Summary
Detta manuskript beskriver en enkel metod för att mäta phagosomal pH och område samt den cytoplasmatiska pH hos människa och mus neutrofiler med användning av ratiometrisk indikatorn seminaphthorhodafluor (Snarf) -1, eller S-1. Detta uppnås med hjälp av live-cell konfokal fluorescensmikroskopi och bildanalys.
Abstract
Neutrofiler är avgörande för att vara värd för medfödda försvaret och därmed utgör ett viktigt område för medicinsk forskning. Den fagosomen, den intracellulära utrymmet där dödandet och nedbrytning av uppslukas partiklar sker, är den viktigaste arenan för neutrofila patogen dödande som kräver stram reglering. Phagosomal pH är en aspekt som är noggrant styrd i sin tur reglerar antimikrobiell proteasaktivitet. Många fluorescerande pH-känsliga färgämnen har använts för att visualisera phagosomal miljön. S-1 har flera fördelar jämfört med andra pH-känsliga färgämnen, inklusive dess dubbla emissionsspektra, dess motståndskraft mot fotoblekning, och dess höga pKa. Med denna metod har vi visat att neutrofiler fagosomen är ovanligt alkalisk i jämförelse med andra fagocyter. Genom att använda olika biokemiska konjugationer av färgämnet kan fagosomen avgränsas från cytoplasman så att ändringar i storleken och formen på fagosomen kan bedömas. Detta tillåter feller vidare övervakning av jonisk rörelse.
Introduction
Den neutrofila är den vanligast förekommande medfödda immunceller i kroppen. Dess huvudsakliga funktion består av patruller blodomloppet och uppsluka och smälta de främmande partiklarna att den kan stöta på i en process känd som fagocytos 1, 2. Partiklarna bryts ned i en intracellulär avdelning kallad fagosomen. Aktiveringen av neutrofila NADPH-oxidas, den isoform NOX2, initierar en kaskad av biokemiska reaktioner som kulminerar i döden av patogenen. NOX2 proteinsubenheter vidare för att bilda en elektrontransportkedja komplex i phagosomal membranet 3. En gång aktiverats, det transporterar elektroner från NADPH över membranet till molekylärt syre inne i fagosomen, producerande superoxidanjoner och ytterligare reaktiva syrespecies. Detta är känt som den respiratory burst, och det tros vara väsentlig för effektiv mikrobiell avdödning och matsmältning 2 4, 5. Denna kanal tillåter passiv förflyttning av protoner ner sin elektrokemiska gradient från cytosolen in i fagosomen. Protonkoncentration reflekteras av pH, så för en given nivå av oxidasaktivitet, kan mätning av pH i fagosomen ge information om den relativa deltagande protoniska och icke-protoniska vägar i laddningskompensation.
Den humana neutrofil fagosomen har ett alkaliskt pH av ca 8,5 under 20-30 min efter fagocytos 5. Detta innebär att det finns ytterligare icke-proton jonkanaler i NOX2-inducerad laddningskompensation, som fusions och frisättning av innehållet i de sura granuler och enda kompensation av HVCN1 skulle bibehålla en sur miljö, i motsats till vad som observerats. Rörelsen av joner för att kompensera denna negativa laddning kan också utöva förändringar i fagosomen storlek via osmos. Dessa kan vara joner närvarande i den neutrofila vid höga fysiologiska koncentrationer: kaliumjoner har visats att flytta in i fagosomen 6, och klorid jonisk rörelse är en annan kandidat viktigt för neutrofil funktion 7.
Regleringen av pH i fagosomen är avgörande för antimikrobiell proteasaktivitet 5. Myeloperoxidas (MPO) synes ha optimal aktivitet vid pH 6, medan det för katepsin G och elastas, de optimala nivåer är pH 7-9 och pH 8-10, respektive 5. Därför kan övergående förändring i phagosomal pH ger aktivitets nischer för olika enzymer till funInsatser. Att förstå hur pH är involverad i neutrofila mikrobiell dödande kan ge användbar information för utformning av nya neutrofila-utöka mikrobiella medel.
Den neutrofila fagosomen är en mycket reaktiv miljö. Detta gör det svårt att exakt bedöma pH, eftersom färgämnen kan lätt oxideras, vilket leder till tekniska artefakter. Historiskt har fluoresceinisotiocyanat (FITC) varit färgämnet med val för att mäta intracellulärt pH 8, 9. Det finns dock vissa nackdelar för dess användning för att mäta neutrofila phagosomal pH. Den har ett pKa av 6,4 10, vilket innebär att den kan endast noggrant användas för att bedöma pH-nivåer från 5 till 7,5 8, eftersom det mättar vid pH <8 11. Som neutrofila phagosomal pH kan bli mycket mer basisk 5, kan FITC inte fånga hela skalan av möjliga pH-förändringar. En ytterligare significant problem med FITC i samband med neutrofiler är att det är tänkt att vara photobleached av MPO 12. MPO-inhibitor, natriumazid, kan användas för att begränsa fotoblekning 13, men det har visat sig att natriumazid direkt sänker phagosomal pH i en MPO-oberoende sätt och är därför olämplig för användning i sådana analyser 5.
