Summary
Эта рукопись описывает простой метод измерения phagosomal рНа и площадь, а также цитоплазматический рН человека и мыши нейтрофилов с помощью радиометрического индикатора seminaphthorhodafluor (Snarf) -1, или S-1. Это достигается с помощью живых клеток конфокальной флуоресцентной микроскопии и анализа изображений.
Abstract
Нейтрофилы имеют решающие значение для проведения врожденной защиты и, следовательно, представляют собой важную область медицинских исследований. Фагосомы, внутриклеточное отделение, где убийство и переваривание поглощенных частиц имеют место, является главной ареной для нейтрофильного патогена убийства, которое требует жесткого регулирования. Phagosomal рН один аспект, который тщательно контролируется, в свою очередь, регулирующими антимикробная активность протеазы. Многие флуоресцентные красители рН-чувствительные, были использованы для визуализации среды phagosomal. S-1 имеет ряд преимуществ по сравнению с другими рН-чувствительных красителей, в том числе его двойной спектров излучения, его устойчивость к фото-отбеливания, и его высокой рКа. С помощью этого метода, мы показали, что нейтрофилы фагосомы необычно щелочная по сравнению с другими фагоцитов. При использовании различного биохимического спряжения красителя, фагосома может быть очерчена из цитоплазмы, так что изменения в размере и форме фагосомы может быть оценены. Это позволяет пили дальнейший мониторинг ионного движения.
Introduction
Нейтрофилов является наиболее распространенной врожденной иммунной клеткой в организме. Его основная функция состоит в патрулировании кровотока и поглощении и переваривании инородных частиц , что он может столкнуться в процессе , известном как фагоцитоз 1, 2. Частицы разлагаться в внутриклеточный компартмент под названием фагосомы. Активации нейтрофилов НАДФН-оксидазы, изоформы NOX2, инициирует каскад биохимических реакций, который завершается смертью возбудителя. NOX2 белковые субъединицы перейти к образуют цепной комплекс переноса электронов в phagosomal мембране 3. После активации, он переносит электроны от NADPH через мембрану молекулярного кислорода внутри фагосомы, производя супероксидных анионов и дополнительно активных форм кислорода. Это известно как респираторные взрывы, и это считается необходимым для эффективного микробного убийства и пищеварения- 4, 5. Этот канал обеспечивает пассивное движение протонов вниз их электрохимический градиент из цитозоля в фагосомы. Концентрация протонов отражается от рН, так что при заданном уровне активности оксидазы, измерение рН в фагосомы может предоставить информацию об относительном участии протонных и не протонных путей в компенсации заряда.
Нейтрофилы фагосома людей имеет щелочной рН примерно 8,5 в течение 20-30 мин после фагоцитоза 5. Это предполагает наличие дополнительных апротонные ионных каналов в NOX2-индуцированной компенсации заряда, как слияние и высвобождение содержимого кислых гранул и единственной компенсации по HVCN1 будет поддерживать кислую среду, в отличие от наблюдаемого. Движение ионов, чтобы компенсировать этот отрицательный заряд может также оказывать изменения в размере фагоса с помощью осмоса. Это может быть ионы , присутствующие в нейтрофилах при высоких физиологических концентрациях: калиевые ионы , как были показаны , чтобы перейти в фагосомы 6, и хлорид ионного движение другой кандидат важен для нейтрофильной функции 7.
Регулирование рН в фагосомы имеет жизненно важное значение для антимикробной активности протеазы 5. Миелопероксидазы (МРО) , как представляется, оптимальной активности при рН 6, в то время как для катепсина G и эластаза, оптимальные уровни рН 7-9 и рН 8-10, соответственно , 5. Таким образом, переходные изменения в phagosomal рНе может обеспечить ниши активности для различных ферментов в удовольствиефикция. Понимание того, как рН участвуют в нейтрофильных микробном убийстве может дать полезную информацию для разработки новых нейтрофилов увеличения микробных агентов.
Нейтрофилов фагосомы является высокой реакционной способностью окружающей среды. Это делает его трудно точно оценить рН, так как красители могут быть легко окисляется, что приводит к техническим артефактам. Исторически сложилось так , изотиоцианат флуоресцеина (FITC) был краситель выбора для измерения внутриклеточного рН 8, 9. Тем не менее, есть некоторые недостатки его использования при измерении нейтрофилы phagosomal рН. Она имеет рКа 6,4 10, а это означает , что он может только точно быть использован для оценки уровня рН от 5 до 7,5 8, так как он насыщает при рН <8 11. Поскольку нейтрофилы phagosomal рН может стать гораздо более щелочной 5, FITC не могут охватить весь спектр возможных изменений рН. Еще один сущесткосяк проблема с FITC в контексте нейтрофилы является то , что , как полагают, photobleached МРО 12. Ингибитор МРО, азид натрия, может быть использован для ограничения фотообесцвечиванию 13, но было показан , что азид натрия непосредственно понижает рН phagosomal в МРО-независимом способе , и, таким образом , не подхожу для использования в таких анализах 5.
По сравнению с другими внутриклеточными красителей, S-1 , имеет относительно высокую рКа 7,5 10. В кислых условиях, молекула протонированного и вырабатывает сигнал излучения между 560 и 600 нм при возбуждении при 488 нм или выше. Когда молекула депротонируется в более щелочных условиях, длина волны излучения составляет более 600 нм. Отношение интенсивностей флуоресценции на этих двух длинах волн указывает на сдвиг излучения, которая является более надежна, чем одиночные измерения флуоресценции, так как он не зависит от концентрации флуорофора и клеточной структуры, S-1 , может быть конъюгирован с антигенным материалом, таким как зимозан 14, хотя убитые нагреванием является предпочтительной (HK) Candida Albicans, так как чем больше площади поверхности дает более последовательное чтение флуоресценции.
