Summary
Autophagy aktivering er gavnlig til forebyggelse af en række sygdomme. En af de fysiologiske fremgangsmåder til at inducere autofagi in vivo er fysisk træning. Her viser vi, hvordan du aktiverer autophagy af aerob træning og måle autofagi niveauer i mus.
Introduction
Autophagy er en evolutionært bevaret nedbrydningsvej, som induceres som respons på forskellige stressbetingelser såsom sult og hypoxi 1, 2. Under autophagy, dobbelt-membran vesikler, kaldet autophagosomes, indarbejde unødvendige eller beskadigede subcellulære komponenter og transportere dem i lysosomer for nedbrydning 3. Basal autophagy er afgørende for cellefunktion og organisme udvikling, og nedsat basal autofagi er impliceret i mange lidelser, herunder neurodegeneration, tumordannelse og type 2 diabetes 4, 5, 6.
Den bedst kendte fysiologiske autophagy inducer er sult. Men det har to store begrænsninger. Først sult tager lang tid til effektivt at fremkalde autophagy hos dyr, fx 48 timers mad begrænsning i musi de fleste organer. Sekund, sult inducerer næppe hjerne autofagi, på grund af en relativt stabil forsyning af næringsstoffer i hjernen. Faktisk er det også vanskeligt at påvise autophagy induktion med små molekyler induktorer, som mange lægemidler ikke kan passere blod-hjerne barrieren. Således bedre til at analysere funktionen af autofagi aktivering i sygdom patogenese, vi for nylig opdaget, at motion er en mere potent fysiologisk metode til at inducere autofagi i en kort periode 7, 8, 9. Sammenlignet med sult, er autophagy effektivt fremkaldt af løbebånd køre så hurtigt som 30 min. , Motion er således en praktisk og potent fysiologisk tilgang til at studere den mekanisme af autofagi ved mediering sundhedsmæssige fordele og forebygge sygdomme.
Der er flere proteinmarkører til påvisning af autophagy aktivitet, herunder LC3 og P62. LC3 (mikrotubulus-associeret protein 1A / 1B-light cHain 3) er et cytosolisk protein (LC3-I-form), der er konjugeret til PE (phosphatidylethanolamin) ved autophagy induktion. PE-lipiderede LC3 (LC3-II form) rekrutteres på autophagosomal membraner og kan bruges til at visualisere autophagosomes når mærket med GFP. Dens translokation fra cytosolen til punktformet strukturer af autophagosomes under mikroskopi er en indikation af autofagi induktion. P62 er en last receptor for Autophagy substrater (såsom ubiquitinering proteiner), og er indarbejdet i autophagosomes samt. Da proteinet nedbrydes i lysosomer sammen med autophagosomes, kan dets niveau anvendes til at måle autofagi flux. Her viser vi, hvordan man bruger disse markører til at kvantificere autofagi i forskellige musevæv fremkaldt af aerobe motion, herunder tvungen motion (løbebånd) og frivillig motion (løb hjul). De samme fremgangsmåder kan også anvendes til in vivo måling af autophagy efter behandling af andre induktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer dyr blev udført i henhold til retningslinjer godkendt af Northwestern University Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).
1. musemodeller
- Brug 8-12 uger gamle mus i træningen. For at detektere udøves-induceret autophagy in vivo, bruge GFP-LC3 transgene mus (C57BL / 6 baggrund) til billeddiagnostiske undersøgelser og C57BL / 6 mus til biokemiske analyser.
2. Anstrengelsesudløst Autophagy
- Løbebånd setup - tvungen motion
- Akklimatisere og træne mus på en 10 ° opad åben løbebånd i 2 dage. På dag 1, udøve musene i 5 minutter ved 8 m / min, og på dag 2, udøve musene i 5 minutter ved 8 m / min efterfulgt af et andet 5 minutter ved 10 m / min 10. Tilskynd mus til at køre ved forsigtig hånd puf.
