Summary
De kernsplijting gist, Schizosaccharomyces pombe is een uitstekend modelsysteem om cytokinese te studeren, het laatste stadium van de celdeling. Hier beschrijven we een microscopie benadering van verschillende cytokinetic gebeurtenissen in levende splijtingsproducten gistcellen te analyseren.
Abstract
Cytokinese, de laatste stap in celdeling is essentieel voor het handhaven van de integriteit van het genoom. Juiste cytokinese is belangrijk voor celdifferentiatie en ontwikkeling. Cytokinese gaat om een reeks van gebeurtenissen die goed gecoördineerd worden in tijd en ruimte. Cytokinese omvat de vorming van een actomyosine ring aan de verdeling site, gevolgd door ring vernauwing, membraanvorming groef en extracellulaire matrix remodeling. De kernsplijting gist, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) is een goed bestudeerde modelsysteem dat heeft onthuld met aanzienlijke duidelijkheid de eerste gebeurtenissen in cytokinese. Toch begrijpen we niet duidelijk hoe de verschillende cytokinetic gebeurtenissen spatiotemporeel worden gecoördineerd. Om dit te bepalen, moet men de verschillende cytokinetic gebeurtenissen in grote details analyseren zowel in tijd als in de ruimte. Hier beschrijven we een microscopie benadering van verschillende cytokinetic ev onderzoekenenten in levende cellen. Met deze aanpak is het mogelijk om keer anders cytokinetic evenementen en bepaalt het tijdstip van de aanwerving van verschillende eiwitten tijdens de cytokinese. Daarnaast beschrijven we protocollen eiwit lokalisatie en verdeling vergelijkt op de plaats van celdeling. Dit is een basisprotocol cytokinese bestuderen splijtgist en kan ook worden gebruikt voor andere gisten en schimmels systemen.
Introduction
Cytokinese, de laatste stap in celdeling, is een complex proces essentieel voor een goede differentiatie, ontwikkeling en overleving van een organisme. Cytokinese bestaat uit meerdere evenementen die worden georganiseerd om een succesvolle cel scheiding te verzekeren met behoud van genomische integriteit 1. Cytokinese impliceert evenementen waar een actomyosine ring eenmaal gemonteerd ondergaat vernauwing, dat is gelijk aan membraan uitbreiding en fronste, en extracellulaire matrix cellulaire remodeling, uiteindelijk gevolgd door de cel afsnijding 1, 2, 3. Onjuiste ordening cytokinetic gebeurtenissen kunnen leiden tot celscheiding en ploïdie gebreken, en kunnen ziekten zoals kanker 4, 5, 6, 7, 8 veroorzaken. De fundamentele principes die het mogelijk maken organisatie van cytokinetic gebeurtenissen zijn niet goed begrepen, hetgeen leidt tot wegversperringen in ons begrip van het ontstaan van deze ziekten.
De splijtgist Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) is een uitstekend modelsysteem cytokinese onderzoeken vanwege de geconserveerde aard van de 1 eiwitten. In kernsplijting gist, na actomyosine ring montage, komt in de ring een rijping / dwell fase waarin het niet vernauwen 9. Rijping eindigt met de start van actomyosine ring vernauwing, tegelijk met membraan fronste en septum binnentreden. Baanbrekende werk door de jaren heen hebben we een redelijk goed begrip van actomyosine ring assemblage in kernsplijting gist 1, 9, 10 gegeven. In sommige eukaryoten, met inbegrip van kernsplijting gist, succesvolle montage van de actomyosine ring is niet voldoende voor membraan fronste. in fissie gist, ring vernauwing alleen niet voldoende kracht om interne turgordruk voor vore formatie 11 te overwinnen. Een recent model geeft aan dat deze kracht wordt geleverd door plaats septum 11 binnentreden. In een ander model is de rol van plasmamembraan verlenging voorgesteld bij te dragen aan de vorming 12, 13 doorkruisen. Ring beklemming en membraan fronste niet voorkomen in Bgs1 / CPS1 temperatuurgevoelige mutant cps1-191, de belangrijkste enzym voor de primaire septum formatie 14, 15. Cellen die Bgs1 tonen defecte primaire septum en langdurige ring vernauwing 15, 16. Bgs1 wordt aangeworven om de celdeling site voor septum binnentreden tijdens de rijping na actomyosine ring montage 17, 18. Similarly, tijdens cellularization in Drosophila embryo's, ring vernauwing is bifasisch met een significant trage initiële vernauwing tarief 19, die lijkt op de rijpingsfase waargenomen in kernsplijting gist. Tweefasige ring vernauwing kan vertragen membraan fronste om voldoende expansie membraan 20 en modificatie van extracellulaire matrix. Dit suggereert dat na actomyosine ring montage ring vernauwing optreedt efficiënt alleen wanneer de cel de vereisten voor vore formatie heeft voldaan. Het is niet goed begrepen welke voorwaarden zijn voldaan actomyosine ring vernauwing na ringsamenstel, noch de moleculaire gebeurtenissen die dit proces reguleren. We hebben onlangs aangetoond dat volgende actomyosine ring montage de kleine GTPase Cdc42 ondergaat een unieke tijdruimtelijk activering patroon 21. Dit patroon wordt vastgesteld door de unieke lokalisatie patroon van de Cdc42 guanidine nucleotide uitwisseling factoren (GEFs) die Cdc42 activeren. De GEF Gef1 lokaliseert aan de verzamelde actomyosine ring en bevordert het ontstaan van de ring beklemming en septum binnentreden, terwijl SCD1 lokaliseert de doorkruisen membraan en bevordert een normale septum formatie. We vinden dat de door haar GEFs Cdc42 activering patroon leiden tot de regulering van verschillende cytokinetic evenementen.
