Summary
Den fission gær, Schizosaccharomyces pombe er en fremragende model til undersøgelse cytokinese, den sidste fase i celledeling. Her beskriver vi en mikroskopi tilgang til at analysere forskellige cytokinetic begivenheder i levende fission gærceller.
Abstract
Cytokinese, det sidste skridt i celledeling er afgørende for at opretholde genom integritet. Korrekt cytokinese er vigtig for celledifferentiering og udvikling. Cytokinese involverer en række begivenheder, der er godt koordineret i tid og rum. Cytokinese involverer dannelsen af en actomyosin ring i division site, efterfulgt af ring konstriktion, membran fure dannelse og ekstracellulær matrix remodellering. Den fission gær, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) er en velundersøgte modelsystem, der har afsløret med betydelig klarhed de indledende begivenheder i cytokinese. Men vi forstår ikke helt, hvordan forskellige cytokinetic begivenheder koordineres spatiotemporally. For at afgøre dette, er man nødt til at analysere de forskellige cytokinetic begivenheder i store detaljer i både tid og rum. Her beskriver vi en mikroskopi tilgang til at undersøge forskellige cytokinetic evenser i levende celler. Med denne fremgangsmåde er det muligt at tid forskellige cytokinetic begivenheder og bestemme tidspunktet for rekruttering af forskellige proteiner under cytokinese. Desuden beskriver vi protokoller til at sammenligne proteinlokalisering og distribution på stedet for celledeling. Dette er en grundlæggende protokol for at studere cytokinese i fission gær og kan også anvendes til andre gær og fungale systemer.
Introduction
Cytokinese, det sidste trin i celledeling, er en kompleks proces med henblik på forsvarlig differentiering, udvikling og overlevelse af en organisme. Cytokinese involverer flere hændelser, der er organiseret til at sikre en vellykket celleseparation samtidig bevare genomisk integritet 1. Cytokinese involverer arrangementer, hvor en actomyosin ring er samlet undergår konstriktion, som er sideløbende med membran ekspansion og furer, og ekstracellulær matrix remodellering endelig efterfulgt af celle abscission 1, 2, 3. Forkert organisering af cytokinetic hændelser kan føre til celle separations- og ploidi defekter, og kan forårsage sygdomme som kræft 4, 5, 6, 7, 8. De grundlæggende principper, der muliggør organization af cytokinetic begivenheder er ikke godt forstået, hvilket fører til vejspærringer i vores forståelse af ætiologien af disse sygdomme.
Den fission gær Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) er en fremragende model til undersøgelse cytokinese grundet den konserverede beskaffenhed af de involverede 1 proteiner. I fission gær, efter actomyosin ring samling, ringen ind i en modning / dvæle fase, hvor det ikke snøre 9. Modning slutter med initiering af actomyosin ring konstriktion, samtidig med membran furer og septum indtrængen. Seminal arbejde gennem årene har givet os en rimelig god forståelse for actomyosin ring forsamling i fission gær 1, 9, 10. I nogle eukaryoter, herunder fission gær, vellykket samling af actomyosin ring er ikke tilstrækkelig til membran furer. I fission gær, ring konstriktion alene giver ikke tilstrækkelig kraft til at overvinde intern saftspændingen for fure dannelse 11. En nylig model indikerer, at denne kraft i stedet leveres af septum indtrængen 11. I en anden model, har den rolle, plasmamembranen udvidelse blevet foreslået at bidrage til fure formation 12, 13. Ring konstriktion og membran furer ikke forekommer i Bgs1 / CPS1 temperaturfølsom mutant cps1-191, de store enzym til primær septum dannelse 14, 15. Celler, der mangler Bgs1 viser defekt primære septum og langvarig ring konstriktion 15, 16. Bgs1 rekrutteres til celledeling site for septum indtrængen under modning efter actomyosin ring samling 17, 18. Similarly, under cellularization i Drosophila embryoer, ring konstriktion er bifasisk med en signifikant langsom indledende konstriktion sats 19, ligner modningsfasen observeret i fission gær. Bifasisk ring konstriktion kan bremse membran furer at give mulighed for tilstrækkelig membran udvidelse 20 og ændring af ekstracellulær matrix. Dette antyder, at efter actomyosin ring samling, ring konstriktion sker effektivt, når cellen har opfyldt kravene for fure formation. Det er ikke godt forstået hvilke betingelser er nødvendige for actomyosin ring konstriktion efter ringsamlingen, eller de molekylære begivenheder, der regulerer denne proces. Vi har for nylig vist, at følgende actomyosin ring forsamling den lille GTPase Cdc42 gennemgår en unik Spatiotemporal aktivering mønster 21. Dette mønster er etableret ved den unikke lokalisering mønster af cdc42 guanidin nukleotid exchange faktorer (GEFs), der aktiverer Cdc42. GEF Gef1 lokaliseres til den samlede actomyosin ring og fremmer indtræden af ring konstriktion og septum indtrængen, mens SCD1 lokaliseres til furer membran og fremmer normal septum formation. Vi finder, at Cdc42 aktivering mønster indført ved dens GEFs fører til regulering af forskellige cytokinetic begivenheder.