Мы также использовали модификацию этого метода для изучения временных изменений рН (Рисунок 3) 5. Этот метод для измерения цитозольного рН может быть легко применен к другим типам клеток, как описана в других местах 15, 16, и клетка с большим количеством щелочных фагосомами 14.
Protocol
Заявление по этике: Все животное работа была проведена с лицензией и утверждением внутренних дел Великобритании. Человеческое участие в этом исследовании было одобрено Объединенной UCL / UCLH комитетов по этике исследований человека. Все участники представили информированное согласие.
1. Приготовление C. Albicans
- Вырастить диск Кандида (см списка материалов) на YPD агаровой пластины в соответствии с инструкциями изготовителя. Выберите колонию и добавить его в 15 мл YPD бульона. Выдержите его в качалке инкубаторе при температуре 30 ° C и 200 оборотов в минуту до тех пор , пока бульон мутный (обычно около 2 дней, или до концентрации примерно более 1 × 10 9 / мл).
- Спин вниз среды Candida и ресуспендируют его в 50 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Центрифуга при 3000 мкг в течение 10 мин. Повторите этот шаг дважды.
- Поместите пробирку , содержащую 50 мл PBS / Candida среды в водяной бане , предварительно нагретой до 60 ° C , так что вся труба сubmerged в течение 1 часа.
- Для того, чтобы подтвердить , что Кандида термически убитых, полоса образец на YPD агаровую пластинку и инкубируют в течение ночи при 30 ° C. Регулировка тепловой убитые концентрации (НК) Candida до 5-9 × 10 8 / мл, в зависимости от роста Candida, и хранить его в 1 мл аликвоты в -20 ° C морозильника.
Примечание: Все количество клеток в этом протоколе были выполнены с использованием автоматического счетчика клеток.
- Для того, чтобы подтвердить , что Кандида термически убитых, полоса образец на YPD агаровую пластинку и инкубируют в течение ночи при 30 ° C. Регулировка тепловой убитые концентрации (НК) Candida до 5-9 × 10 8 / мл, в зависимости от роста Candida, и хранить его в 1 мл аликвоты в -20 ° C морозильника.
2. S-1 Сцепление к тепловым убитым (HK) Кандид
- Готовят аликвоту карбоксильных-S-1 сукцинимидил эфира (50 мкг) путем разбавления его в 100 мкл высококачественной диметилсульфоксиде (ДМСО). Vortex хорошо перемешать.
- Подготовьте 1 мл 1 × 10 8 HK Candida в 0,1 М раствора бикарбоната натрия (рН 8,3) в 15 мл пробирки.
- Добавьте 100 мкл карбокси-S-1 по одной капле за раз к HK Candida во время смешивания на вихрь на уровне примерно 2000 оборотов в минуту ( от средней до высокой скорости). Заверните алюминий FOIл вокруг трубки и поместить его на ролик при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Промывают HK Candida- S-1 (HKC-S-1) три раза центрифугированием при 2250 х г в течение 10 мин каждый. В течение первых двух промываний, ресуспендирует осадок в 15 мл 0,1 М раствора бикарбоната натрия (рН 8,3). После третьей промывки, ресуспендируют его в 1 мл сбалансированного солевого раствора (BSS) буфера (таблица 1).
- Передача HKC-S-1 подвески в пробирки, в 100 мкл аликвоты и хранят их при -20 ° С.
Примечание: Используйте трубы с низким поверхностным связующего материала, если это возможно, так как HKC-S-1 частицы могут прилипать к стенке нормальных центрифужные пробирки. - Opsonize HKC-S-1
- Для нейтрофилов человека, добавляют 100 мкл человеческой сыворотки IgG к 100 мкл талой HKC-S-1.
- Для нейтрофилы мыши, добавить 50 мкл нормальной сыворотке мыши и по 50 мкл мыши Candida иммунной сыворотки (полученные от мышей , которым вводили C57B6 HK Candida) от 5 до 100 мклиз HKC-S-1.
- Смешайте его на тепловой шейкере при 37 ° С и 1100 оборотов в минуту в течение 60-90 мин, а затем на 4 ° C валиком в течение 2 ч.
- Промыть три раза в буфере BSS путем центрифугирования при 17200 х г в течение 1 мин каждый. Ресуспендируют в 100 мкл буфера BSS.
3. Выделение нейтрофилов
- Для человеческих нейтрофилов периферической крови, берут 15 мл крови путем венепункции от здорового донора и поместить его в шприц 20 мл, содержащую 90 мкл 1000 МЕ / мл раствора гепарина натрия (60 мкл гепарина / 10 мл крови).
- С помощью пипетки, вводят 1,5 мл 10% раствора декстрана в шприц. Переверните его осторожно в 3 раза и оставьте его в вертикальном положении на стенде.
- Подождите 30-60 мин, пока кровь делится примерно пополам, с верхним поглощающим покрытием слоем, который является соломенным цветом и нижним слоем, содержащего эритроциты.