Om het moleculaire mechanisme van de gebeurtenissen die uiteindelijk leiden tot het scheiden van cellen volgende actomyosine ring assemblage te begrijpen, moet men de verschillende cytokinetic gebeurtenissen in tijd en ruimte te volgen. In kernsplijting gist, cytokinese gaat eerst de montage van voorloper knooppunten rond de kern, die uiteindelijk het type II myosine, de formin Cdc12, en andere eiwitten die nodig zijn voor actomyosine ring montage te werven. Tot tijd verschillende cytokinetic gebeurtenissen en een referentiekader, het scheiden van de spil paallichaam markers (spindle vorming) wordt als tijd 0 22. De montage van the actomyosine ring kan worden gevolgd door het monitoren van de tijd van de intensiteit van een fluorescent gelabeld actomyosine ring eiwit zoals het type II myosine regulerende lichte keten Rlc1. Hier beschrijven we een microscopische benadering verschillende stadia van cytokinese tijd geanalyseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van Monster
- Grow kernsplijting gist cellen die de spil pole lichaam marker Sad1-mCherry 23 en type II myosine regulerende lichte keten Rlc1-Tomato 24 in YE vloeibare media bij 32 ° C gedurende 8 generaties.
OPMERKING: Bij temperatuurgevoelige mutanten, groeien de cellen bij 25 ° C. Groeien cellen tot mid-log-fase tot een OD 600 van 0,5 in YE. Voor meer informatie over kernsplijting gist groeiomstandigheden verwijzen naar de Fission gist lab handleiding 25. - Bereid YE (of minimaal) media met 0,6% agarose (Agarose gebaseerde media tonen minder fluorescerende achtergrond in vergelijking met agar). Om de gesmolten media voeg 1 mM ascorbinezuur (vitamine C). Het vitamine C lest vrije radicalen die vrijkomen als gevolg van foto-bleken, dus het minimaliseren van foto-toxiciteit.
- Giet 3-4 ml van de vitamine C geregen gesmolten media op een glazen bodem cultuur schotel. Laat de media afkoelen en stollen.
Merk opdikte van het glas in de kweekschaal afhankelijk van het dekglaasje dikte geschikt voor de microscoop. Hier, gebruik dekglaasje No. 1.5. - Voorzichtig verhogen de gestolde media van de cultuur schotel met behulp van een scherp scalpel. Plaats een pipetpunt tussen de media en de plaat kweekschaal aan de plaat kan vallen terug in de schaal (figuur 1).
- Neem 1 ml vers groeiende cellen zoals beschreven in 1.1 hierboven. Spin de cellen voorzichtig bij 300 g gedurende 30 s. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in de kleine hoeveelheid resterend materiaal dat in de buis achterblijft nadat weggooien van het supernatant.
- Load 2-5 pi van geresuspendeerde celkweek tussen de media plaat en de glazen bodem van de cultuur schotel. De cellen moeten worden op het glas. De pipetpunt geplaatst tussen de media en het gerecht in staat stelt gemakkelijk laden van de celkweek.
- Zeer verwijder voorzichtig de pipet tip en plaats de media plaat terug in de oorspronkelijke positie op de culture gerecht. Zorg ervoor dat eventuele luchtbellen te voorkomen. Indien nodig voorzichtig op uit de luchtbellen door het schuiven van de achterkant van een pipet tip op de top van de media plaat.
