccogliere tessuti immediatamente dopo l'esecuzione, in modo che il tempo totale di incubazione della clorochina è la stessa di controllo (a riposo) topi (3 ore).
NOTA: In alternativa, utilizzare una singola iniezione di clorochina per determinare il flusso autofagia nei tessuti di topo.
4. Tessuto Raccolta e Fixation
- Prima della raccolta dei tessuti preparare tampone fosfato salino (PBS) e fresca 4% paraformaldeide (PFA, attenzione: dispositivi di protezione individuale richiesto) in PBS a un pH finale di 7,4. Conservare entrambe le soluzioni a 4 ° C.
- Riempire 30 ml siringa con 15 - 20 ml di PFA 4% (per i topi GFP-LC3). Collegare la siringa con un ago G 20 del catetere.
- Dopo l'esercizio, eutanasia i topi per inalazione isoflurano, seguita da dislocazione cervicale.
- Posto l'animale su una superficie di lavoro pulita sul suo back. Tagliare e aprire la cavità toracica tagliando il diaframma per esporre il cuore.
- Effettuare una piccola incisione sul fegato per lasciare il sangue uscire, e iniettare un totale di 15 ml 4% PFA lentamente nel ventricolo destro del cuore attraverso il catetere, fino al polmone e fegato girare completamente pallido. Profumato il mouse immediatamente dopo la sessione di esercizio, utilizzando una pompa a siringa con una portata costante di 90 ml / h.
- Dopo la perfusione, rimuovere l'ago e raccogliere i tessuti di interesse (ad esempio, del cervello 11 e muscolo scheletrico). Per muscolo scheletrico, sezionare vasto laterale. Brevemente, tirare la pelle della gamba all'indietro per esporre i muscoli, localizzare il quadricipite femorale 12 e sezionare vasto laterale, che è il muscolo esterno collegato alla parte superiore dell'osso femorale.
- Per ulteriori fissazione e disidratazione, posizionare i tessuti di topi GFP-LC3 in 4% PFA per 24 ore a 4 ° C, e poi trasferirli al 15%saccarosio-PBS a 4 ° C durante la notte o fino a quando i tessuti sono stabiliti, e quindi al 30% di saccarosio-PBS a 4 ° C durante la notte o per più lunghi periodi. Conservare i campioni al buio per quanto possibile in quanto possono essere sensibili a luce intensa.
- Per l'analisi Western Blot scatto congelare i tessuti da C57BL / 6 topi direttamente in azoto liquido, e conservare a -80 ° C.
5. Analisi Imaging di GFP-LC3 Puncta
- processo Tissue
- Pre-trattare i tessuti (precedentemente fissate in PFA e conservati nel 30% di saccarosio) nel mezzo di inclusione come "ottimali di taglio composto temperatura" (OCT) per pochi minuti in una piccola capsula di Petri etichettati.
- Trasferire il tessuto in una cryomold l'etichetta che contiene abbastanza fresco di Office per coprire il tessuto. Orient superficie sezionamento verso il fondo della cryomold (sezione per il muscolo vasto laterale e sezione sagittale per la emi-cervello). Evitare la formazione di bolle.
- freÈze campioni ponendo il cryomold per pochi minuti in un dispositivo di raffreddamento di schiuma coperto riempito con ghiaccio secco, fino PTOM diventa bianco. Avvolgere singoli campioni in fogli etichettati, chiuderli in un sacchetto di plastica, e conservarli a -80 ° C durante la notte o più a lungo.
- Utilizzare un criostato per tagliare le sezioni di esempio con uno spessore di 10 micron, e montare le sezioni sulle slitte. Conservare i vetrini a -20 ° C, e sempre tenere i vetrini al riparo dalla luce, quando possibile.
- preparazione del vetrino
- Estrarre i vetrini dal congelatore e scongelare a temperatura ambiente. Coprire la sezione di tessuto con una goccia di mezzo di montaggio con DAPI. Collocare un vetrino di dimensioni adeguate in cima ed evitare la formazione di bolle.
- Utilizzare smalto per sigillare i bordi del vetrino, consentire smalto si asciughi al buio a temperatura ambiente, e quindi memorizzare le diapositive in un contenitore a tenuta di luce a 4 ° C, o procedere con l'imaging cattura di GFP-LC3 puncta.
- <strong> La quantificazione di GFP - LC3 puncta al microscopio a fluorescenza
- Eseguire epifluorescenza, catturando le immagini nella stessa condizione (esposizione e le impostazioni) per tutti i campioni. Per GFP, utilizzare una lunghezza d'onda di emissione di 525 nm; per DAPI, usare 490 nm. Acquisire almeno dieci immagini al campione utilizzando un obiettivo 60X per vasto laterale e la regione della corteccia frontale del cervello.