- Осторожно вытолкнуть верхний слой через иглу или удалить его с наконечником пипетки. Поставил яна 15 мл трубки. Избегайте вынимая красный слой. С помощью 5 мл пипетки, добавьте 3-4 мл в градиенте плотности среды (см список материалов) к нижней части трубы под слоем светлого сгустка крови, чтобы получить два различных слоя. Центрифуга при 913 мкг в течение 10 мин.
Примечание: При использовании нейтрофилов мышей (см ссылки 17 для изоляции мыши нейтрофилов), использует клеточную суспензию , которая была вымывается из костного мозга вместо этого. - Слить супернатант, оставляя за собой красный окатышей. Аккуратно вихревой тревожить осадок. Добавить 7 мл дистиллированной, автоклавного H 2 O к осадку и инвертировать в течение 20 с , чтобы ресуспендируют осадок. Добавить 7 мл 2 раза солевого раствора и инвертировать несколько раз перемешать, лизировать оставшиеся красные кровяные клетки.
- Центрифуга при 300 мкг в течение 5 мин. Слить супернатант и ресуспендируют осадок в буфере BSS примерно 4 × 10 6 / мл.
Примечание: Для оптимальной микроскопии клеток, поддерживать концентрацию клеточной суспензии между 1,5-6 × 10 6
4. Подготовка слайдов
- Предварительно лечить микроскопии пластину 8-а (см список материалов) с 200 мкл поли-L-лизином (0,01% раствор) в каждую лунку в течение 40-60 мин при комнатной температуре.
- Удалите поли-L-лизина (могут быть использованы повторно) и промыть лунки дважды 200 мкл дистиллированной H 2 O.
- Добавьте 200 мкл клеточной суспензии, полученного на стадии 3.6 в каждую лунку. Инкубирую при комнатной температуре в течение 30-60 мин.
- Готовят аликвоту 5- (и-6) карбокси S-1 ацетоксиметил (S-1-AM), сложный эфир (50 мкг) с добавлением 100 мкл высококачественной ДМСО к одной трубке. Vortex перемешать. Когда устройство не используется, хранить при -20 ° С.
- В небольшой трубки, добавляют 1,7 мл буфера BSS и 20 мкл S-1-AM. Vortex перемешать.
- Промыть лунки дважды 200 мкл буфера BSS, а затем заменить буфер с раствором С-1-AM. Позаботьтесь, чтобы не нарушать монослой клеток, прикрепленных к нижней части скважины, осторожно пипеткивниз по стенкам скважины. Инкубируем при комнатной температуре в течение по крайней мере 25 мин.
- Промыть лунки дважды 200 мкл буфера BSS. Чтобы проверить ингибитор, составляет «мастер-микс» соответствующего препарата в буфере BSS. Промыть лунки дважды в растворе ингибитора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том , чтобы использовать такое же количество лекарственного средства (например, ДМСО или этанол) в контроле также был использован для ингибитора. Если тестирование эффекта хлорида цинка, с помощью BSS буфера недостающей KH-PO 4 (HEPES буфер может в одиночку раствора), а цинк выпадает в осадок с фосфатом. - Разрушать ультразвук опсонизированного HKC-S-1 (раздел 6.2) в течение приблизительно 3 сек при 5 мкм амплитуды. Добавьте 10 мкл в каждую лунку. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 15-20 мин, чтобы позволить фагоцитоз, что делает клетки готовы быть отображены для снимков фагоцитоза.
5. конфокальной микроскопии
- С помощью конфокальной микроскопии, отрегулировать длину волны лазера так ена клетки возбуждаются на длине волны 555 нм и излучение детектируют с помощью двух каналов или детекторов: 560-600 нм и более 600 нм.
Примечание: Конкретные параметры микроскопов будут отличаться для каждого микроскопа и должны быть оптимизировано исследователем. - Просмотр клеток с использованием 63X объектив с маслом. Используйте изображение плитки сканирования на непрерывной настройке для просмотра центра плитки. Использование интенсивности флуоресценции и усиления каналов детектора, регулировать фокус и интенсивности лазера и коэффициент усиления двух каналов для оптимизации изображения.
- Разделить изображение, используя настройки для просмотра обоих каналов; проверьте, нет насыщения интенсивности флуоресценции в цитоплазме или вакуолях. Насыщение появляется в виде красных точек. Снизить интенсивность лазерного излучения, так что существует минимальное количество красных точек, но клетка и фагосомы достаточно яркие, чтобы видеть ясно.
- Когда удовлетворены, нажмите на кнопку «Начать эксперимент.» Изображение 9-плитка сканирования генерируется. Сохранить изображение как сложный файл рекомендованныйпрограммное обеспечение, которое содержит составное изображение из двух каналов (не в формате JPEG или TIFF).
6. Калибровочные эксперименты
- Построить стандартную кривую с рН только Candida.
- Подготовьте буферы с рН 3,0 до 13,0, в соответствии с таблицей 1.
- Принимать одну аликвоту (100 мкл) HKC-S-1. Спин ее в течение 1 мин при 17200 х г. Ресуспендируют его в 500 мкл назначенного буфера.
- Начиная с самого низкого диапазона рН, добавляют суспензию до одной предварительно обработанной хорошо (со стадии 4.2). Поместите слайд на конфокальной микроскопии на нагретых стадиях, установленных до 37 ° С.
- Запись флуоресценции каждой мин в течение 10 мин. Повторите эти действия для каждого буфера.
- Сапонины стандартные кривые.