- På den 3. dag, lad musene gennemgå en enkelt anfald af at køre i 90 min på den 10 ° op ad bakke løbebånd, starting ved en hastighed på 10 m / min. Efter 40 minutter øges løbebåndet hastighed med en hastighed på 1 m / min hver 10 min i i alt 30 minutter, og derefter øge hastigheden med en hastighed på 1 m / min hver 5 min, indtil den når 17 m / min, for i alt 90 min motion tid og 1.070 meter kører afstand.
- Sæt den elektriske stimulus ved en lav intensitet interval (1,2 Hz), og tilskynde mus til at køre for at undgå gentagne mund chok.
- For væv indsamling, aflive musene ved isofluran inhalation, efterfulgt af cervikal dislokation umiddelbart efter træning. Andre godkendte eutanasi fremgangsmåder kan også anvendes, såsom CO2 eller IP-injektion af andre anæstetika. Niveauet af autofagi synes ikke at være påvirket af metoderne for eutanasi.
- Løb hjul setup - frivillig øvelse
- Placer en muse-running hjul (11,4 cm diameter) i et bur med en enkelt opstaldede mus.
- Kontroller kører kapacitet ved hjælp af en cykel kilometertæller.Opsæt hjulet parameter [afstand (i mm) pr fuld rotation af hjulet] på 358 (11,4 * π). Mål løbedistancen efter 24 timer.
- Lad musen køre frivilligt i 2 uger med løbehjul. For væv indsamling, ofrer musen om morgenen efter den kørende periode.
3. Autophagy Flux Evaluering
- For at måle autophagic flux under hvile og motion betingelser, behandle mus med autophagy inhibitor chloroquin i tre dage og sammenligne dem med mus behandlet med PBS.
- Opløs chloroquin i PBS (5 mg / ml), og injicere chloroquin i mus intraperitonealt i en dosis på 50 mg / kg / dag i tre på hinanden følgende dage. Sacrifice mus og indsamle væv 3 timer efter den sidste injektion.
- For udnyttede mus, forbehandle dem med chloroquin i to på hinanden følgende dage i en dosis på 50 mg / kg / dag. På den tredje dag, injiceres musene med den samme koncentration af chloroquin, og efter90 min lod dem køre på løbebåndet i en anden 90 min.
- Aflive musene ved isofluran inhalation, efterfulgt af cervikal dislokation. Indsamle væv umiddelbart efter kører, således at den samlede inkubationstid på chloroquin er det samme som kontrol (hviler) mus (3 timer).
BEMÆRK: Alternativt kan du bruge en enkelt injektion af chloroquin at bestemme autofagi flux i muse væv.
4. Tissue Høst og fiksering
- Før væv høst forberede phosphatbufret saltvand (PBS) og frisk 4% paraformaldehyd (PFA, forsigtighed: personligt beskyttelsesudstyr påkrævet) i PBS ved en endelig pH på 7,4. Opbevar begge løsninger ved 4 ° C.
- Fyld 30 ml sprøjte med 15 - 20 ml 4% PFA (for GFP-LC3 mus). Tilslut sprøjten med en 20 G kateter nål.
- Efter øvelsen, aflive musene ved isofluran inhalation, efterfulgt af cervikal dislokation.
- Placer dyret på en ren arbejdsflade på back. Klip og åbne brysthulen ved at skære i mellemgulvet at eksponere hjertet.
- Lave et lille snit på leveren for at lade blodet kommer ud, og injicere i alt 15 ml 4% PFA langsomt ind i højre ventrikel af hjertet via kateteret, indtil lungerne og leveren vende fuldstændig bleg. Perfundere musen umiddelbart efter træningen, ved anvendelse af en sprøjtepumpe med en konstant strømningshastighed på 90 ml / time.