Jämfört med andra intracellulära färgämnen, S-1 har ett relativt högt pKa på 7,5 10. Under sura betingelser, är molekylen protonerad och alstrar ett emissionssignal mellan 560 och 600 nm, när den exciteras vid 488 nm eller högre. När molekylen deprotoneras i mer alkaliska förhållanden, är emissionsvåglängden över 600 nm. Ett förhållande av fluorescensintensiteterna vid dessa två våglängder indikerar emissionsskift, vilket är mer är tillförlitlig än enstaka fluorescensmätningar, eftersom det är opåverkad av fluorofor koncentration och cellstruktur. S-1 kan konjugeras till antigena material, såsom zymosan 14, även om värmedödade (HK) Candida albicans är att föredra, eftersom den större ytarean ger ett mer konsekvent fluorescensavläsning.
Vi har även använt en modifiering av denna metod för att studera tidsmässiga förändringar i pH (Figur 3) 5. Denna metod för mätning av cytosoliskt pH kan lätt tillämpas på andra celltyper, såsom beskrivits på annat ställe 15, 16, och celler med mer alkaliska fagosomer 14.
Protocol
Etik uttalande: Alla djur arbete genomfördes med licensen och godkännande av den brittiska inrikesdepartementet. Human deltagande i denna forskning godkändes av de gemensamma UCL / UCLH kommittéer på etik Human Research. Alla deltagare som informerat samtycke.
1. Framställning av C. albicans
- Odla en Candida skiva (se Material List) på en YPD agarplatta enligt tillverkarens anvisningar. Välj en koloni och lägga till 15 ml YPD buljong. Inkubera den i en skakinkubator vid 30 ° C och 200 rpm tills buljongen är grumlig (vanligtvis cirka två dagar, eller till en koncentration av ungefär över en x 10 9 / ml).
- Centrifugera ner Candida mediet och återsuspendera det i 50 ml av fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Centrifugera vid 3000 xg under 10 min. Upprepa detta steg två gånger.
- Placera röret innehållande 50 mL PBS / Candida-medium i ett vattenbad som förvärmts till 60 ° C, så att hela röret är submerged för en timme.
- För att bekräfta att Candida är värmedödad, strimma ett prov på en YPD-agarplatta och inkubera över natten vid 30 ° C. Justera värmedödade (HK) Candida koncentrationen till 5-9 x 10 8 / ml, beroende på Candida tillväxt, och lagra den i 1 ml alikvoter i en -20 ° C frys.
OBS: Alla celltal i detta protokoll utfördes med hjälp av en automatiserad cellräknare.
- För att bekräfta att Candida är värmedödad, strimma ett prov på en YPD-agarplatta och inkubera över natten vid 30 ° C. Justera värmedödade (HK) Candida koncentrationen till 5-9 x 10 8 / ml, beroende på Candida tillväxt, och lagra den i 1 ml alikvoter i en -20 ° C frys.
2. S-1 Koppling till värmeavdödade (HK) Candida
- Förbereda en alikvot av karboxi-S-1 succinimidyl ester (50 ^ g) genom att späda den i 100 mikroliter av höggradig dimetylsulfoxid (DMSO). Vortex väl för att blanda.
- Förbereda 1 ml av 1 x 10 8 HK Candida i 0,1 M natriumbikarbonat (pH 8,3) i ett 15 ml rör.
- Lägga 100 mikroliter av karboxi-S-en en droppe i taget till HK Candida under blandning på en vortex på ungefär 2000 varv per minut (medelhög till hög hastighet). Linda aluminium foil runt röret och placera den på en rulle vid rumstemperatur under 1 h.
- Tvätta HK Candida- S-1 (HKC-S-1) tre gånger genom centrifugering vid 2250 xg under 10 min vardera. För de första två tvättarna, återsuspendera pelleten i 15 ml 0,1 M natriumbikarbonat (pH 8,3). Efter den tredje tvättningen, återsuspendera det i 1 ml balanserad saltlösning (BSS) buffert (se tabell 1).
- Överföra HKC-S-1 fjädring i rör i 100 pl alikvoter och förvara dem vid -20 ° C.
NOTERA: Använd rör med låg yta bindande material, om möjligt, eftersom HKC-S-1-partiklar kan fastna på väggen av normala centrifugrör. - Opsonisera HKC-S-1
- För humana neutrofiler, tillsätt 100 mikroliter av humant IgG-serum till 100 mikroliter av upptinade HKC-S-1.
- För mus neutrofiler, tillsätt 50 | il av normalt musserum och 50 mikroliter av mus-Candida immunserum (genererat från C57B6 möss injicerade med HK Candida) 5 till 100 | ilav HKC-S-1.
- Blanda det på en värmeskakanordning vid 37 ° C och 1100 rpm under 60-90 min, och sedan på en 4 ° C rulle för två timmar.
- Tvätta tre gånger i BSS-buffert genom centrifugering vid 17.200 xg under 1 min vardera. Återsuspendera i 100 mikroliter av BSS-buffert.
3. Isolering av neutrofiler
- För humana perifera blodneutrofiler, ta 15 ml blod genom venpunktion från en frisk givare och placera den i en 20 ml spruta innehållande 90 mikroliter av 1000 lU / ml heparin-natrium-lösning (60 mikroliter av heparin / 10 ml blod).
- Med användning av en pipettspets, injicera 1,5 ml av 10% dextranlösning i sprutan. Vänd försiktigt 3 gånger och låt den stå upprätt på bänken.
