Summary
الخميرة الانشطار، السكيراء pombe هو نظام نموذجا ممتازا لدراسة الانقسام السيتوبلازمي، والمرحلة النهائية في انقسام الخلايا. نحن هنا وصف نهج المجهري لتحليل الأحداث cytokinetic مختلفة في الخلايا الانشطار الخميرة الحية.
Abstract
السيتوبلازمي، فإن الخطوة النهائية في انقسام الخلايا أمر بالغ الأهمية للحفاظ على سلامة الجينوم. السيتوبلازمي السليم مهم للتمايز الخلايا والتنمية. ويشمل السيتوبلازمي سلسلة من الأحداث التي يتم تنسيقها بشكل جيد في الزمان والمكان. ويشمل السيتوبلازمي تشكيل عصابة أكتوميوزين في موقع الانقسام، تليها انقباض حلقة، وتشكيل غشاء ثلم والاضافي الخلوي إعادة عرض المصفوفة. الخميرة الانشطار، السكيراء pombe (س. pombe) هو نظام نموذجي درس جيدا أن كشفت بكل وضوح كبير في الأحداث الأولية في السيتوبلازمي. ومع ذلك، فإننا لا نفهم بوضوح كيف تختلف يتم تنسيق الأحداث cytokinetic spatiotemporally. لتحديد ذلك، يحتاج المرء إلى تحليل الأحداث cytokinetic مختلفة في تفاصيل كبيرة في كل من الزمان والمكان. نحن هنا وصف نهج المجهر لدراسة إف cytokinetic مختلفةالوالدان في الخلايا الحية. مع هذا النهج فمن الممكن لآخر الأحداث cytokinetic المختلفة، وتحديد وقت التوظيف للبروتينات مختلفة خلال الانقسام السيتوبلازمي. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف بروتوكولات لمقارنة توطين البروتين، والتوزيع في موقع انقسام الخلية. هذا هو بروتوكول الأساسي لدراسة الانقسام السيتوبلازمي في الخميرة الانشطار، ويمكن أن تستخدم أيضا لالخمائر الأخرى والنظم الفطرية.
Introduction
السيتوبلازمي، فإن الخطوة النهائية في انقسام الخلايا، وهو ضروري عملية معقدة للتمايز السليم، والتنمية، والبقاء على قيد الحياة للكائن الحي. ويشمل السيتوبلازمي الأحداث المتعددة التي يتم تنظيمها لضمان فصل الخلية ناجحة مع الحفاظ على سلامة الجينوم 1. ويشمل السيتوبلازمي الأحداث حيث حلقة أكتوميوزين تجميعها مرة واحدة يخضع انقباض، وهو بالتزامن مع توسع الغشاء وسرابات، وخارج الخلية الخلوية إعادة عرض المصفوفة، ثم أخيرا من قبل خلية اقتطاع 1، 2، 3. منظمة غير لائق من الأحداث cytokinetic يمكن أن يؤدي إلى عيوب فصل الخلية والصيغة الصبغية، ويمكن أن تسبب أمراض مثل السرطان 4، 5، 6، 7، 8. المبادئ الأساسية التي تمكن سبأنهم يعتمدون على الأحداث cytokinetic ليست مفهومة جيدا، مما يؤدي إلى حواجز الطرق في فهمنا لمسببات هذه الأمراض.
وpombe السكيراء الانشطار الخميرة (س. pombe) هو نظام نموذجا ممتازا لدراسة الانقسام السيتوبلازمي نظرا لطبيعة الحفظ من البروتينات المشاركة 1. في الخميرة الانشطار، بعد أكتوميوزين التجمع عصابة، عصابة يدخل نضوج / المرحلة يسكن حيث لا يحد 9. نضوج ينتهي مع بدء انقباض حلقة أكتوميوزين، المتزامنة مع سرابات الغشاء وingression الحاجز. أعطت العمل المنوي على مدى السنوات لنا فهم جيد إلى حد ما من أكتوميوزين التجمع حلقة في الانشطار الخميرة 1 و 9 و 10. ، هو التجمع الناجح للحلقة أكتوميوزين في بعض حقيقيات النوى، بما في ذلك الخميرة الانشطار لا يكفي لسرابات الغشاء. في وission الخميرة، حلقة انقباض وحدها لا توفر ما يكفي من القوة للتغلب على ضغط الامتلاء الداخلي لتشكيل ثلم 11. ويشير نموذج مؤخرا أن هذه القوة بدلا المقدمة من الحاجز ingression 11. في نموذج آخر، وقد اقترح دور تمديد غشاء البلازما للمساهمة في ثلم تشكيل 12 و 13. لا يحدث انقباض حلقة وسرابات الغشاء في درجة حرارة Bgs1 / Cps1 cps1-191 متحولة حساسة، الانزيم الرئيسي لتشكيل الحاجز الأساسي 14 و 15. خلايا تفتقر Bgs1 تظهر الحاجز الأساسي معيب ولفترات طويلة انقباض حلقة 15 و 16. يتم تجنيده Bgs1 إلى الموقع انقسام الخلايا لingression الحاجز أثناء النضج بعد