- Efter perfusion, fjernes kanylen og indsamle væv af interesse (f.eks hjerne 11 og skeletmuskulatur). For skeletmuskulatur, dissekere de vastus lateralis. Kort beskrevet trække huden af benet bagud for at blotlægge musklerne, lokalisere quadriceps femoris 12, og dissekere ud vastus lateralis, hvilket er den eksterne muskel fastgjort til den øvre del af den femorale knogle.
- For yderligere fiksering og dehydrering, placere væv af GFP-LC3 mus i 4% PFA i 24 timer ved 4 ° C, og derefter overføre dem til 15%saccharose-PBS ved 4 ° C natten over, eller indtil vævene fast, og derefter til 30% saccharose-PBS ved 4 ° C natten over eller længere opbevaring. Hold prøverne i mørke så meget som muligt, da de kan være følsomme over for stærkt lys.
- Til Western blot-analyse snap fryse væv fra C57BL / 6-mus direkte i flydende nitrogen, og opbevar dem ved -80 ° C.
5. Imaging Analyse af GFP-LC3 puncta
- tissue proces
- Forbehandle væv (tidligere fastsatte i PFA og opbevaret i 30% saccharose) indstøbningsmedium såsom "Optimal Cutting Temperatur forbindelse" (OCT) for et par min i en mærket lille petriskål.
- Overfør vævet i en mærket kryoformen indeholder tilstrækkeligt frisk OLT til et dække vævet. Vend sektionering overflade mod bunden af kryoformen (tværsnit for vastus lateralis musklen og sagittale sektion for hemi-hjerne). Undgå dannelse af bobler.
- Freeze prøverne ved at placere kryoformen for et par minutter i en overdækket skum køler fyldt med tøris, indtil OLT bliver hvid. Wrap individuelle prøver i mærkede folier, forsegle dem i en plasticpose, og opbevar dem ved -80 ° C natten over eller længere.
- Brug en kryostat at skære prøve snit med en tykkelse på 10 um, og montere afsnittene om dias. Opbevar objektglassene ved -20 ° C, og altid holde objektglassene mod lys når det er muligt.
- forberedelse Slide
- Fjern slides fra fryseren og tø dem ved stuetemperatur. Dække vævssnittet med en dråbe montering medier med DAPI. Placer et dækglas af passende størrelse på toppen og undgå bobledannelse.
- Brug neglelak til at forsegle kanterne af dækglasset, tillade neglelak tørre i mørke ved stuetemperatur, og derefter lagre objektglassene i en lystæt beholder ved 4 ° C, eller fortsætte med billeddannelse indfangning af GFP-LC3 puncta.
- <strong> Kvantificering af GFP - LC3 puncta ved fluorescensmikroskopi
- Udfør epifluorescens mikroskopi, opfange billeder i samme stand (eksponering og indstillinger) for alle prøverne. For GFP, bruge en emission bølgelængde på 525 nm; for DAPI, bruge 490 nm. Mindst opnå ti billeder per prøve under anvendelse af et 60X objektiv for vastus lateralis og den frontale cortex region af hjernen.
- Kvantificer antallet af GFP-LC3 puncta i et væv areal på 2500 um 2 i hvert billede til statistisk analyse, blindet for forsøgsgrupper. Beregn det gennemsnitlige antal fra 10 billeder af hver prøve, ved hjælp af den automatiske målefunktion af "Object Count". Indstillinger for vastus lateralis musklen er: Threshold L = 10, H = 200; 2X glat; 1X ren, og indstillinger for hjernen frontale cortex er: Threshold L = 11, H = 200; 2X glat; 1X ren.
6. Western blot analyse på Autophagy Markers
- <strong> Tissue proces
- Forbered lysisbuffer: 50 mM Tris-HCI; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; proteasehæmmer og phosphatase inhibitor (frisk tilsat).
- Fjern vævet i C57BL / 6-mus fra -80 ° C opbevaring. Skær muskelvæv i små stykker med et barberblad før den følgende fremgangsmåde. Tilføj 800 pi (for hemi-hjerne) eller 500 pi (til vastus lateralis) koldt lysepuffer til prøven. Homogenisere prøven ved 4 ° C med en homogenisator ved middel hastighed.
