Summary
Мышиные полная толщина трансплантация кожи является хорошо известной моделью для изучения отказа в установке аллоиммунная. Здесь мы предоставляем учебник каждого шага, участвующих в выполнении / с BALB -> C57BL / 6 всю толщину трансплантата кожи.
Abstract
Мышиные полная толщина трансплантация кожи является хорошо создана в естественных условиях модель для изучения аллоиммунная реакции и отторжения трансплантата. Несмотря на ограниченное применение для человека, трансплантация кожи у мышей широко применяется для исследования трансплантации. Процедура проста в освоении и выполнять, и это не требует тонких методов микрохирургических, ни интенсивное обучение. Кроме того, отторжение трансплантата в этой модели имеет место в очень воспроизводимым иммунологической реакции и легко контролировать путем непосредственного осмотра и пальпации. Кроме того, вторичная трансплантация кожи с донорскими соответствием или третьей стороной кожи трансплантаты могут быть выполнены на более сложные модели трансплантации в качестве альтернативы и несложный метод оценки донорского-специфической толерантности. Осложнения низкие, и в общем случае ограничено анестезии передозировки или респираторного дистресс-синдрома после процедуры. отказ привитые, с другой стороны, происходит обычно в результате плохой подготовки гркормовой части, неправильное положение в привитой постели, или несоответствующее размещение повязки. В этой статье мы приводим протокол для полной толщины пересадки кожи у мышей и описывают важные шаги, необходимые для успешной процедуры.
Introduction
Трансплантация органов является методом выбора при лечении больных с недостаточностью терминальной стадии органов, а также исходы значительно улучшилось с прогрессом в области хирургических процедур и протоколов иммуносупрессии. Тем не менее, длительное подавление иммунитета связано со значительными побочными эффектами, а также разработка новых стратегий, способствующих толерантности остается целью современных исследований трансплантации.
Многочисленные животные модели были разработаны для фундаментальных исследований в области трансплантации, чтобы изучить механизмы отторжения трансплантата и испытать иммуносупрессии подходы для предотвращения отторжения трансплантата и для содействия долгосрочному толерантности 1-3. Мышиные модели стали основой иммунологического исследований в связи с исключительной и обширной доступности диагностических и терапевтических антител и четко определенных инбредных и трансгенных линий. Пересадка кожи является простая процедура, которая не требует специальных навыков микрохирургических и можетлегко контролировать в послеоперационном периоде. Взятые вместе, трансплантация кожи мыши была исключительным инструментом для изучения многих аспектов , участвующих в реакции аллоиммунная, включая доставку антигена, незаконный оборот клеток и разрушения тканей во время отторжения трансплантата 4,5.
Здесь мы покажем процедуру шаг за шагом для полной толщины пересадки кожи с использованием модели мыши, и мы опишем важные шаги, необходимые для успешного приживления пересаженного кожи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья (NIH) и были одобрены Университета животных по уходу и использованию комитета Джона Хопкинса (JHUACUC) путем. Конкретные процедуры были выполнены в соответствии с утвержденными протоколами ACUC MO13M292 и MO13M370.
1. Донор Урожай кожи
- Обезболить мыши-донора с изофлуран (индукционным испарителем на уровне 4%, обслуживание на 1 - 2% через конус мыши). Используйте носок вывода пинч рефлекс контролировать глубину анестезии.
- Используя электрическую бритву, брить спину животного и дезинфицировать его с 10% повидон йода (например, Бетадин).
- Используя стерильные ножницы, перчатки и асептики, донорские урожай кожи спины от бедра до шеи, с тупым на уровне рыхлой соединительной ткани.
- Усыпить животное шейки дислокации после сбора урожаякожа трансплантат.
- Под микроскопом, отделить соединительной ткани, жировой ткани, и panniculus carnosus из кожи спины с помощью тонких ножниц тенотомию. Panniculus carnosus представляет собой тонкий, прозрачный мышцы отвечают за подергивание движений кожи.
- Использование стерильных инструментов, вырезать 15-мм х 15-мм трансплантаты из кожи спины для 10-мм х 10 мм до 15 мм х 15 мм привитого кровати.
- Хранить трансплантатов на марли, смоченными стерильным фосфатно-солевом буфере (PBS) в чашке Петри на льду.
Примечание: 8 - 10 трансплантаты могут быть получены из одной мыши-донора.
2. Получатель Пересадка кожи
- Обезболить мышь получателя с изофлуран (индукционным испарителем на уровне 4%, обслуживание на 1 - 2% через конус мыши). Используйте носок вывода пинч рефлекс контролировать глубину анестезии.
- Администрирование 0,02 мг / кг веса тела бупренорфина для послеоперационного обезболивания.
