Summary
Делящихся дрожжей, Schizosaccharomyces pombe является прекрасной модельной системой для изучения цитокинез, заключительный этап клеточного деления. Здесь мы опишем подход микроскопии для анализа различных cytokinetic событий в делящихся дрожжей живых клеток.
Abstract
Цитокинез, заключительный шаг в делении клеток имеет решающее значение для поддержания целостности генома. Правильное цитокинез имеет важное значение для дифференцировки и развития клеток. Цитокинез включает в себя ряд мероприятий, которые хорошо скоординированные во времени и пространстве. Цитокинез предполагает формирование актомиозинового кольца на участке разделения, а затем кольцевой сужением, формирование мембраны по бороздам и внеклеточной матрицы ремоделирования. Делящихся дрожжей, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) является хорошо изученным модель системы, которая раскрывается с существенной ясности начальные события в цитокинезе. Тем не менее, мы не понимаем ясно, каким образом различные cytokinetic мероприятия координируются spatiotemporally. Чтобы определить это, необходимо проанализировать различные cytokinetic события в больших деталях и во времени и в пространстве. Здесь мы опишем подход микроскопии для изучения различных cytokinetic эвЭнты в живых клетках. При таком подходе можно время разные cytokinetic события и определить время набора различных белков во время цитокинеза. Кроме того, мы описываем протоколы для сравнения локализацию белка и распределение на месте клеточного деления. Это базовый протокол для изучения цитокинез в делящихся дрожжей, а также могут быть использованы для других дрожжевых и грибковых систем.
Introduction
Цитокинез, заключительный шаг в клеточном делении, является сложным процессом, необходимым для правильной дифференциации, развития и выживания организма. Цитокинез включает в себя множество событий, которые организованы , чтобы обеспечить успешное разделение клеток при сохранении целостности геномную 1. Цитокинез включает в себя события , где актомиозиновый кольцо после сборки претерпевает перетяжку, которая одновременно с расширением мембраны и бороздование, и внеклеточной клеточной ремоделирование матрикса, наконец , с последующей клеточной опадение 1, 2, 3. Неправильная организация cytokinetic событий может привести к разделению клеток и плоидности дефектов, а также может вызвать такие заболевания , как рак 4, 5, 6, 7, 8. Основные принципы, которые дают возможность выводаРГАНИЗАЦИЯ из cytokinetic событий не вполне понятны, что приводит к блокпостов в нашем понимании этиологии этих заболеваний.
Делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) является отличной моделью системы для изучения цитокинеза из - за сохраняющегося природы белков , участвующих 1. В делящихся дрожжей, после того, как актомиозинового кольцо в сборе, кольцо входит в / задержки фазы созревания , где она не сужают 9. Созревание заканчивается с началом актомиозиновый кольца перетяжки, одновременно с мембраной бороздить и перегородку ингрессии. Семенной работа на протяжении многих лет дали нам достаточно хорошее понимание актомиозинового кольца сборки при делении дрожжей 1, 9, 10. В некоторых эукариот, в том числе делящихся дрожжей, успешная сборка актомиозинового кольца не является достаточным для мембранного бороздование. В Fission дрожжи, кольцо Сужение само по себе не обеспечивает достаточной силы , чтобы преодолеть внутреннее давление тургора для формирования борозды 11. Недавно модель указывает на то, что эта сила вместо этого обеспечивается перегородке ингрессии 11. В другой модели, роль расширения плазматической мембраны было предложено внести свой вклад в борозду образование 12, 13. Кольцо Сужение и мембраны бороздование не происходит в температурном Bgs1 / CPS1 чувствительной мутантной cps1-191, основного фермента для формирования первичной перегородки 14, 15. Клетки , лишенные Bgs1 показывают дефектный первичный перегородку и длительное кольцо перетяжку 15, 16. Bgs1 набирается на сайт клеточного деления для перегородке вхождени во время созревания после актомиозинового кольца в сборе 17, 18. Similarlу, во время cellularization у дрозофилы эмбрионов, кольцо Сужение двухфазный со значительно медленной начальной скорости 19 стягивания, напоминающим фазу созревания наблюдается у делящихся дрожжей. Двухфазный кольцо Сужение может замедлить мембраны бороздят , чтобы обеспечить достаточное расширение мембраны 20 и модификации внеклеточного матрикса. Это говорит о том, что после того, как актомиозинового кольцо в сборе, кольцо Сужение эффективно происходит только тогда, когда клетка удовлетворяет требованиям, предъявляемым к бороздам формирования. Это не очень хорошо понимал, какие условия необходимы для актомиозиновый кольцевого сужения после сборки кольца, ни молекулярных событий, которые регулируют этот процесс. Недавно мы показали , что после актомиозина кольцо сборка маленький GTPase Cdc42 подвергается уникальной пространственно - временной паттерн активации 21. Эта модель устанавливается уникальным рисунком локализации Cdc42 факторов обмена гуанидин (нуклеотидныхGEFs), которые активируют Cdc42. Gef1 ГЭФ локализуется в собранном актомиозинового кольце и способствует начало кольца сужением и перегородку ингрессии, в то время как scd1 локализуется в бороздить мембраны и способствует нормальному формированию перегородки. Мы находим, что картина активации Cdc42 устанавливается его GEFs приводят к регуляции различных cytokinetic событий.
