Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Imaging den Neutrofil fagosomet og Cytoplasma Ved hjælp af en Ratiometrisk pH-indikator

doi: 10.3791/55107 Published: April 5, 2017

Summary

Dette manuskript beskriver en enkel metode til at måle fagosomale pH og område samt den cytoplasmatiske pH af humane og muse neutrofiler ved hjælp af den ratiometriske indikator seminaphthorhodafluor (snarf) -1, eller S-1. Dette opnås ved hjælp af live-cell konfokal fluorescens mikroskopi og billedanalyse.

Abstract

Neutrofile er afgørende at være vært medfødte forsvar og dermed udgøre et vigtigt område for medicinsk forskning. Fagosomet, det intracellulære rum, hvor drabet og fordøjelse af opslugt partikler finder sted, er den vigtigste arena for neutrofil patogen drab, der kræver tæt regulering. Fagosomale pH er et aspekt, der styres omhyggeligt til gengæld regulering antimikrobiel proteaseaktivitet. Mange fluorescerende pH-følsomme farvestoffer er blevet brugt til at visualisere fagosomale miljø. S-1 har flere fordele frem for andre pH-følsomme farvestoffer, herunder dets dobbelte emissionsspektre, dens modstand til foto-blegning, og dets høje pKa. Anvendelse af denne fremgangsmåde, har vi vist, at neutrofil fagosom er usædvanlig basisk i forhold til andre fagocytter. Ved anvendelse af forskellige biokemiske bøjninger af farvestoffet, kan fagosomet afgrænses fra cytoplasmaet, så kan vurderes ændringer i størrelse og form af fagosomet. Dette giver mulighed feller yderligere overvågning af ionisk bevægelse.

Introduction

Neutrofilen er den mest rigelige medfødte immunsystem celle i kroppen. Dets vigtigste funktion består i patruljering blodbanen og oversvømmer og fordøje de fremmede partikler, at den kan støde på i en proces kendt som fagocytose 1, 2. Partiklerne nedbrydes i et intracellulært rum kaldet fagosomet. Aktiveringen af ​​neutrofil NADPH-oxidase, isoformen NOX2, initierer en kaskade af biokemiske reaktioner der kulminerer i død af patogenet. NOX2 proteinunderenheder videre til dannelse af en elektron transportkæden kompleks i fagosomale membran 3. Når den er aktiveret, det transporterer elektroner fra NADPH over membranen til molekylært oxygen inde fagosomet, der producerer superoxidanioner og yderligere reaktive oxygenarter. Dette er kendt som det respiratoriske burst, og det menes at være essentiel for effektiv mikrobiel drab og fordøjelse 2 4, 5. Denne kanal muliggør den passive bevægelse af protoner ned deres elektrokemiske gradient fra cytosolen ind fagosomet. Protonkoncentration reflekteres af pH, så for et givet niveau af oxidaseaktivitet, kan måling af pH i fagosomet give oplysninger om den relative deltagelse af protoniske og ikke-protoniske veje i ladning kompensation.

Den human neutrofil fagosom har en alkalisk pH-værdi på ca. 8,5 i 20-30 minutter efter fagocytose 5. Dette indebærer, at der findes yderligere ikke-proton ionkanaler i NOX2-induceret ladning kompensation, som fusionen og frigivelse af indholdet af de sure granuler og tunge erstatning af HVCN1 ville opretholde et surt miljø, i modsætning til den observeret. Bevægelsen af ​​ioner at kompensere for denne negative ladning kan også udøve ændringer i fagosom størrelse via osmose. Disse kan være ioner til stede i neutrofil ved høje fysiologiske koncentrationer: kaliumioner har vist sig at bevæge sig ind i fagosomet 6 og chlorid ionisk bevægelse er en anden kandidat vigtig for neutrofilfunktion 7.

Regulering af pH i fagosomet er afgørende for antimikrobiel proteaseaktivitet 5. Myeloperoxidase (MPO) synes at have optimal aktivitet ved pH 6, mens det for cathepsin G og elastase, de optimale niveauer er pH 7-9 og pH 8-10, henholdsvis 5. Derfor kan forbigående ændring i fagosomale pH giver aktivitet nicher for forskellige enzymer til sjovIndsatsen. Forstå, hvordan pH er involveret i neutrofil mikrobiel drab kan tilvejebringe nyttig information til konstruktion af hidtil ukendte neutrofil-forstærke mikrobielle midler.

Den neutrofile fagosom er en meget reaktiv miljø. Det gør det vanskeligt præcist at vurdere pH, fordi farvestoffer kan let oxideret, hvilket fører til tekniske artefakter. Historisk har fluoresceinisothiocyanat (FITC) været farvestoffet med valg at måle intracellulær pH 8, 9. Der er dog nogle ulemper for dens anvendelse ved måling neutrofil fagosomale pH. Det har en pKa på 6,4 10, hvilket betyder, at den kun nøjagtigt kan anvendes til at vurdere pH-niveauer på fra 5 til 7,5 8, da det mætter ved pH <8 11. Som den neutrofile fagosomale pH kan blive meget mere basisk 5, kan FITC ikke indfange hele spektret af potentielle pH-ændringer. En yderligere signifioverhøjde problem med FITC i forbindelse med neutrofiler er, at det menes at fotobleges af MPO 12. MPO-inhibitor, natriumazid, kan anvendes til at begrænse fotoblegning 13, men det har vist sig, at natriumazid direkte sænker fagosomale pH i en MPO-uafhængig måde og er derfor uhensigtsmæssig til anvendelse i sådanne assays 5.