- Бритье сторону задней части животного, где трансплантат WiLL быть вставлена и дезинфицируют 10% повидон-йод.
- Используя ножницы, вырезать 10 мм х 10 мм до 15 мм-х 15-мм квадратной кожи. Размер дефекта должен быть немного больше (10%), чем трансплантата. Вырезать так же поверхностно, насколько это возможно. Позаботьтесь, чтобы сохранить panniculus carnosus и сосуды. Panniculus carnosus можно отличить от основной лицевой панели его подвижности и кровеносных сосудов, которые работают поверхностные к нему.
- Поместите трансплантат на привитой постели, избегая складок по краям.
- Поместите 8 швов на углах и на середине каждого края. Для каждого шва, проходят через иглу трансплантата, а затем через panniculus carnosus трансплантата дну ниже окружающей кожи реципиента.
- Снимите маску обезболивающий и пусть животное частично восстановиться после анестезии перед нанесением клеевой повязку.
- Оберните мышь получателя в клеевой повязка с сложенную марлю над трансплантатом. Повязка путем объединения двух бинты, резкаклеевой состав одного и размещения двух впитывающие прокладки вместе.
- Монитор мыши тесно во время восстановления, чтобы убедиться, что повязка не ограничивая грудную клетку экскурсии и дыхания. Снимите повязку, если частота дыхания снижается или животное начинает задыхаться или дыхание неглубоко.
3. Послеоперационный
- Администрирование Энрофлоксацин 5 мг / кг после операции по поводу инфекции профилактики.
- Поместите пересаженных мышь в чистой клетке над Microwavable грелку, пока она полностью не оправится от анестезии.
- Соблюдайте мыши в течение 1 часа после операции до возвращения его к жилому объекту.
- Через семь дней после операции, анестезию мыши, как на шаге 2.1. Снимите повязку путем разрезания только через брюшную сторону повязки.
- Наблюдайте и ощупывать трансплантата на следующий день на наличие признаков струпьев, сокращения или твердости. Если он присутствует, трансплантат не может быть достигнуто надлежащее vascularizaции и следует рассматривать как технический сбой.
- ежедневно контролировать на наличие признаков отторжения. Рассмотрим трансплантатов отвергнута при ≥90% от трансплантата ткани становится некротической.
- Эвтаназии отклоненные животных и собирать их для анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Размещение повязкой на мыши-реципиента является важным шагом процедуры. Кожный трансплантат позиционируется на стволе получателя, между плеча, бедра и позвоночника (рисунок 1). Бандаж выполнен со сложенным марлю и сочетание двух пластиковых пластырей. Мышь получатель помещается с трансплантатом вниз через марлю в центре бинта. С помощью двух изогнутых микро щипцами, нижний конец бинта вытягивается, а затем верхняя часть бинта оборачивают над мышью в живот.
В полных моделей рассогласования, полная толщина пересадка кожи, как правило, отвергается в 8 до 12 дней. В незначительных моделях несоответствия, отказ ответы медленнее, более изменчивы, и внешний вид кожного трансплантата характеризуется меньшим количеством различных изменений, таких как сжатие или потери волос (рисунок 2). Острый отторжение трансплантата родыLLY начинается с отеком и эритемы трансплантата. Эти события сопровождаются привитого высыхании, усадке и образованию струпа (рис 2B и C). В зависимости от степени несоответствия MHC и протокол иммуносупрессии, отказ может происходить с помощью процесса подострого, отмечены небольшие изменения, такие как выпадение волос, пигментация, кожными гребнями, и объем трансплантата. В этих случаях, отвергнутый трансплантата появляется блестящий, белый, и голые, с неровными краями (рис 2F) 14.
Используя эту модель пересадки кожи, мы исследовали новый подход таргетирования Т-клеточный метаболизм для предотвращения отторжения трансплантата 15. Хорошо известно , что метаболические сигнальные пути играют решающую роль в диктуя результаты Т-клеточных реакций 16. Наивные Т-клетки полагаются на митохондриального окислительного фосфорилирования для выработки энергии, необходимой для основного иммунного надзора. Однако,при активации, эффекторные Т - клетки метаболически перепрограммировать к аэробного гликолиза и демонстрируют повышенную глутамин метаболизм 16,17. Использование BALB / C в качестве доноров и C57BL / 6 в качестве получателей, мы наблюдали, что ингибирование гликолиза и окислительного фосфорилирования (2DG + метформин) или глутамин метаболизм в покое (ДОН) увеличивал выживаемость трансплантата кожи, но блокирует три пути одновременно привело к значительному-повышенную трансплантат выживаемости (рис 3C). Кроме того, тройной метаболическая терапия была более эффективна , чем традиционная циклоспорина или рапамицина (Фигура 3А и В). Постоянный прием не было достигнуто, и дальнейшие стратегии, включая истощение терапии, костимуляцию блокады, или более новых метаболических терапии, может способствовать лучшей индукции толерантности трансплантации. Тем не менее, исследование дало два новых идеи: использование неспецифических ингибиторов целевой селективные клетки иммунной системы с увеличением метаболических потребностей, а также требование т O блокировать три пути метаболизма одновременно, чтобы получить более надежную иммуносупрессии в отторжения трансплантата.