- Laat cellen zitten in de kweekschaal gedurende 30 minuten tot een uur in het donker bij de temperatuur waarbij microscopie wordt uitgevoerd. Dit is belangrijk om schokken te voorkomen door verandering groeiomstandigheden voor de cellen.
2. Image Acquisition
- Een druppel olie op de buitenzijde van het glas op de kweekschaal. Plaats de cultuur schotel op een omgekeerde microscoop.
- Om automatisch fluorescentie van YE media te minimaliseren gebruik maken van een GFP filter met een smal golflengtegebied (520-535 nm).
- Focus op de mediale vlak van de cellen en ervoor zorgen dat ze zijn goed gespreid en niet te druk. Zorg ervoor dat beeldacquisitie van de cellen beginnen in de geschikte fase van de celcyclus. Voor dit experiment, volgen cellen uit de late G2.
- Programmeer de afbeelding acquisitie software to nemen GFP, RFP en DIC beelden van de cellen.
- Voor dit experiment gebruiken 100 exposure ms tijd voor DIC en 75 ms belichtingstijd voor GFP en RFP filters. De belichtingstijd afhankelijk van de instellingen van de microscoop, het bestuderen eiwit en de duur van het experiment. Voor de gegeven microscoop, instellingen, gebruik 50% laservermogen.
- Om afbeeldingen in 3 dimensies, het programma van het beeld acquisitie software voor Z-schaal beeldvorming vast te leggen. Gebruik een stapgrootte van 0,4 urn en een afstand van 3,0 urn (de helft van de totale z) rond centraal punt van de cellen. Dit leidt tot de vangst van 16 Z-frames per tijdstip met een totaal Z afstand van 6 urn.
OPMERKING: Z-series beeldacquisitie kan de vangst van de spindel pole lichamen.
- Neem beelden elke 2 min. Verander de belichtingstijd volgens de eisen van het experiment. De belichtingstijd kan ook worden aangepast aan het eiwit van belang en signaalsterkte. Echter, er rekening mee dat de korteer intervallen of langere belichtingstijd toename foto- toxiciteit door bleken en derhalve cellen kunnen worden gevolgd slechts korte tijd.
- Acquire beelden tot de cellen fysiek gescheiden zoals waargenomen door de DIC afbeeldingen of programmeren van de software om overname te stoppen na 90 min.
3. Beeldanalyse
- Temporele analyse van cytokinetic evenementen
- Het gebruik van de afbeelding acquisitie software maakt projecties van de Z-frames voor elk tijdstip-point. Maak verschillende bestanden voor elke golflengte van het beeld verkregen.
- Exporteer deze projectie time-point series als .tiff-bestand.
- Analyseren van de beelden met behulp van ImageJ software. Open de beeldreeks voor elk van de golflengten.
- Selecteer een cel te bestuderen. Dubbelklik op de lijn mogelijkheid werkbalk. Dit zal een ander venster om lijndikte aan te passen te openen. Stel de lijndikte overeenkomen met de celbreedte. Voor een WT cel is dit ongeveer 40 - 50 pixels. Trek een lijn langs delange as van de cel van belang.
- Klik op Analyseren> Extra> ROI manager en klik op toevoegen. Dit zal de geselecteerde lijn later toe te voegen aan de ROI-venster voor gebruik. Dit venster niet sluiten.
- Klik op de afbeelding van de rente en selecteer Bewerken> Selectie> rechttrekken. Dit zal een venster. Check "Verwerk hele stack". Dit zal de cel horizontaal recht.
- Klik op Afbeelding> Transformatie> Roteren 90 graden naar rechts. Dit beeld is nu verticaal rechtgetrokken.
- Klik op Afbeelding> Stacks> Maak Montage. Dit zal een venster om het aantal rijen en kolommen toe te wijzen aan de stapel te openen, de schaal factor voor het beeldformaat, de eerste en de laatste slice (frame) voor de montage en het frame increment voor de montage. Controleer label plakken en druk op enter.
- Als een venster met een montage van de cel van interesse wordt getoond, opent het beeld reeksen voor de andere golflengte.
- Klik op de lijn identifier op ROI manager. Dit zal selecterendezelfde cel op de tweede beeldbestand. Herhaal stap 3.1.6 - 3.1.8. Dit zal een montage van de tweede afbeelding te openen.