- Fuldt lyserer den homogeniserede blanding i yderligere 30 minutter til 1 time ved 4 ° C med rotation.
- Spin ned homogenatet ved 12.000 xg i 10 min ved 4 ° C, kasseres pellet, og den ovenstående væske opsamles i et nyt rør.
- autophagy analyse
- Bestem proteinkoncentration væv lysater under anvendelse af BCA Protein Assay kit ifølge producentens specifikationer. Normalisere hver prøvetil den samme koncentration.
- Kombiner prøven med 2x Laemmli-prøvebuffer ved en 1: 1-forhold, kog det ved 95 ° C i 5 - 10 min, og fortsæt med western blot analyse på autophagy markører 13, 14, såsom P62 (anti-P62-antistof, 1: 500 fortynding) og LC3 (anti-LC3 antistof, 1: 500 fortynding). Kog prøverne umiddelbart efter tilsætning af prøven buffer, som længere inkubering på is kan generere flere nedbrudte bands af LC3.
- Kvantificer P62 og LC3 bands ved densitometrianalyse hjælp ImageJ, og normalisere værdien til den tilsvarende actin band.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver to forskellige metoder til at fremkalde autofagi i muse væv ved aerob træning: i alt 90 min af tvungen motion på en multi-lane løbebånd fortsatte med to dages akklimatisering; eller to uger af frivillige motion på en kørende hjul, der anvendes af en enkelt-opstaldet mus. I hver øvelse protokollen, kan vi måle autofagi flux ved fluorescensmikroskopi og western blot-analyse i forskellige organer.
Vi brugte en transgen mus, der udtrykker GFP-mærket LC3 som en reporter til overvågning autophagy ved øvelse 1. Ved autophagy induktion, LC3 translokerer fra cytosolen til autophagosome i punktformig strukturer. Efter sektionering, kan dannelsen af GFP-LC3 puncta visualiseres direkte ved fluorescensmikroskopi (Figur 1A). Alternativt kan autophagosome strukturer også immunfarvet med et LC3 antistof tilbilleddannelse. Enten 90 min på løbebånd eller 2 ugers frivillig drift øget antallet af GFP-LC3 puncta i både skeletmuskel (vastus lateralis) og cerebral cortex, sammenlignet med hvilende tilstand (figur 1 B). Det skal bemærkes, at den frontale cortex region har været den store region i hjernen, hvor autofagi klart induceret af begge metoder indtil nu. Motion induceret også omdannelsen af LC3 fra den cytosoliske formen (LC3-I) til lipid-konjugeret form (LC3-II), der kan detekteres ved western blot-analyse (figur 1C).
Anstrengelsesudløst inkrement autophagosomes (ved LC3-II og GFP-LC3 puncta) skyldes en forhøjet autophagic flux, snarere end en blokeret autophagosome nedbrydning, vurderet ved anvendelse af inhibitorer af lysosomal nedbrydning, såsom bafilomycin A1 eller chloroquin . Her målte vi nedbrydningen af autophagic fragt receptor p62 som en exrigelig. Motion (90 min på løbebånd) forårsagede en højere nedbrydning af P62 i skeletmuskel end den hvilende tilstand, der blev reddet ved injektion med chloroquin forud for træningen (figur 2). De tilsvarende resultater er også observeret med frivillig motion ved at køre hjul. Således aerobic ved løbebånd eller kører hjulene inducerer autophagy in vivo, målt ved steady-state niveau af LC3 og nedbrydningen af P62.