Для того, чтобы понять молекулярный механизм событий, которые в конечном итоге приводят к разделению клеток после актомиозиновый кольца в сборе, необходимо следовать различные cytokinetic события во времени и пространстве. В делящихся дрожжей, цитокинез первая включает в себя сборку узлов-предшественников вокруг ядра, которые в конечном итоге вербуют миозина II типа, в Formin Cdc12, а также другие белки, необходимые для сборки актомиозиновый кольца. Для того, чтобы время различные cytokinetic события и обеспечить систему отсчета, разделение шпинделя полюса маркеров тела (формирование шпинделя) считается время 0 22. Сборка-гое актомиозиновый кольцо может сопровождаться мониторинг с течением времени интенсивность флуоресцентно меченый актомиозиновом кольцевого белка, таких как тип II регуляторной легкой цепи миозина Rlc1. Здесь мы опишем микроскопический подход для анализа различных этапов цитокинезе с течением времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление образца
- Grow дрожжевые клетки деления , выражающие полюс шпинделя тела маркер SAD1-mCherry 23 и типа II регуляторной легкой цепи миозина Rlc1-томат 24 в YE жидких средах при температуре 32 ° С в течение 8 поколений.
Примечание: Для чувствительных к температуре мутантов, растут клетки при 25 ° С. Рост клеток до середины логарифмического до OD 600 0,5 в YE. Более подробную информацию о делении условий роста дрожжей относятся к лабораторным руководстве делящихся дрожжей 25. - Приготовьтесь (или минимальные) сред с 0,6% агарозы (Агарозном на основе средств массовой информации показывают менее флюоресцентный фон по сравнению с агар). К расплавленному сред добавляют 1 мМ аскорбиновой кислоты (витамин С). Витамин С гасит свободные радикалы, которые выделяются из-за фото-отбелки, тем самым сводя к минимуму фото-токсичность.
- Налить 3 - 4 мл витамина С Зашнурованный топленого носитель на стеклянной культуральной чашки. Пусть прохладно СМИ и затвердеть.
Обратите вниманиеТолщина стекла в культуральной чашке зависит от толщины покровного стекла, подходящего для микроскопа. При этом используется покровное No. 1.5. - Осторожно поднимите затвердевшей носитель из культуральной чашки с помощью острым скальпелем. Поместите наконечник между плитой и медиа - культуры блюдо , чтобы предотвратить плиту от падения обратно в блюдо (рисунок 1).
- Принимать по 1 мл свеже растущих клеток, как описано в пункте 1.1 выше. Спин клетки осторожно при 300 мкг в течение 30 с. Удалите супернатант. Ресуспендируют клеток в небольшом количестве остаточного сред, который остается в трубке после удаления надосадочной жидкости.
- Нагрузка 2 - 5 мкл ресуспендированных культуры клеток между СМИ плитой и стеклянным дном чашки для культивирования. Клетки должны быть на стекле. Наконечник пипетки помещают между средствами массовой информации и блюдо позволяет легко загружать культуре клеток.
- Очень осторожно удалите наконечник пипетки и поместить медиа плиту обратно в исходное положение на у.е.lture блюдо. Убедитесь в том, чтобы избежать каких-либо воздушных пузырьков. В случае необходимости аккуратно выдавить пузырьки воздуха, сдвинув заднюю часть наконечника пипетки на верхней части медиа-плиты.