- Vänta 30-60 min, tills blodet delas ungefär i halv, med ett övre buffy coat skikt som är halmfärgad och ett bottenskikt som innehåller erytrocyter.
- Tryck försiktigt ut det översta lagret genom en nål eller ta bort den med en pipettspets. Sätt den ina 15 ml rör. Undvik att ta ut den röda lagret. Med användning av en 5 ml pipett, tillsätt 3-4 ml densitetsgradient-medium (se Material List) till botten av röret under koncentratskiktet för att erhålla två distinkta skikt. Centrifugera vid 913 xg under 10 min.
OBS: Om med hjälp av mus-neutrofiler (se referens 17 för mus-neutrofil isolering), använder cellsuspension som har spolats från benmärgen istället. - Häll av supernatanten och lämnar efter sig en röd pellet. Försiktigt virvel störa pelleten. Lägga 7 ml destillerat, autoklaverat H2O till pelleten och invertera under 20 s för att resuspendera pelleten. Lägg 7 ml 2x saltlösning och skaka för att blanda, lys av återstående röda blodkroppar.
- Centrifugera vid 300 xg under 5 min. Häll bort supernatanten och återsuspendera pelleten i BSS-buffert till cirka 4 x 10 6 / ml.
OBS: För optimal mikroskopi av cellerna, hålla cellsuspensionen koncentrationen mellan 1,5-6 x 10 6
4. Framställning av Slides
- Pre-behandla en 8-brunnars mikroskopi platta (se Material List) med 200 mikroliter av poly-L-lysin (0,01% lösning) i varje brunn under 40-60 min vid rumstemperatur.
- Avlägsna poly-L-lysin (kan återanvändas) och tvätta brunnarna två gånger med 200 mikroliter destillerat H2O
- Tillsätt 200 | il av cellsuspension som framställts i steg 3,6 till varje brunn. Inkubera vid rumstemperatur under 30-60 min.
- Förbereda en alikvot av 5- (och-6) -karboxi S-1 acetoximetyl (S-1-AM) ester (50 ^ g) genom att tillsätta 100 mikroliter av höggradig DMSO till ett rör. Vortex att blanda. När den inte används, förvara vid -20 ° C.
- I ett litet rör, tillsätt 1,7 ml BSS-buffert och 20 | il av S-1-AM. Vortex att blanda.
- Tvätta brunnarna två gånger med 200 mikroliter av BSS-buffert, och sedan ersätta bufferten med S-1-AM-lösning. Var noga med att inte störa monolager av celler anslutna till botten av brunnen genom att försiktigt pipetteraner väggarna av brunnarna. Inkubera vid rumstemperatur under minst 25 min.
- Tvätta brunnarna två gånger med 200 mikroliter av BSS-buffert. För att testa en hämmare, utgör en "master mix" av lämplig drogen i BSS buffert. Tvätta brunnarna två gånger i lösningen hämmare.
OBS: Se till att använda samma mängd läkemedel vehikel (t ex DMSO eller etanol) i kontrollbrunnen som användes för inhibitorn. Om att testa effekten av zinkklorid, använd BSS-buffert som saknar KH 2 PO 4 (HEPES kan buffra lösningen ensam), såsom zink utfälles med fosfat. - Sonikera opsoniserad HKC-S-1 (avsnitt 6,2) under ca 3 s vid 5 amplitud um. Tillsätt 10 mikroliter till varje brunn. Inkubera plattan vid 37 ° C under 15-20 min för att tillåta fagocytos, vilket gör cellerna redo att avbildas för ögonblicksbilder av fagocytos.
5. konfokalmikroskopi
- Med användning av ett konfokalt mikroskop, justera laservåglängden så thvid cellerna exciteras vid 555 nm och emissions detekteras av två kanaler, eller detektorer: 560-600 nm och över 600 nm.
OBS: Särskilda mikroskop parametrar kommer att skilja sig för varje mikroskop och måste optimeras av forskaren. - Visa cellerna med hjälp av en 63X objektiv med olja. Använd en bricka-scan image kontinuerlig inställning för att visa mitt kakel. Med användning av fluorescensintensitet och förstärkningen hos detektorkanaler, justera fokus och intensitet hos lasern och förstärkningen av de två kanalerna för att optimera bilden.
- Dela bilden med de inställningar för att visa båda kanalerna; Kontrollera att det inte finns någon mättnad av fluorescensintensiteten i cytoplasman eller vakuoler. Mättnad visas som röda prickar. Minska laserintensiteten så att det finns ett minimalt antal röda prickar, men cellerna och fagosomer är ljusa nog att se klart.
- När du är nöjd, klicka på "Starta experiment." En 9-plattor skannade bilden genereras. Spara bilden som en komplex fil som rekommenderas avden programvara som innehåller en sammansatt bild av de två kanalerna (ej JPEG eller TIFF).
6. Kalibrerings Experiment
- Konstruera pH standardkurvan med Candida enbart.
- Framställa buffertar från pH 3,0 till 13,0, enligt tabell 1.
- Ta en alikvot (100 | al) av HKC-S-1. Snurra det fastställts för en min vid 17.200 x g. Resuspendera den i 500 mikroliter av den tilldelade buffert.
- Med start från det lägsta pH-området, lägga suspensionen till en förbehandlad brunn (från steg 4,2). Placera objektglaset på konfokalmikroskop på en uppvärmd skede satt till 37 ° C.