Figur 1. aerob træning inducerer Autophagy i Mouse væv. Repræsentative billeder (A) og kvantificering (B) af GFP-LC3 puncta i skeletmuskulatur (vastus lateralis) og hjerne (frontale cortex) af GFP-LC3 transgene mus under kontrol tilstand (hvile), efter 90 min af tvungen motion (løbebånd ) eller efter 2 ugers frivillig øvelse (hjul). Resultats repræsenterer middelværdi ± SEM af 10 billeder per mus. N = 5 mus. Følgende emissionsbølgelængder blev anvendt: GFP - 525 nm; DAPI - 490 nm. (C) Western blot påvisning af LC3 i skeletmuskulatur (vastus lateralis) fra udhvilet og udøves (ved løbebånd) mus. Kvantificering data repræsenterer niveauet for LC3-II normaliseret til actin (venstre), og forholdet mellem LC3-II til LC3-I (til højre). N = 3 mus. Statistik sammenligner hver værdi til kontrolprøven. Resultaterne repræsenterer middelværdi ± sem *, P <0,05; ** P <0,01; ***, P <0,001, t-test. Scale bar, 25 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Øvelse Øger Autophagy Flux i Mouse Skeletal Muscle. (A) Western blotpåvisning af P62 i vastus lateralis fra hvilede og udøves mus i nærvær eller fravær af lysosomale inhibitorer chloroquin. (B) (venstre) Kvantificering analyse af P62 normaliseret til det tilsvarende actin band. (Højre) p62 flux bestemmes ved at subtrahere den normaliserede densitometrisk værdien af PBS-behandlede P62 fra den for chloroquin-behandlede P62. Resultaterne repræsenterer middelværdi ± sem n = 3 mus. *, P <0,05, t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Autophagy er en katabolisk proces, der giver energi og reducerer cytotoksicitet ved lysosomal nedbrydning af cytoplasma komponenter eller beskadigede organeller. Studere autophagy er vigtigt at forstå reguleringen af cellulære homeostase og mekanismerne i stressrespons. Nye modeller og metoder dukker på forskningsområdet 15, for at studere, hvordan nedsat autofagi bidrager til en lang række patologiske processer 16, 17.
Næringsberøvelse (sult) og farmakologisk induktion er almindeligt anvendte fremgangsmåder til at inducere autofagi in vitro og in vivo. Disse metoder, især for dyremodeller, kan vise negative virkninger, der kan påvirke de samlede resultater. For eksempel, da det kræver mindst 48 timer af sult til at inducere et påviseligt niveau af autofagi, dyrene måske ikke nødvendige energi til regelmæssig motorisk aktivitet, sompåvirker resultatet af mange efterfølgende adfærdsmæssige undersøgelser. Endnu farmakologiske fremmere kan også føre til bivirkninger på grund af deres manglende specificitet til autofagi pathway. Den største autophagy inducer rapamycin og dets derivater undertrykker mTOR aktivitet og forårsage metabolisk dysfunktion og immunosuppression 18, 19, 20, som bør tages i betragtning i den eksperimentelle design til langtidsbehandling. Således har vi arbejdet på flere fysiologiske og robuste måder for autophagy aktivering i dyremodeller.
For nylig har vi og andre identificerede motion som en effektiv, hurtigere og sikrere autofagi inducer in vivo 7, 8, 9. Begge tvunget øvelse ved løbebånd og frivillig motion ved at køre hjulet er blevet brugt til at analysere virkningerne af motion på autophagy enctivation, med variationer i motion varighed og intensitet 21, 22. For eksempel, en times løbebånd kører (starter ved hastighed på 10 m / min til maksimalt 40 m / min) inducerer rigelige LC3 lipidering i skeletmuskulatur 21, og på længere sigt frivillig hjul kører i 3 måneder eller 4 - 5 uger øger også basal autophagy og øger ekspressionen af autofagi proteiner i skeletmuskulatur 21, 22.