ингибиторы кальциневрина и мишени рапамицина у млекопитающих (МРМ) ингибиторы представляют собой большую часть традиционной иммуносупрессивной терапии, используемой в клинической трансплантации. Срединные привитые выживаемости Balb / с до C57BL / 6 трансплантатов кожи, обработанных циклоспорином и рапамицина были 17 и 16 дней, соответственно. Для сравнения, получатели обрабатывают метаболических ингибиторов, которые ингибируют клеточную гликолиза T, митохондриальной окислительного фосфорилирования, и глютамин метаболизма продлил выживание: медиана выживаемости трансплантата составила 29 дней. Кроме того, гистология кожных трансплантатов из метаболической терапии группы выставлены выравнивание более неповрежденной ткани и меньше лимфоцитарный воспалительный инфильтрат (рисунок 4).
105 / 55105fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Покрытие привитого с повязкой. Трансплантат (А) кожи на правой ствола. (B) Бинт сделал со сложенным марлю и двух пластиковых полосок бинтов. (С) Получатель мышь помещают на марлю. (DF) бинт оборачивают вокруг мыши. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Внешний вид Прививка во время острого и хронического отторжения. (A) BALB / C до C57BL / 6 (полное несоответствие) полную толщину пересадки кожи без признаков отторжения (день 8). (B) BALB / C в C57BL / 6 полную толщину пересадки кожи с 50% отторжения трансплантата (день 13). (C) BALB / C в C57BL / 6 полную толщину пересадки кожи с полным отторжения трансплантата (день 18). (D) Сингенная полная толщина трансплантация кожи (8 -й день). (E) Сингенная полная толщина трансплантация кожи (день 30). (F) C57BL / 10 до C57BL / 6 (незначительное несоответствие) полную толщину пересадки кожи с хроническим отторжением трансплантата (день 100). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Balb / с до C57BL / 6 Skin Graft выживания. (А) Лечение с помощью циклоспорина (25 мг / кг QD). (Б) Обработка рапамицина (3 мг / кг QD). (С) Лечение с метаболическими ингибиторами, 2-дезокси-D-глюкоза (2DG) 500мг / кг QD, метформин 150 мг / кг QD и 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин (ДОН) 1,6 мг / кг QOD. Все процедуры были введены со дня трансплантации до отказа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: гематоксилином и эозином Пятно (справа, X100, слева, X200) кожных графты с метаболической терапии в послеоперационный день 7. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С момента своего появления по Medawar, во- первых , в исследованиях на людях , а затем у кроликов и мышей, трансплантация кожи была бесценным моделью для изучения аллогенных иммунных ответов 6,7. В этой рукописи, мы представляем модель крупномасштабного, не кровоснабжением, полную толщину пересадки кожи с помощью верхней и нижней части спины кожу. Различные альтернативные методы, в том числе с помощью хвоста кожи или уха кожи мыши в качестве источника ткани трансплантата, было зарегистрировано на сегодняшний день 8,9. Эти модели представляют явное преимущество технической простотой и позволяют крупносерийного пропускную способность. Относительный дефицит эпидермальных клеток Лангерганса и дермальные дендритных клеток в трансплантатов кожи хвоста, однако, приводит к задержке отторжения, а также упрощенную процедуру принятия трансплантата хозяином, в частности , в небольших моделей несовпадение MHC 10,11. Таким образом, полная толщина-прививка ствол кожа считается более надежной моделью и более подходящим для изучения Т-клетками СМИTed острое отторжение 12.
Кроме того, наша модель использует простые методы и не требует продвинутых микрохирургических навыков. Время работы короткий (~ 10 мин на мышь от начала анестезии до завершения процедуры), а также послеоперационная заболеваемость и смертность незначительна. Общая операционная смертность (смерть в течение 24 часов после операции плюс смерть до снятия повязки) было сообщено, что на 3,8% 13. Большинство осложнений возникают в результате анестезии передозировки или чрезмерно ограничительных повязок, которые можно легко предотвратить путем тщательного контроля функции дыхания в течение ближайшем послеоперационном периоде и быстрое удаление повязки при первых признаках респираторного дистресса 6,17.