أكتوميوزين عصابة التجمع 17 و 18. Similarlذ، خلال cellularization في أجنة ذبابة الفاكهة، حلقة انقباض هو ثنائي الطور مع بطيئة بشكل ملحوظ معدل انقباض الأولي 19، تشبه مرحلة النضج التي لوحظت في الخميرة الانشطار. قد تبطئ ثنائي الطور حلقة انقباض أسفل الغشاء سرابات للسماح كافية توسع غشاء 20 وتعديل المصفوفة خارج الخلية. وهذا يشير إلى أنه بعد أكتوميوزين التجمع عصابة، يحدث انقباض حلقة بكفاءة إلا عندما الخلية قد استوفت متطلبات تشكيل ثلم. ليست مفهومة جيدا ما هي الشروط اللازمة لانقباض حلقة أكتوميوزين بعد التجميع حلقة، ولا الأحداث الجزيئية التي تنظم هذه العملية. لقد أظهرنا مؤخرا أنه في أعقاب حلقة أكتوميوزين التجمع GTPase Cdc42 صغيرة تخضع لعملية فريدة من نوعها الزمانية المكانية نمط تفعيل 21. تم تأسيس هذا النمط من نمط التعريب فريد من Cdc42 العوامل الصرف غوانيدين النوكليوتيدات (GEFs) التي تنشط Cdc42. وGef1 مرفق البيئة العالمية يموضع إلى الحلبة أكتوميوزين تجميعها ويعزز بداية انقباض حلقة وingression الحاجز، بينما يموضع Scd1 إلى غشاء تثليم ويعزز تشكيل حاجز طبيعي. نجد أن نمط تفعيل Cdc42 التي وضعتها GEFs التي تؤدي إلى تنظيم الأحداث cytokinetic متميزة.
لفهم الآلية الجزيئية من الأحداث التي تؤدي في نهاية المطاف إلى فصل الخلية التالية التجمع حلقة أكتوميوزين، ويحتاج المرء لمتابعة الأحداث cytokinetic متميزة في الزمان والمكان. في الخميرة الانشطار، السيتوبلازمي تتضمن أولا تجميع العقد السلائف حول النواة، التي تجند في نهاية المطاف ميوسين من النوع الثاني، وformin Cdc12، وغيرها من البروتينات اللازمة لتجميع حلقة أكتوميوزين. لآخر الأحداث cytokinetic متميزة وتوفير إطار مرجعي، ويعتبر الفصل بين علامات الجسم القطب المغزل (تكوين المغزل) وقتها 0 22. تجميع عشريمكن اتباعها ه حلقة أكتوميوزين من خلال رصد مرور الوقت شدة الموسومة fluorescently أكتوميوزين البروتين حلقة مثل النوع الثاني الميوسين سلسلة ضوء التنظيمي Rlc1. نحن هنا وصف نهج المجهري لتحليل مختلف مراحل الانقسام السيتوبلازمي مع مرور الوقت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد عينة
- زراعة خلايا الخميرة الانشطار معربا عن المغزل القطب الجسم علامة Sad1-mCherry 23 والنوع الثاني الميوسين سلسلة ضوء التنظيمي Rlc1-الطماطم 24 في YE السائلة وسائل الإعلام في 32 درجة مئوية لمدة 8 أجيال.
ملاحظة: للحصول على المسوخ الحساسة درجة الحرارة، وتنمو الخلايا في درجة حرارة 25 درجة مئوية. تنمو الخلايا إلى مرحلة منتصف السجل إلى OD 600 من 0.5 في YE. لمعرفة المزيد عن الانشطار تشير ظروف نمو الخميرة إلى الانشطار الخميرة دليل المختبر 25. - اعدوا (أو الحد الأدنى) وسائل الاعلام مع 0.6٪ الاغاروز (تظهر وسائل الإعلام على أساس الاغاروز الخلفية أقل الفلورسنت بالمقارنة مع أجار). إلى وسائل الإعلام ذاب إضافة 1 ملم من حمض الاسكوربيك (فيتامين C). فيتامين C يروي الجذور الحرة التي تم إصدارها بسبب الصور وتبييض، وبالتالي التقليل من الصور سمية.
- صب 3-4 مل من فيتامين C الذي تغلب عليه اسهم ذاب وسائل الإعلام على لزجاج قاع طبق ثقافة. دع بارد وسائل الاعلام وترسيخ.
لاحظ السمك الزجاج في صحن الثقافة يعتمد على سماكة الغطاء زلة مناسبة للالمجهر. هنا، استخدام ساترة رقم 1.5. - رفع بلطف وسائل الإعلام طدت من الطبق الثقافة مع مساعدة من مشرط حاد. ضع طرف ماصة بين لوح وسائل الإعلام والطبق الثقافة لمنع لوح من الوقوع مرة أخرى في طبق (الشكل 1).
- خذ 1 مل من نمو الخلايا حديثا كما هو موضح في 1.1 أعلاه. تدور الخلايا برفق في 300 x ج لمدة 30 ثانية. تجاهل طاف. resuspend الخلايا في كمية صغيرة من وسائل الاعلام المتبقية التي لا تزال في الأنبوب بعد التخلص من طاف.