Her beskrev vi og sammenlignet de to metoder (løbebånd og løbehjul) at udøve mus, og præsenteres optimeret kortere protokoller med høj effektivitet i autophagy induktion. Hver metode har fordele og ulemper. En enkelt anfald af 90 min af tvungen motion på løbebånd er tilstrækkelig til at fremkalde autofagi i skeletmuskulatur og hjerne. Vi har gjort et tidsforløb af løbebånd motion 7, og fandt, at exerciSE betingelserne beskrevet her inducere det maksimale niveau af autofagi i muse skeletmuskel, som også valideres af andre 23. Under disse betingelser, mus undergår aerob træning; som tidligere rapporteret, er aerob motion induceret af langvarig kører med gradvise stigninger i hastigheder på et løbebånd 24, 25, 26, hvorimod den anaerobe tilstand opnås ved en kortvarig høj intensitet øvelse, hvilket øger muskelmassen men ikke nødvendigvis forbedre motion udholdenhed 27, 28. Desuden hastigheden rapporteret her i denne protokol positivt korrelerer med iltoptagelse kapacitet, ved indirekte metoder til at vurdere den aerobe kapacitet 29. Derfor aerob træning på et løbebånd er en hurtig og effektiv måde at fremkalde autofagi.
Men kræfed kører i et lukket rum kan udøve stress til mus. For således at undgå at give yderligere stress til dyr, vi bruger finger nudges eller wire kvaster som en metode til at holde mus kører, i stedet for den indbyggede elektrisk stød. Sammenlignet med løbebåndet, brug af løbehjul har mange fordele. Det er mindre stressende, ikke kræver forskernes observationstid, og er bekvemt at studere langsigtede virkninger af autophagy aktivering. Alligevel motion på en kørende hjul er frivillig og genererer dermed variabilitet med hensyn til at køre distance og hastighed mellem forskellige mus eller den samme mus på forskellige dage. Derfor er det nødvendigt at køre mus på et hjul i en længere periode (fx flere uger) for at minimere den individuelle variabilitet. Vigtigere er det, fremgangsmåde kræver også anvendelse af et odometer om natten for at kontrollere, at mus faktisk kører. Vi målte den gennemsnitlige drift afstand af vildtype C57BL / 6-mus over en periode på 2 uger, og fundet, at de løber indbyrdesende 1 km / nat i begyndelsen af uddannelse (dag 1) og kan køre op til 8 - 10 km / nat på dag 14. Samlet set løbehjul er en effektiv metode til at stimulere autofagi i de fleste organer, selv om, er det sværere at indfange autophagosome akkumulering i skeletmuskulaturen forhold til at bruge løbebåndet. Årsagen er, at skeletmuskulaturen har en høj autophagic flux og en hurtig autophagosome nedbrydningshastighed, som kræver omgående vævshøst efter kører at detektere autophagy induktion af GFP-LC3 puncta måling. I begge protokol, hurtig PFA perfusion og fiksering af væv efter dyr eutanasi er et afgørende skridt i proceduren at bevare de autophagosome strukturer, der er ellers let nedbrydes under dissektion.
Denne protokol viser, hvordan du bruger aerobe motion for at stimulere autofagi i muse væv, herunder hjerne og skeletmuskulatur. Disse fremgangsmåder kan anvendes til at undersøge mekanismerne i autofagi pathway i mvedligehold af væv funktion, såsom mitokondrie vedligeholdelse 23, og studere de langsigtede virkninger af autophagy induktion om regulering af adfærd og sundhed dyresygdomsmodeller, såsom styrke smertestillende effekter af cannabinoider 9. Både løbebånd og løbehjul metoder fremkalde et godt niveau af autofagi; men det er vigtigt at overveje deres forskelle, når du vælger den bedste tilgang til at opfylde forskellige forskningsmæssige mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Treadmill | Columbus Instruments | 150-RM Exer 3/6 | |
| Mouse running wheel | Super Pet | 100079365 | diameter 11.4 cm |
| Odometer | Bell | DASHBOARD 100 | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Model: inverted microscope ECLIPSE | |
| Cryostat | Leica | CM 1850UV | |
| Homogenizer | IKA | 003737001 / Model: T10 Basic S1 | |
| Chloroquine | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
| Parafolmaldehye | SIGMA-ALDRICH | P6148 | Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer. |
| Mounting media | Vector Laboratories | H-1200 | |
| p62 antibody | BD Biosciences | 610833 | |
| LC3 antibody | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0737 | |
| ImageJ | NIH |
References
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).