For at forstå den molekylære mekanisme af begivenheder, der i sidste ende fører til celleseparation efter actomyosin ringsamlingen, er man nødt til at følge de forskellige cytokinetic begivenheder i tid og rum. I fission gær, cytokinese først involverer samling af precursor-knudepunkter omkring kernen, som i sidste ende rekrutterer type II myosin, den formin Cdc12, og andre proteiner, der er nødvendige for actomyosin ringaggregat. Til tid distinkte cytokinetic begivenheder og giver en referenceramme, er adskillelsen af spindel pole krop markører (spindel dannelse) betragtes som tiden 0 22. Samlingen af the actomyosin ring kan følges ved overvågning over tid intensiteten af en fluorescens mærkede actomyosin ring protein, såsom type II myosin regulatoriske let kæde Rlc1. Her beskriver vi en mikroskopisk fremgangsmåde til at analysere forskellige stadier af cytokinese over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af prøven
- Grow fission gærceller der udtrykker spindelpol-legemer markør Sad1-mCherry 23 og type II myosin regulatoriske let kæde Rlc1-Tomato 24 i YE flydende medier ved 32 ° C i 8 generationer.
BEMÆRK: temperaturfølsomme mutanter, vokser celler ved 25 ° C. Grow celler til midten logaritmisk fase til en OD 600 på 0,5 i YE. For mere om fission betingelser gær vækst refererer til fission gær lab manual 25. - Forbered YE (eller minimale) medier med 0,6% agarose (agarose baserede medier viser mindre fluorescerende baggrund i forhold til agar). Til den smeltede medier tilsættes 1 mM ascorbinsyre (vitamin C). C-vitamin slukker frie radikaler, der er udgivet på grund af foto-blegning, hvilket minimerer foto-toksicitet.
- Hæld 3 - 4 ml af C-vitamin snøret smeltet medier på en glas bund dyrkningsskål. Lad medierne afkøle og størkne.
BEMÆRK:tykkelse af glasset i dyrkningsskålen afhænger dækglasset tykkelse egnet til mikroskopet. Her bruge dækglas No. 1.5. - Hæv forsigtigt den størknede medier fra dyrkningsskålen ved hjælp af en skarp skalpel. Placer en pipettespids mellem medierne plade og dyrkningsskålen for at forhindre pladen i at falde tilbage i skålen (figur 1).
- Tag 1 ml frisk voksende celler som beskrevet i 1.1 ovenfor. Spin cellerne forsigtigt ved 300 xg i 30 s. Supernatanten kasseres. Resuspender cellerne i den lille mængde af resterende medier, der forbliver i røret efter bortkastning af supernatanten.
- Load 2 - 5 pi af resuspenderet cellekultur mellem medierne plade og glasset bunden af dyrkningsskålen. Cellerne bør være på glasset. Pipettespidsen placeret mellem medierne og skålen muliggør let fyldning af cellekulturen.
- Meget forsigtigt fjerne pipettespidsen og placer medierne plade tilbage i sin oprindelige position på culture skålen. Sørg for at undgå luftbobler. Om nødvendigt tryk forsigtigt ud luftboblerne ved at skubbe bagsiden af en pipettespids oven på medierne slab.