- Изолировать 1 × 10 7 нейтрофилов человека 5 и ресуспендируют их в 1 мл низшего буфера рН.
- Выполните метод, описанный в разделе 4 для измерения рhagosomal рН в нейтрофилах.
- После инкубации с суспензией Candida в течение 20 мин, добавляют 0,3% сапонина (15 мкл 10% -ного запаса к одному предварительно обработанных хорошо (со стадии 4.2)) к чашке, а затем инкубируют в течение 20 мин при 37 ° С. Возьмите изображение каждую минуту в течение 10 мин. Повторите эти действия для каждого буфера.
- Цитозольные стандартные кривые рН с помощью высокой K + / нигерицина техника 5, 18, 19.
- Составляют буферы , описанные в таблице 1, рН от 4,0 до 13,0.
- Последующие шаги 4.1-4.7, оставив только нейтрофилы в предварительно обработанных скважин - каждую лунку, чтобы содержать другой буфер. Добавить слайд к нагретой стадии 37 ° С и регистрируют флуоресценцию каждую мин в течение 10 мин.
- Примечание: Это может занять некоторое время для цитозольного рНа для стабилизации с внешним раствором, но после этого момента, значение отношений S-1, становитсяпостоянная. Измерение внеклеточных HKC-S-1 в каждом эксперименте может служить в качестве контроля, чтобы проверить, что любые добавленные ингибиторы не мешают S-1, испускаемой флуоресценции или повлиять на рН этого буфера.
Анализ 7. Изображение
Примечание: Здесь, инструкции для анализа изображений (количественной флуоресценции) с использованием свободного программного обеспечения ImageJ предоставляются. Использование ImageJ рекомендуется.
- Скачать и установить ImageJ версию> 1.46r в соответствии с инструкциями разработчика (https://imagej.nih.gov/ij/). Установите дополнительный файл код, прикрепленный с этим протоколом под названием «Измерение Phagosomal.»
- Открыть изображение J и загрузить файл изображения, выбранный для анализа на панели инструментов. Чтобы объединить два канала, используйте Image> Color> Make Composite.
- Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать файл, в котором для хранения результатов.
- Нажмите на инструмент линии на панели инструментов и дважды нажмите, чтобы увеличить ширину & #34; 2 «.
- Нарисуйте линию по ширине фагосомы, а затем щелкните правой кнопкой мыши на «меры рН». Средняя интенсивность двух каналов приобретается, а их коэффициент рассчитывается автоматически с помощью файла кода в ImageJ.
- После окончания измерения, щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать «сохранить файл.»
- Для измерения площади фагосомы, использовать четвертый значок вдоль панели инструментов, чтобы нарисовать от руки вокруг области. Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать «область измерения.»
Примечание: Результаты сохраняются и файл журнала создается в каталоге, выбранном. Результаты могут быть обработаны с использованием таблицы, R, или эквивалентное программное обеспечение. Взаимосвязь между отношением флуоресценции до рН приблизительно сигмовидной, а значения отношения, генерируемые с помощью анализа ImageJ могут быть преобразованы до рН с использованием обобщенного логистическую или сигмовидной функции или с помощью линейной или кубической сплайн-интерполяции. - Для измерения цитоплазму, нарисуйте линию через цитоплазму и щелкните правой кнопкой мыши на «измерения рН».
Representative Results
На рисунке 1 представлены снимки нейтрофилов из различных источников , чтобы продемонстрировать различные среды phagosomal. Для того, чтобы облегчить количественный анализ, важно, чтобы семя скважины с соответствующим количеством ячеек: слишком много приведет клетку к слою друг над другой, что делает его трудно просматривать приложенные фагосомы точно; слишком мало будет, конечно, дают меньше результатов, в частности, не каждый будет нейтрофилы фагоцитируют. Фиг.2 представляет собой изображение, которое перенасыщено; это может быть оценено путем разделения изображения между двумя каналами его (с использованием программного обеспечения микроскопа, рекомендованный в Списке материалов или эквивалент) - красные точки показывают, где был обнаружен максимум флуоресценции. Это можно противопоставить путем уменьшения интенсивности лазера. Калибровочные кривые с использованием различных буферных систем, показаны на рисунке 3, адаптировано из Levine и соавт. 5 </ SUP>. Столбики ошибок показывают, что есть некоторые различия в флюоресценции между показаниями. На фиг.4 приведен пример того , как можно было бы представить данные для phagosomal рН и области. Такой подход позволяет каждое отдельное измерение, которое будет отображаться с чрезмерной укладкой boxplot. Тем не менее, данные также могут быть отображены в виде гистограммы гистограммы.