- Op de afbeelding met de spindel pole lichaam marker Sad1-mCherry, op zoek naar het begin van de scheiding van de spindel pole lichaam marker en markeer dat tijdstip als de tijd 0.
- Volg de Rlc1-Tomato signaal op de afbeelding in de tijd en kijk voor het signaal dat verschijnt als een duidelijke lijn in tegenstelling tot flarden van Rlc1-tomaat. Deze keer-punt markeert voltooiing van actomyosine ring montage / begin van rijping fase.
- Volgende scroll door de film na verloop van tijd om te bepalen wanneer de Rlc1-Tomato ring begint te dalen in omvang. Dit wordt gemarkeerd als het einde van rijpingsfase / begin ring vernauwing.
- Volg de Rlc1-Tomato signaal na verloop van tijd het hele vernauwing totdat deze verschijnt als een stip in het midden van de cel-as. Dit wordt gemarkeerd als het einde van ring vernauwing / eind septum binnentreden.
- Na de montage van DIC beelden, bepalen de uiteindelijke celscheiding. Noteer het tijdstip wanneer de cel fysiek scheidt.
- Voor spindle pole lichaam scheiding meet de afstand tussen de twee spindle pole lichamen na verloop van tijd met behulp van de lijn instrument in ImageJ. Plot de afstand in spindel pole lichaam na verloop van tijd.
- Noteer de verschillende tijdstippen voor verschillende gebeurtenissen cytokinetic de duur van elke fase cytokinetic berekenen en te vergelijken met spindel poollichaam scheiding in de tijd.
- Ruimtelijke analyse van cytokinetic evenementen
- Selecteer een cel met een zichtbare actomyosine ring. Dubbelklik op de lijn mogelijkheid ImageJ werkbalk. Dit zal een ander venster om lijndikte aan te passen te openen. Stel de lijndikte overeenkomt met de dikte ring (15 - 20 pixels). Trek een lijn langs de ring zorg ervoor dat de gehele dikte van de ring te waarborgen is inbegrepen.
- Klik op Analyseren> Extra> ROI manager en klik op toevoegen. Dit zal de geselecteerde lijn later toe te voegen aan de ROI-venster voor gebruik.Dit venster niet sluiten.
- Klik op de afbeelding van de rente en selecteer Bewerken> Selectie> rechttrekken. Dit zal een venster. Check "Verwerk hele stack". Dit zal de ring horizontaal recht.
- Stel de intensiteit van de helderste vliegtuig in de rechtgetrokken z-stack (uit 3.1.6) met behulp van Image> Adjust> Brightness / Contrast> Reset.
- Klik op het tabblad Stk> 3D Project. Dit zal een dialoogvenster openen. Verander de projectie methode om Brightest Point en de Slice afstand tot 2 of 3 pixels. Tot slot, verandering rotatieas X of Y-as (dit zal veranderen afhankelijk van de gewenste kijkhoek), klikt u interpoleren en klik op OK om een 3D-projectie van het beeld te genereren. Gebruik de schuifbalk onder het beeld om het beeld te roteren.
- Open de afbeelding-serie voor de andere golflengte met behulp van ImageJ.
- Klik op de lijn identifier op ROI manager. Dit zal dezelfde ring op de tweede image-bestand te selecteren. Herhaal stap 4.2.4 en 4.2.5.Dit zal een 3-dimensionale ring te openen in de afbeelding met de andere golflengte.
- Met de beide 3D-beeld ringen geopend, klikt u op Afbeelding> Kleur> Kanalen samenvoegen. Dit zal openen. Selecteer elke afbeelding uit het drop down menu voor de overeenkomstige gewenste kleur en klik op OK. Dit zal een samenstelling van zowel de beelden met verschillende golflengten openen.
- Vergelijk de lokalisatie van verschillende markers met betrekking tot de lokalisatie op de cytokinetic ring of ingressing membraan. Rlc1-GFP is een marker voor de cytokinetic ring. Eiwitten co-lokalisatie met Rlc1-GFP te lokaliseren naar de ring, terwijl eiwitten lokaliseren achter Rlc1-GFP signaal lokaliseren aan de ingressing membraan.
Opmerking: Het eiwit van belang heeft van een andere fluorofoor dan de ring marker zijn. - Genereren 3 dimensionale ringen tijdens verschillende stadia van cytokinese de ruimtelijke lokalisatie van de eiwitten vergelijken hele cytokinese.