- Lad cellerne sidde i dyrkningsskålen i 30 minutter til en time i mørke ved den temperatur, ved hvilken mikroskopi vil blive udført. Det er vigtigt at undgå enhver chok som følge af ændring i vækstbetingelserne for cellerne.
2. Image Acquisition
- Placer en dråbe olie på den ydre side af glasset på dyrkningsskålen. Placer dyrkningsskålen på et omvendt mikroskop.
- For at minimere auto fluorescens af YE medier anvende en GFP-filter med et snævert bølgelængdeområde (520 - 535 nm).
- Fokus på den mediale plan cellerne og sikre, at de er godt fordelt og ikke for overfyldt. Sørg for at starte erhvervelse af cellerne billede i egnet fase af cellecyklussen. Til dette forsøg, følger celler fra sen G2.
- Program købet billedsoftware to tage GFP, RFP og DIC billeder af cellerne.
- Til dette eksperiment bruge 100 ms eksponering tid til DIC og 75 ms eksponering tid for GFP og RFP filtre. Eksponeringstiden afhænger af indstillingerne i mikroskopet, proteinet under undersøgelse og varigheden af forsøget. For de givne mikroskop indstillinger, bruge 50% laser magt.
- At tage billeder i 3 dimensioner, program billedet erhvervelse software til Z-skala billeddannelse. Brug en trinstørrelse på 0,4 um og en afstand på 3,0 um (halvdelen af den samlede z) omkring den centrale fokuspunkt af cellerne. Dette fører til fangst af 16 Z-frames per tidspunkt med en samlet Z strækning på 6 um.
BEMÆRK: Z-series billede erhvervelse tillader indfangning af spindel-legemer.
- Tag billeder hver 2 min. Ændre eksponeringstiden i henhold til kravene for eksperimentet. Eksponeringstiden kan også ændres i henhold til proteinet af interesse og signalstyrke. Bemærk dog, at kortis intervaller eller længere eksponeringstid stigning foto-toksicitet, der skyldes blegning og dermed celler kan følges kun for en kort tid.
- Anskaf billeder indtil cellerne fysisk adskilte som observeret af DIC billeder, eller programmere software til at stoppe erhvervelse efter 90 min.
3. Image Analysis
- Temporal analyse af cytokinetic begivenheder
- Brug af købet billedet software gør fremskrivninger af Z-rammer for hvert tidspunkt. Lav forskellige filer for hver bølgelængde på billedet erhvervet.
- Eksporter denne fremskrivning tid-point serien som et .tiff fil.
- Analyser billederne ved hjælp ImageJ software. Åbn billedet serie for ethvert af de bølgelængder.
- Vælg en celle, der skal undersøges. Dobbeltklik på linjen mulighed for værktøjslinjen. Dette vil åbne et andet vindue for at justere linjebredde. Juster linjebredde at svare til cellen bredde. For en WT celle dette er omkring 40-50 pixels. Tegn en linje langslange akse af cellen af interesse.
- Klik på Analyser> Værktøjer> ROI Manager og klik på add. Dette vil tilføje den valgte linje til vinduet ROI til brug senere. Luk ikke dette vindue.
- Klik på billedet af interesse, og vælg Rediger> Valg> Ret. Dette vil åbne et andet vindue. Check "Proces hele stakken". Dette vil rette cellen vandret.
- Klik på Billede> Transformer> Roter 90 grader til højre. Dette billede er nu rettet lodret.
- Klik på Billede> Stakke> Make Montage. Dette vil åbne et vindue for at tildele antallet af rækker og kolonner for stakken, omfanget faktor for billedets størrelse, den første og sidste skive (ramme) for montage og rammen tilvækst for montage. Kontroller etiketten skiver og tryk enter.
- Som et vindue med en montage af cellen af interesse er vist, åbne billedet serie for den anden bølgelængde.
- Klik på linjen id på ROI manager. Dette vil vælgeden samme celle på den anden billedfil. Gentag trin 3.1.6 - 3.1.8. Dette vil åbne en montage af det andet billede.
- På billedet med spindel pole krop markør Sad1-mCherry, kigge efter indtræden af adskillelse af spindlen pole krop markør og markere, at tidspunkt som tiden 0.