Рисунок 1: Соответствующий снимок изображение из нейтрофилов человека и мышей. В крайнем правом представляет собой качественный визуальный ключ приближенного цвета S-1-окрашенные фагосом, соответствующих рН. Желтый цвет указывает на более кислотность, в то время как красный указывает на более щелочности. (А) показывает Hvcn1 - / - мыши костных нейтрофилов костного мозга через 20 мин после фагоцитоза. В фагосомы появляется очень красной, щелочным и раздутой. Красная стрелка в нижней правой частиизображения указывает на внутриклеточный Candida, в то время как стрелка в верхнем левом углу указывает на внеклеточный частицы. (В) показывают , нейтрофилы костного мозга мыши дикого типа кости , которые заглатывание Candida; они гораздо меньше , чем щелочная Hvcn1 - / - клетки. (С) показывает человеческие нейтрофилы периферической крови в той же точке после фагоцитоза. Они появляются чуть более щелочным , чем мыши дикого типа клетки, но фагосомы все еще не так велики , и красные , как Hcvn1 - / - клетки. (D) , показывает человеческие нейтрофилы , которые фагоцитируют Candida в присутствии 5 мкМ дифениленовой иодония (DPI). Все фагосомы очень кислые, с рНом 6 или менее; препарат ингибирует НАДФНА-оксидазу, так что нет компенсационного движения ионов. Протоны , высвобождаемые из кислых гранул , которые сливаются в фагосомы вызвать кислый рН 20, и увеличение набора в V-АТФазе к йе phagosomal мембраны при обработке DPI 9. В цитоплазме также появляется более щелочной по сравнению с клетками других условий. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: перенасыщение Hvcn1 - / - мыши нейтрофилов костного мозга. Важно исключить из анализа изображений, в которых данные флуоресценции перенасыщен. Как описано в разделе 5.3, составное изображение разделяется на два изображения (вверху слева, красная стрелка) с обоих каналов, представленных в индивидуальном порядке. В этом программном обеспечении, индикатор диапазона проверяется на (слева внизу, красная стрелка), то любые пиксели, которые чрезмерно насыщенный ярко-красный. Существует перенасыщение присутствует в обоих каналах (1 и 2). magnification некоторых клеток и внеклеточный Кандид показан в правом нижнем угле, со стрелками , указывающими на пораженные участки. Анализ этих точек приведет к ложному логометрическому измерению. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Стандартные калибровочные кривые для конверсии коэффициентов флуоресценции S-1 к измерениям рН. Стандартные кривые для Candida один в различных буферах (помечены как «Трис») и , когда клетки проницаемыми с сапонина ( «сапонин») очень похожи, показывая , что S-1 , чтение внутри и вне клетки (фагосомы и внеклеточной среда) сопоставимы. Столбики ошибок обозначают среднее значение ± SD. S-1, отношение кривой / рН укорачивается при испытании Iп цитоплазма ( «цитоплазма»), которые должны быть приняты во внимание при анализе изображения. Эта цифра была изменена с Levine и соавт. 5. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Количественное phagosomal рН и области. На этом рисунке представлен пример представления данных. Графики были получены с использованием программного обеспечения программирования Р. А: показывает соотношение phagosomal и соответствующее значение рН для А (Hvcn1 - / - мыши нейтрофилов костного мозга), B: мыши дикого типа костного мозга нейтрофилов, C: нейтрофилы периферической крови человека, и D: человеческие нейтрофилы с 5 мкМ DPI п = 3/300. Отдельные измерения показаны в виде маленьких квадратиков, с наложением boxplot с лечебамиап и межквартильный. Красная полоса представляет собой среднее значение. Как видно на изображениях на рисунке 1, Hvcn1 - / - клетки имеют очень щелочные фагосомы по сравнению с диким типом мышиных и человеческими нейтрофилов. Они также имеют большую площадь phagosomal (рисунок 4B, N = 3/300). фагосомы человека нейтрофильных немного более щелочные и больше, чем нейтрофилы мыши дикого типа, тогда как нейтрофилы человека, инкубированные с DPI имеют очень кислые и мелкие фагосомы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Сбалансированный солевой раствор (BSS) , буфер | |||
| NaCl | 156 мМ | ||
| KCl | 3 мМ | ||
| MgSO 4 | 2 мМ | ||
| КН 2 РО 4 | 1,25 мМ | ||
| CaCl 2 | 2 мМ | ||
| глюкоза | 10 мМ | ||
| Hepes | 10 мМ | ||
| рН 7,4 с помощью NaOH или HCl | |||
| YPD бульона | |||
| YPD бульона | 50 г | ||
| Дистиллированная вода | 1 л | ||
| Автоклаве при 121 ° С в течение 15 мин | |||
| Для YPD агар: перед автоклавированием добавить 15 г / л агара | |||
| 10% раствор декстрана | |||
| Декстран клиническая оценка | 50 г | ||
| NaCl | <TD>4,5 г | ||
| Дистиллированная вода | 500 мл | ||
| Добавить в стеклянной бутылке и автоклаве при 121 ° С в течение 15 мин | |||
| Раствор 2x Солевой | |||
| NaCl | 18 г | ||
| Дистиллированная вода | 1 л | ||
| Добавить в стеклянной бутылке и автоклаве при 121 ° С в течение 15 мин | |||
| 10% акций сапонины | |||
| буфер ПБС | 50 мл | ||
| сапонины | 5 г | ||
| Тепло ПБС буфера до 37 ° С, добавляют сапонин и перемешать. | |||
| Добавить 0,1% азид натрия в качестве консерванта, хранить смесь при 4 ° С. | </ TR>|||
| Калибровочные буферы | |||
| Стандартная кривая Кандида | |||
| Сначала составляет 0,15 М запасли каждый буфер | |||