Sammenlignet med andre intracellulære farvestoffer, S-1 har en relativ høj pKa på 7,5 10. Under sure betingelser, er molekylet protonerede og frembringer en emission signal mellem 560 og 600 nm ved excitation ved 488 nm eller derover. Når molekylet deprotoneret i mere alkaliske betingelser, emissionsbølgelængden er over 600 nm. Et forhold mellem fluorescensintensiteterne ved disse to bølgelængder indikerer emission skift, som er mere er pålidelig end enkelt fluorescensmålinger, som det er upåvirket af fluorofor koncentration og cellestruktur. S-1 kan konjugeres til antigent materiale, såsom zymosan 14, selvom varmedræbte (HK) Candida albicans foretrækkes, da den større overfladeareal giver en mere ensartet fluorescens læsning.

Vi har også brugt en modifikation af denne metode til at studere tidsmæssige ændringer i pH (figur 3) 5. Denne metode til måling af cytosolisk pH kan let anvendes til andre celletyper, som beskrevet andetsteds 15, 16, og celler med mere alkaliske fagosomer 14.

Protocol

Etik erklæring: Alle dyr arbejde blev udført med licens og godkendelse af Det Forenede Kongeriges indenrigsministerium. Menneskelig deltagelse i denne forskning blev godkendt af de fælles UCL / UCLH udvalg om den etiske for Human Research. Alle deltagere forudsat informeret samtykke.

1. Fremstilling af C. albicans

  1. Dyrk en Candida-disk (se Materialer List) på en YPD agarplade i henhold til fabrikantens anvisninger. Vælge en koloni og føje den til 15 ml YPD-medium. Inkubere det i en rysteinkubator ved 30 ° C og 200 rpm, indtil væsken er uklar (sædvanligvis ca. 2 dage, eller til en koncentration på omtrent over 1 x 10 9 / ml).
  2. Spin ned Candida-medium og resuspender i 50 ml phosphatpufret saltvand (PBS). Centrifugere ved 3000 xg i 10 min. Gentag dette trin to gange.
  3. Placer røret indeholdende 50 ml PBS / Candida medium i et vandbad forvarmet til 60 ° C, således at hele røret er submerged i 1 time.
    1. At bekræfte, at Candida er varmedræbte, streak en prøve på en YPD-agarplade og inkuber natten over ved 30 ° C. Juster varmedræbte (HK) Candida fusions 5-9 x 10 8 / ml, afhængigt af Candida vækst, og gemme det i 1 ml prøver i en -20 ° C fryser.
      BEMÆRK: Alle celletællinger i denne protokol blev udført ved anvendelse af en automatiseret celletæller.

2. S-1 Kobling til varmedræbte (HK) Candida

  1. Forberede en alikvot af carboxygrupperne-S-1 succinimidyl ester (50 ug) ved at fortynde det i 100 pi high-grade dimethylsulfoxid (DMSO). Vortex godt at blande.
  2. Forbered 1 ml 1 x 10 8 HK Candida i 0,1 M natriumbicarbonat (pH 8,3) i et 15 ml rør.
  3. Tilsæt 100 pi af carboxygrupperne-S-1 en dråbe ad gangen til HK Candida under blanding på en vortex på nogenlunde 2.000 rpm (medium til høj hastighed). Wrap aluminium foil omkring røret og placere den på en rulle ved stuetemperatur i 1 time.
  4. Vaske HK Candida- S-1 (HKC-S-1) tre gange ved centrifugering ved 2,250 x g i 10 minutter hver. For de første to vaske, pellet resuspenderes i 15 ml 0,1 M natriumbicarbonat (pH 8,3). Efter den tredje vask, resuspender i 1 ml balanceret saltopløsning (BSS) puffer (se tabel 1).
  5. Overfør HKC-S-1 suspension i rør i 100 pi alikvoter og opbevares ved -20 ° C.
    BEMÆRK: Brug rør med lavt overfladeareal bindemateriale om muligt som HKC-S-1-partikler kan klæbe til væggen af ​​normale centrifugerør.
  6. Opsonisere HKC-S-1
    1. For humane neutrofiler, tilsættes 100 pi humant IgG serum til 100 pi optøede HKC-S-1.
    2. For muse neutrofiler, tilsættes 50 pi normalt museserum og 50 pi muse Candida immunserum (genereret fra C57B6 mus injiceret med HK Candida) 5 til 100 piaf HKC-S-1.
    3. Bland det på en varme-ryster ved 37 ° C og 1.100 rpm i 60-90 minutter og derefter på en 4 ° C valse i 2 timer.
    4. Vask tre gange i BSS-buffer ved centrifugering ved 17.200 xg i 1 minut hver. Resuspender i 100 pi af BSS-buffer.