- Følg Rlc1-tomat-signal på billedet over tid og se efter det signal, der vises som en særskilt linje i modsætning til pletter af Rlc1-tomat. Denne gang-punkt markerer afslutningen af actomyosin ringsamlingen / start modningsfasen.
- Næste rulle gennem filmen over tid til at afgøre, hvornår Rlc1-tomat ring begynder at falde i størrelse. Dette er markeret som afslutningen på modningsfasen / indtræden af ring konstriktion.
- Følg Rlc1-Tomato signal over tid i løbet konstriktion indtil den vises som en prik i midten af cellen akse. Dette er markeret som i slutningen af ringen konstriktion / ende af skillevæggen indtrængen.
- Efter montage af DIC billeder, fastlægge den endelige celleadskillelse. Notér tidspunkt når cellen fysisk adskiller.
- For spindelpol-legemer separation måle afstanden mellem de to spindelpol organer over tid under anvendelse af linjen værktøjet i ImageJ. Plot afstanden i spindel pole krop over tid.
- Optag de forskellige tidspunkter for de forskellige cytokinetic begivenheder til at beregne varigheden af hver cytokinetic fase og sammenligne med spindel pole krop adskillelse over tid.
- Rumlig analyse af cytokinetic begivenheder
- Vælg en celle med en synlig actomyosin ring. Dobbeltklik på linjen mulighed for ImageJ værktøjslinjen. Dette vil åbne et andet vindue for at justere linjebredde. Juster linjebredde at svare til ringen tykkelse (15 - 20 pixels). Tegn en linje langs ringen idet det sikres hele tykkelsen af ringen er inkluderet.
- Klik på Analyser> Værktøjer> ROI Manager og klik på add. Dette vil tilføje den valgte linje til vinduet ROI til brug senere.Luk ikke dette vindue.
- Klik på billedet af interesse, og vælg Rediger> Valg> Ret. Dette vil åbne et andet vindue. Check "Proces hele stakken". Dette vil rette ringen vandret.
- Nulstil intensiteten af den lyseste flyet i udrettet z-stak (fra 3.1.6) ved hjælp af Image> Juster> Lysstyrke / Kontrast> Nulstil.
- Klik på fanen Stk> 3D Project. Dette vil åbne en dialogboks. Skift projektion metode til lyseste punkt og Slice afstanden til 2 eller 3 pixels. Endelig ændre rotationsakse til X eller Y-akse (dette vil ændre sig afhængigt af den ønskede betragtningsvinkel), klik interpolere og klik på OK for at generere en 3D-projektion af billedet. Brug rullepanelet under billedet for at rotere billedet.
- Åbn billedet serie for den anden bølgelængde ved hjælp ImageJ.
- Klik på linjen id på ROI manager. Dette vil vælge den samme ring på den anden billedfil. Gentag trin 4.2.4 og 4.2.5.Dette vil åbne en 3 dimensionelle ring i billedet med den anden bølgelængde.
- Med både 3D billede ringe åbne, skal du klikke på Billede> Farve> Flet Kanaler. Dette vil åbne en kasse. Vælg hvert billede fra drop down menuen for den tilsvarende farve ønskes, og klik på OK. Dette vil åbne en sammensætning af begge billeder ved forskellige bølgelængder.
- Sammenlign lokaliseringen af forskellige markører med hensyn til lokalisering på cytokinetic ring eller indtrængende membran. Rlc1-GFP er en markør for cytokinetic ring. Proteiner co-lokalisere med Rlc1-GFP lokalisere til ringen, mens proteiner lokalisere bag Rlc1-GFP signal lokalisere til den indtrængende membran.
BEMÆRK: Proteinet af interesse skal være af en anden fluorofor end ringen markør. - Generere 3-dimensionelle ringer under forskellige stadier af cytokinese at sammenligne den rumlige lokalisering af proteinerne gennem hele cytokinese.
- Analyse af protein distriling på cytokinetic ring
- At sammenligne og analysere fordelingen af proteiner langs ringen måle koefficienten af varians af protein distribution. En høj koefficient af varians angiver ujævn fordeling af proteiner langs division website og foreslår ukorrekt ringsamlingen, modning eller septum formation, afhængigt af hvilken fase afbildes eller analyseres.