| Составляет 0,15 М раствора NaCl | |||
| 15 мл конечный объем: 5 мл 0,15 М желаемого буферного раствора + 10 мл 0,15 М NaCl раствор | |||
| рН 3 | 100 мМ NaCl, | 50 мМ глицина | |
| рН 4 | 100 мМ NaCl, | 50 мМ ацетат | |
| рН 5 | 100 мМ NaCl, | 50 мМ ацетат | |
| рН 6 | 100 мМ NaCl, | 50 мМ ацетат | |
| рН 7 | 100 мМ NaCl, | 50 мМ Трис | |
| рН 8 | 100 мМ NaCl, | 50 мМ Трис | |
| рН 9 | 100 мМ NaCl, | 50 мМ Трис | |
| рН 10 | 100 мМ NaCl, | 50 мМ глицина | |
| рН 11 | 100 мМ NaCl, | 50 мМ фосфат | |
| рН 12 | 100 мМ NaCl, | 50 мМ фосфат | |
| рН 13 | 100 мМ NaCl, | 50 мМ фосфат | |
| Цитозольные стандартные кривой | |||
| Используйте сделанные ранее 0,15 М маточного буферных растворов | |||
| Составляет 0,15 М раствора KCl | |||
| 15 мл конечный объем: 5 мл 0,15 М раствора желаемого буфера + 10 мл 0,15 М KCl | |||
| 10 мМ запаса нигерицина в этаноле, добавляет 15 мкл в каждый конечный раствор объема | |||
| рН 3 | 100 мМ КСl 50 мМ глицина | 10 мкМ нигерицин | |
| рН 4 | 100 мМ КСl | 50 мМ ацетат | 10 мкМ нигерицин |
| рН 5 | 100 мМ КСl | 50 мМ ацетат | 10 мкМ нигерицин |
| рН 6 | 100 мМ КСl | 50 мМ ацетат | 10 мкМ нигерицин |
| рН 7 | 100 мМ КСl | 50 мМ Трис | 10 мкМ нигерицин |
| рН 8 | 100 мМ КСl | 50 мМ Трис | 10 мкМ нигерицин |
| рН 9 | 100 мМ КСl | 50 мМ Трис | 10 мкМ нигерицин |
| рН 10 | 100 мМ КСl | 50 мМ глицина | 10 мкМ нигерицин |
| рН 11 | 100 мМ КСl | 50 мМ фосфат | 10 мкМ нигерицин |
| рН 12 100 мМ КСl | 50 мМ фосфат | 10 мкМ нигерицин | |
| рН 13 | 100 мМ КСl | 50 мМ фосфат | 10 мкМ нигерицин |
| рН все калибровочные растворы либо с HCl или NaOH | |||
Таблица 1: Состав буферов. В данной таблице приведены соответствующие составы различных буферов, используемых в протоколе.
Дополнительный код файл. Этот файл содержит ряд макросов, написанных Ап Левин, которые необходимы для анализа изображений. Авторы были бы рады, чтобы попытаться решить любые вопросы, связанные с использованием этого кода. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы скачать этот файл.
Discussion
После того, как соответствующие реагенты, настройки микроскопа, и эксперименты калибровки настроены, этот метод относительно прост в исполнении. Критические шаги включают: мечение Candida с S-1 , чтобы гарантировать , что нет перегрузки красителя, калибровки и анализа изображения.
S-1 , представляет собой реагент подходит для более щелочных рН среды, что особенно важно для нейтрофилов 21 , но ограничивает его использование в определенных типах клеток. Для получения более кислых сред, такие как макрофаг фагосомы, Snarf-4, или S-4, больше подходит из - за его более низкий рКа 22. Кроме того, для более точных показаний цитоплазматических, то лучше использовать S-4, в качестве стандартной кривой для S-1 показывает , что коэффициенты флуоресценции начинают плато ниже рН 6 (рисунок 3). Другие красители, такие, как 2' , 7'-бис- (2-карбоксиэтил) -5- (и-6) -Carboxyfluorescein (BCECF) или pHrodo Красный также может быть более подходящим в продолжениевнутр, что, как ожидается, будет кислым. Однако цитоплазма окрашивание еще необходимо для правильной идентификации фагосом , содержащих Candida.
Важной особенностью показателя рН phagosomal является то, что она не необратимо изменяется при реактивной среде phagosomal. S-1, кажется, быть устойчивым к нейтрофильной среде. Об этом свидетельствует Левин и др. 5 (см Дополнительное видео 4 из ссылки 5) , которые демонстрируют фагоцитоз и последующее высвобождение S-1-меченых Candida частицы на Hvcn1 - / - нейтрофилы. Когда фагоцитозу, частица превращается из желтого / оранжевого до красного (нейтрального до щелочного рН), но когда частица высвобождается нейтрофилов, он возвращается к своему первоначальному цвету.
Важно отметить некоторые ограничения, связанные с использованием S-1. Тот факт, что этот краситель имеет два спектров излучения, позволяющие логометрический МЭСurement является преимуществом, но специальное оборудование необходимо для получения изображений; микроскоп, использованный для экспериментов должны иметь возможность записывать два изображения одновременно или с незначительной временной задержкой. Авторы полагают, что исследователь пытается этот протокол имеет опыт работы с помощью конфокальной микроскопии, или имеет доступ к квалифицированному специалисту. Мы не можем перечислить все конкретные параметры микроскопа, как они будут отличаться для каждого микроскопа и должны быть оптимизированы исследователем. Ацетоксиметил эфир, конъюгированный с S-1, что позволяет краситель диффундировать в цитоплазме клеток разрушается под действием неспецифических эстераз в цитоплазме клеток с образованием молекулы флуоресцентного. Эстеразы, такие как щелочной фосфатазы, присутствуют в человеческой сыворотке и эмбриональной телячьей сыворотки, которые используются для дополнения среды для культивирования клеток. Соответственно, среда, в которой клетки загружаются с S-1-AM (раздел 4.5) не должны содержать сыворотку. Это может оказаться сложным, если с использованием клеток, которые требуют более питательной RICч среды для поддержания их чем сбалансированного солевого раствора, используемого в данном протоколе. Аналогичным образом, другие компоненты, флуоресцентные средние, такие как феноловый красный, могут создавать помехи измерений S-1.