- Пусть клетки сидят в чашку для культивирования в течение 30 минут до одного часа в темноте при температуре, при которой будет выполнена микроскопия. Это важно, чтобы предотвратить шок из-за изменения условий роста для клеток.
2. Получение изображения
- Поместите каплю масла на внешней стороне стекла на чашке для культивирования. Место культуры блюдо на инвертированный микроскоп.
- Для того, чтобы свести к минимуму авто флуоресценцию YE СМИ используют фильтр GFP с узким диапазоном длин волн (520 - 535 нм).
- Сосредоточьтесь на медиальной плоскости клеток и убедиться, что они хорошо разнесены и не слишком многолюдно. Убедитесь в том, чтобы начать получение изображения клеток в подходящей стадии клеточного цикла. Для этого эксперимента следуют клетки от конца G2.
- Программирование получения изображения программного обеспечения тO принять GFP, RFP и DIC изображений клеток.
- Для этого эксперимента используют 100 мс время экспозиции для DIC и 75 мс время экспозиции для GFP и RFP фильтров. Время экспозиции зависит от настроек микроскопа, белка исследуемой и продолжительности эксперимента. При заданных параметрах микроскопа, использовать 50% мощности лазера.
- Для захвата изображений в 3-х измерениях, программа программного обеспечения для захвата изображений Z-масштаба изображения. Используйте размер шага 0,4 мкм и расстояние 3,0 мкм (половина общего г) вокруг центральной точки фокусировки клеток. Это приводит к захвату 16 Z-кадров в момент времени с общей Z расстоянии 6 мкм.
Примечание: получение изображений Z-серии позволяет фиксировать шпинделя тел полюса.
- Делать снимки каждые 2 мин. Изменение времени экспозиции в соответствии с требованиями эксперимента. Время экспозиции также может быть изменен в соответствии с интересующим белком и силы сигнала. Тем не менее, обратите внимание, что короткаяэр интервалы или больше времени экспозиции увеличение фото-токсичность из-за отбеливания и, следовательно, клетки могут следовать только в течение короткого промежутка времени.
- Получение изображений до клеток физически разделенных по наблюдениям изображений ДИК, или запрограммировать программное обеспечение, чтобы остановить приобретение через 90 мин.
Анализ 3. Изображение
- Временной анализ событий cytokinetic
- С помощью программного обеспечения захвата изображений делают проекции Z-кадров для каждого момента времени. Сделать различные файлы для каждой длины волны изображения, полученного.
- Экспорт этой проекции серии временных точек в виде файла .tiff.
- Анализ изображений с помощью программного обеспечения ImageJ. Открыть серию изображений для любой из длин волн.
- Выберите ячейку для изучения. Двойной щелчок по выбору линии панели инструментов. Откроется еще одно окно для регулировки ширины линии. Регулировка ширины линии, чтобы соответствовать ширине ячейки. Для ячейки WT это около 40 - 50 пикселей. Нарисуйте линию вдольДлинная ось ячейки, представляющей интерес.
- Нажмите на Analyze> Инструменты> Диспетчер ROI и нажмите на доп. Это добавит выбранную строку в окне ROI для последующего использования. Не закрывайте это окно.
- Нажмите на изображение интереса и выберите Edit> Selection> Выпрямление. Откроется еще одно окно. Проверка "Процесс весь стек". Это будет выпрямить ячейку по горизонтали.
- Нажмите на Image> Transform> Поворот 90 градусов вправо. Это изображение теперь выпрямлены вертикально.
- Нажмите на Image> Стеки> Make Montage. При этом откроется окно, чтобы назначить количество строк и столбцов для стека, масштабный коэффициент для размера изображения, первый и последний кусочек (рама) для монтажа и приращение рамы для монтажа. Проверьте кусочки этикетки и нажать кнопку ввода.
- Как окно с монтажом ячейки интереса показано, открыть серию изображений для другой длины волны.
- Нажмите на идентификатор линии на менеджера ROI. Это позволит выбратьта же ячейка на втором файле изображения. Повторите шаги 3.1.6 - 3.1.8. Это откроет монтаж второго изображения.
- На изображении с шпинделя маркером полюса тела SAD1-mCherry, искать начала разделения шпинделя маркера полюса тела и отметить, что момент времени, как момент времени 0.