- Brug tre dimensionelle rekonstrueret cytokinetic ring (fra 3.2.2), opdele billedet i mindst 4 kvadranter sådan, at en fjerdedel af ringen vises i hver kvadrant. Til denne anvendelse linjen til at tegne vinkelrette linier på billedet. Efter hver linje klik Image> Overlay> Tilføj valg eller bruge genvej Ctrl + B.
- Gå til Analyser> Indstil måling. Vælg middelværdi grå værdi i den boks, der åbnes. Klik på OK.
- Brug af linjer tegnet ovenfor som guider tegne et rektangel for at definere hver kvadrant ved hjælp rektangelværktøjet.
- For at måle Mean intensiteten af hver kvadrant, klikpå Analyser> Mål eller bruge genvej Ctrl + M.
- Gennemsnitsværdien grå værdi for alle fire kvadranter (MG 1 -mg 4).
- Vælg et lille område i hver kvadrant udenfor ringen som baggrund udvælgelse.
- Mål middelværdi grå værdi for Background valg for alle fire kvadranter (BG 1 -BG 4).
- li> For baggrund subtraktion for hver kvadrant brug følgende formulering MG 1 -Gennemsnitlig (BG 1: BG 4) = Intensitet ring i hver kvadrant (IRQ). På dette stadium er der 4 IRQ værdier, en for hver kvadrant.
- Næste beregne koefficienten af varians for hver ring ved hjælp af følgende formulering Standardafvigelse (IRQ 1: IRQ 4) / Gennemsnitlig (IRQ 1: IRQ 4). Beregn gennemsnit Koefficient variansanalyse for hver stamme og sammenlign de andre stammer.
BEMÆRK: En statistisk signifikant stigning i koefficient af varians i en stamme i forhold til kontroller INDicates ujævn protein distribution / levering langs division webstedet i denne fase af cytokinese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fission gærceller der udtrykker ringen markering, blev Rlc1-GFP (grønt, figur 2) og spindelpol-legemer markør Sad1-mCherry (rød, figur 2) afbildes under cytokinese. Indtræden af spindelpol-legemer markør (hvid pil, figur 2A, B) betragtes som tid 0. Rlc1-GFP signal vises på tidspunkt -4 minutter med henvisning til spindelpol-legemer separation (rød pil, figur 2A, 2B). Rlc1-GFP signal danner en kontinuerlig ring 10 min efter spindelpol-legemer separation (uudfyldt pil, figur 2A, B) markerer afslutningen på actomyosin ringaggregat. Den actomyosin ring (Rlc1-GFP) begynder at falde i bredden 22 min efter afslutning af ringsamlingen og 32 min efter spindelpol-legemer separation (lukket pilespids, figur 2A, B). Ring konstriktion ender 20 min efter indtræden af konstriktion, 42 min siden indtræden af ringsamlingen og 52 min siden spindelpol-legemer separation (hvide Asterisk, Figur 2A, B). Endelig celle abscission opstår 72 minutter efter spindelpol-legemer separation (rød pilespids, figur 2A, B).
Lokaliseringen af ringen markør Rlc1-Tomat og septum membran markør Bgs1-GFP blev analyseret ved division stedet hele cytokinese. 3D-rekonstruktion af ringen viste, at actomyosin ring markeret med Rlc1-Tomat samlet, før Bgs1-GFP rekruttering (figur 3, 10 min). Under ringen modning fase blev Bgs1-GFP rekrutteret til afdelingen stedet og overlappede med actomyosin ring som vist ved Rlc1-Tomato (figur 3, 30 min). Dette indikerer, at Bgs1 lokaliserer til ringen ved ansættelsen. Som ringen bremsende, Bgs1-GFP lokaliseres også til indtrængende membran støder op til den snærende ring (figur 3, 40 min). Ved udgangen af konstriktion, den Bgs1-GFP signal er synlig ved ingressed membran barriER (figur 3, 50 min). Endelig efter indsnævring af Rlc1-Tomato signal er fraværende, mens Bgs1-GFP synes at lokalisere hele membranen barriere med en skive lignende udseende (figur 3, 60 min). Disse observationer indikerer således, at skillevæggen syntetiserende enzym Bgs1 lokaliserer til ringen efter samling og fortsætter efter ring konstriktion på membranen barriere, som er blevet rapporteret før 17..