Столбики ошибок на рисунке 3 , показывают , что есть некоторые различия в измерениях коэффициента при каждом значении рН. Подходящее количество повторений каждого эксперимента (по крайней мере, п = 3), и как много отдельных измерений в каждом отдельно взятом эксперименте необходимы, чтобы преодолеть между вакуолярной вариацией. Таким образом , целесообразно измерять рН по меньшей мере , 100 фагосом для каждого условия и столько phagosomal областей , которые , как представляются, содержат только один Кандид. В фагосомах быть измерены количественным должен быть те, которые полностью поглотили частицу кандидоза (т.е. те , полностью окруженная цитоплазмами). Для смягчения от случайных смещений в отборе клеток / фагосом для количественного определения, все анализы должны выполняться во времяслеп к условиям эксперимента.
Здесь мы описали выделение нейтрофилов путем осаждени с применением декстрана цельной крови с последующим центрифугированием слоя плазмы через градиент плотности. Мы используем эту технику, так как он быстро и эффективно производит чистую (> 95%) популяцию нейтрофилов, хотя существует и другие методы, доступные, например, всего центрифугирование крови через другие градиент плотности формулы или отрицательную селекцию нейтрофилов с использованием специализированных наборов с антителами или магнитными бусы. Однако, последние могут быть слишком дорогими для большинства групп, которые изолируют нейтрофилы обычно. Кроме того, мы используем антикоагулянт гепарин в крови собирающих трубки, в то время как другие исследователи могут быть более привыкли использовать этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) или кислый цитрат натрия (ACD). Поскольку существует много различных методов, чтобы выбрать из, это до личных предпочтений исследователя.
Более того,при выделении и манипулирования нейтрофилы они должны быть обработаны с некоторой осторожностью, чтобы избежать чрезмерной активации. Предупредительные шаги включают в себя: только с помощью пластиковой посуды, без стекла; фильтр-стерилизовать все буфера, чтобы удалить загрязняющий эндотоксин; когда спиннинг нейтрофилы убедитесь, что центрифуга хорошо сбалансирована, чтобы избежать чрезмерных вибраций; ограничить настолько, насколько это возможно, время нейтрофилы остаются в осадке после центрифугирования; не выдерживают нейтрофилов в растворе более чем на 5 × 10 6 / мл; и выполнить эксперимент, как можно скорее после выделения.
Этот метод может быть адаптирован для измерения изменений в области рНа и phagosomal с течением времени с помощью набора нагретой ступени до 37 ° С на микроскопе и принимая снимки один раз каждые 30-60 лет с той же позиции, как описано для этапов калибровки. Это также может теоретически быть адаптирован для более высокой пропускной способностью экспериментов, например, в 96-луночные планшеты, а также для проточной цитометрии экспериментов, где S-1 можетбыть использованы в качестве индикатора рН 23. Однако, в этих условиях, акцент на индивидуальной активности клеток заменяются более глобальным влиянием на популяции клеток.
Этот метод призван обеспечить относительно простой экспериментальной установки, на которой отдельные исследователи могут адаптироваться в соответствии с их областью интереса. Исследователи могут хотеть исследовать нейтрофильных phagosomal рН и в то же время площадь измерения движения других ионов, например, внутриклеточной концентрации кальция. Есть несколько флуоресцентных Са 2+ показателей легко доступны для конфокальной микроскопии, таких как индо-1, который также имеет двойственные спектры излучения при 400 и 475 нме 24. Эти длины волн излучения не перекрываются с спектров излучения S-1, но длина волны возбуждения находится в ультрафиолетовой (УФ) части спектра, которые могут быть вредными для клеток, и УФ-лазер не обычным явлением на всех микроскопах. Исчерпывающий обзор различных показателейизмерения внутриклеточного кальция поток покрывается Такахаши и др. 25 и Хиллсон и др. 26.
В заключение, существуют другие методы , доступные для измерения рН phagosomal с использованием различных флуоресцентных красителей , как Нунеш и др. показали , 13, а также другие группы 27, 28. Другие исследователи также использовали S-1 для измерения цитозольного рН 29 или рН phagosomal 14. Тем не менее, этот протокол является уникальным в измерении одновременно рН как цитозоль и фагосомы, что обеспечивает возможность наблюдать изменения в phagosomal площади поперечного сечения и различать дикого типа и Hvcn1 - / - нейтрофилы мыши, и нейтрофилы человека с и без работая NADPH оксидазы.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была любезно финансируется Wellcome Trust, биотехнологии и биологических наук Исследовательского Совета, и Ирвин Йоффе Мемориальной стипендии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Candida albicans ATCC 10231 Vitroids 80 CFU | Sigma-Aldrich | RQC14003-10EA | Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions |
| YPD broth | Sigma-Aldrich | Y1375 | Follow manufacturer's instructions, various providers exist |
| Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000 | MP Biomedicals | 2101514 | Use gloves |
| Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000 IU/mL | Fannin, Wockhardt UK Ltd | FP1077 | We purchased from UCH inpatient pharmacy |
| SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester - Special Packaging | Thermo Scientific/Invitrogen | SS22801 | Use gloves |
| 5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | Thermo Scientific/Invitrogen | C1272 | Use gloves |
| Vivaglobin human IgG 160 mg/mL solution | CSL Behring | received as a gift | Various providers exist |
| Normal mouse serum | Abcam | ab7486 | Various providers exist |
| Lymphoprep (density gradient medium) | Alere Ltd | 1114547 | Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | Various providers exist |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Various providers exist |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Various providers exist |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | Various providers exist |
| Absolute Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
| Diphenylene iodonium (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Various providers exist |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 | Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate |
| Poly L lysine | Sigma | P4707 | Various providers exist |
| Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700) | Carl Zeiss | The microscope must be able to excite at 555 nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600 nm, >610 nm) | |
| Ibidi µ slide 8 well ibiTreat | Thistle Scientific | IB-80826 | Other appropriate imaging dishes can be substituted |
| Soniprep 150 | MSE | Any appropriate sonicator will suffice | |
| TC20 Automated Cell Counter | BioRad | Various providers exist | |
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs |
References
- Segal, A. W. NADPH oxidases as electrochemical generators to produce ion fluxes and turgor in fungi, plants and humans. Open Biol. 6 (5), 515-517 (2016).
- Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annu Rev Immunol. 23, 197-223 (2005).
- Cross, A. R., Segal, A. W. The NADPH oxidase of professional phagocytes - Prototype of the NOX electron transport chain systems. BBA Bioenergetics. 1657 (1), 1-22 (2004).
- Demaurex, N., El Chemaly, A. Physiological roles of voltage-gated proton channels in leukocytes. J Physiol. 588 (23), 4659-4665 (2010).
- Levine, A. P., Duchen, M. R., de Villiers, S., Rich, P. R., Segal, A. W. Alkalinity of neutrophil phagocytic vacuoles is modulated by HVCN1 and has consequences for myeloperoxidase activity. PLoS One. 10 (4), 0125906 (2015).
- Reeves, E. P., Lu, H., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416 (6878), 291-297 (2002).
- Menegazzi, R., Busetto, S., Dri, P., Cramer, R., Patriarca, P. Chloride ion efflux regulates adherence, spreading, and respiratory burst of neutrophils stimulated by tumor necrosis factor-alpha (TNF) on biologic surfaces. J Cell Biol. 135 (2), 511-522 (1996).
- Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Cell Biol. 75 (7), 3327-3331 (1978).
- Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in neutrophils. J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).
- Tsien, R. Y. Fluorescent Indicators of Ion Concentrations. Methods in Cell Biol. 30, 127-156 (1989).
- Lavis, L. D., Rutkoski, T. J., Raines, R. T. Tuning the pK a of Fluorescein to Optimize Binding Assays. Anal Chem. 79 (17), 6775-6782 (2007).
- Hurst, J. K., Albrich, J. M., Green, T. R., Rosen, H., Klebanoff, S. Myeloperoxidase-dependent fluorescein chlorination by stimulated neutrophils. J Biol Chem. 259 (8), 4812-4821 (1984).
- Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy. J Vis Exp. (106), e53402 (2015).
- Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Mol Biol Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).
- Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. (109), e53622 (2016).
- Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D. Application of a new pH-sensitive fluoroprobe (carboxy-SNARF-1) for intracellular pH measurement in small, isolated cells. Pfl ügers Archiv EJP. 417 (2), 234-239 (1990).
- El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leuko Biol. 95 (5), 827-839 (2014).
- Morgan, D., Capasso, M., et al. Voltage-gated proton channels maintain pH in human neutrophils during phagocytosis. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 18022-18027 (2009).
- Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18 (11), 2210-2218 (1979).
- Levine, A. P., Segal, A. W. The NADPH Oxidase and Microbial Killing by Neutrophils, With a Particular Emphasis on the Proposed Antimicrobial Role of Myeloperoxidase within the Phagocytic Vacuole. Microbiol Spectr. 4 (4), (2016).
- Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Van Erp, P. E. J., Jansen, M. J. J. M., De Jongh, G. J., Boezeman, J. B. M., Schalkwijk, J. Ratiometric measurement of intracellular pH in cultured human keratinocytes using carboxy-SNARF-1 and flow cytometry. Cytometry. 12 (2), 127-132 (1991).
- Minamikawa, T., Takamatsu, T., Kashima, S., Fushiki, S., Fujita, S. Confocal calcium imaging with ultraviolet laser- scanning microscopy and indo-1. Micron. 24 (6), 551-556 (1993).
- Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of Intracellular Calcium. Physiol Rev. 79 (4), (1999).
- Hillson, E. J., Dewitt, S., Hallett, M. B. Optical methods for the measurement and manipulation of cytosolic free calcium in neutrophils. Methods Mol Biol. 412, Clifton, N.J. 125-137 (2007).
- Bernardo, J., Long, H. J., Simons, E. R. Initial cytoplasmic and phagosomal consequences of human neutrophil exposure to Staphylococcus epidermidis. Cytometry Part A. 77 (3), 243-252 (2010).
- Riazanski, V., Gabdoulkhakova, A. G., et al. TRPC6 channel translocation into phagosomal membrane augments phagosomal function. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (47), 6486-6495 (2015).
- Martínez-Zaguilán, R., Martínez, G. M., Lattanzio, F., Gillies, R. J. Simultaneous measurement of intracellular pH and Ca2+ using the fluorescence of SNARF-1 and fura-2. Am J Physiol Cell Physiol. 260 (2), (1991).