Самым важным фактором в процессе приживления является реваскуляризации трансплантата ткани за счет врастания сосудов принимающих к трансплантата 6. Собранный кожа требуетS тщательной подготовки, а также рассечение panniculus carnosus является важным шагом. Мы предпочитаем, чтобы удалить panniculus carnosus под микроскопом. Рекомендуется начать рассечение от одного из краев и медленно продвигаться вперед, нажав на мышцы и отделяя ее от кожи с лезвием изогнутой тенотомии под небольшим углом. Сайт привитого слоя должно быть далеко от суставов и позвоночника. Перед тем как сделать надрезы в мышь-реципиента, плеча и бедра должны быть перемещены, чтобы визуализировать складки кожи, которые помогают разграничить уровень суставов. При удалении кожи получателя, важно, чтобы не повредить кровеносные сосуды, которые бегут к поверхностным panniculus carnosus. В случае возникновения кровотечения, применяют местную компрессию и удалить кровь и сгустки, которые могут помешать приживления. Наконец, повязка не должна вызывать трудности с дыханием, что компромисс восстановления, хотя оно должно быть достаточно констриктивно, чтобы предотвратить смещение трансплантата и авто-муtilation в процессе реваскуляризации. Пластиковые Полоски бинты являются приверженцем и достаточно сильны для этой цели. Мы объединяем два бинты , чтобы полностью обернуть талию мыши и позволяют размещать в сложенном марли между повязкой и трансплантат (рисунок 1). Повязка удаляется путем разрезания вентральной стороне его, а остальные удаляют животного, для того, чтобы избежать нарушения трансплантата при попытке удалить повязку вручную.
Таким образом, полная толщина трансплантация кожи является хорошо известной моделью с обильными ссылками в литературе. Процедура проста в исполнении, время работы мало, и послеоперационные осложнения ограничены. Критические шаги связаны с дотошной урожая донорской кожи и правильного размещения бинта получателя. Дальнейшие исследования с участием биоматериалы, которые способствуют ангиогенез и восстановление тканей может дополнительно повысить вероятность успеха процедуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась грантом NIH R01AI077610.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight micro forceps | Sigma | F4017 | |
| Curved micro forceps | Aesculap | BD333R | |
| Curved Stevens tenotomy scissors | Aesculap | BC905R | |
| Mayo dissecting scissors | Sigma | S3146 | |
| Micro needle holder | Aesculap | BM563R | |
| Sterile gauze | Covidien | 441218 | |
| 6-0 Nylon suture | MWI | 31849 | |
| Plastic Strips Band-Aid | Johnson & Johnson | Obtained from pharmacy | |
| 10 cm Petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| PBS | Quality Biological | 119069131 | |
| Buprenorphine | DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy | ||
| Enrofloxacin | Bayer Health Care | 186599 |
References
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. J Vis Exp. , (2016).
- Oh, B., et al. A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice. J Vis Exp. , (2016).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , e50753 (2014).
- Jones, T. R., Shirasugi, N., Adams, A. B., Pearson, T. C., Larsen, C. P. Intravital microscopy identifies selectins that regulate T cell traffic into allografts. J Clin Invest. 112, 1714-1723 (2003).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17, 744-749 (2011).
- Medawar, P. B. The behaviour and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits: A report to the War Wounds Committee of the Medical Research Council. J Anat. 78, 176-199 (1944).
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B., Sparrow, E. M. Quantitative studies on tissue transplantation immunity. I. The survival times of skin homografts exchanged between members of different inbred strains of mice. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 143, 43-58 (1954).
- Garrod, K. R., Cahalan, M. D.
- Schmaler, M., Broggi, M. A., Rossi, S. W. Transplantation of tail skin to study allogeneic CD4 T cell responses in mice. J Vis Exp. , e51724 (2014).
- Bergstresser, P. R., Toews, G. B., Gilliam, J. N., Streilein, J. W. Unusual numbers and distribution of Langerhans cells in skin with unique immunologic properties. J Invest Dermatol. 74, 312-314 (1980).
- Chen, H. D., Silvers, W. K. Influence of Langerhans cells on the survival of H-Y incompatible skin grafts in rats. J Invest Dermatol. 81, 20-23 (1983).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a015495 (2013).
- Mayumi, H., Nomoto, K., Good, R. A. A surgical technique for experimental free skin grafting in mice. Jpn J Surg. 18, 548-557 (1988).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S.
- Lee, C. F., et al. Preventing Allograft Rejection by Targeting Immune Metabolism. Cell reports. 13, 760-770 (2015).
- Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses. Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342, 1242454 (2013).