3. Isolering af neutrofiler

  1. For humane blodneutrofiler perifere, tage 15 ml blod ved venepunktur fra en rask donor og placere den i en 20 ml sprøjte indeholdende 90 pi 1.000 IE / ml heparin-natrium-opløsning (60 pi heparin / 10 ml blod).
  2. Under anvendelse af en pipettespids, injicere 1,5 ml af 10% dextranopløsning i sprøjten. Vend det forsigtigt 3 gange og lad det stå oprejst på bænken.
  3. Vente 30-60 min, indtil blodet er delt omtrent på midten, med en top buffy coat lag, som er strågul og et nedre lag, der indeholder erythrocytter.
  4. Skub forsigtigt ud toplaget gennem en nål eller fjerne det med en pipettespids. Put det ina 15 ml rør. Undgå at tage den røde lag. Anvendelse af en 5 ml pipette, tilsæt 3-4 ml massefyldegradientmedium (se Materialer List) til bunden af ​​røret under buffy coat lag til opnåelse af to adskilte lag. Der centrifugeres ved 913 xg i 10 min.
    BEMÆRK: Hvis der anvender mus neutrofiler (se henvisning 17 for muse neutrofil isolation), anvender cell suspension, der er skyllet fra knoglemarven i stedet.
  5. Hæld supernatanten, efterlod en rød pellet. Forsigtigt vortex at forstyrre bundfaldet. Tilsættes 7 ml destilleret, autoklaveret H2O til pelleten og vendes i 20 s for at resuspendere pelleten. Tilsættes 7 ml 2x saltvand og bland for at blande, lysere de tilbageværende røde blodlegemer.
  6. Centrifugere ved 300 xg i 5 min. Hæld supernatanten og resuspender pellet i BSS-buffer til ca. 4 x 10 6 / ml.
    BEMÆRK: For optimal mikroskopi af cellerne, holde koncentrationen cellesuspensionen mellem 1,5-6 x 10 6

4. Fremstilling af Slides

  1. Præ-behandling af en 8-brønds mikroskopi plade (se Materialer List) med 200 pi af poly-L-lysin (0,01% opløsning) i hver brønd i 40-60 minutter ved stuetemperatur.
  2. Fjerne poly-L-lysin (kan genbruges) og vaskes brøndene to gange med 200 pi destilleret H2O
  3. Tilsæt 200 pi cellesuspension fremstillet i trin 3.6 til hver brønd. Inkubere ved stuetemperatur i 30-60 min.
  4. Forberede en alikvot af 5- (og-6) -carboxy S-1 acetoxymethyl (S-1-AM) ester (50 ug) ved tilsætning af 100 pi af high-grade DMSO til ét rør. Vortex at blande. Når den ikke anvendes, opbevares ved -20 ° C.
  5. I et lille rør, tilsæt 1,7 ml BSS-puffer og 20 pi S-1-AM. Vortex at blande.
  6. Brøndene vaskes to gange med 200 pi BSS-buffer, og derefter erstatte bufferen med S-1-AM-opløsningen. Vær omhyggelig med at ikke forstyrre monolag af celler knyttet til bunden af ​​brønden ved forsigtigt pipetteringned brøndenes vægge. Inkubere ved stuetemperatur i mindst 25 min.
  7. Brøndene vaskes to gange med 200 pi af BSS-buffer. For at teste en inhibitor, udgør en "master mix" af den passende lægemiddel i BSS-buffer. Brøndene vaskes to gange i inhibitoropløsningen.
    BEMÆRK: Sørg for at bruge den samme mængde medikament køretøj (for eksempel DMSO eller ethanol) i kontrolgruppen såvel som blev anvendt til inhibitoren. Hvis teste virkningen af zinkchlorid, bruge BSS-buffer mangler KH 2 PO4 (HEPES kan buffer alene opløsningen), som zink udfælder med phosphat.
  8. Sonikeres opsoniseret HKC-S-1 (afsnit 6.2) i ca. 3 sekunder ved 5 amplitude um. Tilsæt 10 uL til hver brønd. Inkubér pladen ved 37 ° C i 15-20 minutter for at tillade fagocytose, hvilket gør cellerne klar til at blive afbildet for snapshots af fagocytose.

5. Konfokal mikroskopi

  1. Ved anvendelse af et konfokalt mikroskop, justere laserbølgelængden så thpå cellerne exciteres ved 555 nm og emissionen detekteres af to kanaler, eller detektorer: 560-600 nm og over 600 nm.
    BEMÆRK: Specifikke mikroskop parametre vil variere fra mikroskop og skal optimeres af forskeren.
  2. Se cellerne ved hjælp af en 63X objektiv med olie. Brug en flise-scanning billede på kontinuerlig indstilling for at se centret flise. Brug af fluorescensintensiteten og forstærkning af detektorkanaler, justere fokus og intensiteten af ​​laseren og forstærkningen af ​​de to kanaler for at optimere billedet.
  3. Split billedet ved hjælp af indstillingerne for at se begge kanaler; kontrollere, at der ikke er nogen mætning af fluorescensintensitet i cytoplasmaet eller vakuoler. Mætning vises som røde prikker. Reducer laser intensitet, så der er et minimalt antal røde prikker, men cellerne og fagosomer er lyse nok til at se klart.
  4. Når du er tilfreds, skal du klikke på "Start eksperiment." En scanning billede 9-flise er genereret. Gem billedet som en kompleks fil anbefales afden software, der indeholder et sammensat billede af de to kanaler (ikke jpeg eller tiff).