- Anteckna fluorescens varje minut under 10 minuter. Upprepa för varje buffert.
- Saponin standardkurva.
- Isolera 1 x 10 7 humana neutrofiler 5 och återsuspendera dem i en ml av de lägsta pH-buffert.
- Följa den metod som beskrivs i avsnitt 4 för mätning av phagosomal pH i neutrofiler.
- Efter inkubering med Candida suspension för 20 minuter, tillsätt 0,3% saponin (15 mikroliter av 10% lager till en förbehandlad brunn (från steg 4,2)) till skålen, och sedan inkubera under 20 min vid 37 ° C. Ta en bild varje minut under 10 minuter. Upprepa för varje buffert.
- Cytosoliska pH-standardkurvor med användning av den höga K + / nigericin teknik 5, 18, 19.
- Utgör de buffertar som beskrivs i tabell 1, från pH 4,0 till 13,0.
- Följ stegen 4.1-4.7, vilket innebär att endast neutrofiler i förbehandlade brunnar - varje brunn för att innehålla en annan buffert. Lägga sliden till 37 ° C uppvärmd stadium och registrera fluorescens varje minut under 10 min.
- Obs: Det kan ta lite tid för det cytosoliska pH att stabilisera med den yttre lösningen, men efter denna punkt blir S-1 förhållandevärdekonstant. Mäta de extracellulära HKC-S-1 i varje experiment kan tjäna som en kontroll för att kontrollera att eventuella inhibitorer tillsatta inte stör med S-1 emitterad fluorescens eller påverka buffertens pH.
7. Bildanalys
OBS: Här instruktioner för bildanalys (kvantifiering av fluorescens) med fri programvara ImageJ tillhandahålls. Användning av ImageJ rekommenderas.
- Ladda ner och installera ImageJ version> 1.46r enligt utvecklarens instruktioner (https://imagej.nih.gov/ij/). Installera kompletterande kodfil fäst med detta protokoll som heter ”Phagosomal mätning.”
- Öppna bild J och ladda bildfil valts för analys på verktygsfältet. Att kombinera de två kanalerna, använder Image> Färga> Gör Composite.
- Högerklicka för att välja en fil för att lagra resultat.
- Klicka på linjen verktyget på verktygsfältet och dubbelklicka för att öka bredden till & #34; 2 ".
- Rita en linje tvärs över bredden på en fagosomen och högerklicka på "mått pH". Medelintensiteten av de två kanalerna förvärvas, och deras förhållande beräknas automatiskt med koden fil i ImageJ.
- Efter avslutad mätningarna, högerklicka för att välja "spara filen."
- För att mäta fagosomen området använder fjärde ikonen längs verktygsraden för att rita på fri hand runt området. Högerklicka och välj "mått området."
OBS: Resultaten sparas och en loggfil skapas i katalogen väljs. Resultat kan bearbetas med användning av kalkylarket, R, eller en motsvarande programvara. Förhållandet mellan fluorescensförhållande till pH är approximativt sigmoidal, och förhållandevärdena genererade av ImageJ analysen kan omvandlas till pH med användning av en generaliserad logistisk eller sigmoid funktion eller genom linjär eller kubisk spline interpolation. - För att mäta cytoplasma, dra en linje över cytoplasman och högerklicka för att ”mäta pH”.
Representative Results
Figur 1 visar ögonblicksbilder av neutrofiler från olika ursprung för att demonstrera varierande phagosomal miljöer. För att underlätta kvantitativ analys, är det viktigt att ympa brunnarna med ett lämpligt antal celler: alltför många kommer att få cellerna att lager över varandra, vilket gör det svårt att visa bifogade fagosomer noggrant; alltför få kommer naturligtvis ge färre resultat, särskilt som inte varje neutrofila kommer fagocytera. Figur 2 är en bild som är över-mättad; detta kan bedömas genom att dela bilden mellan dess två kanalerna (med hjälp av mikroskop programvara rekommenderas i Materiallista eller motsvarande) - röda prickarna visar där maximal fluorescens har detekterats. Detta kan motverkas genom att minska intensiteten av lasern. Kalibreringskurvor med användning av de olika buffertsystem visas i figur 3, anpassad från Levine et al. 5 </ Sup>. Felstavarna visar att det finns en viss variation i fluorescens mellan mätningarna. Figur 4 ger ett exempel på hur data för phagosomal pH och område skulle kunna presenteras. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för varje enskild mätning som ska visas med en över om boxplot. Däremot kan data även visas i ett histogram stapeldiagram.