- Analyse van eiwit distridrage bij cytokinetic ring
- Te vergelijken en distributie van eiwitten te analyseren langs de ring te meten van de coëfficiënt van variantie van eiwit distributie. Een hoge coëfficiënt van variantie geeft ongelijke verdeling van eiwitten langs de deling terrein en suggereert verkeerde ringsamenstel, rijping of vorming septum, afhankelijk van de fase wordt afgebeeld of geanalyseerd.
- Met behulp van 3-dimensionale gereconstrueerde cytokinetic ring (vanaf 3.2.2), verdeel het beeld in ten minste 4 kwadranten zodanig dat een kwart van de ring verschijnt in elk kwadrant. Hiervoor gebruikt u de line tool om lijnen haaks op het beeld te tekenen. Na elke regel Klik op de afbeelding> Overlay> selectie toevoegen of gebruik maken van short cut Ctrl + B.
- Ga naar Analyze> Set meting. Selecteer gemiddelde grijswaarde in het vak dat wordt geopend. Klik op OK.
- Met behulp van de lijnen boven als gidsen trek een rechthoek om elk kwadrant definiëren met de rechthoek gereedschap getrokken.
- Om de gemiddelde intensiteit van elk kwadrant, klik metenop Analyseren> Meet of gebruik maken van de short cut Ctrl + M.
- De gemeten gemiddelde grijswaarde voor alle vier de kwadranten (MG 1 -MG 4).
- Selecteer een klein gebied in elk kwadrant buiten de ring als achtergrondselectie.
- Meet de gemiddelde grijswaarde voor Achtergrond selectie voor alle vier de kwadranten (BG 1 -BG 4).
- li> Voor achtergrondinformatie aftrekken voor elk kwadrant gebruik de volgende formulering MG 1 -Gemiddelde (BG 1: BG 4) = Intensiteit van de ring in elk kwadrant (IRQ). Op dit moment zijn er 4 IRQ waarden, een voor elk kwadrant.
- Volgende berekenen van de coëfficiënt van variantie voor elke ring met de volgende formulering Standaarddeviatie (IRQ 1: IRQ 4) / Gemiddeld (IRQ 1: IRQ 4). Bereken gemiddelde Coëfficiënt van Variance voor elke stam en te vergelijken met de andere stammen.
OPMERKING: Een statistisch significante toename van de coëfficiënt van variatie in een stam vergeleken met controles Indicates ongelijke eiwit distributie / levering langs de divisie website in dat stadium van cytokinese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Splijtingsproducten gistcellen uiting van de ring marker, Rlc1-GFP (groen, figuur 2) en spindel pole lichaam marker Sad1-mCherry (rood, figuur 2) werden in beeld gebracht tijdens de cytokinese. Onset spil paallichaam marker (witte pijl, figuren 2A, B) wordt beschouwd als tijd 0. Rlc1 GFP-signaal verschijnt op tijdstip -4 min onder verwijzing naar poollichaam scheiding spil (rode pijl, figuren 2A, 2B). Rlc1-GFP signaal vormt een continue ring 10 min na spindel scheiding pole lichaam (open pijl, figuren 2A, B) die het einde van actomyosine ring montage. De actomyosine ring (Rlc1-GFP) begint te dalen in de breedte 22 minuten na voltooiing van de ring montage en 32 minuten na de spindel pole lichaam scheiding (gesloten pijlpunt, figuren 2A, B). Ring vernauwing eindigt 20 minuten na het begin van beklemming, 42 min sinds het begin van de ring montage en 52 min sinds spindle pole lichaam scheiding (wit Asterisk, figuren 2A, B). Tot slot, mobiele afsnijding gebeurt 72 minuten na spindel scheiding pole lichaam (rode pijlpunt, figuren 2A, B).
De lokalisatie van de ring marker Rlc1-Tomaat en septum membraan marker Bgs1-GFP werden geanalyseerd op de divisie site in heel cytokinese. 3D-reconstructie van de ring bleek dat actomyosine ring gemarkeerd met Rlc1-Tomaat aangesloten voordat Bgs1-GFP recruitment (figuur 3, 10 min). Tijdens de ring rijpingsfase werd Bgs1-GFP aangeworven om de verdeling plaats en overlapt met de actomyosine ring zoals getoond door Rlc1-Tomato (figuur 3, 30 min). Dit geeft aan dat Bgs1 lokaliseert aan de ring bij aanwerving. Als de ring vernauwt, Bgs1-GFP lokaliseert ook de ingressing membraan grenzend aan de beperkende ring (figuur 3, 40 min). Eind vernauwing, de Bgs1 GFP-signaal zichtbaar op ingressed membraan barriER (figuur 3, 50 min). Tenslotte, na de vernauwing Rlc1-Tomato afwezig is, terwijl Bgs1-GFP blijkt lokaliseren gehele membraan barrière een schijfvormige uiterlijk (figuur 3, 60 min). Dus deze waarnemingen aan dat het septum synthetiserende enzym Bgs1 lokaliseert de ring na montage en aanhoudt nadat ring vernauwing aan het membraan barrière is gerapporteerd voor 17.