- Следуйте сигнал Rlc1-томат на фотографии с течением времени и посмотреть на сигнал, который появляется в качестве отдельной линии, в отличие от пятен Rlc1-томата. На этот раз точка знаменует завершение актомиозиновый кольца сборки / начало фазы созревания.
- Затем прокрутить фильм в течение долгого времени, чтобы определить, когда Rlc1-томат кольцо начинает уменьшаться в размерах. Это помечено как конец созревания фазы / начала кольцевого сужения.
- Выполните сигнал Rlc1-томат с течением времени на протяжении сужением до тех пор, пока не появится как точка в середине оси клетки. Это помечено как конец кольцевого сужения / конца перегородки ингрессии.
- После монтажа DIC изображений, определить окончательную ячейкуразделение. Записывают момент времени, когда клетка физически отделяется.
- Для шпинделя разделения полюса тела измеряют расстояние между двумя шпиндельных тел полюсных в течение долгого времени с помощью инструмента линии в ImageJ. Участок расстояние в шпинделя полюса тела с течением времени.
- Запишите различные моменты времени для различных событий cytokinetic рассчитать продолжительность каждого cytokinetic фазы и сравнить с шпинделя полюса разделения тела с течением времени.
- Пространственный анализ событий cytokinetic
- Выберите ячейку с видимым актомиозинового кольцом. Двойной щелчок по выбору линии панели инструментов ImageJ. Откроется еще одно окно для регулировки ширины линии. Отрегулируйте ширину линии, чтобы соответствовать толщине кольца (15 - 20 пикселей). Проведите линию вдоль кольца, заботясь, чтобы обеспечить всю толщину кольца входит.
- Нажмите на Analyze> Инструменты> Диспетчер ROI и нажмите на доп. Это добавит выбранную строку в окне ROI для последующего использования.Не закрывайте это окно.
- Нажмите на изображение интереса и выберите Edit> Selection> Выпрямление. Откроется еще одно окно. Проверка "Процесс весь стек". Это будет выпрямить кольцо горизонтально.
- Сброс интенсивности самой яркой плоскости в расправленном г-стека (от 3.1.6) с помощью Image> Adjust> Brightness / Contrast> Сброс.
- Нажмите на вкладку Stk> 3D проекта. При этом откроется диалоговое окно. Измените способ проецирования на Brightest точке и расстояния между Slice 2 или 3 пикселя. Наконец, ось изменение направления вращения на X или Y-оси (это будет меняться в зависимости от требуемого угла обзора), нажмите интерполировать и нажмите кнопку OK, чтобы создать 3D-проекцию изображения. Используйте полосу прокрутки под изображением, чтобы повернуть изображение.
- Открыть серию изображений для другой длины волны с использованием ImageJ.
- Нажмите на идентификатор линии на менеджера ROI. Это позволит выбрать тот же кольцо на второй файл изображения. Повторите шаги 4.2.4 и 4.2.5.Это откроет 3-мерного кольца в изображении с другой длиной волны.
- С обеих 3D колец изображения открытыми, нажмите на Image> Color> Объединить каналы. При этом откроется окно. Выберите каждое изображение из выпадающего меню для соответствующего желаемого цвета и нажмите кнопку OK. Это позволит открыть композицию обоих изображений на разных длинах волн.
- Сравните локализацию различных маркеров в отношении локализации на cytokinetic кольца или ingressing мембраны. Rlc1-GFP является маркером для cytokinetic кольца. Белки совместно с локализацией Rlc1-GFP локализовать на ринг в то время как белки локализовать за сигналом Rlc1-GFP локализуются в ingressing мембране.
Примечание: белок, представляющий интерес должен быть другого флуорофора, чем у кольцевого маркера. - Генерация 3 мерных колец на разных этапах цитокинезе для сравнения пространственной локализации белков через все цитокинезе.
- Анализ белка DISTRIпределение на cytokinetic кольце
- Для того, чтобы сравнить и проанализировать распределение белков вдоль кольца измеряют коэффициентом дисперсии распределения белка. Высокая эффективность совместной дисперсии указывает на неравномерное распределение белков вдоль участка разделения и предлагает неправильное кольцо в сборе, созреванием или образование перегородки, в зависимости от того, какая фаза проецируется или проанализированы.