- Quantificare il numero di GFP-LC3 puncta in una zona di tessuto di 2.500 micron 2 in ogni immagine per l'analisi statistica, accecato per gruppi sperimentali. Calcolare il numero medio di 10 immagini di ogni campione, utilizzando la funzione di misura automatica di "conteggio degli oggetti". Impostazioni per il muscolo vasto laterale sono: Soglia L = 10, H = 200; 2X liscia; 1X pulito, e le impostazioni per la corteccia frontale del cervello sono: Soglia L = 11, H = 200; 2X liscia; 1X pulito.
6. occidentale Analisi Blot su autofagia Marcatori
- <strong> processo Tissue
- Preparare il tampone di lisi: 50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; inibitore della proteasi e inibitori della fosfatasi (appena aggiunto).
- Rimuovere il tessuto di C57BL 6 topi / da -80 ° C di stoccaggio. Tagliare il tessuto muscolare in piccoli pezzi con una lama di rasoio prima il seguente processo. Aggiungere 800 ml (per emi-cervello) o 500 ml (per vasto laterale) di tampone di lisi freddo al campione. Omogeneizzare il campione a 4 ° C con un omogeneizzatore ad una velocità media.
- Completamente lisare la miscela omogeneizzata per altri 30 minuti per 1 ora a 4 ° C con rotazione.
- Centrifugare l'omogeneizzato a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C, scartare il pellet, e raccogliere il surnatante in una nuova provetta.
- analisi autofagia
- Determinare la concentrazione di proteine di lisati di tessuto utilizzando il kit di test BCA Protein in base alle specifiche del costruttore. Normalizzare ogni campionealla stessa concentrazione.
- Unire il campione con il tampone 2x Laemmli in un rapporto 1: 1, far bollire a 95 ° C per 5 - 10 minuti, e procedere con l'analisi Western Blot su autofagia marcatori 13, 14, come ad esempio P62 (anticorpo anti-P62, diluizione 1: 500) e LC3 (anticorpo anti-LC3, diluizione 1: 500). Lessare i campioni immediatamente dopo l'aggiunta del tampone, come più incubazione in ghiaccio può generare più bande degradate LC3.
- Quantificare P62 e LC3 bande di analisi densitometria utilizzando ImageJ, e normalizzare il valore al corrispondente banda di actina.
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Representative Results
Questo protocollo descrive due diversi metodi per indurre l'autofagia nei tessuti di topo di esercizio aerobico: un totale di 90 minuti di esercizio fisico forzato su un tapis roulant a più corsie preceduto da due giorni di acclimatazione; o due settimane di esercizio volontario su una ruota in esecuzione usato dai topi alloggiati individualmente. In ogni protocollo di esercizio, siamo in grado di misurare il flusso autofagia da microscopia a fluorescenza e l'analisi Western Blot in vari organi.
Abbiamo usato una linea di topo transgenico che esprimono GFP-LC3 etichettato come un sistema reporter per monitorare l'autofagia con l'esercizio 1. Al momento di induzione autofagia, LC3 trasloca dal citoplasma al autofagosoma in strutture puntiformi. Dopo il sezionamento, la formazione di GFP-LC3 puncta può essere direttamente visualizzato mediante microscopia a fluorescenza (Figura 1A). In alternativa, strutture dell'autofagosoma possono anche essere immunoistochimica da un anticorpo LC3 perimaging. O 90 minuti di esercizio treadmill o 2 settimane di corsa volontaria aumentato il numero di GFP-LC3 puncta sia muscolo scheletrico (vasto laterale) e nella corteccia cerebrale, rispetto alla condizione di riposo (Figura 1B). Va notato che la regione corteccia frontale è stato regione importante nel cervello dove autofagia è chiaramente indotta da entrambi i metodi finora. Esercizio anche indotto la conversione di LC3 dalla forma citosolica (LC3-I) alla forma lipidi coniugato (LC3-II), che può essere rilevato mediante analisi western blot (Figura 1C).
incremento Esercizio indotta autophagosomes (rappresentate da LC3-II e GFP-LC3 puncta) è dovuto ad un flusso autophagic elevata, piuttosto che un blocco nella degradazione autofagosoma, valutata mediante l'uso di inibitori di degradazione lisosomiale, come bafilomicina A1 o clorochina . Qui abbiamo misurato il degrado del autofagica p62 recettore carico come un exampio. Esercizio (90 min di treadmill) ha causato una maggiore degradazione di p62 nel muscolo scheletrico rispetto alla condizione di riposo, che è stato salvato da iniezione con clorochina prima dell'esercizio (Figura 2). I risultati simili si osservano anche con l'esercizio fisico volontario eseguendo ruote. Così, l'esercizio aerobico con tapis roulant o in esecuzione ruote induce l'autofagia in vivo, misurato dal livello di stato stazionario di LC3 e la degradazione di p62.