6. kalibreringsforsøg

  1. Konstruere pH standardkurven med Candida alene.
    1. Forbered buffere fra pH 3,0 til 13,0, som pr tabel 1.
    2. Udtages en alikvot (100 pi) af HKC-S-1. Spinde det ned i 1 min ved 17.200 x g. Resuspender i 500 pi af den tildelte puffer.
    3. Begyndende fra den laveste pH-område, tilføje suspensionen til en forbehandlet godt (fra trin 4.2). Placer glider på det konfokale mikroskop på en opvarmet scenen sat til 37 ° C.
    4. Optag fluorescens hver min i 10 minutter. Gentag for hver puffer.
  2. Saponin standardkurve.
    1. Isoler 1 x 10 7 humane neutrofiler 5 og resuspender dem i 1 ml den laveste pH-buffer.
    2. Følge den metode der er beskrevet i afsnit 4 til måling af phagosomal pH i neutrofiler.
    3. Efter inkubation med Candida suspensionen i 20 minutter, tilsæt 0,3% saponin (15 pi 10% lager til en præ-behandlet godt (fra trin 4.2)) til skålen, og derefter inkuberes i 20 minutter ved 37 ° C. Tag et billede hvert minut i 10 minutter. Gentag for hver puffer.
  3. Cytosoliske pH standardkurver under anvendelse af høj K + / nigericin teknik 5, 18, 19.
    1. Udgør pufferne i tabel 1 beskrevne, fra pH 4,0 til 13,0.
    2. Følg trin 4.1-4.7, så kun neutrofiler i de forbehandlede brønde - hver brønd for at indeholde en anden puffer. Tilføje objektglasset til 37 ° C opvarmet stadium og registrere fluorescens hver min i 10 min.
    3. Bemærk: Det kan tage lidt tid for cytosolisk pH at stabilisere med den eksterne løsning, men efter dette tidspunkt, bliver S-1 forhold værdikonstant. Måling de ekstracellulære HKC-S-1 i hvert eksperiment kan tjene som en kontrol til at kontrollere, at eventuelle tilsatte inhibitorer ikke interfererer med S-1 udsendte fluorescens eller påvirke bufferens pH.

7. Billedanalyse

BEMÆRK: Her er instruktioner til billedanalyse (kvantificering af fluorescens) ved hjælp af den gratis software ImageJ forudsat. Anvendelse af ImageJ anbefales.

  1. Hent og installer ImageJ version> 1.46r som pr bygherrens anvisninger (https://imagej.nih.gov/ij/). Installer den supplerende kode fil vedhæftet med denne protokol kaldet ”fagosomale måling.”
  2. Åbn billede J og indlæse billedfilen valgt til analyse på værktøjslinjen. For at kombinere de to kanaler, bruge Image> Farve> Make Composite.
  3. Højreklik for at vælge en fil til at gemme resultater.
  4. Klik på linjen værktøj på værktøjslinjen og dobbeltklik for at øge bredden til & #34; 2 ".
  5. Tegn en linje på tværs af bredden af ​​en fagosomet, og højreklik derefter på "foranstaltning pH". Den gennemsnitlige intensitet af de to kanaler er erhvervet, og deres forhold beregnes automatisk ved koden filen i ImageJ.
  6. Efter at have afsluttet målingerne, højreklikke for at vælge "gem fil".
  7. For at måle fagosomet område, skal du bruge det fjerde ikon langs værktøjslinjen for at tegne i fri hånd rundt i området. Højreklik for at vælge "foranstaltning område."
    BEMÆRK: Resultaterne gemmes og en log fil er genereret i den valgte mappe. Resultaterne kan behandles ved hjælp af regneark, R, eller en tilsvarende software. Forholdet mellem fluorescensforhold til pH er omtrent S-formet, og forholdsværdierne genereret af ImageJ analyse kan omdannes til pH ved anvendelse af en generaliseret logistisk eller sigmoid funktion eller ved lineær eller kubisk spline interpolation.
  8. For at måle cytoplasma, tegne en linje på tværs cytoplasmaet og højreklik for at ”måle pH”.

Representative Results

Figur 1 viser snapshots af neutrofiler fra forskellige oprindelser at demonstrere varierende fagosomale miljøer. For at lette kvantitativ analyse, er det vigtigt at pode brøndene med et passende antal celler: for mange vil bevirke, at cellerne til lag over hinanden, hvilket gør det vanskeligt at se vedlagte fagosomer nøjagtigt; for få vil naturligvis, giver færre resultater, især da ikke alle neutrofile vil fagocytere. Figur 2 er et billede, der er over-mættet; dette kan vurderes ved at opdele billedet mellem sine to kanaler (ved hjælp af mikroskop software anbefalet i Materialer liste eller et tilsvarende) - røde prikker viser, hvor der er konstateret maksimal fluorescens. Dette kan modvirkes ved at reducere intensiteten af ​​laseren. Kalibreringskurver under anvendelse af de forskellige buffersystemer er vist i figur 3, tilpasset fra Levine et al. 5 </ Sup>. Fejlsøjlerne viser, at der er nogen variation i fluorescens mellem aflæsninger. Figur 4 giver et eksempel på, hvordan dataene for fagosomale pH og område kunne præsenteres. Denne fremgangsmåde tillader hver enkelt måling, der skal vises med en over-æglæggende boxplot. Imidlertid kunne de data, også vises i et histogram søjlediagram.