Figur 1: Lämpliga ögonblicksbilder av neutrofiler från människor och möss. Längst till höger är en kvalitativ visuell nyckel av den ungefärliga färgen på S-1-färgade fagosomer motsvarar pH-värdet. Den gula färgen indikerar mer syra, medan rött betyder mer alkalinitet. (A) visar Hvcn1 - / - mus benmärgs neutrofiler 20 min efter fagocytos. De fagosomer verkar mycket rött, alkaliska och svullen. Den röda pilen i det nedre högra delen avbildpunkter till en intracellulär Candida, medan pilen i övre vänstra pekar på ett extracellulärt partikel. (B) visar vildtyp mus benmärgs neutrofiler som har intagit Candida; de är mycket mindre alkaliska än Hvcn1 - / - celler. (C) visar humana perifera blodneutrofiler vid samma punkt efter fagocytos. De verkar lite mer basisk än mus vildtyp celler, men fagosomer är fortfarande inte så stor och rött som Hcvn1 - / - celler. (D) visar humana neutrofiler som har fagocyteras Candida i närvaro av 5 | iM difenylen jodonium- (DPI). Alla fagosomer är mycket sur, med ett pH av 6 eller mindre; läkemedlet inhiberar NADPH-oxidas, så det finns ingen kompenserande jon rörelse. Protonerna som frigörs från de sura granulerna som smälter samman till fagosomen orsaka att surt pH 20, och en ökad rekrytering av V-ATPas till the phagosomal membran vid behandling med DPI 9. Cytoplasman tycks också mer basisk än cellerna från de andra villkoren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Over-mättnad av Hvcn1 - / - mus benmärgs neutrofiler. Det är viktigt att utesluta från analysbilder där fluorescensdata är övermättad. Såsom beskrivs i avsnitt 5,3, är den sammansatta bilden delas upp i två bilder (överst till vänster, röd pil) med båda kanalerna som presenteras individuellt. I detta program, är intervall indikator kontrolleras på (längst ned till vänster, röd pil), sedan eventuella pixlar som är övermättad är klarröda. Det är över-mättnads närvarande i båda kanalerna (1 och 2). En magnifblue av vissa celler och extracellulär Candida visas längst ned till höger, med pilar som pekar på drabbade områden. Analysera dessa punkter skulle leda till en falsk ratiometrisk mätning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Standardkalibreringskurvor för omvandling av S-1 fluorescensförhållanden till pH-mätningar. De standardkurvor för Candida ensam i de olika buffertarna (märkta som "Tris"), och när cellerna permeabiliserades med saponin ( "Saponin") är mycket lika, vilket visar att S-en läsning i och utanför cellen (fagosomen och extracellulär medium) är jämförbara. Felgränserna representerar medelvärdet ± SD. S-1-förhållande / pH-kurvan förkortas när den testas in cytoplasman ( "Cytoplasma"), vilket bör beaktas vid bildanalysen. Denna figur har modifierats Levine et al. 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Kvantifiering av phagosomal pH och område. Denna siffra visar ett exempel på presentation av data. Graferna genererades med användning programmeringsprogrammet R. A: visar phagosomal förhållande och motsvarande pH för A (Hvcn1 - / - mus benmärgs neutrofiler), B: vildtyp mus benmärgs neutrofiler, C: humana perifera blodneutrofiler, och D: human neutrofiler med 5 pM DPI n = 3/300. Individuella mätningar visas som små fyrkanter, med en överliggande boxplot med medien och interkvartilt intervall. En röd stapel representerar medelvärdet. Såsom framgår av bilderna i figur 1, Hvcn1 - / - celler har mycket alkaliska fagosomer i jämförelse med vildtyp mus och humana neutrofiler. De har också en större phagosomal område (Figur 4B, n = 3/300). Mänskliga neutrofila fagosomer är något mer basisk och större än vildtyp mus neutrofiler, medan humana neutrofiler inkuberade med DPI har mycket sura och små fagosomer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Balanserad saltlösning (BSS) -buffert | |||
| NaCl | 156 mM | ||
| KCI | 3 mM | ||
| MgSO 4 | 2 mM | ||
| KH 2 PO 4 | 1,25 mM | ||
| CaCl 2 | 2 mM | ||
| Glukos | 10 mM | ||
| hepes | 10 mM | ||
| pH 7,4 med NaOH eller HCl | |||
| YPD-buljong | |||
| YPD-buljong | 50 g | ||
| Destillerat vatten | 1 L | ||
| Autoklav vid 121 ° C under 15 min | |||
| För YPD-agar: före autoklavering till 15 g / L-agar | |||
| 10% Dextran-lösning | |||
| Dextran klinisk klass | 50 g | ||
| NaCl | <td>4,5 g | ||
| Destillerat vatten | 500 ml | ||
| Lägga till glasflaska och autoklavera vid 121 ° C under 15 min | |||
| 2x Saltlösning | |||
| NaCl | 18 g | ||
| Destillerat vatten | 1 L | ||
| Lägga till glasflaska och autoklavera vid 121 ° C under 15 min | |||
| 10% Saponin lager | |||
| BSS-buffert | 50 ml | ||
| saponin | 5 g | ||
| Värme BSS-buffert till 37 ° C, tillsätt saponin och blanda. | |||
| Lägga 0,1% natriumazid som konserveringsmedel, lagra blandningen vid 4 ° C. | </ Tr>|||
| kalibreringsbuffert | |||
| Candida standardkurva | |||
| Först göra upp 0,15 M lager av varje buffert | |||
| Utgör 0,15 M NaCl-lösning | |||