De verdeling van eiwitten langs de ring actomyosine werd geanalyseerd om de efficiëntie van cytokinetic gebeurtenissen (figuur 4) te bepalen. Oneffen of niet homogeen verdeling van eiwitten langs de actomyosine ring is verbonden met verslechterde signalering en inefficiënte cytokinetic ringsamenstel 26. Hier tonen wij twee 3D gereconstrueerd ringen tijdens de rijpingsfase, de uiting van de F-Bar eiwit Cdc15-GFP (Figuur 4). De afbeeldinglinks toont gelijkmatige verdeling van Cdc15-GFP langs de ring met een lage variatiecoëfficiënt (0,098), terwijl de afbeelding rechts ziet ongelijke verdeling met een hoge variatiecoëfficiënt (0,226, figuur 4).
Figuur 1: Voorbereiding van Cultuur Dish for Imaging. Schematische beschrijven enting van cellen in een glazen bodem cultuur schotel bedekt met media pad. Zie protocol voor meer informatie (deel 1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 Timing van Cytokinetic Evenementen in S. pombe. (A) Montage van een cel die Spindle pole lichaam marker Sad1-mCherry (linker paneel), ring eiwit Rlc1-GFP (middelste paneel) en bright-field (rechter paneel) ondergaat cytokinese wordt getoond bij 2 min intervallen. Witte pijlen markeert spindle pole lichaam (centrosome) scheiding aan 17 min, rode pijl markeert de eerste werving van Rlc1-GFP in de divisie site, geopend pijlmarkeringen ring rijping op 27 min, pijl hoofd markeert het begin van de ring vernauwing op 47 min, asterisks marks einde van de ring vernauwing op 69 min en rode pijl markeert cel afsnijding op 97 min. (B) Chronologie van cytokinetic evenementen met betrekking tot mitose zoals te bepalen door spindle pole vorming van lichaam en scheiding. Cellen werden afgebeeld bij 25 ° C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Cell Division Site Tijdens de verschillende stadia van Cytokinese. 3D-reconstructie van actomyosine ring Z-stapels in de verschillende fasen van cytokinese voor dezelfde cel, ring (10 min na de As pole lichaam scheiding), ring rijping (30 min scheiding achteraf Spindel pole lichaam), ring vernauwing (40 min na Spil pole body scheiding), einde van de vernauwing (50 min na de As pole lichaam scheiding), septum barrière (60 min na de As pole lichaam scheiding). Rlc1-Tomato markeert ring terwijl Bgs1-GFP markeert het plasmamembraan omhult het septum. Schaal bar = 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Verdeling van eiwitten langs de Ring. Beelden van 3D gereconstrueerd actomyosine ring van wild-type cells uiten van Cdc15-GFP verdeeld in vier kwadranten. De co-efficiënte van de variantie van elke ring wordt vermeld. Schaal bar = 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben we een protocol beschreven cytokinetic gebeurtenissen in kernsplijting gist studeren in een tijdelijke manier. De hier beschreven protocol biedt tijdsresolutie van verschillende cytokinetic gebeurtenissen met betrekking tot elkaar; timing van eiwit aanwerving of het verlies met betrekking tot cytokinetic fase; structuur van de ring in de verschillende fasen van cytokinese; en de progressie van cytokinese hand van mitose. Met dit protocol is het mogelijk de cytokinetic fase die kan veranderen bij verschillende mutanten, waardoor een meer gedetailleerd begrip van de bij verschillende fasen cytokinetic eiwitten verschaffen nauwkeurig te definiëren. Bovendien zal het vermogen om tijdelijk onderscheiden verschillende fasen cytokinetic de analyse van moleculaire mechanismen die leiden tot de organisatie van verschillende cytokinetic fasen mogelijk. Temporele resolutie van de verschillende cytokinetic gebeurtenissen maakt het ook mogelijk de analyse van cytokinetic ringstructuur en eiwitten distributiein de verschillende gebeurtenissen. De spatiotemporele lokalisatie van verschillende eiwitten kunnen worden vergeleken en geanalyseerd met deze benadering. Met het gebruik van geschikte fluoroforen kunnen meerdere eiwitten worden onderzocht en met elkaar vergeleken. Daarnaast hebben we hier ook beschreven hoe de verdeling van eiwitten aan de ring kan worden geanalyseerd op eiwit organisatie of bepaald wat bij de splitsing plaats. Hoewel de hier beschreven protocol geldt splijtgist cytokinese, kan deze benadering worden gebruikt om cytokinese in andere gisten en fungi met geschikte wijzigingen voor groei en beeldvormingsomstandigheden.