- С помощью 3-мерного реконструированного cytokinetic кольцо (от 3.2.2), делят изображение на по крайней мере 4-х квадрантов таким образом, что четверть кольца появляется в каждом квадранте. Для этого используйте инструмент линии рисовать перпендикулярные линии на изображении. После каждой строки Нажмите на изображение> Overlay> Добавить выбор или использовать короткий отруб Ctrl + B.
- Перейти к Анализировать> Установить измерение. Выберите среднее значение серого в окне, которое открывается. Нажмите кнопку ОК.
- Используя линии, проведенные выше, в качестве направляющих нарисуйте прямоугольник, чтобы определить каждый квадрант с помощью инструмента прямоугольник.
- Для измерения средней интенсивности каждого квадранта, нажмите кнопкуна Проанализировать> Мера или использовать короткую стрижку Ctrl + M.
- Запишите среднее значение серого для всех четырех квадрантах (MG 1 -MG 4).
- Выберите небольшой участок в каждом квадранте вне кольца в качестве фона выбора.
- Измерьте среднее значение серого для выбора фона для всех четырех квадрантах (BG 1 -BG 4).
- li> Для вычитания фона для каждого квадранта с помощью следующей формулировке MG 1 -Средняя (BG 1: BG 4) = Интенсивность кольца в каждом квадранте (IRQ). На данном этапе есть 4 значения IRQ, по одному для каждого квадранта.
- Затем вычислить коэффициент отклонения для каждого кольца , используя следующую формулировку Стандартное отклонение (IRQ 1: IRQ 4) / Average (IRQ 1: IRQ 4). Расчет средней Co-эффективность дисперсионный для каждого штамма и по сравнению с другими штаммами.
Примечание: статистически значимое увеличение совместного эффективной дисперсии в штамме по сравнению с контрольной группой Indicates неравномерное распределение белка / доставки вдоль участка разделения на той стадии цитокинеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Деление дрожжевые клетки , экспрессирующие маркер кольцо, Rlc1-GFP (зеленый, рисунок 2) и шпиндель маркер полюса тела SAD1-mCherry (красный, рисунок 2) во время цитокинеза были обследованы. Наступление шпинделя маркера полюса тела (белая стрелка, рисунке 2а, б) рассматривается как время появляется 0. Rlc1-GFP сигнал на время -4 мин со ссылкой на шпинделе полюса разделение тела (красная стрелка, рис 2А, 2В). Сигнал Rlc1-GFP образует сплошное кольцо 10 мин пост шпинделя разделения полюса тела (открытый стрелка, рисунке 2а, б) отмечая конец актомиозиновый кольца в сборе. Актомиозиновый кольцо (Rlc1-GFP) начинает уменьшаться по ширине 22 мин после завершения кольцевой сборки и 32 мин после шпинделя полюса разделения тела (закрытом Arrowhead, рисунке 2а, б). Кольцо Сужение заканчивается через 20 мин после начала перетяжки, 42 мин с момента начала сборки и кольца 52 мин с момента разделения шпинделя полюса тела (белый Asterisк, 2А, В). Наконец, ячейка опадение происходит 72 мин пост шпинделя разделения полюса тела (красный наконечник стрелы, фиг.2А, В).
Локализация кольца маркера Rlc1-томатном и перегородку мембраны маркера Bgs1-GFP были проанализированы на месте разделения всей цитокинезе. 3D - реконструкция кольца показало , что актомиозиновый кольцо отмеченные Rlc1-томата собраны до того набора Bgs1-GFP (рис 3, 10 мин). Во время фазы созревания кольца Bgs1-GFP был принят на работу к месту разделения и перекрывается с актомиозинового кольца , как показано на Rlc1-томата (рис 3, 30 мин). Это указывает на то, что Bgs1 локализуется на ринг после набора. По мере того как кольцо сужает, Bgs1-GFP также локализуется в ingressing мембраны , прилегающей к сковывающий кольца (рис 3, 40 мин). В конце сужением, сигнал Bgs1-GFP, виден в втекает мембраны Barriэр (рис 3, 50 мин). Наконец, после того, как сужением сигнал Rlc1-томат отсутствует, в то время как Bgs1-GFP появляется локализовать на протяжении мембранного барьера с диска , как внешний вид (рисунок 3, 60 мин). Таким образом , эти наблюдения указывают на то, что перегородку синтезирующий фермент Bgs1 локализуется на ринг после сборки и сохраняется после кольцевого сужения на мембранный барьер , как сообщалось ранее 17.