- تحميل 2-5 ميكرولتر من زراعة الخلايا معلق بين لوح وسائل الإعلام وأسفل الزجاج من صحن الثقافة. يجب أن تكون الخلايا على الزجاج. غيض ماصة ضعها بين وسائل الإعلام وطبق يتيح سهولة التحميل من زراعة الخلايا.
- جدا إزالة بلطف طرف ماصة ووضع لوح وسائل الإعلام مرة أخرى في موقعه الأصلي على مكعبطبق lture. تأكد لتجنب أي فقاعات الهواء. إذا لزم أن الصحافة برفق فقاعات الهواء عن طريق تحريك الجزء الخلفي من طرف ماصة على أعلى من لوح وسائل الإعلام.
- السماح للخلايا الجلوس في صحن الثقافة لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة في الظلام في درجة الحرارة التي سوف يتم تنفيذها المجهر. وهذا أمر مهم لمنع أي صدمة بسبب تغيير في ظروف نمو للخلايا.
2. الحصول على الصور
- ضع قطرة من الزيت على الجانب الخارجي من الزجاج على طبق الثقافة. مكان الطبق الثقافة على مجهر مقلوب.
- للحد من مضان السيارات من وسائل الإعلام YE استخدام عامل تصفية GFP مع النطاق الموجي الضيق (520-535 نانومتر).
- التركيز على مستوى محوري للخلايا وضمان أن تكون متباعدة بشكل جيد وغير مزدحمة جدا. تأكد لبدء الحصول على الصور من الخلايا في مرحلة مناسبة من دورة الخلية. لهذه التجربة، اتبع الخلايا من أواخر G2.
- البرنامج الحصول على الصور البرمجيات رس اتخاذ GFP، طلب تقديم العروض والصور مدينة دبي للإنترنت من الخلايا.
- لهذه التجربة استخدام 100 زمن التعرض مللي لمدينة دبي للإنترنت و 75 مللي وقت التعرض للGFP وطلب تقديم العروض المرشحات. وقت التعرض يعتمد على إعدادات المجهر، وبروتين قيد الدراسة ومدة التجربة. للحصول على الضبط المجهر معين، استخدام طاقة الليزر 50٪.
- لالتقاط الصور في 3 أبعاد، برنامج البرنامج الحصول على صورة للتصوير Z الحجم. استخدام حجم خطوة من 0.4 ميكرون والمسافة من 3.0 ميكرون (نصف مجموع ض) حول نقطة التركيز الرئيسية للخلايا. وهذا يؤدي الى القبض على 16 Z-لقطة في نقطة زمنية مع المسافة الإجمالية Z من 6 ميكرون.
ملاحظة: Z-سلسلة الحصول على الصور يسمح القبض على الهيئات القطب المغزل.
- التقاط صور كل دقيقة 2. تغيير وقت التعرض وفقا لمتطلبات التجربة. ويمكن أيضا أن وقت التعرض أن تتغير وفقا للبروتين من الفائدة وقوة الإشارة. ومع ذلك، لاحظ أن باختصارإيه فترات أطول أو وقت التعرض الزيادة الصور سمية بسبب التبييض وبالتالي الخلايا يمكن اتباعها فقط لفترة قصيرة.
- الحصول على صور حتى خلايا منفصلة جسديا كما لوحظ من قبل صور مدينة دبي للإنترنت، أو برمجة برنامج لوقف الاستحواذ بعد 90 دقيقة.
تحليل 3. صورة
- التحليل الزمني للأحداث cytokinetic
- باستخدام برنامج الحصول على الصور جعل التوقعات من Z-إطارات لكل نقطة الساعة. جعل ملفات مختلفة لكل طول موجي من صورة المكتسبة.
- تصدير هذا الإسقاط السلاسل الزمنية نقطة كملف TIFF..
- تحليل الصور باستخدام برنامج ImageJ. فتح سلسلة صورة لأي سبب من الأطوال الموجية.
- حدد الخلية المراد دراستها. انقر مرتين على خيار سطر من شريط الأدوات. هذا وسوف تفتح نافذة أخرى لضبط عرض الخط. ضبط عرض الخط لتتوافق مع عرض الخلية. لخلية WT هذا هو حوالي 40 - 50 بكسل. رسم خط على طولمحور طويل من الخلايا في المصالح.
- انقر على تحليل> أدوات> مدير العائد على الاستثمار وانقر على إضافة. هذا سيضيف الخط المحدد إلى إطار العائد على الاستثمار لاستخدامها لاحقا. لا تغلق هذه النافذة.
- اضغط على الصورة لمصلحة واختر تحرير> اختيار> تصويب. هذا وسوف تفتح نافذة أخرى. تحقق "عملية كومة بأكمله". وهذا تصويب الخلية أفقيا.
- انقر على الصورة> تحويل> تدوير 90 درجة إلى اليمين. والآن تقويمها هذه الصورة عموديا.