Dit protocol omvat beeldvorming levende cellen als ze delen. De cellen afgebeeld met dit protocol moet groeien onder optimale omstandigheden om eventuele pleotropic te vermijden. Zorg moet worden genomen om niet verdringen de cellen in het gezichtsveld, buitensporig cellen kan leiden tot snelle verlies van voedingsstoffen. Bovendien beeldvorming fluoroforen in cellen leidt tot toxiciteit door vrijeresten vrij als gevolg van foto-bleking. Dit kan worden geminimaliseerd door toevoeging van een vrije radicaal uitdoving verbinding zoals ascorbinezuur. De toevoeging van ascorbinezuur maakt langdurige beeldvorming van de cellen onder de microscoop. Tijdens beeldacquisitie, de volledige Z-as van de cel moet worden afgebeeld om de vangst van de spindel pole instanties te verzekeren. Het ontbreken van een goede signaal voor de spindel pole lichamen zullen niet toestaan dat een goede temporele resolutie van cytokinese. In het bijzonder dient men nauwkeurig beeld de initiële scheiding van de spil paallichaam merkers zoals dit moment 0. Een goede opname van de cellen langs de Z-as is ook belangrijk voor juiste 3 reconstructies van de ringen en septa.
Om het beeld dwarsdoorsneden van ringen en septa, de hier beschreven protocol kan worden gemodificeerd met een microfabricated goed dat toelaat de staafvormige splijtingsproducten gistcellen plaatsvinden verticaal voor beeldvorming langs de lengteas van het cell zoals hier 27 beschreven. Hoewel dit protocol zeer nauwkeurig het eiwit werving en lokalisatie na verloop van tijd bij de celdeling site kan vastleggen van de ruimtelijke resolutie van de beelden is beperkt als gevolg van de resolutie van de microscoop gebruikt. Super-resolutie microscopie kan helpen bij het verbeteren van de ruimtelijke resolutie, maar kan de temporele resolutie beïnvloeden. Recente ontwikkelingen in de microscopie zoals rooster licht sheet microscopie kan helpen bij het verbeteren van de ruimtelijke resolutie, zonder afbreuk te doen aan tijdsresolutie 28. Naast het licht microscopie, kan cytokinese in kernsplijting gist ook bestudeerd worden na verloop van tijd met behulp van Raman spectroscopie 29, 30.
Met deze aanpak hebben we gemeld dat de kleine GTPase Cdc42 ondergaat een unieke tijdruimtelijk activering patroon tijdens cytokinese 21. Deze aanpak stelt ons in staat om de organisatie van verschillende cytokinetic evenement bestuderens in de tijd en een beschrijving van de moleculaire details van deze gebeurtenissen. Rapporten hebben gesuggereerd dat de aanwezigheid van een samengestelde ring actomyosine alleen niet voldoende is voor efficiënte membraan fronste en cytokinese 11, 21, 31. De hier beschreven protocol kan worden gebruikt om de moleculaire gebeurtenissen die leiden tot goede cytokinese na actomyosine ringsamenstel onderzoeken. Bovendien kan de integriteit van de actomyosine ring en de gevolgen daarvan membraan fronste en septum indringing onderzocht. Dit zal een dieper begrip van de verschillende moleculaire gebeurtenissen die samen leiden tot een succesvolle scheiding te bieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract media | Sunrise Science Products | YES 225 | 0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine |
| Agarose | SeaKem LE agarose, Lonza | 50001 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Glass Bottomed culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used. |
| VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system | Visitech International, UK | with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu). | |
| ImageJ | NIH | Image analysis software |
References
- Pollard, T. D.
- Guertin, D. A., Trautmann, S., McCollum, D.
- Xu, X., Vogel, B. E. A secreted protein promotes cleavage furrow maturation during cytokinesis. Curr Biol. 21 (2), 114-119 (2011).
- Sagona, A. P., Stenmark, H.