Распределение белков вдоль актомиозинового кольца были проанализированы для определения эффективности cytokinetic событий (рисунок 4). Неравномерное или неоднородны распределение белков вдоль актомиозинового кольца было связано с нарушением сигнализации и неэффективным cytokinetic кольца в сборе 26. Здесь мы покажем два 3D реконструированы кольца во время фазы созревания, экспрессирующие белок F-Bar Cdc15-GFP (Рисунок 4). Изображениеслева показывает равномерное распределение Cdc15-GFP вдоль кольца с низким коэффициентом дисперсии (0,098), в то время как изображение в правом показывает неравномерное распределение с высоким коэффициентом дисперсии (0,226, рис 4).
Рисунок 1: Получение культуры Блюдо для работы с изображениями. Схема, описывающая инокуляция клеток в стеклянном культуральной чашки обложен медиа-площадку. См протокол для деталей (раздел 1). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2 Сроки Cytokinetic События в S. pombe. (A) Монтаж экспрессирующий spindl клетоке полюс тела маркер SAD1-mCherry (левая панель), кольцо белок Rlc1-GFP (средняя панель) и светлого поля (правая панель) проходит цитокинез показано с интервалом 2 мин. Белые стрелки метки тела (центросомы) разделение полюсов веретена на 17 мин, красная стрелка отмечает начальный набор Rlc1-GFP на участке разделения, открытая стрелка отмечает кольцо созреванию при 27 мин, стрелка голова отмечает начало кольцевого сужения на 47 мин, звездочками знаков конец кольцевого сужения на 69 мин и красной стрелкой Оценки клеток опадение на 97 мин. (B) Хронология событий cytokinetic со ссылкой на митоза , как определить , за счет образования шпинделя полюса тела и разделения. Клетки были обследованы при 25 ° C. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: CeLL Отдел сайта на различных этапах Цитокинез. 3D реконструкция актомиозиновый кольца Z-стеки на различных этапах цитокинезе для той же клетке, кольцо в сборе (10 мин пост шпинделя полюса разделения тела), кольцо созревания (30 мин разделение пост шпинделя полюса тела), кольцо типа перетяжек (40 мин пост шпинделя полюса разделение тела), конец сужением (50 мин пост шпинделя полюса разделение тела), перегородка барьер (60 мин пост шпинделя полюса разделение тела). Rlc1-томат отмечает кольцо в то время как Bgs1-GFP отмечает плазматическую мембрану, охватывающую перегородку. Шкала бар = 5 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Распределение белков по кольцу. Изображения 3D реконструированы актомиозина кольцо из дикого типа сгезов, выражающие Cdc15-GFP делится на четыре квадранта. Совместное эффективной дисперсии каждого кольца указано. Шкала бар = 5 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описали протокол для изучения cytokinetic событий в делящихся дрожжей во временном порядке. Протокол, описанный здесь, обеспечивает временное разрешение различных событий cytokinetic со ссылкой друг к другу; сроки набора белков или потери со ссылкой на cytokinetic фазе; Структура кольца на протяжении различных фаз цитокинезе; и прогрессирование цитокинезе со ссылкой на митоз. С помощью этого протокола можно точно определить cytokinetic фазы, которые могут быть изменены в различных мутантов, тем самым обеспечивая более детальное понимание белков, участвующих в различных cytokinetic фаз. Кроме того, способность различать разные по времени cytokinetic фазы позволит анализ молекулярных механизмов, приводящих к организации различных cytokinetic фаз. Временное разрешение различных cytokinetic событий также позволяет анализировать cytokinetic кольцевой структуры и распределения белковна протяжении различных событий. Пространственно-временной локализации различных белков, можно сравнивать и анализировать с этим подходом. При использовании подходящих флуорофоров, несколько белков могут быть изучены и сопоставлены друг с другом. Кроме того здесь мы также описали, как распределение белков вдоль кольца могут быть проанализированы, чтобы определить организацию белка или доставки на месте разделения. В то время как протокол, описанный здесь, относится к делящихся дрожжей цитокинеза, этот подход может быть также использован для изучения цитокинез в других дрожжей и грибов с подходящими изменениями роста и визуализации условий.