- انقر على الصورة> الأكوام> جعل المونتاج. هذا وسوف تفتح نافذة لتعيين عدد من الصفوف والأعمدة لالمكدس، عامل مقياس لحجم الصورة، وشريحة الأولى والأخيرة (الإطار) لالمونتاج والزيادة الإطار لالمونتاج. تحقق شرائح التسمية وتصل إلى تدخل.
- كما هو مبين نافذة مع المونتاج الخلية من الفائدة، فتح سلسلة صورة لطول الموجة الآخرين.
- انقر على معرف خط على مدير العائد على الاستثمار. سيؤدي هذا إلى تحديدنفس الخلية على ملف الصورة الثانية. كرر الخطوات من 3.1.6 - 3.1.8. هذا وسوف تفتح مونتاج للصورة الثانية.
- في الصورة مع المغزل علامة الجسم القطب Sad1-mCherry، والبحث عن حلول فصل المغزل علامة الجسم القطب وبمناسبة هذه النقطة الوقت والوقت 0.
- اتبع إشارة Rlc1-الطماطم على الصورة مع مرور الوقت والبحث في إشارة إلى أن يظهر على شكل خط واضح بالمقارنة مع بقع من Rlc1-الطماطم. وتعتبر هذه نقطة وقت الانتهاء من حلقة أكتوميوزين التجميع / بداية مرحلة النضج.
- التمرير المقبل من خلال فيلم مع مرور الوقت لتحديد متى تبدأ حلقة Rlc1-الطماطم في الانخفاض في الحجم. وضعت هذا كما في نهاية نضوج المرحلة / بداية حلقة انقباض.
- اتبع إشارة Rlc1-الطماطم مع مرور الوقت في جميع أنحاء انقباض حتى يبدو وكأنها نقطة في منتصف محور الخلية. وضعت هذا كما في نهاية حلقة انقباض / نهاية ingression الحاجز.
- بعد المونتاج للصور مدينة دبي للإنترنت، وتحديد الخلية الأخيرةانفصال. تسجيل نقطة عند الساعة يفصل الخلية جسديا.
- لالمغزل فصل الجسم القطب قياس المسافة بين الهيئتين القطب المغزل مع مرور الوقت باستخدام أداة سطر في ImageJ. رسم المسافة في الجسم القطب المغزل مع مرور الوقت.
- تسجيل مختلفة الوقت نقاط عن الأحداث cytokinetic مختلفة لحساب مدة كل مرحلة cytokinetic ومقارنة مع الفصل الجسم القطب المغزل مع مرور الوقت.
- التحليل المكاني للأحداث cytokinetic
- حدد خلية مع عصابة أكتوميوزين مرئية. انقر مرتين على خيار سطر من يماغيج شريط الأدوات. هذا وسوف تفتح نافذة أخرى لضبط عرض الخط. ضبط عرض الخط لتتوافق مع سمك الحلقة (15-20 بكسل). رسم خط طول الحلبة مع الحرص على ضمان سمك كامل من الحلقة يتم تضمين.
- انقر على تحليل> أدوات> مدير العائد على الاستثمار وانقر على إضافة. هذا سيضيف الخط المحدد إلى إطار العائد على الاستثمار لاستخدامها لاحقا.لا تغلق هذه النافذة.
- اضغط على الصورة لمصلحة واختر تحرير> اختيار> تصويب. هذا وسوف تفتح نافذة أخرى. تحقق "عملية كومة بأكمله". وهذا تصويب حلقة أفقيا.
- إعادة تعيين كثافة من ألمع الطائرة في ض المكدس تقويمها (من 3.1.6) باستخدام صورة> ضبط> السطوع / التباين> إعادة تعيين.
- انقر فوق علامة التبويب STK> مشروع 3D. هذا وسوف تفتح مربع الحوار. تغيير أسلوب الإسقاط لألمع نقطة والتباعد شريحة إلى 2 أو 3 بكسل. وأخيرا، محور التغيير الدوران إلى X أو Y-محور (هذا سيتغير تبعا لزاوية العرض المطلوب)، انقر فوق أقحم ثم انقر فوق موافق لتوليد الإسقاط 3D من الصورة. استخدام شريط التمرير تحت صورة لتدوير الصورة.
- فتح سلسلة صورة لطول الموجة الأخرى باستخدام يماغيج.
- انقر على معرف خط على مدير العائد على الاستثمار. سيؤدي هذا إلى تحديد نفس العصابة على ملف الصورة الثانية. كرر الخطوات من 4.2.4 و 4.2.5.هذا وسوف تفتح الحلقة 3 الأبعاد في الصورة مع الطول الموجي الآخرين.
- مع كل من الحلقتين صورة 3D مفتوحة، انقر على الصورة> اللون> دمج القنوات. هذا وسوف تفتح مربع. حدد كل صورة من القائمة المنسدلة للون المقابل المطلوب لأسفل وانقر فوق موافق. هذا وسوف تفتح مركب من كل من الصور في أطوال موجية مختلفة.
- مقارنة توطين علامات مختلفة فيما يتعلق التعريب في حلقة cytokinetic أو ingressing الغشاء. Rlc1-GFP هو علامة للحلقة cytokinetic. البروتينات شارك في توطين مع Rlc1-GFP توطين إلى الحلبة بينما البروتينات توطين وراء إشارة Rlc1-GFP توطين لغشاء ingressing.