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437 (7061), 1043-1047 (2005).
- Li, R. Cytokinesis in development and disease: variations on a common theme. Cell Mol Life Sci. 64 (23), 3044-3058 (2007).
- Daniels, M. J., Wang, Y., Lee, M., Venkitaraman, A. R. Abnormal cytokinesis in cells deficient in the breast cancer susceptibility protein BRCA2. Science. 306 (5697), 876-879 (2004).
- Storchova, Z., Pellman, D. From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (1), 45-54 (2004).
- Lee, I. J., Coffman, V. C., Wu, J. Q. Contractile-ring assembly in fission yeast cytokinesis: Recent advances and new perspectives. Cytoskeleton (Hoboken). 69 (10), 751-763 (2012).
- Balasubramanian, M. K., Bi, E., Glotzer, M. Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells. Curr Biol. 14 (18), R806-R818 (2004).
- Proctor, S. A., Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Contributions of turgor pressure, the contractile ring, and septum assembly to forces in cytokinesis in fission yeast. Curr Biol. 22 (17), 1601-1608 (2012).
- Munoz, J., et al. Extracellular cell wall beta(1,3)glucan is required to couple septation to actomyosin ring contraction. J Cell Biol. 203 (2), 265-282 (2013).
- Wang, N., Lee, I. J., Rask, G., Wu, J. Q. Roles of the TRAPP-II Complex and the Exocyst in Membrane Deposition during Fission Yeast Cytokinesis. PLoS Biol. 14 (4), e1002437 (2016).
- Liu, J., Wang, H., McCollum, D., Balasubramanian, M. K. Drc1p/Cps1p, a 1,3-beta-glucan synthase subunit, is essential for division septum assembly in Schizosaccharomyces pombe. Genetics. 153 (3), 1193-1203 (1999).
- Cortes, J. C., et al. The (1,3)beta-D-glucan synthase subunit Bgs1p is responsible for the fission yeast primary septum formation. Mol Microbiol. 65 (1), 201-217 (2007).
- Cortes, J. C., et al. Cooperation between Paxillin-like Protein Pxl1 and Glucan Synthase Bgs1 Is Essential for Actomyosin Ring Stability and Septum Formation in Fission Yeast. PLoS Genet. 11 (7), e1005358 (2015).
- Cortes, J. C., Ishiguro, J., Duran, A., Ribas, J. C. Localization of the (1,3)beta-D-glucan synthase catalytic subunit homologue Bgs1p/Cps1p from fission yeast suggests that it is involved in septation, polarized growth, mating, spore wall formation and spore germination. J Cell Sci. 115 (Pt 21), 4081-4096 (2002).
- Liu, J., Tang, X., Wang, H., Oliferenko, S., Balasubramanian, M. K. The localization of the integral membrane protein Cps1p to the cell division site is dependent on the actomyosin ring and the septation-inducing network in Schizosaccharomyces pombe. Mol Biol Cell. 13 (3), 989-1000 (2002).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15 (2), 838-850 (2004).
- Figard, L., Xu, H., Garcia, H. G., Golding, I., Sokac, A. M. The plasma membrane flattens out to fuel cell-surface growth during Drosophila cellularization. Dev Cell. 27 (6), 648-655 (2013).
- Wei, B., et al. Unique Spatiotemporal Activation Pattern of Cdc42 by Gef1 and Scd1 Promotes Different Events during Cytokinesis. Mol Biol Cell. , (2016).
- Nabeshima, K., et al. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9 (11), 3211-3225 (1998).
- Johnson, A. E., Gould, K. L. Dma1 ubiquitinates the SIN scaffold, Sid4, to impede the mitotic localization of Plo1 kinase. EMBO J. 30 (2), 341-354 (2011).
- Yonetani, A., Chang, F.
- Fission Yeast: A laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
- Hachet, O., Simanis, V. Mid1p/anillin and the septation initiation network orchestrate contractile ring assembly for cytokinesis. Genes Dev. 22 (22), 3205-3216 (2008).
- Zhou, Z., et al. The contractile ring coordinates curvature-dependent septum assembly during fission yeast cytokinesis. Mol Biol Cell. 26 (1), 78-90 (2015).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Huang, Y. S., Karashima, T., Yamamoto, M., Hamaguchi, H. O. Molecular-level investigation of the structure, transformation, and bioactivity of single living fission yeast cells by time- and space-resolved Raman spectroscopy. Biochemistry. 44 (30), 10009-10019 (2005).
- Huang, C. K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging. Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).
- Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe. Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).