Этот протокол включает в себя получение изображений живых-клеток, как они делят. Клетки визуализируют с помощью этого протокола должны расти в оптимальных условиях, чтобы избежать каких-либо эффектов pleotropic. Следует проявлять осторожность, чтобы не переполняют клетки в поле зрения, так как чрезмерные клетки может привести к быстрой потере питательных веществ. Кроме того флуорофоры визуализации в клетках приводит к токсичности за счет бесплатнорадикалы выпустили в результате фото-отбеливание. Это может быть сведено к минимуму с добавлением свободного радикала закалочной соединения, такого как аскорбиновая кислота. Добавление аскорбиновой кислоты позволяет пролонгированное визуализацию клеток под микроскопом. Во время захвата изображения, вся Z-оси клетки должна быть отображена, чтобы обеспечить захват шпинделе тел полюсов. Отсутствие надлежащего сигнала для шпинделя органов полюсных не позволит осуществить необходимое временное разрешение цитокинеза. В частности, следует соблюдать осторожность, чтобы точно изображение начального разделения шпинделя полюса маркеров тела, как это время 0. Правильный захват клеток вдоль оси Z. также имеет важное значение для правильной 3-х мерных реконструкций колец и перегородками.
Для изображения сечения колец и перегородками, протокол, описанный здесь, может быть изменен с микроизготовленном скважины, что позволяет палочковидных клеток дрожжей деления быть место по вертикали для получения изображения вдоль длинной оси CELL , как было сообщено здесь 27. Хотя этот протокол может очень точно захватить набор белков и локализации с течением времени на месте клеточного деления пространственное разрешение изображений ограничено из-за разрешения микроскопа, используемого. Супер-разрешение микроскопия может помочь улучшить пространственное разрешение, но может повлиять на временное разрешение. Последние достижения в области микроскопии , такие как решетки световой микроскопии листа может помочь улучшить пространственное разрешение без ущерба для временного разрешения 28. Кроме световой микроскопии, цитокинез в делящихся дрожжей также могут быть изучены в течение долгого времени с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния света 29, 30.
При использовании такого подхода мы уже сообщали о том , что малый ГТФазная Cdc42 , подвергается уникальной пространственно - временной паттерн активации во время цитокинеза 21. Такой подход позволяет исследовать организацию различного cytokinetic событияс течением времени и описать молекулярные детали этих событий. Отчеты показали , что присутствие собранного актомиозиновом только кольцо не является достаточным для эффективного мембранного бороздование и цитокинеза 11, 21, 31. Протокол, описанный здесь, может быть использован для изучения молекулярных событий, которые приводят к правильному цитокинезе после актомиозиновый кольца в сборе. Кроме того, целостность актомиозинового кольца и его влияние на мембраны бороздить и перегородку ингрессии могут быть рассмотрены. Это позволит обеспечить более глубокое понимание различных молекулярных событий, которые в совокупности приводят к успешному разделению.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют нет конкурирующих финансовых интересов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract media | Sunrise Science Products | YES 225 | 0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine |
| Agarose | SeaKem LE agarose, Lonza | 50001 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Glass Bottomed culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used. |
| VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system | Visitech International, UK | with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu). | |
| ImageJ | NIH | Image analysis software |
References
- Pollard, T. D. Mechanics of cytokinesis in eukaryotes. Curr Opin Cell Biol. 22 (1), 50-56 (2010).
- Guertin, D. A., Trautmann, S., McCollum, D. Cytokinesis in eukaryotes. Microbiol Mol Biol Rev. 66 (2), 155-178 (2002).
- Xu, X., Vogel, B. E. A secreted protein promotes cleavage furrow maturation during cytokinesis. Curr Biol. 21 (2), 114-119 (2011).
- Sagona, A. P., Stenmark, H. Cytokinesis and cancer. FEBS Lett. 584 (12), 2652-2661 (2010).
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437 (7061), 1043-1047 (2005).
- Li, R. Cytokinesis in development and disease: variations on a common theme. Cell Mol Life Sci. 64 (23), 3044-3058 (2007).
- Daniels, M. J., Wang, Y., Lee, M., Venkitaraman, A. R. Abnormal cytokinesis in cells deficient in the breast cancer susceptibility protein BRCA2. Science. 306 (5697), 876-879 (2004).