ملاحظة: هذا البروتين من الفائدة يجب أن يكون من fluorophore مختلفا عن علامة حلقة. - توليد 3 حلقات الأبعاد خلال المراحل المختلفة من الانقسام السيتوبلازمي للمقارنة توطين المكاني من البروتينات عن طريق الانقسام السيتوبلازمي.
- تحليل زعته البروتينيسود تبادل في حلقة cytokinetic
- مقارنة وتحليل توزيع البروتينات طول الحلبة قياس شارك في فعالية من التباين في توزيع البروتين. رفيع شارك في كفاءة التباين يشير التوزيع غير المتكافئ للبروتينات على طول الموقع الانقسام وتشير الجمعية عصابة غير لائق، والنضج أو تشكيل الحاجز، اعتمادا على أي مرحلة من تصوير أو تحليلها.
- باستخدام 3 الأبعاد حلقة cytokinetic أعيد بناؤها (من 3.2.2)، تقسيم الصورة إلى لا يقل عن 4 الأرباع مثل أن ربع من الحلبة ويبدو في كل رباعي. لهذا استخدم أداة خط لرسم خطوط عمودية على الصورة. بعد كل سطر اضغط على الصورة> تراكب> أضف اختيار أو استخدام اختصار الطريق على Ctrl + B.
- الذهاب إلى تحليل> تعيين القياس. تحديد قيمة الرمادي يعني في المربع الذي يفتح. انقر فوق موافق.
- باستخدام الخطوط المرسومة أعلاه، ورسم أدلة مستطيل لتحديد كل رباعي باستخدام أداة المستطيل.
- لقياس كثافة يعني من كل رباعي، انقر فوقعلى تحليل> قياس أو استخدام قطع قصيرة على Ctrl + M.
- تسجيل قيمة الرمادي المتوسط لجميع الأرباع الأربعة (MG 1 -MG 4).
- اختر منطقة صغيرة في كل رباعي خارج الحلبة واختيار خلفية.
- قياس القيمة الرمادي يعني لاختيار خلفية لجميع الأرباع الأربعة (BG 1 -BG 4).
- li> بالنسبة خلفية الطرح لكل استخدام رباعي ما يلي MG formula- 1 متوسط درجات (BG 1: BG 4) = كثافة حلقة في كل رباعي (IRQ). في هذه المرحلة هناك 4 القيم IRQ، واحد لكل رباعي.
- بجانب حساب معامل التباين لكل حلقة باستخدام الانحراف المعياري formula- التالية (IRQ 1: IRQ 4) / متوسط (IRQ 1: IRQ 4). حساب المتوسط المشارك كفاءة التباين لكل سلالة ومقارنتها مع سلالات أخرى.
ملاحظة: زيادة ذات دلالة إحصائية في المشترك كفاءة التباين في سلالة مقارنة مع الضوابط INDicates متفاوتة من البروتين توزيع / تسليم على طول الموقع الانقسام في هذه المرحلة من الانقسام السيتوبلازمي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خلايا الانشطار الخميرة معربا عن علامة حلقة، تم تصوير Rlc1-GFP (أخضر، الشكل 2) والمغزل علامة الجسم القطب Sad1-mCherry (أحمر، الشكل 2) أثناء الانقسام السيتوبلازمي. بداية المغزل علامة الجسم القطب (السهم الأبيض، أرقام 2A، B) يعتبر الوقت يبدو 0. إشارة Rlc1-GFP في وقت -4 دقائق مع الإشارة إلى المغزل فصل الجسم القطب (السهم الأحمر، أرقام 2A، 2B). إشارة Rlc1-GFP تشكل مستمر حلقة 10 دقيقة بعد المغزل فصل القطب الجسم (السهم مفتوحة، أرقام 2A، B) بمناسبة انتهاء التجمع حلقة أكتوميوزين. الحلقة أكتوميوزين (Rlc1-GFP) تبدأ في الانخفاض في العرض 22 دقيقة بعد الانتهاء من التجمع عصابة و 32 دقيقة بعد المغزل فصل الجسم القطب (رأس السهم مغلق، أرقام 2A، B). حلقة انقباض ينتهي 20 دقيقة بعد بداية انقباض، 42 دقيقة منذ بداية التجمع عصابة و 52 دقيقة منذ انفصال الجسم القطب المغزل (asteris البيضاءك، أرقام 2A، B). وأخيرا، يحدث إنقطاع مفاجئ خلية 72 دقيقة بعد المغزل فصل القطب الجسم (رأس السهم الأحمر، أرقام 2A، B).