figur 1
Figur 1: Passende øjebliksbilleder på neutrofiler fra mennesker og mus. Til højre er en kvalitativ visuel nøgle af den omtrentlige farve af S-1-farvede fagosomer svarer til pH-værdien. Den gule farve indikerer mere syreindhold, mens rød indikerer mere alkalinitet. (A) viser Hvcn1 - / - museknoglemarvsceller neutrofiler 20 min efter fagocytose. De fagosomer synes meget rød, alkalisk, og hævede. Den røde pil i nederste højre del afbilledpunkter til et intracellulært Candida, mens pilen i øverste venstre peger på en ekstracellulær partikel. (B) viser vildtype museknoglemarvsceller neutrofiler, der har indtaget Candida; de er langt mindre basisk end Hvcn1 - / - celler. (C) viser humane perifere blodneutrofiler på samme punkt efter fagocytose. De vises lidt mere basisk end de mus vildtype celler, men de fagosomer er stadig ikke så stor og rød som den Hcvn1 - / - celler. (D) viser humane neutrofiler som har fagocyteret Candida i nærvær af 5 pM diphenylen iodonium (DPI). Alle fagosomer er meget sure, med en pH på 6 eller derunder; lægemidlet hæmmer NADPH-oxidase, så der er ingen kompenserende ion bevægelse. Protonerne frigives fra de sure granula, som fusionerer til fagosomet forårsage sur pH 20, og øget rekruttering af V-ATPase til the fagosomale membranen ved behandling med DPI 9. Cytoplasmaet synes også mere basisk end cellerne fra de øvrige betingelser. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 2
Figur 2: Over-mætning af Hvcn1 - / - mus knoglemarv neutrofiler. Det er vigtigt at udelukke fra analysen billeder, hvor fluorescensdata er overmættet. Som beskrevet i afsnit 5.3, er det sammensatte billede opdeles i to billeder (øverst til venstre, rød pil) med begge kanaler præsenteres individuelt. I denne software, er indstillingsområdet kontrolleres på (nederst til venstre, rød pil), så eventuelle pixels, som er over-mættede er lyse rødt. Der er overmætning stede i begge kanaler (1 og 2). En magnifgement af nogle celler og ekstracellulære Candida er vist nederst til højre, med pile, der peger til de ramte områder. Analyse disse punkter ville føre til en falsk radiometrisk måling. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 3
Figur 3: Standard kalibreringskurver til omdannelse af S-1 fluorescens-forhold for at pH-målinger. Standardkurverne for Candida alene i de forskellige buffere (mærket som "Tris"), og når cellerne permeabiliseret med saponin ( "Saponin") er meget ens, hvilket viser, at S-1 læsning i og uden for cellen (fagosom og ekstracellulære medium), er sammenlignelige. Fejlsøjlerne repræsenterer middelværdien ± SD. S-1-forhold / pH-kurven forkortes, når det afprøves in cytoplasmaet ( "Cytoplasma"), som bør tages i betragtning ved billedanalyse. Dette tal er blevet modificeret fra Levine et al. 5. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 4
Figur 4: Kvantificering af fagosomale pH og område. Dette tal giver et eksempel på præsentation af data. Graferne blev dannet ved anvendelse programmeringssoftwaren R. A: viser fagosomale forhold og tilsvarende pH for A (Hvcn1 - / - mus knoglemarv neutrofiler), B: vildtype museknoglemarvsceller neutrofiler, C: humane blodneutrofiler perifere, og D: human neutrofiler med 5 uM DPI n = 3/300. Individuelle målinger er vist som små firkanter, med en overlejring kasseafbildning med medien og interkvartile område. En rød søjle repræsenterer middelværdien. Som det ses i billederne i figur 1, Hvcn1 - / - celler har meget alkaliske fagosomer i sammenligning med vildtype-mus og humane neutrofiler. De har også en større fagosomale område (figur 4B, n = 3/300). Humane neutrofile fagosomer er lidt mere basisk og større end vildtype mus neutrofiler, mens humane neutrofiler inkuberet med DPI har meget sure og små fagosomer. Klik her for at se en større version af dette tal.

<td> </ Tr>
Balancerede saltopløsning (BSS) puffer
NaCl 156 mM
KCI 3 mM
MgSO4 2 mM
KH 2 PO4 1,25 mM
CaCl2 2 mM
Glukose 10 mM
Hepes 10 mM
pH 7,4 med NaOH eller HCI
YPD-medium
YPD-medium 50 g
Destilleret vand 1 L
Autoklav ved 121 ° C i 15 minutter
For YPD agar: før autoklavering tilsættes 15 g / l agar
10% Dextran opløsning
Dextran klinisk kvalitet 50 g
NaCl 4,5 g
Destilleret vand 500 ml
Tilføj til glasflaske og autoklav ved 121 ° C i 15 minutter
2x Saltvandsopløsning
NaCl 18 g
Destilleret vand 1 L
Tilføj til glasflaske og autoklav ved 121 ° C i 15 minutter
10% Saponin lager
BSS-buffer 50 ml
saponin 5 g
Varme BSS-buffer til 37 ° C, tilsæt saponin og blandes.
Tilføje 0,1% natriumazid som konserveringsmiddel, lagre blandingen ved 4 ° C.
kalibrering buffere
Candida standardkurve
Først fyldes op 0,15 M stamopløsning af hver puffer
Udgør 0,15 M NaCl-opløsning
15 ml slutvolumen: 5 ml 0,15 M af ønsket pufferopløsning + 10 ml 0,15 M NaCl-opløsning
pH 3 100 mM NaCl 50 mM glycin
pH 4 100 mM NaCl 50 mM acetat
pH 5 100 mM NaCl 50 mM acetat
pH 6 100 mM NaCl 50 mM acetat
pH 7 100 mM NaCl 50 mM Tris
pH 8 100 mM NaCl 50 mM Tris
pH 9 100 mM NaCl 50 mM Tris
pH 10 100 mM NaCl 50 mM glycin
pH 11 100 mM NaCl 50 mM phosphat
pH 12 100 mM NaCl 50 mM phosphat
pH 13 100 mM NaCl 50 mM phosphat
Cytosolisk standardkurve
Brug tidligere foretagne 0,15 M stamopløsning bufferopløsninger
Udgør 0,15 M KCl-opløsning
15 ml slutvolumen: 5 ml 0,15 M af ønsket puffer + 10 ml 0,15 M KCI opløsning
10 mM stamopløsning af nigericin i ethanol, tilsættes 15 pi til hver slutvolumen opløsning
pH 3 100 mM KCI 50 mM glycin 10 pM nigericin
pH 4 100 mM KCI 50 mM acetat 10 pM nigericin
pH 5 100 mM KCI 50 mM acetat 10 pM nigericin
pH 6 100 mM KCI 50 mM acetat 10 pM nigericin
pH 7 100 mM KCI 50 mM Tris 10 pM nigericin
pH 8 100 mM KCI 50 mM Tris 10 pM nigericin
pH 9 100 mM KCI 50 mM Tris 10 pM nigericin
pH 10 100 mM KCI 50 mM glycin 10 pM nigericin
pH 11 100 mM KCI 50 mM phosphat 10 pM nigericin
pH 12 100 mM KCI 50 mM phosphat 10 pM nigericin
pH 13 100 mM KCI 50 mM phosphat 10 pM nigericin
pH alle kalibreringsopløsninger med enten HCI eller NaOH