Fordelingen af proteiner langs actomyosin ring blev analyseret for at bestemme effektiviteten af cytokinetic hændelser (figur 4). Ujævn eller nonhomogenous fordeling af proteiner langs actomyosin ring er blevet forbundet med nedsat signalering og ineffektiv cytokinetic ringaggregat 26. Her viser vi to 3D rekonstruerede ringer under modningsfasen, der udtrykker F-Bar-protein Cdc15-GFP (figur 4). Billedettil venstre viser jævn fordeling af Cdc15-GFP langs ringen med en lav koefficient af varians (0,098), mens billedet i højre viser ujævn fordeling med en høj koefficient af varians (0,226, figur 4).
Figur 1: Udarbejdelse af Kultur Dish for Imaging. Skematisk beskriver podning af celler i et glas bund dyrkningsskål overlejret med medier pad. Se protokol for detaljer (§ 1). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 Timing af Cytokinetic Begivenheder i S. pombe. (A) Montage af en celle, der udtrykker Spindle pole krop markør Sad1-mCherry (venstre panel), ring protein Rlc1-GFP (midterste panel) og lyse-felt (højre panel) undergår cytokinese er vist ved 2 min intervaller. Hvide pile markerer spindel pole krop (centrosom) adskillelse på 17 min, rød pil markerer indledende rekruttering af Rlc1-GFP ved division site, åben pilemærkerne ring modning på 27 min, pil hoved markerer starten på ring konstriktion på 47 min, asterisker mærker ende af ringen konstriktion ved 69 min og røde pilespids markerer celle løsnen ved 97 min. (B) Tidslinje for cytokinetic arrangementer med reference til mitose som bestemme ved spindel pole krop dannelse og adskillelse. Celler blev afbildet ved 25 ° C. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Cell Division site Under forskellige stadier af Cytokinese. 3D rekonstruktion af actomyosin ring Z-stakke under forskellige stadier af cytokinese for den samme celle, ring (10 minutter efter spindelpol-legemer separation), ring modning (30 minutter efter spindelpol-legemer separation), ring indsnævringen (40 minutter efter spindelpol organ separation), enden af indsnævringen (50 minutter efter spindelpol-legemer separation), septum barriere (60 minutter efter spindelpol-legemer separation). Rlc1-Tomato markerer ring mens Bgs1-GFP markerer plasmamembranen omslutter septum. Scale bar = 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Fordeling af proteiner langs Ring. Billeder af 3D rekonstrueret actomyosin ring fra vildtype calen udtrykker Cdc15-GFP opdelt i fire kvadranter. Koefficienten af varians af hver ring er angivet. Scale bar = 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet en protokol til at studere cytokinetic begivenheder i fission gær i en tidsmæssig måde. Den her beskrevne protokol giver tidsmæssige opløsning af forskellige cytokinetic begivenheder med henvisning til hinanden; timing af protein rekruttering eller tab med henvisning til cytokinetic fase; struktur af ringen i de forskellige faser af cytokinese; og progression af cytokinesen med henvisning til mitose. Med denne protokol er det muligt præcist at definere den cytokinetic fase, der kan ændres i forskellige mutanter, hvilket giver en mere detaljeret forståelse af de involverede i forskellige cytokinetic faser proteiner. Desuden vil evnen til tidsmæssigt skelne mellem forskellige cytokinetic faser muliggøre analysen af molekylære mekanismer, der fører til afholdelse af forskellige cytokinetic faser. Tidsmæssig opløsning på forskellige cytokinetic begivenheder gør det også muligt at analysere cytokinetic ringstruktur og proteiner fordelingi de forskellige arrangementer. Den Spatiotemporal lokalisering af forskellige proteiner kan sammenlignes og analyseres med denne tilgang. Med brugen af egnede fluoroforer, kan multiple proteiner undersøges og sammenlignes med hinanden. Derudover her har vi også beskrevet, hvordan fordelingen af proteiner langs ringen kan analyseres for at bestemme protein organisation eller levering på divisionen site. Mens den her beskrevne protokol gælder for fission gær cytokinese, kan denne tilgang også anvendes til at studere cytokinese i andre gærtyper og svampe med passende ændringer til vækst og billedbehandling betingelser.