وقد تم تحليل توطين علامة حلقة Rlc1-الطماطم والغشاء الحاجز علامة Bgs1-GFP في الموقع تقسيم في السيتوبلازمي. كشفت 3D إعادة بناء الخاتم الذي حلقة أكتوميوزين ملحوظ مع Rlc1-الطماطم تجميعها قبل التوظيف Bgs1-GFP (الشكل 3، 10 دقيقة). خلال مرحلة النضج حلقة تم تجنيده Bgs1-GFP إلى الموقع الانقسام وتتداخل مع عصابة أكتوميوزين كما هو مبين من قبل Rlc1-الطماطم (الشكل 3، 30 دقيقة). هذا يدل على أن Bgs1 يموضع إلى الحلبة عند تعيينهم. كما يضيق الحلقة، يموضع Bgs1-GFP أيضا على غشاء ingressing المتاخمة للحلقة تشنجا (الشكل 3، 40 دقيقة). في نهاية انقباض، إشارة Bgs1-GFP مرئيا في باري غشاء ingressedإيه (الشكل 3، 50 دقيقة). أخيرا، وبعد انقباض إشارة Rlc1-الطماطم غائبة، في حين يبدو Bgs1-GFP لحصر جميع أنحاء حاجز الغشاء مع قرص ظهور مثل (الشكل 3، 60 دقيقة). وبالتالي هذه الملاحظات تشير إلى أن إنزيم الحاجز توليف Bgs1 يموضع إلى الحلبة بعد التجميع واستمرت بعد انقباض حلقة في حاجز الغشاء كما تردد قبل 17 عاما.
تم تحليل توزيع البروتينات على طول حلقة أكتوميوزين لتحديد كفاءة الأحداث cytokinetic (الشكل 4). ارتبط التوزيع غير المتكافئ أو nonhomogenous من البروتينات طول الحلبة أكتوميوزين مع إشارات ضعف وعدم كفاءة cytokinetic حلقة تجميع 26. نحن هنا تظهر حلقتين 3D بناؤها خلال مرحلة النضج، معربا عن البروتين F-بار Cdc15-GFP (الشكل 4). الصورةعلى اليسار يظهر حتى توزيع Cdc15-GFP طول الحلبة مع انخفاض معامل التباين (0.098)، في حين أن الصورة في اليمين يظهر التوزيع غير المتكافئ مع ارتفاع معامل التباين (0.226، الشكل 4).
الشكل 1: إعداد صحن الثقافة للتصوير. التخطيطي التلقيح واصفا من الخلايا في الزجاج قاع طبق ثقافة مضافين مع لوحة وسائل الإعلام. انظر بروتوكول للحصول على التفاصيل (القسم 1). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 توقيت Cytokinetic الأحداث في S. pombe. (A) المونتاج خلية معربا عن spindlالبريد القطب الجسم علامة Sad1-mCherry (اللوحة اليسرى) والبروتين حلقة Rlc1-GFP (وسط لوحة) ومشرق الميدان (اللوحة اليمنى) يظهر تمر السيتوبلازمي في فترات دقيقة 2. السهام البيضاء تمثل محور القطب الجسم (الجسيم المركزي) الفصل في 17 دقيقة، السهم الأحمر يمثل التوظيف الأولي من Rlc1-GFP في موقع الانقسام، وفتح علامات السهم حلقة النضج في 27 دقيقة، رأس السهم يمثل بداية حلقة انقباض في 47 دقيقة، وعلامات النجمة نهاية حلقة انقباض في 69 دقيقة، ورأس السهم الأحمر علامات إنقطاع مفاجئ خلية في 97 دقيقة. (ب) الجدول الزمني للأحداث cytokinetic مع الإشارة إلى الانقسام كما تحدد من قبل تشكيل الجسم القطب المغزل والانفصال. تم تصوير الخلايا عند 25 درجة مئوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: CEليرة لبنانية قسم الموقع خلال مراحل مختلفة من الانقسام السيتوبلازمي. إعادة الإعمار 3D من حلقة أكتوميوزين Z-مداخن خلال مراحل مختلفة من الانقسام السيتوبلازمي لنفس الخلية، خاتم التجمع (10 وظيفة دقيقة القطب المغزل فصل الجسم)، والنضج حلقة (30 دقيقة فصل آخر المغزل القطب الجسم)، حلقة انقباض (40 دقيقة بعد المغزل القطب فصل الجسم)، نهاية انقباض (50 دقيقة بعد القطب المغزل فصل الجسم)، وحاجز الحاجز (60 دقيقة بعد القطب المغزل فصل الجسم). يصادف Rlc1-الطماطم حلقة في حين يمثل Bgs1-GFP غشاء البلازما تخيم على الحاجز. شريط مقياس = 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: توزيع البروتينات على طول الدائري. صور 3D إعادة بنائها حلقة أكتوميوزين من نوع البرية جملتعلمي اللغة اإلنكليزية معربا عن Cdc15-GFP مقسمة إلى أربعة أجزاء. وذكر المشارك الفعال للتباين كل حلقة. شريط مقياس = 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا وصفناها بروتوكول لدراسة الأحداث cytokinetic في الخميرة الانشطار بطريقة الزمنية. بروتوكول الموصوفة هنا يوفر القرار الزماني للأحداث cytokinetic مختلفة مع الإشارة إلى بعضها البعض. توقيت التوظيف البروتين أو الخسارة مع الإشارة إلى مرحلة cytokinetic. هيكل حلقة طوال المراحل المختلفة من الانقسام السيتوبلازمي. وتطور الانقسام السيتوبلازمي مع الإشارة إلى الانقسام. مع هذا البروتوكول أنه من الممكن أن تحدد بدقة المرحلة cytokinetic التي يمكن أن تتغير في المسوخ مختلفة، وبالتالي توفير فهم أكثر تفصيلا من البروتينات المشاركة في مراحل cytokinetic مختلفة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن القدرة على التمييز زمنيا مراحل cytokinetic مختلف تمكين تحليل الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى تنظيم مراحل cytokinetic مختلفة. تمكن قرار الزمني للأحداث cytokinetic مختلفة أيضا تحليل cytokinetic هيكل حلقة والبروتينات التوزيعطوال أحداث مختلفة. توطين الزمانية المكانية للبروتينات مختلفة يمكن مقارنتها وتحليلها مع هذا النهج. مع استخدام fluorophores المناسبة، والبروتينات متعددة يمكن دراستها ومقارنتها مع بعضها البعض. وبالإضافة إلى ذلك هنا وصفناها أيضا كيف يمكن تحليل توزيع البروتينات على طول الحلبة لتحديد منظمة البروتين أو تسليم في موقع الانقسام. في حين أن بروتوكول الموصوفة هنا ينطبق على الانشطار الخميرة السيتوبلازمي، ويمكن أيضا أن تستخدم هذا النهج لدراسة الانقسام السيتوبلازمي في الخمائر الأخرى والفطريات مع التغييرات المناسبة لظروف النمو والتصوير.