Figura 1. Esercizio aerobico Induce autofagia in mouse tessuti. Immagini rappresentative (A) e la quantificazione (B) di GFP-LC3 puncta nel muscolo scheletrico (vasto laterale) e il cervello (corteccia frontale) di GFP-LC3 topi transgenici sotto la condizione di controllo (a riposo), dopo 90 minuti di esercizio fisico forzato (tapis roulant ) o dopo 2 settimane di esercizio volontario (ruota). Risultatos rappresentano media ± SEM di 10 immagini al mouse. N = 5 topi. I seguenti lunghezze d'onda di emissione sono stati utilizzati: GFP - 525 nm; DAPI - 490 nm. (C) la rilevazione Western Blot di LC3 nel muscolo scheletrico (vasto laterale) da topi riposato e esercitate (dal tapis roulant). dati di quantificazione rappresentano il livello di LC3-II normalizzata actina (sinistra) e il rapporto di LC3-II LC3-I (a destra). N = 3 topi. Statistica sta confrontando ogni valore al campione di controllo. I risultati rappresentano media ± sem *, P <0.05; **, P <0,01; ***, P <0.001, t-test. barra della scala, 25 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. L'esercizio fisico aumenta autofagia Flux in mouse muscolo scheletrico. (A) Western blotrilevamento di p62 nel vasto laterale di topi riposato e esercitato in presenza o assenza degli inibitori lisosomiali clorochina. (B) (Sinistra) analisi Quantificazione di p62 normalizzata per fascia di actina. (Destro) Il flusso p62 è determinata sottraendo il valore densitometrica normalizzato di p62 PBS trattati da quella di p62 clorochina-trattata. I risultati rappresentano media ± SEM n = 3 topi. *, P <0,05, t-test. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Autofagia è un processo catabolico che fornisce energia e riduce citotossicità dalla degradazione lisosomiale di anticitoplasma o organelli danneggiati. Studiare l'autofagia è importante capire la regolazione dell'omeostasi cellulare e meccanismi di risposta allo stress. Nuovi modelli e metodologie stanno emergendo nel campo della ricerca 15, per studiare come alterata autofagia contribuisce a numerosi processi patologici 16, 17.
Privazione di nutrienti (inedia) e induzione farmacologica sono comunemente usati approcci per indurre autofagia in vitro e in vivo. Questi metodi, in particolare per i modelli animali, possono mostrare effetti negativi che possono influenzare i risultati complessivi. Ad esempio, dal momento che richiede almeno 48 ore di fame per indurre un livello rilevabile dell'autofagia, gli animali non possono avere l'energia necessaria per l'attività motoria regolare,colpisce il risultato di molti studi comportamentali successivi. Eppure induttori farmacologici possono anche portare ad effetti collaterali a causa della loro mancanza di specificità al percorso autofagia. Il principale rapamicina autofagia induttore e suoi derivati sopprimere l'attività di mTOR e causano disfunzioni metaboliche e immunosoppressione 18, 19, 20, che dovrebbe essere preso in considerazione nel progetto sperimentale per il trattamento a lungo termine. Così, abbiamo lavorato sui modi più fisiologico e robusti per l'attivazione dell'autofagia in modelli animali.
Esercizio Recentemente noi ed altri hanno identificato come un efficace, sicuro autofagia induttore velocemente e in vivo 7, 8, 9. Entrambi esercizio costretto da tapis roulant e esercizio volontario eseguendo ruota sono stati utilizzati per analizzare gli effetti dell'esercizio fisico sulla autofagia unctivation, con variazioni di durata e di intensità di esercizio 21, 22. Ad esempio, un'ora di treadmill in esecuzione (Avvio a velocità di 10 m / min fino ad un massimo di 40 m / min) induce abbondante lipidation LC3 nel muscolo scheletrico 21, e la ruota volontaria a lungo termine in esecuzione per 3 mesi o 4 - 5 settimane aumenta anche basali autofagia e aumenta l'espressione delle proteine autofagia nel muscolo scheletrico 21, 22.