| 15 ml slutlig volym: 5 ml 0,15 M av önskad buffertlösning + 10 ml 0,15 M NaCl-lösning | |||
| pH 3 | 100 mM NaCl | 50 mM glycin | |
| pH 4 | 100 mM NaCl | 50 mM acetat | |
| pH 5 | 100 mM NaCl | 50 mM acetat | |
| pH 6 | 100 mM NaCl | 50 mM acetat | |
| pH 7 | 100 mM NaCl | 50 mM Tris | |
| pH 8 | 100 mM NaCl | 50 mM Tris | |
| pH 9 | 100 mM NaCl | 50 mM Tris | |
| pH 10 | 100 mM NaCl | 50 mM glycin | |
| pH 11 | 100 mM NaCl | 50 mM fosfat | |
| pH 12 | 100 mM NaCl | 50 mM fosfat | |
| pH 13 | 100 mM NaCl | 50 mM fosfat | |
| Cytosoliskt standardkurva | |||
| Använda tidigare gjort 0,15 M stambuffertlösningar | |||
| Utgör 0,15 M KCl-lösning | |||
| 15 ml slutlig volym: 5 ml 0,15 M av önskad buffert + 10 ml 0,15 M KCl-lösning | |||
| 10 mM förråds av nigericin i etanol, tillsätt 15 | il till varje slutlig volym lösning | |||
| pH 3 | 100 mM KCl 50 mM glycin | 10 uM nigericin | |
| pH 4 | 100 mM KCl | 50 mM acetat | 10 uM nigericin |
| pH 5 | 100 mM KCl | 50 mM acetat | 10 uM nigericin |
| pH 6 | 100 mM KCl | 50 mM acetat | 10 uM nigericin |
| pH 7 | 100 mM KCl | 50 mM Tris | 10 uM nigericin |
| pH 8 | 100 mM KCl | 50 mM Tris | 10 uM nigericin |
| pH 9 | 100 mM KCl | 50 mM Tris | 10 uM nigericin |
| pH 10 | 100 mM KCl | 50 mM glycin | 10 uM nigericin |
| pH 11 | 100 mM KCl | 50 mM fosfat | 10 uM nigericin |
| pH 12 100 mM KCl | 50 mM fosfat | 10 uM nigericin | |
| pH 13 | 100 mM KCl | 50 mM fosfat | 10 uM nigericin |
| pH alla kalibreringslösningar med antingen HCl eller NaOH | |||
Tabell 1: Sammansättning av buffertar. Denna tabell beskriver de lämpliga sammansättningarna hos de olika buffertar som används i protokollet.
Kompletterande kodfil. Denna fil innehåller ett antal makron, skriven av AP Levine, som är nödvändiga för bildanalys. Författarna skulle gärna försöka ta itu med frågor som är förknippade med att använda denna kod. Klicka här för att ladda ner filen.
Discussion
När väl de lämpliga reagens, mikroskopinställningar och kalibreringsexperiment sätts upp, är denna metod relativt enkel att utföra. De kritiska stegen inkluderar: märkning av Candida med S-1 för att säkerställa att det inte finns någon överbelastning av färg, kalibrering och analysera bilden.
S-1 är ett reagens lämpat för mera alkaliska pH-miljöer, vilket är särskilt viktigt för neutrofiler 21 men begränsar dess användning i vissa celltyper. För mer sura miljöer, såsom makrofag fagosomer, Snarf-4, eller S-4, är mer lämpliga på grund av dess lägre pKa 22. Dessutom, för mer noggranna cytoplasmatiska avläsningar, är det bättre att använda S-4, som standardkurvan för S-1 visar att fluorescensförhållanden börjar platå under pH 6 (figur 3). Andra färgämnen, såsom 2' , 7'-bis- (2-karboxietyl) -5- (och-6) -karboxifluorescein (BCECF) eller pHrodo Red kan också vara mer lämpliga i en fortsext som förväntas vara surt. Ändå cytoplasman färgningen är fortfarande nödvändigt för korrekt identifiering av fagosomer innehåller Candida.
En viktig egenskap hos en phagosomal pH-indikator är att den inte är irreversibelt förändras av den reaktiva phagosomal miljön. S-1 verkar vara resistenta mot neutrofila miljö. Detta visas av Levine et al. 5 (se Kompletterande Video 4 av referens 5), vilka demonstrerar fagocytos och efterföljande frisättning av en S-1-märkt Candida partikel genom en Hvcn1 - / - neutrofil. När fagocyteras, vänder partikeln från gul / orange till röd (neutralt till alkaliskt pH), men när partikeln frigörs av den neutrofila, återgår den till sin ursprungliga färg.
Det är viktigt att nämna några av de begränsningar som är förknippade med att använda S-1. Det faktum att detta färgämne har två emissionsspektra medger ratiometrisk measurement är en fördel, men det krävs specialutrustning för att förvärva bilder; mikroskop som används för experimenten måste kunna spela in två bilder samtidigt eller med en obetydlig tidsfördröjning. Författarna antar att forskaren försöker detta protokoll har erfarenhet av att använda konfokalmikroskopi, eller har tillgång till en utbildad professionell. Vi kan inte räkna upp alla specifika mikroskop parametrar som de kommer att skilja sig för varje mikroskop och måste optimeras av forskaren. Den acetoximetylester konjugerad till S-1 som medger färgämnet att diffundera in i cellcytoplasman bryts ned av icke-specifika esteraser i cellcytoplasman att bilda den fluorescerande molekylen. Esteraser, såsom alkaliskt fosfatas, är närvarande i humant serum och fetalt bovint serum, vilka används för att komplettera cellkulturmedia. Följaktligen måste det medium i vilket cellerna är laddade med S-1-AM (avsnitt 4,5) inte innehålla serum. Detta kan vara svårt om användning av celler som kräver en mer närings Rich-medium för att upprätthålla dem än den balanserade saltlösningen används i hela detta protokoll. På liknande sätt, andra fluorescerande mediumkomponenter, såsom fenolrött, kan störa S-1-mätningar.