ويشمل هذا البروتوكول التصوير الحية الخلايا كما أنها تقسم. الخلايا تصويرها باستخدام هذا البروتوكول بحاجة الى ان تنمو تحت الظروف المثلى لتجنب أي آثار pleotropic. وينبغي الحرص على عدم حشد الخلايا في مجال الرؤية، والخلايا الزائدة قد تؤدي إلى فقدان المواد الغذائية السريعة. وبالإضافة إلى ذلك fluorophores التصوير في الخلايا يؤدي إلى تسمم بسبب مجاناالجذور أفرجت نتيجة الصورة تبيض. يمكن التقليل من هذا مع إضافة مركب التبريد الجذور الحرة مثل حمض الاسكوربيك. إضافة حمض الاسكوربيك تسمح التصوير لفترات طويلة من الخلايا تحت المجهر. خلال الحصول على الصور، كامل Z-محور الخلية يحتاج إلى تصوير لضمان القبض على الهيئات القطب المغزل. وعدم وجود إشارة مناسبة للهيئات القطب المغزل لا تسمح القرار الزماني الصحيح من الانقسام السيتوبلازمي. على وجه الخصوص، ينبغي الحرص على وجه التحديد صورة الفصل الأول من علامات الجسم القطب المغزل لأن هذا هو الوقت 0. التقاط السليم للخلايا على طول المحور Z أمر بالغ الأهمية أيضا لمناسبة 3 إعادة البناء الأبعاد من الخواتم وحواجز.
لصورة المقاطع العرضية من حلقات وحواجز، وبروتوكول الموصوفة هنا يمكن تعديلها مع بئر microfabricated التي تسمح للخلايا الخميرة الانشطار على شكل قضيب لتكون مكان عموديا للتصوير على طول المحور الطويل للمليرة لبنانية كما تم الإبلاغ عن هنا 27. في حين أن هذا البروتوكول يمكن التقاط بدقة متناهية تجنيد البروتين والتعريب مع مرور الوقت في موقع انقسام الخلية القرار المكاني للصور محدودة نظرا لدقة من الاداة المستخدمة. فائقة الدقة المجهري قد تساعد على تحسين القرار المكانية ولكن قد يؤثر على قرار الزمني. التطورات الحديثة في الفحص المجهري مثل شعرية المجهر ورقة خفيفة قد تساعد على تحسين القرار المكانية دون المساس القرار الزماني 28. وبالاضافة الى المجهر الضوئي، السيتوبلازمي في الخميرة الانشطار يمكن أيضا أن تدرس على مر الزمن باستخدام رامان الطيفي 29، 30.
باستخدام هذا النهج الذي قد ذكرت أن GTPase Cdc42 صغير يخضع لنمط تفعيل الزمانية المكانية فريدة من نوعها خلال الانقسام السيتوبلازمي 21. هذا النهج تمكننا من دراسة تنظيم الحدث cytokinetic مختلفةعلى مر الزمن، ووصف التفاصيل الجزيئية لهذه الأحداث. وأشارت تقارير إلى أن وجود حلقة أكتوميوزين تجميعها وحدها ليست كافية لكفاءة سرابات الغشاء السيتوبلازمي و11، 21، 31. بروتوكول الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم للتحقيق في الأحداث الجزيئية التي تؤدي إلى الانقسام السيتوبلازمي الصحيح بعد التجميع حلقة أكتوميوزين. وبالإضافة إلى ذلك، على سلامة حلقة أكتوميوزين وتأثيرها على سرابات الغشاء وingression الحاجز يمكن فحص. هذا وسوف توفر فهما أعمق للأحداث الجزيئية المختلفة التي تؤدي معا إلى فصل ناجحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract media | Sunrise Science Products | YES 225 | 0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine |
| Agarose | SeaKem LE agarose, Lonza | 50001 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Glass Bottomed culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used. |
| VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system | Visitech International, UK | with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu). | |
| ImageJ | NIH | Image analysis software |
References
- Pollard, T. D.
- Guertin, D. A., Trautmann, S., McCollum, D.
- Xu, X., Vogel, B. E. A secreted protein promotes cleavage furrow maturation during cytokinesis. Curr Biol. 21 (2), 114-119 (2011).
- Sagona, A. P., Stenmark, H.
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437 (7061), 1043-1047 (2005).
- Li, R. Cytokinesis in development and disease: variations on a common theme. Cell Mol Life Sci. 64 (23), 3044-3058 (2007).
- Daniels, M. J., Wang, Y., Lee, M., Venkitaraman, A. R. Abnormal cytokinesis in cells deficient in the breast cancer susceptibility protein BRCA2. Science. 306 (5697), 876-879 (2004).
- Storchova, Z., Pellman, D. From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (1), 45-54 (2004).
- Lee, I. J., Coffman, V. C., Wu, J. Q. Contractile-ring assembly in fission yeast cytokinesis: Recent advances and new perspectives. Cytoskeleton (Hoboken). 69 (10), 751-763 (2012).
- Balasubramanian, M. K., Bi, E., Glotzer, M. Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells. Curr Biol. 14 (18), R806-R818 (2004).
- Proctor, S. A., Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Contributions of turgor pressure, the contractile ring, and septum assembly to forces in cytokinesis in fission yeast. Curr Biol. 22 (17), 1601-1608 (2012).
- Munoz, J., et al. Extracellular cell wall beta(1,3)glucan is required to couple septation to actomyosin ring contraction. J Cell Biol. 203 (2), 265-282 (2013).
- Wang, N., Lee, I. J., Rask, G., Wu, J. Q. Roles of the TRAPP-II Complex and the Exocyst in Membrane Deposition during Fission Yeast Cytokinesis. PLoS Biol. 14 (4), e1002437 (2016).
- Liu, J., Wang, H., McCollum, D., Balasubramanian, M. K. Drc1p/Cps1p, a 1,3-beta-glucan synthase subunit, is essential for division septum assembly in Schizosaccharomyces pombe. Genetics. 153 (3), 1193-1203 (1999).
- Cortes, J. C., et al. The (1,3)beta-D-glucan synthase subunit Bgs1p is responsible for the fission yeast primary septum formation. Mol Microbiol. 65 (1), 201-217 (2007).
- Cortes, J. C., et al. Cooperation between Paxillin-like Protein Pxl1 and Glucan Synthase Bgs1 Is Essential for Actomyosin Ring Stability and Septum Formation in Fission Yeast. PLoS Genet. 11 (7), e1005358 (2015).
- Cortes, J. C., Ishiguro, J., Duran, A., Ribas, J. C. Localization of the (1,3)beta-D-glucan synthase catalytic subunit homologue Bgs1p/Cps1p from fission yeast suggests that it is involved in septation, polarized growth, mating, spore wall formation and spore germination. J Cell Sci. 115 (Pt 21), 4081-4096 (2002).
- Liu, J., Tang, X., Wang, H., Oliferenko, S., Balasubramanian, M. K. The localization of the integral membrane protein Cps1p to the cell division site is dependent on the actomyosin ring and the septation-inducing network in Schizosaccharomyces pombe. Mol Biol Cell. 13 (3), 989-1000 (2002).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15 (2), 838-850 (2004).
- Figard, L., Xu, H., Garcia, H. G., Golding, I., Sokac, A. M. The plasma membrane flattens out to fuel cell-surface growth during Drosophila cellularization. Dev Cell. 27 (6), 648-655 (2013).
- Wei, B., et al. Unique Spatiotemporal Activation Pattern of Cdc42 by Gef1 and Scd1 Promotes Different Events during Cytokinesis. Mol Biol Cell. , (2016).
- Nabeshima, K., et al. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9 (11), 3211-3225 (1998).
- Johnson, A. E., Gould, K. L. Dma1 ubiquitinates the SIN scaffold, Sid4, to impede the mitotic localization of Plo1 kinase. EMBO J. 30 (2), 341-354 (2011).
- Yonetani, A., Chang, F.
- Fission Yeast: A laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
- Hachet, O., Simanis, V. Mid1p/anillin and the septation initiation network orchestrate contractile ring assembly for cytokinesis. Genes Dev. 22 (22), 3205-3216 (2008).
- Zhou, Z., et al. The contractile ring coordinates curvature-dependent septum assembly during fission yeast cytokinesis. Mol Biol Cell. 26 (1), 78-90 (2015).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Huang, Y. S., Karashima, T., Yamamoto, M., Hamaguchi, H. O. Molecular-level investigation of the structure, transformation, and bioactivity of single living fission yeast cells by time- and space-resolved Raman spectroscopy. Biochemistry. 44 (30), 10009-10019 (2005).
- Huang, C. K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging. Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).
- Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe. Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).