- Storchova, Z., Pellman, D. From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (1), 45-54 (2004).
- Lee, I. J., Coffman, V. C., Wu, J. Q. Contractile-ring assembly in fission yeast cytokinesis: Recent advances and new perspectives. Cytoskeleton (Hoboken). 69 (10), 751-763 (2012).
- Balasubramanian, M. K., Bi, E., Glotzer, M. Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells. Curr Biol. 14 (18), R806-R818 (2004).
- Proctor, S. A., Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Contributions of turgor pressure, the contractile ring, and septum assembly to forces in cytokinesis in fission yeast. Curr Biol. 22 (17), 1601-1608 (2012).
- Munoz, J., et al. Extracellular cell wall beta(1,3)glucan is required to couple septation to actomyosin ring contraction. J Cell Biol. 203 (2), 265-282 (2013).
- Wang, N., Lee, I. J., Rask, G., Wu, J. Q. Roles of the TRAPP-II Complex and the Exocyst in Membrane Deposition during Fission Yeast Cytokinesis. PLoS Biol. 14 (4), e1002437 (2016).
- Liu, J., Wang, H., McCollum, D., Balasubramanian, M. K. Drc1p/Cps1p, a 1,3-beta-glucan synthase subunit, is essential for division septum assembly in Schizosaccharomyces pombe. Genetics. 153 (3), 1193-1203 (1999).
- Cortes, J. C., et al. The (1,3)beta-D-glucan synthase subunit Bgs1p is responsible for the fission yeast primary septum formation. Mol Microbiol. 65 (1), 201-217 (2007).
- Cortes, J. C., et al. Cooperation between Paxillin-like Protein Pxl1 and Glucan Synthase Bgs1 Is Essential for Actomyosin Ring Stability and Septum Formation in Fission Yeast. PLoS Genet. 11 (7), e1005358 (2015).
- Cortes, J. C., Ishiguro, J., Duran, A., Ribas, J. C. Localization of the (1,3)beta-D-glucan synthase catalytic subunit homologue Bgs1p/Cps1p from fission yeast suggests that it is involved in septation, polarized growth, mating, spore wall formation and spore germination. J Cell Sci. 115 (Pt 21), 4081-4096 (2002).
- Liu, J., Tang, X., Wang, H., Oliferenko, S., Balasubramanian, M. K. The localization of the integral membrane protein Cps1p to the cell division site is dependent on the actomyosin ring and the septation-inducing network in Schizosaccharomyces pombe. Mol Biol Cell. 13 (3), 989-1000 (2002).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15 (2), 838-850 (2004).
- Figard, L., Xu, H., Garcia, H. G., Golding, I., Sokac, A. M. The plasma membrane flattens out to fuel cell-surface growth during Drosophila cellularization. Dev Cell. 27 (6), 648-655 (2013).
- Wei, B., et al. Unique Spatiotemporal Activation Pattern of Cdc42 by Gef1 and Scd1 Promotes Different Events during Cytokinesis. Mol Biol Cell. , (2016).
- Nabeshima, K., et al. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9 (11), 3211-3225 (1998).
- Johnson, A. E., Gould, K. L. Dma1 ubiquitinates the SIN scaffold, Sid4, to impede the mitotic localization of Plo1 kinase. EMBO J. 30 (2), 341-354 (2011).
- Yonetani, A., Chang, F. Regulation of cytokinesis by the formin cdc12p. Curr Biol. 20 (6), 561-566 (2010).
- Fission Yeast: A laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
- Hachet, O., Simanis, V. Mid1p/anillin and the septation initiation network orchestrate contractile ring assembly for cytokinesis. Genes Dev. 22 (22), 3205-3216 (2008).
- Zhou, Z., et al. The contractile ring coordinates curvature-dependent septum assembly during fission yeast cytokinesis. Mol Biol Cell. 26 (1), 78-90 (2015).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Huang, Y. S., Karashima, T., Yamamoto, M., Hamaguchi, H. O. Molecular-level investigation of the structure, transformation, and bioactivity of single living fission yeast cells by time- and space-resolved Raman spectroscopy. Biochemistry. 44 (30), 10009-10019 (2005).
- Huang, C. K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging. Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).
- Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe. Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).