De felstaplar i figur 3 indikerar att det finns viss variation i förhållandemätningar vid varje pH. Ett lämpligt antal upprepningar av varje experiment (minst n = 3) och så många enskilda mätningarna i varje enda experiment behövs för att övervinna den inter-vakuolär variation. Det är därför tillrådligt att mäta pH av minst 100 fagosomer för varje tillstånd och lika många phagosomal områden som ser ut att innehålla endast en Candida. De fagosomer skall mätas för kvantifiering bör vara de som helt har engulfed en Candida partikel (dvs de helt omgiven av cytoplasman). För att mildra effekterna av oavsiktliga fördomar i valet av celler / fagosomer för kvantifiering bör alla analyser utföras medanblind för försöksbetingelserna.
Här beskriver vi isoleringen av neutrofiler genom dextransedimentering av helblod följt av centrifugering av plasmaskiktet genom en densitetsgradient. Vi använder denna teknik, eftersom det snabbt och effektivt producerar en ren (> 95%) population av neutrofiler, även om det finns andra metoder tillgängliga, såsom helblod centrifugering genom andra densitetsgradient formler eller negativ selektion av neutrofiler med användning av specialiserade kit med antikroppar eller magnetisk pärlor. Däremot kan den senare vara oöverkomligt dyra för de flesta grupper som isolerar neutrofiler rutinmässigt. Dessutom använder vi antikoaguleringsmedlet heparin i bloduppsamlingsröret, medan andra forskare kan vara mer vana vid att använda etylendiamintetraättiksyra (EDTA) eller syracitrat natrium (ACD). Eftersom det finns många olika metoder att välja mellan, är det upp till den personliga preferenser forskaren.
Dessutom,när isolera och manipulera neutrofiler de bör hanteras med viss försiktighet för att undvika överdriven aktivering. Förebyggande åtgärder är: bara använder plastartiklar, inga glas; filtrera-sterilisera alla buffertar för att avlägsna eventuellt kontaminerande endotoxin; när snurra neutrofiler se till att centrifugen är väl balanserad för att undvika alltför stora vibrationer; begränsa så mycket som möjligt den tid neutrofiler kvar i en pellet efter centrifugering; upprätthåller inte neutrofiler i lösning av mer än 5 x 10 6 / ml; och utför experimentet så snart som möjligt efter isolering.
Denna metod kan anpassas för att mäta ändringar i pH och phagosomal område över tiden genom att använda en uppvärmd skede uppsättning till 37 ° C på mikroskop och ta ögonblicksbilder gång varje 30-60 s från samma position, såsom beskrivits för kalibreringsstegen. Det kan också teoretiskt kunna anpassas för högre genomströmning experiment, såsom vid 96-brunnsplattor, och för flödescytometri experiment, där S-1 kananvändas som en pH-indikator 23. Men i dessa inställningar är betoningen på individuell cellsaktivitet ersätts av en mer global effekt på cellpopulationen.
Denna metod syftar till att ge en relativt enkel experimentuppställning på vilken enskilda forskare kan anpassa för att passa deras intresseområde. Forskare kan vill utforska neutrofil phagosomal pH och område och samtidigt även mäta förflyttning av andra joner, till exempel, intracellulär kalciumkoncentration. Det finns flera fluorescerande Ca2 + indikatorer lätt tillgängliga för konfokal mikroskopi, såsom Indo-1, som också har dubbla emissionsspektra vid 400 och 475 nm 24. Dessa emissionsvåglängder inte överlappar med S-1 emissionsspektra, men excitationsvåglängden är i ultraviolett (UV) änden av spektrumet, som kan skada till celler, och en UV-laser är inte vanligt på alla mikroskop. En omfattande genomgång av de olika indikatorer för attmäta intracellulärt kalciumflöde är täckt av Takahashi et al. 25 och Hillson et al. 26.
Sammanfattningsvis finns det andra metoder som finns tillgängliga för att mäta phagosomal pH med användning av olika fluorescerande färgämnen som Nunes et al. har visat 13 liksom andra grupper 27, 28. Andra forskare har också använt S-1 för att mäta cytosoliska pH 29 eller phagosomal pH 14. Emellertid är detta protokoll unik i att mäta samtidigt pH i både cytosol och fagosomen, vilket ger möjlighet att observera förändringar i phagosomal tvärsnittsarea och för att skilja mellan vildtyp och Hvcn1 - / - mus neutrofiler och humana neutrofiler med och utan en arbets NADPH-oxidas.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete har vänligt finansieras av Wellcome Trust, bioteknik och Biological Sciences Research Council, och Irwin Joffe Memorial Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Candida albicans ATCC 10231 Vitroids 80 CFU | Sigma-Aldrich | RQC14003-10EA | Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions |
| YPD broth | Sigma-Aldrich | Y1375 | Follow manufacturer's instructions, various providers exist |
| Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000 | MP Biomedicals | 2101514 | Use gloves |
| Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000 IU/mL | Fannin, Wockhardt UK Ltd | FP1077 | We purchased from UCH inpatient pharmacy |
| SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester - Special Packaging | Thermo Scientific/Invitrogen | SS22801 | Use gloves |
| 5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | Thermo Scientific/Invitrogen | C1272 | Use gloves |
| Vivaglobin human IgG 160 mg/mL solution | CSL Behring | received as a gift | Various providers exist |
| Normal mouse serum | Abcam | ab7486 | Various providers exist |
| Lymphoprep (density gradient medium) | Alere Ltd | 1114547 | Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | Various providers exist |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Various providers exist |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Various providers exist |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | Various providers exist |
| Absolute Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
| Diphenylene iodonium (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Various providers exist |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 | Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate |
| Poly L lysine | Sigma | P4707 | Various providers exist |
| Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700) | Carl Zeiss | The microscope must be able to excite at 555 nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600 nm, >610 nm) | |
| Ibidi µ slide 8 well ibiTreat | Thistle Scientific | IB-80826 | Other appropriate imaging dishes can be substituted |
| Soniprep 150 | MSE | Any appropriate sonicator will suffice | |
| TC20 Automated Cell Counter | BioRad | Various providers exist | |
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs |
References
- Segal, A. W. NADPH oxidases as electrochemical generators to produce ion fluxes and turgor in fungi, plants and humans. Open Biol. 6 (5), 515-517 (2016).
- Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annu Rev Immunol. 23, 197-223 (2005).
- Cross, A. R., Segal, A. W. The NADPH oxidase of professional phagocytes - Prototype of the NOX electron transport chain systems. BBA Bioenergetics. 1657 (1), 1-22 (2004).
- Demaurex, N., El Chemaly, A. Physiological roles of voltage-gated proton channels in leukocytes. J Physiol. 588 (23), 4659-4665 (2010).
- Levine, A. P., Duchen, M. R., de Villiers, S., Rich, P. R., Segal, A. W. Alkalinity of neutrophil phagocytic vacuoles is modulated by HVCN1 and has consequences for myeloperoxidase activity. PLoS One. 10 (4), 0125906 (2015).
- Reeves, E. P., Lu, H., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416 (6878), 291-297 (2002).
- Menegazzi, R., Busetto, S., Dri, P., Cramer, R., Patriarca, P. Chloride ion efflux regulates adherence, spreading, and respiratory burst of neutrophils stimulated by tumor necrosis factor-alpha (TNF) on biologic surfaces. J Cell Biol. 135 (2), 511-522 (1996).
- Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Cell Biol. 75 (7), 3327-3331 (1978).
- Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in neutrophils. J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).
- Tsien, R. Y. Fluorescent Indicators of Ion Concentrations. Methods in Cell Biol. 30, 127-156 (1989).
- Lavis, L. D., Rutkoski, T. J., Raines, R. T. Tuning the pK a of Fluorescein to Optimize Binding Assays. Anal Chem. 79 (17), 6775-6782 (2007).
- Hurst, J. K., Albrich, J. M., Green, T. R., Rosen, H., Klebanoff, S. Myeloperoxidase-dependent fluorescein chlorination by stimulated neutrophils. J Biol Chem. 259 (8), 4812-4821 (1984).
- Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy. J Vis Exp. (106), e53402 (2015).
- Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Mol Biol Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).
- Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. (109), e53622 (2016).
- Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D. Application of a new pH-sensitive fluoroprobe (carboxy-SNARF-1) for intracellular pH measurement in small, isolated cells. Pfl ügers Archiv EJP. 417 (2), 234-239 (1990).
- El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leuko Biol. 95 (5), 827-839 (2014).
- Morgan, D., Capasso, M., et al. Voltage-gated proton channels maintain pH in human neutrophils during phagocytosis. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 18022-18027 (2009).
- Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18 (11), 2210-2218 (1979).
- Levine, A. P., Segal, A. W. The NADPH Oxidase and Microbial Killing by Neutrophils, With a Particular Emphasis on the Proposed Antimicrobial Role of Myeloperoxidase within the Phagocytic Vacuole. Microbiol Spectr. 4 (4), (2016).
- Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Van Erp, P. E. J., Jansen, M. J. J. M., De Jongh, G. J., Boezeman, J. B. M., Schalkwijk, J. Ratiometric measurement of intracellular pH in cultured human keratinocytes using carboxy-SNARF-1 and flow cytometry. Cytometry. 12 (2), 127-132 (1991).
- Minamikawa, T., Takamatsu, T., Kashima, S., Fushiki, S., Fujita, S. Confocal calcium imaging with ultraviolet laser- scanning microscopy and indo-1. Micron. 24 (6), 551-556 (1993).
- Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of Intracellular Calcium. Physiol Rev. 79 (4), (1999).
- Hillson, E. J., Dewitt, S., Hallett, M. B. Optical methods for the measurement and manipulation of cytosolic free calcium in neutrophils. Methods Mol Biol. 412, Clifton, N.J. 125-137 (2007).
- Bernardo, J., Long, H. J., Simons, E. R. Initial cytoplasmic and phagosomal consequences of human neutrophil exposure to Staphylococcus epidermidis. Cytometry Part A. 77 (3), 243-252 (2010).
- Riazanski, V., Gabdoulkhakova, A. G., et al. TRPC6 channel translocation into phagosomal membrane augments phagosomal function. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (47), 6486-6495 (2015).
- Martínez-Zaguilán, R., Martínez, G. M., Lattanzio, F., Gillies, R. J. Simultaneous measurement of intracellular pH and Ca2+ using the fluorescence of SNARF-1 and fura-2. Am J Physiol Cell Physiol. 260 (2), (1991).