Tabel 1: Sammensætning af buffere. Denne tabel beskriver de passende sammensætninger af de forskellige buffere, der anvendes i protokollen.

Supplerende kode fil. Denne fil indeholder en række makroer, skrevet af AP Levine, som er nødvendige for billedanalyse. Forfatterne vil være glade for at forsøge at løse eventuelle forespørgsler i forbindelse med brug af denne kode. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Når de passende reagenser, mikroskop indstillinger og kalibreringsforsøg er sat op, denne metode er relativt enkel at udføre. De kritiske skridt omfatter: mærkning af Candida med S-1 for at sikre, at der ikke er overbelastning af farvestoffet, kalibrering og analyse af billedet.

S-1 er et reagens egnet til flere alkaliske pH-miljøer, hvilket er særligt vigtigt for neutrofiler 21 men begrænser dets anvendelse i visse celletyper. For flere sure miljøer, såsom makrofag fagosomer, snarf-4, eller S-4, er mere egnet på grund af dens lavere pKa 22. Desuden er det for mere nøjagtige cytoplasmatiske aflæsninger, er det bedre at bruge S-4, som standardkurven for S-1 viser, at fluorescens-forhold begynder at plateau under pH 6 (figur 3). Andre farvestoffer, såsom 2' , 7'-bis- (2-carboxyethyl) -5- (and-6) -carboxyfluorescein (BCECF) eller pHrodo Red kan også være mere velegnet i et context, der forventes at være sur. Alligevel cytoplasmaet farvningen er stadig nødvendig for korrekt identifikation af de fagosomer indeholder Candida.

Et vigtigt træk ved en fagosomale pH-indikator er, at den ikke er irreversibelt ændret af den reaktive fagosomale miljø. S-1 synes at være resistent over for det neutrofile miljø. Dette er vist ved Levine et al. 5 (se supplerende Video 4 reference 5), som demonstrerer fagocytose og efterfølgende frigivelse af en S-1-mærket Candida partikel ved en Hvcn1 - / - neutrofil. Når fagocyteres, partiklen skifter fra gul / orange til rød (neutral til alkalisk pH), men når partiklen frigøres af neutrofil, vender den tilbage til sin oprindelige farve.

Det er vigtigt at nævne nogle af de begrænsninger, der er forbundet med brug af S-1. At denne farvestof har to emissionsspektre tillader ratiometriske measurement er en fordel, men der er behov for specialudstyr til at erhverve billeder; mikroskop bruges til forsøgene skal kunne optage to billeder samtidigt eller med en ubetydelig tidsforsinkelse. Forfatterne antager, at forskeren forsøger denne protokol har erfaring med at bruge konfokalmikroskopi eller har adgang til en uddannet professionel. Vi kan ikke nævne alle de specifikke mikroskop parametre, som de vil variere for hver mikroskop og skal optimeres af forskeren. Den acetoxymethylester konjugeret til S-1, der tillader farvestoffet at diffundere ind i cellecytoplasmaet nedbrydes af ikke-specifikke esteraser i cellecytoplasmaet til dannelse af fluorescerende molekyle. Esteraser, såsom alkalisk phosphatase, er til stede i humant serum og føtalt bovint serum, der anvendes som supplement celledyrkningsmedier. Følgelig skal det medium, hvori cellerne er fyldt med S-1-AM (afsnit 4.5) ikke indeholder serum. Dette kan vise sig udfordrende, hvis anvendelse af celler, der kræver en mere næringsstof-rich medium til at opretholde dem end den afbalancerede saltopløsning anvendt i hele denne protokol. Tilsvarende andre fluorescerende mediekomponenter, såsom phenolrødt, kan interferere med S-1 målinger.

Fejlsøjlerne i figur 3 indikerer, at der er nogen variation i forholdet målinger ved hver pH. Et passende antal gentagelser af hvert forsøg (mindst n = 3) og der er behov så mange individuelle målinger i hver enkelt eksperiment for at overvinde den inter-vakuolær variation. Det er således tilrådeligt at måle pH på mindst 100 fagosomer for hver betingelse og lige så mange fagosomale områder, der synes at indeholde kun én Candida. De fagosomer skal måles til kvantificering bør være dem, der har fuldstændig opslugt en Candida partikel (dvs. dem helt omgivet af cytoplasma). At afbøde utilsigtede skævheder i udvælgelsen af ​​celler / fagosomer for kvantificering, bør alle analyser udføres, medensblind for de eksperimentelle betingelser.