Qui abbiamo descritto e confrontato i due metodi (tapis roulant e ruota in esecuzione) di esercitare i topi, e presentato ottimizzato i protocolli più brevi ad alta efficienza in induzione autofagia. Ogni approccio ha i suoi pro e contro. Un singolo attacco di 90 minuti di esercizio fisico forzata sul tapis roulant è sufficiente per indurre l'autofagia nel muscolo scheletrico e nel cervello. Abbiamo fatto un corso a tempo di tapis roulant esercizio 7, e ha scoperto che il Esercicondizioni SE qui descritte inducono il livello massimo di autofagia nel topo muscoli scheletrici, che viene convalidato anche da altri 23. In queste condizioni, i topi sottoposti a esercizio aerobico; come riportato in precedenza, l'esercizio aerobico è indotta eseguendo prolungato con un graduale incremento velocità su un tapis roulant 24, 25, 26, mentre la condizione anaerobica si ottiene una breve durata di esercizio ad alta intensità, che aumenta la massa muscolare, ma non necessariamente aumentare esercizio la resistenza 27, 28. Inoltre, la velocità di funzionamento riportata qui in questo protocollo è correlata positivamente con capacità di consumo di ossigeno, con metodi indiretti per valutare la capacità aerobica 29. Pertanto, l'esercizio aerobico su un tapis roulant è un modo veloce ed efficace per indurre l'autofagia.
Tuttavia, FORCEd in esecuzione in uno spazio chiuso può esercitare stress per topi. Così, per evitare di dare ulteriore stress per gli animali, usiamo dito trilli o nappe di filo come un metodo per mantenere i topi correre, anziché il built-in di scosse elettriche. Rispetto al treadmill, l'uso di ruota portante ha molti vantaggi. E 'meno stressante, non necessita di tempo di osservazione dei ricercatori, ed è comodo per studiare gli effetti a lungo termine di attivazione autofagia. Eppure esercizio su una ruota in esecuzione è volontaria e genera quindi la variabilità in termini di esecuzione di distanza e velocità tra i diversi topi o lo stesso mouse su diversi giorni. Pertanto, è necessario eseguire topi su una ruota per un lungo periodo di tempo (ad esempio, diverse settimane) per ridurre al minimo la variabilità individuale. È importante sottolineare che l'approccio richiede anche utilizzando un odometro notte per verificare che il mouse è effettivamente in esecuzione. Abbiamo misurato la distanza media di funzionamento di wild-type C57BL 6 topi / per un periodo di 2 settimane, e abbiamo trovato che corrono Approxinell'intervallo 1 km / notte all'inizio della formazione (giorno 1) e può funzionare fino a 8 - 10 km / notte al giorno 14. Nel complesso, la ruota portante è un metodo efficace per stimolare l'autofagia nella maggior parte degli organi, anche se, è più difficile catturare accumulo dell'autofagosoma nel muscolo scheletrico rispetto all'utilizzo del tapis roulant. La ragione è che il muscolo scheletrico ha un elevato flusso autophagic e un tasso di degradazione rapida autofagosoma, che richiede la raccolta immediata del tessuto dopo l'esecuzione per rilevare l'induzione autofagia mediante misurazione puncta GFP-LC3. In entrambi i protocolli, rapida perfusione PFA e la fissazione dei tessuti dopo l'eutanasia degli animali è un passaggio fondamentale della procedura di preservare le strutture autofagosoma che altrimenti si degrada facilmente durante la dissezione.
Questo protocollo viene illustrato come utilizzare l'esercizio aerobico per stimolare l'autofagia nei tessuti di topo, tra cervello e muscoli scheletrici. Questi metodi possono essere utilizzati per studiare i meccanismi della via autophagy in manutenzione di funzione del tessuto, come la manutenzione mitocondriale 23, e per studiare gli effetti a lungo termine di induzione autofagia sulla regolazione del comportamento e della salute dei modelli di malattie degli animali, come ad esempio potenziando gli effetti analgesici dei cannabinoidi 9. Entrambi i metodi di tapis roulant e ruota in esecuzione inducono un buon livello di autofagia; ma è importante prendere in considerazione le loro differenze al momento di scegliere l'approccio migliore per soddisfare le diverse obiettivi di ricerca.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Treadmill | Columbus Instruments | 150-RM Exer 3/6 | |
| Mouse running wheel | Super Pet | 100079365 | diameter 11.4 cm |
| Odometer | Bell | DASHBOARD 100 | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Model: inverted microscope ECLIPSE | |
| Cryostat | Leica | CM 1850UV | |
| Homogenizer | IKA | 003737001 / Model: T10 Basic S1 | |
| Chloroquine | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
| Parafolmaldehye | SIGMA-ALDRICH | P6148 | Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer. |
| Mounting media | Vector Laboratories | H-1200 | |
| p62 antibody | BD Biosciences | 610833 | |
| LC3 antibody | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0737 | |
| ImageJ | NIH |
References
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