Denne protokol omfatter imaging levende celler som de deler. Cellerne afbildes ved hjælp af denne protokol har brug for at vokse under optimale forhold for at undgå pleotropic virkninger. Der bør drages omsorg for ikke fortrænge de celler i synsfeltet, som overdrevne celler kan føre til hurtige tab af næringsstoffer. Desuden imaging fluoroforer i celler fører til toksicitet på grund af friradikaler frigivet som følge af foto-blegning. Dette kan minimeres ved tilsætning af en fri radikal-quenching forbindelse, såsom ascorbinsyre. Tilsætningen af ascorbinsyre tillader langvarig billeddannelse af cellerne under mikroskopet. Under erhvervelsen billede, skal afbildes for at sikre indfangning af spindelpol organer hele Z-aksen af cellen. Fraværet af en ordentlig signal for spindel-legemer vil ikke tillade en ordentlig tidsmæssig opløsning på cytokinese. Navnlig skal sørges for præcist billede den indledende adskillelse af spindelpol-legemer markører som dette er tiden 0. Korrekt opsamling af cellerne langs Z-aksen er også kritisk for korrekt 3-dimensionelle rekonstruktioner af ringene og septa.
Af billedet tværsnittene af ringe og septa, kan den her beskrevne protokol modificeres med en mikrofabrikeret brønd, der tillader de stavformede fission gærceller til at være plads lodret til billeddannelse langs den lange akse af cell som er blevet rapporteret her 27. Mens denne protokol meget præcist kan fange protein rekruttering og lokalisering over tid ved celledeling stedet den rumlige opløsning af billederne er begrænset på grund af opløsning af mikroskopet anvendes. Super opløsning mikroskopi kan hjælpe med at forbedre rumlig opløsning, men kan påvirke den tidsmæssige opløsning. Nylige fremskridt inden mikroskopi såsom gitter lys ark mikroskopi kan hjælpe med at forbedre rumlig opløsning uden at kompromittere tidsmæssig opløsning 28. Udover lysmikroskopi, kan cytokinese i fission gær også undersøgt over tid ved hjælp Raman spektroskopi 29, 30.
Ved hjælp af denne metode har vi rapporteret, at den lille GTPase Cdc42 gennemgår en unik Spatiotemporal aktivering mønster under cytokinese 21. Denne tilgang gør os i stand til at studere organisering af forskellige cytokinetic begivenheds over tid og beskrive de molekylære detaljer i disse begivenheder. Rapporter har antydet, at tilstedeværelsen af en samlet actomyosin ring alene ikke er tilstrækkelig til effektiv membran furer og cytokinese 11, 21, 31. Protokollen beskrevet her kan anvendes til at undersøge de molekylære begivenheder, der fører til ordentlig cytokinese efter actomyosin ringaggregat. Desuden kan integriteten af actomyosin ring og dens virkning på membranen furer og septum indtrængen undersøges. Dette vil give en dybere forståelse af de forskellige molekylære begivenheder, der tilsammen fører til en vellykket adskillelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract media | Sunrise Science Products | YES 225 | 0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine |
| Agarose | SeaKem LE agarose, Lonza | 50001 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Glass Bottomed culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used. |
| VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system | Visitech International, UK | with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu). | |
| ImageJ | NIH | Image analysis software |
References
- Pollard, T. D.
- Guertin, D. A., Trautmann, S., McCollum, D.
- Xu, X., Vogel, B. E. A secreted protein promotes cleavage furrow maturation during cytokinesis. Curr Biol. 21 (2), 114-119 (2011).
- Sagona, A. P., Stenmark, H.
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437 (7061), 1043-1047 (2005).
- Li, R. Cytokinesis in development and disease: variations on a common theme. Cell Mol Life Sci. 64 (23), 3044-3058 (2007).
- Daniels, M. J., Wang, Y., Lee, M., Venkitaraman, A. R. Abnormal cytokinesis in cells deficient in the breast cancer susceptibility protein BRCA2. Science. 306 (5697), 876-879 (2004).