Her beskriver vi isolering af neutrofiler ved dextransedimentering af fuldblod efterfulgt af centrifugering af plasmaet lag gennem en densitetsgradient. Vi anvende denne teknik, det hurtigt og effektivt producerer en ren (> 95%) population af neutrofiler, selv om der er andre tilgængelige metoder, såsom fuldblod centrifugering gennem andre densitetsgradient formler eller negativ selektion af neutrofiler ved anvendelse af specialiserede kits med antistoffer eller magnetisk perler. Imidlertid kan sidstnævnte være uoverkommeligt dyrt for de fleste grupper, der isolerer neutrofiler rutinemæssigt. Derudover bruger vi den antikoagulerende heparin i blodet opsamle rør, mens andre forskere kan være mere vant til at bruge ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) eller syrecitrat natrium (ACD). Da der er mange forskellige metoder at vælge imellem, er det op til den personlige præferencer for forskeren.

Desuden,når isolere og manipulere neutrofiler de skal håndteres med en vis forsigtighed for at undgå overdreven aktivering. Forebyggende skridt omfatter: kun ved hjælp af plast ware, ingen glas; Filtersteriliser alle buffere for at fjerne ethvert kontaminerende endotoxin; når spinning neutrofiler sørg centrifugen er velafbalanceret at undgå for store vibrationer; begrænse så meget som muligt de tidsmæssige neutrofiler forblive i en pellet efter centrifugering; ikke opretholde neutrofiler i opløsning på mere end 5 x 10 6 / ml; og udfører eksperimentet så hurtigt som muligt efter isolering.

Denne fremgangsmåde kan tilpasses til at måle ændringer i pH og fagosomale område over tid ved anvendelse af en opvarmet kulisse til 37 ° C på mikroskopet og tage snapshots gang hver 30-60 s fra samme position, som beskrevet for kalibreringstrinnene. Det kunne også teoretisk tilpasses til højere throughput eksperimenter, såsom i plader med 96 brønde, og til flowcytometri eksperimenter, hvor S-1 kananvendes som en pH-indikator 23. Men i disse indstillinger, er det vægt på individuel celle aktivitet erstattet af en mere global effekt på cellen befolkning.

Denne metode har til formål at give en relativt simpel forsøgsopstilling, hvorpå de enkelte forskere kan tilpasse der passer til deres område af interesse. Forskere kan ønsker at udforske neutrofil fagosomale pH og område samtidig måling bevægelse af andre ioner, for eksempel den intracellulære calciumkoncentration. Der er flere fluorescerende Ca2 + indikatorer let tilgængelige for konfokal mikroskopi, såsom Indo-1, som også har dobbelt emissionsspektre ved 400 og 475 nm 24. Disse emissionsbølgelængder ikke overlapper med S-1 emissionsspektre, men excitationsbølgelængden er ved ultraviolet (UV) ende af spektret, som kan være til skade for celler, og en UV-laser ikke er almindelig på alle mikroskoper. En omfattende gennemgang af de forskellige indikatorer tilmåle intracellulært calcium flux er dækket af Takahashi et al. 25 og Hillson et al. 26.