- Tracy, K., et al. BNIP3 is an RB/E2F target gene required for hypoxia-induced autophagy. Molecular and cellular biology. 27, 6229-6242 (2007).
- Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
- Nikoletopoulou, V., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Autophagy in the physiology and pathology of the central nervous system. Cell Death Differ. 22, 398-407 (2015).
- Rocchi, A., He, C. Emerging roles of autophagy in metabolism and metabolic disorders. Frontiers in biology. 10, 154-164 (2015).
- Mathew, R., Karantza-Wadsworth, V., White, E. Role of autophagy in cancer. Nature reviews. Cancer. 7, 961-967 (2007).
- He, C., et al. Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis. Nature. 481, 511-515 (2012).
- He, C., Sumpter, R. J., Levine, B. Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain. Autophagy. 8, 4 (2012).
- Kuramoto, K., et al. Autophagy activation by novel inducers prevents BECN2-mediated drug tolerance to cannabinoids. Autophagy. 12, 1460-1471 (2016).
- Dougherty, J. P., Springer, D. A., Gershengorn, M. C. The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse. JoVE. , (2016).
- Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nature protocols. 8, 1680-1693 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature protocols. 10, 1612-1624 (2015).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Bjørkøy, G., et al. Chapter 12 Monitoring Autophagic Degradation of p62/SQSTM1. Methods Enzymol. 452, 181-197 (2009).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12, 1-222 (2016).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the Pathogenesis of Disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Fang, Y., et al. Duration of rapamycin treatment has differential effects on metabolism in mice. Cell Metab. 17, 456-462 (2013).
- Thomson, A. W., Turnquist, H. R., Raimondi, G. Immunoregulatory functions of mTOR inhibition. Nature reviews. Immunology. 9, 324-337 (2009).
- Miller, R. A., et al. Rapamycin-mediated lifespan increase in mice is dose and sex dependent and metabolically distinct from dietary restriction. Aging Cell. 13, 10 (2014).
- Grumati, P., et al. Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles. Autophagy. 7, 1415-1423 (2011).
- Lira, V. A., et al. Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 27, 4184-4193 (2013).
- Lo Verso, F., Carnio, S., Vainshtein, A., Sandri, M. Autophagy is not required to sustain exercise and PRKAA1/AMPK activity but is important to prevent mitochondrial damage during physical activity. Autophagy. 10, 1883-1894 (2014).
- Kregel, K. C., et al. Resource book for the design of animal exercise protocols. American Physiological Society. , 152 (2006).
- Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debated, K. S., Kleeberg, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med Sci Sports Exerc. 33, 5 (2001).
- Rezende, E. L., Chappell, M. A., Gomes, F. R., Malisch, J. L., Garland, T. Maximal metabolic rates during voluntary exercise, forced exercise, and cold exposure in house mice selectively bred for high wheel-running. The Journal of experimental biology. 208, 2447-2458 (2005).
- Kayatekin, B. M., Gonenc, S., Acikgoz, O., Uysal, N., Dayi, A. Effects of sprint exercise on oxidative stress in skeletal muscle and liver. European journal of applied physiology. 87, 141-144 (2002).
- Kawanaka, K., Tabata, I., Tanaka, A., Higuchi, M. Effects of high-intensity intermittent swimming on glucose transport in rat epitrochlearis muscle. J Appl Physiol. 84, 4 (1998).
- Fernando, P., Bonen, A., Hoffman-Goetz, L. Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice. Can J Physiol Pharmacol. 71, 4 (1993).