- Storchova, Z., Pellman, D. From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (1), 45-54 (2004).
- Lee, I. J., Coffman, V. C., Wu, J. Q. Contractile-ring assembly in fission yeast cytokinesis: Recent advances and new perspectives. Cytoskeleton (Hoboken). 69 (10), 751-763 (2012).
- Balasubramanian, M. K., Bi, E., Glotzer, M. Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells. Curr Biol. 14 (18), R806-R818 (2004).
- Proctor, S. A., Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Contributions of turgor pressure, the contractile ring, and septum assembly to forces in cytokinesis in fission yeast. Curr Biol. 22 (17), 1601-1608 (2012).
- Munoz, J., et al. Extracellular cell wall beta(1,3)glucan is required to couple septation to actomyosin ring contraction. J Cell Biol. 203 (2), 265-282 (2013).
- Wang, N., Lee, I. J., Rask, G., Wu, J. Q. Roles of the TRAPP-II Complex and the Exocyst in Membrane Deposition during Fission Yeast Cytokinesis. PLoS Biol. 14 (4), e1002437 (2016).
- Liu, J., Wang, H., McCollum, D., Balasubramanian, M. K. Drc1p/Cps1p, a 1,3-beta-glucan synthase subunit, is essential for division septum assembly in Schizosaccharomyces pombe. Genetics. 153 (3), 1193-1203 (1999).
- Cortes, J. C., et al. The (1,3)beta-D-glucan synthase subunit Bgs1p is responsible for the fission yeast primary septum formation. Mol Microbiol. 65 (1), 201-217 (2007).
- Cortes, J. C., et al. Cooperation between Paxillin-like Protein Pxl1 and Glucan Synthase Bgs1 Is Essential for Actomyosin Ring Stability and Septum Formation in Fission Yeast. PLoS Genet. 11 (7), e1005358 (2015).
- Cortes, J. C., Ishiguro, J., Duran, A., Ribas, J. C. Localization of the (1,3)beta-D-glucan synthase catalytic subunit homologue Bgs1p/Cps1p from fission yeast suggests that it is involved in septation, polarized growth, mating, spore wall formation and spore germination. J Cell Sci. 115 (Pt 21), 4081-4096 (2002).
- Liu, J., Tang, X., Wang, H., Oliferenko, S., Balasubramanian, M. K. The localization of the integral membrane protein Cps1p to the cell division site is dependent on the actomyosin ring and the septation-inducing network in Schizosaccharomyces pombe. Mol Biol Cell. 13 (3), 989-1000 (2002).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15 (2), 838-850 (2004).
- Figard, L., Xu, H., Garcia, H. G., Golding, I., Sokac, A. M. The plasma membrane flattens out to fuel cell-surface growth during Drosophila cellularization. Dev Cell. 27 (6), 648-655 (2013).
- Wei, B., et al. Unique Spatiotemporal Activation Pattern of Cdc42 by Gef1 and Scd1 Promotes Different Events during Cytokinesis. Mol Biol Cell. , (2016).
- Nabeshima, K., et al. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9 (11), 3211-3225 (1998).
- Johnson, A. E., Gould, K. L. Dma1 ubiquitinates the SIN scaffold, Sid4, to impede the mitotic localization of Plo1 kinase. EMBO J. 30 (2), 341-354 (2011).
- Yonetani, A., Chang, F.
- Fission Yeast: A laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
- Hachet, O., Simanis, V. Mid1p/anillin and the septation initiation network orchestrate contractile ring assembly for cytokinesis. Genes Dev. 22 (22), 3205-3216 (2008).
- Zhou, Z., et al. The contractile ring coordinates curvature-dependent septum assembly during fission yeast cytokinesis. Mol Biol Cell. 26 (1), 78-90 (2015).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Huang, Y. S., Karashima, T., Yamamoto, M., Hamaguchi, H. O. Molecular-level investigation of the structure, transformation, and bioactivity of single living fission yeast cells by time- and space-resolved Raman spectroscopy. Biochemistry. 44 (30), 10009-10019 (2005).
- Huang, C. K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging. Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).
- Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe. Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).