Afslutningsvis er der andre metoder til rådighed til at måle fagosomale pH under anvendelse af forskellige fluorescerende farvestoffer som Nunes et al. har demonstreret 13 samt andre grupper 27, 28. Andre forskere har også brugt S-1 for at måle cytosolisk pH 29 eller fagosomale pH 14. Men denne protokol er enestående i samtidigt at måle pH-værdien af både cytosol og fagosom, som giver mulighed for at observere ændringer i fagosomale tværsnitsareal og at skelne mellem vildtype og Hvcn1 - / - mus neutrofiler, og humane neutrofiler med og uden en arbejder NADPH-oxidase.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde er venligst finansieret af Wellcome Trust, for Bioteknologi og biologiske Sciences Research Council, og Irwin Joffe Memorial Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Candida albicans ATCC 10231 Vitroids  80 CFU Sigma-Aldrich RQC14003-10EA Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions
YPD broth Sigma-Aldrich Y1375 Follow manufacturer's instructions, various providers exist
Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000 MP Biomedicals 2101514 Use gloves 
Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000 IU/mL  Fannin, Wockhardt UK Ltd FP1077 We purchased from UCH inpatient pharmacy
SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester - Special Packaging Thermo Scientific/Invitrogen SS22801 Use gloves
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate Thermo Scientific/Invitrogen C1272 Use gloves
Vivaglobin human IgG  160 mg/mL solution CSL Behring received as a gift Various providers exist
Normal mouse serum Abcam ab7486 Various providers exist
Lymphoprep (density gradient medium) Alere Ltd 1114547 Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque
Nigericin Sigma-Aldrich N7143 Toxic, use gloves, various providers exist
Saponin Sigma-Aldrich 47036 Toxic, use gloves, various providers exist
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Toxic, use gloves, various providers exist
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375 Various providers exist
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma-Aldrich T1503  Various providers exist
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333 Various providers exist
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653 Various providers exist
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266 Various providers exist
Magnesium sulphate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506 Various providers exist
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791 Various providers exist
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C1016 Various providers exist
Glucose Sigma-Aldrich D9434 Various providers exist
Absolute Ethanol  Sigma-Aldrich 2860 Various providers exist
Diphenylene iodonium (DPI) Sigma-Aldrich D2926 Various providers exist
Zinc chloride Sigma-Aldrich 208086 Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate
Poly L lysine Sigma P4707 Various providers exist
Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700) Carl Zeiss The microscope must be able to excite at 555 nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600 nm, >610 nm)
Ibidi µ slide 8 well ibiTreat Thistle Scientific IB-80826 Other appropriate imaging dishes can be substituted
Soniprep 150 MSE Any appropriate sonicator will suffice
TC20 Automated Cell Counter BioRad Various providers exist
1.5 mL Protein LoBind Tubes Sigma-Aldrich Z666505-100EA Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Segal, A. W. NADPH oxidases as electrochemical generators to produce ion fluxes and turgor in fungi, plants and humans. Open Biol. 6, (5), 515-517 (2016).
  2. Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annu Rev Immunol. 23, 197-223 (2005).
  3. Cross, A. R., Segal, A. W. The NADPH oxidase of professional phagocytes - Prototype of the NOX electron transport chain systems. BBA Bioenergetics. 1657, (1), 1-22 (2004).
  4. Demaurex, N., El Chemaly, A. Physiological roles of voltage-gated proton channels in leukocytes. J Physiol. 588, (23), 4659-4665 (2010).
  5. Levine, A. P., Duchen, M. R., de Villiers, S., Rich, P. R., Segal, A. W. Alkalinity of neutrophil phagocytic vacuoles is modulated by HVCN1 and has consequences for myeloperoxidase activity. PLoS One. 10, (4), 0125906 (2015).
  6. Reeves, E. P., Lu, H., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416, (6878), 291-297 (2002).
  7. Menegazzi, R., Busetto, S., Dri, P., Cramer, R., Patriarca, P. Chloride ion efflux regulates adherence, spreading, and respiratory burst of neutrophils stimulated by tumor necrosis factor-alpha (TNF) on biologic surfaces. J Cell Biol. 135, (2), 511-522 (1996).
  8. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Cell Biol. 75, (7), 3327-3331 (1978).
  9. Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in neutrophils. J Biol Chem. 277, (8), 6059-6066 (2002).
  10. Tsien, R. Y. Fluorescent Indicators of Ion Concentrations. Methods in Cell Biol. 30, 127-156 (1989).
  11. Lavis, L. D., Rutkoski, T. J., Raines, R. T. Tuning the pK a of Fluorescein to Optimize Binding Assays. Anal Chem. 79, (17), 6775-6782 (2007).
  12. Hurst, J. K., Albrich, J. M., Green, T. R., Rosen, H., Klebanoff, S. Myeloperoxidase-dependent fluorescein chlorination by stimulated neutrophils. J Biol Chem. 259, (8), 4812-4821 (1984).
  13. Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy. J Vis Exp. (106), e53402 (2015).
  14. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Mol Biol Cell. 25, (21), 3330-3341 (2014).
  15. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. (109), e53622 (2016).
  16. Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D. Application of a new pH-sensitive fluoroprobe (carboxy-SNARF-1) for intracellular pH measurement in small, isolated cells. Pfl ügers Archiv EJP. 417, (2), 234-239 (1990).
  17. El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leuko Biol. 95, (5), 827-839 (2014).
  18. Morgan, D., Capasso, M., et al. Voltage-gated proton channels maintain pH in human neutrophils during phagocytosis. Proc Natl Acad Sci USA. 106, (42), 18022-18027 (2009).
  19. Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18, (11), 2210-2218 (1979).
  20. Levine, A. P., Segal, A. W. The NADPH Oxidase and Microbial Killing by Neutrophils, With a Particular Emphasis on the Proposed Antimicrobial Role of Myeloperoxidase within the Phagocytic Vacuole. Microbiol Spectr. 4, (4), (2016).
  21. Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290, (5805), 406-409 (1981).
  22. Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 71, (5), 2501-2510 (2005).
  23. Van Erp, P. E. J., Jansen, M. J. J. M., De Jongh, G. J., Boezeman, J. B. M., Schalkwijk, J. Ratiometric measurement of intracellular pH in cultured human keratinocytes using carboxy-SNARF-1 and flow cytometry. Cytometry. 12, (2), 127-132 (1991).
  24. Minamikawa, T., Takamatsu, T., Kashima, S., Fushiki, S., Fujita, S. Confocal calcium imaging with ultraviolet laser- scanning microscopy and indo-1. Micron. 24, (6), 551-556 (1993).
  25. Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of Intracellular Calcium. Physiol Rev. 79, (4), (1999).
  26. Hillson, E. J., Dewitt, S., Hallett, M. B. Optical methods for the measurement and manipulation of cytosolic free calcium in neutrophils. Methods Mol Biol. 412, Clifton, N.J. 125-137 (2007).
  27. Bernardo, J., Long, H. J., Simons, E. R. Initial cytoplasmic and phagosomal consequences of human neutrophil exposure to Staphylococcus epidermidis. Cytometry Part A. 77, (3), 243-252 (2010).
  28. Riazanski, V., Gabdoulkhakova, A. G., et al. TRPC6 channel translocation into phagosomal membrane augments phagosomal function. Proc Natl Acad Sci USA. 112, (47), 6486-6495 (2015).
  29. Martínez-Zaguilán, R., Martínez, G. M., Lattanzio, F., Gillies, R. J. Simultaneous measurement of intracellular pH and Ca2+ using the fluorescence of SNARF-1 and fura-2. Am J Physiol Cell Physiol. 260, (2), (1991).
Imaging den Neutrofil fagosomet og Cytoplasma Ved hjælp af en Ratiometrisk pH-indikator
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Foote, J. R., Levine, A. P., Behe, P., Duchen, M. R., Segal, A. W. Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator. J. Vis. Exp. (122), e55107, doi:10.3791/55107 (2017).More

Foote, J. R., Levine, A. P., Behe, P., Duchen, M. R., Segal, A. W. Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator. J. Vis. Exp. (122), e55107, doi:10.3791/55107 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter