Summary
La levure de fission, Schizosaccharomyces pombe est un excellent modèle pour étudier la cytocinèse, la dernière étape de la division cellulaire. Nous décrivons ici une approche de microscopie pour analyser différents événements cytokinétique dans des cellules vivantes de levure fission.
Abstract
Cytocinèse, la dernière étape de la division cellulaire est essentielle pour le maintien de l'intégrité du génome. cytokinèse est importante pour la différenciation cellulaire et le développement. Cytocinèse implique une série d'événements qui sont bien coordonnés dans le temps et l'espace. Cytocinèse implique la formation d'un anneau de actomyosine sur le site de la division, suivie par l'anneau de constriction, la formation de sillon de membrane et extra matrice cellulaire remodelage. La levure de fission, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) est un système de modèle bien étudié qui a révélé avec une clarté substantielle les événements initiaux dans cytokinèse. Cependant, nous ne comprenons pas clairement comment les différents événements cytokinétique sont coordonnés spatiotemporelle. Pour le déterminer, il faut analyser les différents événements cytokinétique en grands détails dans le temps et dans l'espace. Nous décrivons ici une approche de microscopie pour examiner différents ev cytokinétiqueents dans les cellules vivantes. Avec cette approche, il est possible en temps différents événements cytokinétique et de déterminer le moment du recrutement de protéines différentes au cours de la cytocinèse. En outre, on décrit des protocoles pour comparer la localisation des protéines, et la distribution à l'emplacement de la division cellulaire. Ceci est un protocole de base pour étudier la cytokinèse dans une levure à fission, et peut également être utilisé pour d'autres levures et des systèmes fongiques.
Introduction
Cytocinèse, l'étape finale dans la division cellulaire, est un processus complexe essentiel de la différenciation appropriée, le développement et la survie d'un organisme. Cytocinèse implique plusieurs événements qui sont organisés pour assurer la séparation cellulaire avec succès , tout en maintenant l' intégrité du génome 1. Cytocinèse implique des événements où un anneau actomyosine une fois assemblé subit une constriction, ce qui coïncide avec l' expansion de la membrane et froncement et extracellulaire matrice cellulaire remodelage, finalement suivi par la cellule abscission 1, 2, 3. Organisation inadéquate des événements cytokinétique peut conduire à la séparation cellulaire et ploïdie défauts, et peut provoquer des maladies comme le cancer 4, 5, 6, 7, 8. Les principes fondamentaux qui permettent organisation des événements cytokinétique ne sont pas bien compris, conduisant ainsi à des barrages routiers dans notre compréhension de l'étiologie de ces maladies.
La fission Schizosaccharomyces pombe de levure (S. pombe) est un excellent modèle pour étudier la cytokinèse en raison de la nature préservée des protéines impliquées 1. Dans la levure de fission, après actomyosine ensemble d'anneau, la bague entre une maturation / phase de séjour où il ne restreint pas 9. Maturation se termine par l'initiation de l'anneau de constriction actomyosine, concurremment avec froncement de membrane et d'un septum ingression. Travail séminal au fil des ans nous ont donné une assez bonne compréhension de l' actomyosine ensemble de bague dans la levure de fission 1, 9, 10. Dans certains eucaryotes, y compris la levure à fission, l'assemblage réussie de l'anneau de actomyosine est insuffisante pour froncement de la membrane. En fission levure, anneau de constriction seul ne fournit pas une force suffisante pour surmonter la pression de turgescence interne pour la formation de sillon 11. Un modèle récent indique que cette force est la place fournie par septum ingression 11. Dans un autre modèle, le rôle de l' extension de la membrane plasmique a été suggérée pour contribuer à la formation de sillon 12, 13. Constriction Ring et froncement de la membrane ne se produisent pas dans la température Bgs1 / CPS1 cps1-191 mutant sensible, la principale enzyme pour la formation du septum primaire 14, 15. Les cellules dépourvues Bgs1 montrent septum primaire défectueuse et prolongée constriction de l' anneau 15, 16. Bgs1 est recruté sur le site de la division cellulaire pour septum ingression pendant la maturation après actomyosine assemblage en anneau 17, 18. Similarly, pendant cellularisation dans des embryons de drosophile, l' anneau de constriction est biphasique avec un taux de rétrécissement initial significativement lent 19, ressemblant à la phase de maturation observée dans la levure de fission. Biphasique constriction annulaire peut ralentir froncement de la membrane pour permettre l'expansion de la membrane suffisante 20 et la modification de la matrice extracellulaire. Cela donne à penser que, après actomyosine assemblage, anneau de constriction se produit efficacement que lorsque la cellule a satisfait aux exigences en matière de formation sillon. Il ne comprend pas bien quelles sont les conditions nécessaires pour l'anneau de constriction actomyosine après assemblage de l'anneau, ni les événements moléculaires qui régulent ce processus. Nous avons récemment montré que , suite à l' anneau de actomyosine ensemble la petite GTPase Cdc42 subit un motif d'activation spatiotemporelle uniques 21. Ce modèle est établi par le motif de localisation unique des guanidique facteurs d'échange nucléotidiques Cdc42 (GEFs) Cdc42 qui activent. Le GEF1 FEM localise à l'anneau de actomyosine assemblé et favorise l'apparition de constriction annulaire et septum ingression, tandis que scd1 localise à la membrane fronçant et favorise la formation du septum normal. Nous constatons que le modèle d'activation Cdc42 établi par ses GEFs conduisent à la réglementation des événements cytokinétique distincts.
Pour comprendre le mécanisme moléculaire d'événements qui conduisent finalement à la séparation cellulaire après assemblage d'anneau de actomyosine, il faut suivre les événements cytokinétique distincts dans le temps et l'espace. Dans la levure de fission, cytokinesis implique d'abord l'ensemble des précurseurs nœuds autour du noyau, qui a finalement recrutent la myosine de type II, l'Formin CDC12, et d'autres protéines nécessaires à l'assemblage de bague de actomyosine. Pour le temps des événements cytokinétique distincts et fournir un cadre de référence, la séparation des marqueurs de corps polaires des fuseaux (formation de broche) est considérée comme temps 0 22. L'assemblage de the actomyosine anneau peut être suivi par le suivi au fil du temps l'intensité d'une actomyosine protéine fluorescente marqué de cycle tel que le type II myosine chaîne légère régulatrice RLC1. Nous décrivons ici une approche microscopique pour analyser les différentes étapes de la cytokinèse au fil du temps.
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Protocol
1. Préparation de l'échantillon
- Cultiver des cellules de levure de fission exprimant le pôle de broche corps marqueur SAD1-mCherry 23 et type II myosine chaîne légère régulatrice RLC1-Tomato 24 YE milieu liquide à 32 ° C pendant 8 générations.
REMARQUE: Pour des mutants sensibles à la température, faire croître des cellules à 25 ° C. Cultiver les cellules à la phase mi-log à une DO 600 de 0,5 à YE. Pour en savoir plus sur la fission des conditions de croissance de levure se réfèrent à la levure de Fission manuel de laboratoire 25. - Préparer YE (ou minimes) médias avec 0,6% d'agarose (médias basés Agarose montrent fond moins fluorescent par rapport à l'agar). Sur le support fondu ajoute 1 mM d'acide ascorbique (vitamine C). La vitamine C désaltère les radicaux libres qui sont libérés en raison de photo-blanchiment, minimisant ainsi la photo-toxicité.
- Verser 3 - 4 mL de la vitamine C lacées fondu médias sur une boîte de culture à fond de verre. Laissez refroidir les médias et se solidifier.
Noter lal'épaisseur du verre dans la boîte de culture dépend de l'épaisseur de la lamelle couvre-objet approprié pour le microscope. Ici, l'utilisation lamelle No. 1.5. - Soulevez doucement les médias solidifié de la boîte de culture à l'aide d'un scalpel. Placez une pointe de pipette entre la dalle de support et la boîte de culture pour empêcher la dalle de retomber dans le plat (Figure 1).
- Prendre 1 mL de cellules fraîchement croissance comme décrit dans 1.1 ci-dessus. Faites tourner les cellules doucement à 300 xg pendant 30 s. Jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans la petite quantité de milieu résiduel qui reste dans le tube après avoir éliminé le surnageant.
- Charge 2 - 5 pi de culture cellulaire remis en suspension entre la dalle de support et le fond de verre de la boîte de culture. Les cellules doivent être sur le verre. La pointe de la pipette placée entre les médias et le plat permet le chargement facile de la culture cellulaire.
- Très retirer délicatement la pointe de la pipette et placer la dalle de support dans sa position d'origine sur le cuplat lture. Assurez-vous d'éviter les bulles d'air. Le cas échéant appuyer doucement sur les bulles d'air en faisant glisser le dos d'une pointe de la pipette au-dessus de la dalle de médias.
- Que les cellules sont assis dans la boîte de culture pendant 30 minutes à une heure dans l'obscurité à la température à laquelle la microscopie sera effectuée. Ceci est important pour éviter tout choc en raison du changement dans des conditions de croissance pour les cellules.
2. Image Acquisition
- Placer une goutte d'huile sur la face extérieure du verre sur la boîte de culture. Placez la boîte de culture sur un microscope inversé.
- Pour minimiser auto-fluorescence de YE médias utiliser un filtre GFP avec une gamme de longueur d'onde étroite (520-535 nm).
- Focus sur le plan médian des cellules et veiller à ce qu'ils sont bien espacés et pas trop de monde. Assurez-vous de commencer l'acquisition d'images des cellules dans la phase appropriée du cycle cellulaire. Pour cette expérience, suivez les cellules de la fin G2.
- Programmez le logiciel d' acquisition d'image to prendre GFP, RFP et images DIC des cellules.
- Pour cette expérience, utiliser 100 temps d'exposition de ms DIC et 75 ms de temps d'exposition pour les filtres GFP et RFP. Le temps d'exposition dépend des réglages du microscope, la protéine à l'étude et la durée de l'expérience. Pour les réglages du microscope donné, utiliser 50% de la puissance laser.
- Pour capturer des images en 3 dimensions, le programme du logiciel d'acquisition d'image pour l'imagerie Z-échelle. Utilisez une taille de pas de 0,4 pm et une distance de 3,0 pm (la moitié de z totale) autour du point de mise au point central des cellules. Cela conduit à la capture de 16 Z-images par point de temps avec une distance totale Z de 6 pm.
NOTE: acquisition d'image série Z permet la capture des corps polaires des fuseaux.
- Prenez des images toutes les 2 min. Changer le temps d'exposition en fonction des besoins de l'expérience. Le temps d'exposition peut également être modifiée en fonction de la protéine d'intérêt et l'intensité du signal. Toutefois, notez que courter intervalles ou plus le temps d'exposition augmentation photo-toxicité due au blanchissement et donc les cellules peuvent être suivies que pour un court laps de temps.
- Acquérir les images jusqu'à ce que les cellules séparées physiquement comme observé par les images DIC, ou programmer le logiciel pour arrêter l'acquisition après 90 min.
3. Analyse de l'image
- L' analyse temporelle des événements cytokinétique
- Utilisation du logiciel d'acquisition d'image faire des projections des Z-cadres pour chaque point de temps. Faire des fichiers différents pour chaque longueur d'onde de l'image acquise.
- Exporter cette projection série point de temps en tant que fichier .tiff.
- Analyser les images en utilisant le logiciel ImageJ. Ouvrez la série d'images pour l'une des longueurs d'onde.
- Sélectionnez une cellule à étudier. Double-cliquez sur l'option de ligne de la barre d'outils. Cela va ouvrir une autre fenêtre pour ajuster la largeur de ligne. Ajuster la largeur de ligne pour correspondre à la largeur de la cellule. Pour une cellule WT c'est d'environ 40 - 50 pixels. Tracez une ligne le long de laaxe long de la cellule d'intérêt.
- Cliquez sur Analyse> Outils> Gestionnaire de ROI et cliquez sur ajouter. Cela va ajouter la ligne sélectionnée à la fenêtre de retour sur investissement pour une utilisation ultérieure. Ne fermez pas cette fenêtre.
- Cliquez sur l'image d'intérêt et sélectionnez Modifier> Sélection> Redresser. Cela va ouvrir une autre fenêtre. Cochez la case "Processus ensemble de la pile". Cela redresser la cellule horizontalement.
- Cliquez sur l'image> Transformation> Rotation de 90 degrés vers la droite. Cette image est maintenant redressé verticalement.
- Cliquez sur l'image> Piles> Faire Montage. Cela va ouvrir une fenêtre pour attribuer le nombre de lignes et de colonnes pour la pile, le facteur d'échelle pour la taille de l'image, la première et la dernière tranche (cadre) pour le montage et l'incrément de trame pour le montage. Vérifiez les tranches d'étiquettes et appuyez sur Entrée.
- Comme une fenêtre avec un montage de la cellule d'intérêt est affiché, ouvrir la série d'images pour l'autre longueur d'onde.
- Cliquez sur l'identifiant de ligne sur gestionnaire ROI. Cela permet de sélectionnerla même cellule sur le second fichier image. Répétez les étapes 3.1.6 - 3.1.8. Cela ouvrira un montage de la deuxième image.
- Sur l'image avec la broche corps polaire marqueur SAD1-mCherry, recherchez le début de la séparation du marqueur de corps polaire broche et marquer ce point de temps que le temps 0.
- Suivez le signal RLC1-tomate sur l'image au fil du temps et chercher le signal qui apparaît comme une ligne distincte, par opposition à des taches de RLC1-tomate. Cette fois-point marque l'achèvement du cycle actomyosine montage / début de la phase de maturation.
- scroll Suivant dans le film au fil du temps pour déterminer quand l'anneau RLC1-tomate commence à diminuer en taille. Ceci est marqué comme la fin de la maturation de phase / apparition de l'anneau de constriction.
- Suivez le signal RLC1-tomate au fil du temps tout au long de la constriction jusqu'à ce qu'il apparaisse comme un point au milieu de l'axe de la cellule. Ceci est marqué comme la fin de l'anneau de constriction / fin du septum ingression.
- Après le montage des images DIC, déterminer la dernière celluleséparation. Notez le point de temps lorsque la cellule se sépare physiquement.
- Pour la broche de séparation de corps polaire mesurer la distance entre les deux corps polaires des fuseaux au fil du temps en utilisant l'outil de ligne dans ImageJ. Tracer la distance dans le corps polaire du fuseau au fil du temps.
- Notez les différents points de temps pour les différents événements cytokinétique pour calculer la durée de chaque phase cytokinétique et de comparer avec la séparation du corps polaire du fuseau au fil du temps.
- L' analyse spatiale des événements cytokinétique
- Sélectionnez une cellule avec un anneau de actomyosine visible. Double-cliquez sur l'option de ligne de la barre d'outils ImageJ. Cela va ouvrir une autre fenêtre pour ajuster la largeur de ligne. Régler la largeur de ligne pour correspondre à l'épaisseur de la bague (15 - 20 pixels). Tracez une ligne le long de l'anneau en prenant soin d'assurer la totalité de l'épaisseur de l'anneau est inclus.
- Cliquez sur Analyse> Outils> Gestionnaire de ROI et cliquez sur ajouter. Cela va ajouter la ligne sélectionnée à la fenêtre de retour sur investissement pour une utilisation ultérieure.Ne fermez pas cette fenêtre.
- Cliquez sur l'image d'intérêt et sélectionnez Modifier> Sélection> Redresser. Cela va ouvrir une autre fenêtre. Cochez la case "Processus ensemble de la pile". Cela redresser l'anneau horizontalement.
- Réinitialiser l'intensité du plan lumineux dans le z-stack redressé (de 3.1.6) en utilisant Image> Réglages> Luminosité / Contraste> Réinitialiser.
- Cliquez sur l'onglet Stk> Projet 3D. Cela va ouvrir une boîte de dialogue. Changer la méthode de projection pour Brightest Point et l'espacement Slice à 2 ou 3 pixels. Enfin, l'axe de changement de rotation à X ou Y-axe (cela va changer en fonction de l'angle de vue souhaité), cliquez sur interpoler et cliquez sur OK pour générer une projection 3D de l'image. Utilisez la barre de défilement sous l'image pour faire pivoter l'image.
- Ouvrez la série d'images pour l'autre longueur d'onde en utilisant ImageJ.
- Cliquez sur l'identifiant de ligne sur gestionnaire ROI. Cela permet de sélectionner le même anneau sur le second fichier image. Répétez les étapes 4.2.4 et 4.2.5.Cela va ouvrir une bague 3 dimensions dans l'image avec l'autre longueur d'onde.
- Avec les deux images 3D anneaux ouverts, cliquez sur Image> Couleur> Fusionner les canaux. Cela va ouvrir une boîte. Sélectionnez chaque image dans le menu déroulant pour la couleur correspondante souhaitée vers le bas et cliquez sur OK. Cela va ouvrir un composite de deux images à différentes longueurs d'onde.
- Comparez la localisation des différents marqueurs en ce qui concerne la localisation de l'anneau cytokinétique ou membrane ingressing. RLC1-GFP est un marqueur de l'anneau cytokinétique. Les protéines co-localisant avec RLC1-GFP se localisent à l'anneau tandis que les protéines localisant derrière le signal RLC1-GFP localiser à la membrane ingressing.
REMARQUE: La protéine d'intérêt doit être d'un fluorophore différent de celui du marqueur de l'anneau. - Générer 3 anneaux dimensionnelles au cours des différentes étapes de la cytokinèse pour comparer la localisation spatiale des protéines tout au long de la cytocinèse.
- L' analyse des protéines distribution à anneau cytokinétique
- Pour comparer et analyser la distribution des protéines le long de l'anneau de mesurer le coefficient de la variance de la distribution des protéines. Un haut coefficient de variation indique une répartition inégale des protéines le long du site de division et indique un mauvais assemblage d'anneau, la maturation ou la formation de cloison, selon laquelle la phase est imagé ou analysée.
- Utilisation de 3 dimensions anneau cytokinétique reconstruit (de 3.2.2), diviser l'image en au moins 4 quadrants de telle sorte que le quart de l'anneau apparaît dans chaque quadrant. Pour cela, utilisez l'outil de ligne pour tracer des lignes perpendiculaires sur l'image. Après chaque ligne cliquez sur l'image> Overlay> Ajouter la sélection ou utiliser raccourci Ctrl + B.
- Aller à Analyse> Définir la mesure. Sélectionnez la valeur de gris moyen dans la boîte qui ouvre. Cliquez sur OK.
- En utilisant les lignes tracées ci-dessus comme guides dessinent un rectangle pour définir chaque quadrant en utilisant l'outil de rectangle.
- Pour mesurer l'intensité moyenne de chaque quadrant, cliquez sursur Analyse> Mesure ou utilisez le raccourci Ctrl + M.
- Notez la valeur de gris moyenne pour les quatre quadrants (MG 1 -MG 4).
- Sélectionnez une petite zone dans chaque quadrant extérieur de l'anneau que la sélection d'arrière-plan.
- Mesurer la valeur de gris moyen pour la sélection d'arrière - plan pour les quatre quadrants (BG 1 -BG 4).
- li> Pour soustraction de fond pour chaque utilisation quadrant les suivantes MG 1 formula- -Moyenne (BG 1: BG 4) = Intensité de l' anneau dans chaque quadrant (IRQ). A ce stade, il y a 4 valeurs IRQ, un pour chaque quadrant.
- Suivant calculer le coefficient de variance pour chaque cycle en utilisant la déviation standard formula- suivante (IRQ 1: IRQ 4) / moyenne (IRQ 1: IRQ 4). Calculer la moyenne Co-efficace de la variance pour chaque souche et comparer aux autres souches.
NOTE: Une augmentation statistiquement significative de la co-efficace de la variance dans une souche par rapport aux contrôles indcats inégale protéine de distribution / livraison le long du site de la division à ce stade de la cytocinèse.
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Representative Results
Des cellules de levure de Fission exprimant le marqueur de cycle, RLC1-GFP (vert, Figure 2) et de la broche marqueur de corps polaire SAD1-mCherry (rouge, Figure 2) ont été imagées au cours cytokinèse. Début de la broche marqueur de corps polaire (flèche blanche, les figures 2A, B) est considéré comme temps 0. signal de RLC1-GFP apparaît au moment -4 min en référence à la broche de séparation de corps polaire (flèche rouge, les figures 2A, 2B). Le signal RLC1-GFP forme un anneau 10 broche de poste min séparation de corps polaire continue (flèche ouverte, les figures 2A, B) marquant la fin de l' assemblage de bague de actomyosine. L'anneau de actomyosine (RLC1-GFP) commence à diminuer en largeur 22 min après l' achèvement de l' assemblage de bague et 32 min après la broche de séparation de corps polaire (flèche fermée, les figures 2A, B). constriction Ring se termine 20 minutes après le début de la constriction, 42 min depuis le début de l'assemblage de bague et 52 min depuis la séparation de corps polaire broche (asteris blanck, les figures 2A, B). Enfin, abscission cellulaire se produit 72 broche de poste min séparation du corps polaire (flèche rouge, les figures 2A, B).
La localisation du marqueur de cycle RLC1-tomate et le marqueur de la membrane septum Bgs1-GFP ont été analysées sur le site de la division tout au long de la cytokinèse. Reconstruction 3D de l'anneau a révélé que l' anneau de actomyosine marqué avec RLC1-Tomato assemblé avant le recrutement Bgs1-GFP (Figure 3, 10 min). Au cours de la phase de maturation du cycle Bgs1-GFP a été recruté sur le site de division et de chevauchement avec la bague de actomyosine comme indiqué par RLC1-tomate (Figure 3, 30 min). Cela indique que Bgs1 localise à l'anneau lors du recrutement. Comme l'anneau constriction, Bgs1-GFP localise également à la membrane ingressing adjacente à l'anneau de constriction (figure 3, 40 min). A la fin du rétrécissement, le signal Bgs1-GFP est visible à la barri membranaire ingresseder (Figure 3, 50 min). Enfin, après rétrécissement du signal RLC1-tomate est absent, tandis que Bgs1-GFP semble se localiser à travers la barrière de la membrane avec un aspect semblable à disque (Figure 3, 60 min). Ainsi , ces observations indiquent que le septum enzyme synthétisant Bgs1 localise sur le ring après assemblage et persiste après l' anneau de constriction à la barrière de la membrane comme cela a été rapporté avant le 17.
La répartition des protéines le long de l'anneau de actomyosine a été analysé pour déterminer l' efficacité des événements cytokinétique (figure 4). La répartition inégale ou non homogène de protéines le long de la bague de actomyosine a été associée à une altération de signalisation et cytokinétique inefficace ensemble bague 26. Ici , nous montrons deux anneaux 3D reconstruite au cours de la phase de maturation, exprimant la protéine F-Bar Cdc15-GFP (figure 4). L'imagesur la gauche montre une distribution uniforme de Cdc15-GFP le long de la bague avec un faible coefficient de variance (0,098), alors que l'image de droite montre une répartition inégale avec un haut coefficient de variance (0,226, Figure 4).
Figure 1: Préparation de Dish Culture for Imaging. Schéma inoculation décrivant des cellules dans une boîte de culture à fond de verre recouvert de tapis de médias. Voir protocole pour plus de détails (section 1). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 Moment de cytokinétique Evénements S. pombe. (A) Montage d'un SPINDL exprimant des cellulese marqueur de corps polaire SAD1-mCherry (panneau de gauche), la protéine de cycle RLC1-GFP (panneau du milieu) et champ lumineux (panneau de droite) subissant la cytokinèse est représenté à intervalles de 2 min. Les flèches blanches marque broche pôle corps (centrosome) séparation à 17 min, la flèche rouge marque le recrutement initial de RLC1-GFP sur le site de division, ouvert les flèches anneau maturation à 27 min, tête de flèche marque le début de l'anneau de constriction à 47 min, les marques de astérisques extrémité de l'anneau de constriction à 69 min et arrowhead rouge marque abscission cellulaire à 97 min. (B) Chronologie des événements cytokinétique avec référence à la mitose comme déterminer par broche pôle formation de corps et de séparation. Les cellules ont été imagées à 25 ° C. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: CeDivision II du site pendant les différentes étapes de Cytocinèse. reconstruction 3D de l'anneau de actomyosine Z-piles au cours des différentes étapes de la cytokinèse pour la même cellule, ensemble d'anneau (10 min après pôle broche corps de séparation), l'anneau de maturation (de séparation de corps polaire poste de broche 30 min), l'anneau de constriction (pôle post broche 40 min séparation de corps), fin de la constriction (après pôle broche séparation de corps de 50 min), barrière de septum (poste pôle broche de séparation de corps de 60 min). RLC1-tomate marque anneau tout Bgs1-GFP marque la membrane plasmique enveloppant le septum. Barre d'échelle = 5 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Répartition des protéines le long du Ring. Images de 3D reconstruit anneau actomyosine de type sauvage caunes exprimant Cdc15-GFP divisés en quatre quadrants. Le coefficient de variance de chaque anneau soit indiqué. Barre d'échelle = 5 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ici, nous avons décrit un protocole pour étudier les événements cytokinétique dans la levure de fission d'une manière temporelle. Le protocole décrit ici fournit une résolution temporelle des événements différents cytokinétique en se référant à l'autre; moment du recrutement de protéines ou de la perte par rapport à la phase cytokinétique; la structure de l'anneau à travers les différentes phases de la cytokinèse; et la progression de la cytokinèse en se référant à la mitose. Avec ce protocole, il est possible de définir avec précision la phase cytokinétique qui peut être modifiée dans différents mutants, fournissant ainsi une compréhension plus détaillée des protéines impliquées dans les différentes phases de la cytokinèse. En outre, la capacité de distinguer différentes phases temporellement cytokinétique permettra l'analyse des mécanismes moléculaires qui conduisent à l'organisation des différentes phases de la cytokinèse. La résolution temporelle de différents événements cytokinétique permet également à l'analyse de la répartition de la structure en anneau et protéines cytokinétiquetout au long des différents événements. La localisation spatio-temporelle des protéines différentes peuvent être comparées et analysées avec cette approche. Avec l'utilisation de fluorophores appropriés, de multiples protéines peuvent être étudiés et comparés les uns aux autres. En plus ici, nous avons également décrit comment la distribution des protéines le long de l'anneau peut être analysé pour déterminer l'organisation de protéines ou de livraison sur le site de la division. Alors que le protocole décrit ici est valable pour la levure de fission cytokinèse, cette approche peut également être utilisée pour étudier la cytokinèse dans d'autres levures et champignons avec des changements appropriés aux conditions de croissance et d'imagerie.
Ce protocole implique des cellules vivantes imagerie comme ils divisent. Les cellules imagées en utilisant ce protocole ont besoin pour croître dans des conditions optimales pour éviter les effets pleotropic. Il faut prendre soin de ne pas évincer les cellules dans le champ de vision, en tant que cellules excessives peuvent conduire à une perte rapide des éléments nutritifs. En outre fluorophores d'imagerie dans les cellules conduit à la toxicité due à la libreles radicaux libérés en raison de la photo-blanchiment. Ceci peut être minimisé par addition d'un composé d'extinction des radicaux libres, tels que l'acide ascorbique. L'addition de l'acide ascorbique permet l'imagerie prolongée des cellules au microscope. Lors de l'acquisition d'image, l'ensemble de l'axe Z de la cellule doit être imagé pour assurer la capture des corps polaires des fuseaux. L'absence d'un signal approprié pour les corps polaires des fuseaux ne permettra pas la résolution temporelle appropriée de la cytokinèse. En particulier, il convient de veiller précisément à l'image de la séparation initiale des marqueurs de corps polaires des fuseaux comme cela est temps 0. capture correcte des cellules le long de l'axe Z est également critique pour appropriées 3 reconstructions tridimensionnelles des anneaux et des cloisons.
Pour l'image des sections transversales des anneaux et septa, le protocole décrit ici peuvent être modifiés avec un puits microfabriqué qui permet aux cellules de levure de fission en forme de tige à être placé verticalement pour l'imagerie le long du grand axe de la CEll comme cela a été rapporté ici 27. Alors que ce protocole peut capturer de manière très précise le recrutement de la protéine et la localisation dans le temps sur le site de la division cellulaire de la résolution spatiale des images est limitée en raison de la résolution du microscope utilisé. Super-résolution microscopie peut aider à améliorer la résolution spatiale mais peut affecter la résolution temporelle. Les progrès récents en microscopie tels que réseau microscopie nappe de lumière peut aider à améliorer la résolution spatiale sans compromettre la résolution temporelle 28. Outre la microscopie optique, la cytokinèse dans la fission levure peut également être étudiée au fil du temps en utilisant la spectroscopie Raman 29, 30.
En utilisant cette approche , nous avons signalé que la petite GTPase Cdc42 subit un motif spatiotemporel unique activation lors de la cytocinèse 21. Cette approche nous permet d'étudier l'organisation de différents événements cytokinétiques au fil du temps et de décrire les détails moléculaires de ces événements. Des rapports ont suggéré que la présence d'un anneau actomyosine assemblé seul ne suffit pas pour efficace froncement membranaire et cytocinèse 11, 21, 31. Le protocole décrit ici peut être utilisé pour enquêter sur les événements moléculaires qui conduisent à la cytokinèse appropriée après l'assemblage de bague de actomyosine. En outre, l'intégrité de l'anneau de actomyosine et son effet sur froncement de la membrane et le septum ingression peut être examiné. Cela permettra de mieux comprendre les différents événements moléculaires qui conduisent ensemble à une séparation réussie.
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Disclosures
Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract media | Sunrise Science Products | YES 225 | 0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine |
| Agarose | SeaKem LE agarose, Lonza | 50001 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Glass Bottomed culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used. |
| VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system | Visitech International, UK | with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu). | |
| ImageJ | NIH | Image analysis software |
References
- Pollard, T. D.
- Guertin, D. A., Trautmann, S., McCollum, D.
- Xu, X., Vogel, B. E. A secreted protein promotes cleavage furrow maturation during cytokinesis. Curr Biol. 21 (2), 114-119 (2011).
- Sagona, A. P., Stenmark, H.
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437 (7061), 1043-1047 (2005).
- Li, R. Cytokinesis in development and disease: variations on a common theme. Cell Mol Life Sci. 64 (23), 3044-3058 (2007).
- Daniels, M. J., Wang, Y., Lee, M., Venkitaraman, A. R. Abnormal cytokinesis in cells deficient in the breast cancer susceptibility protein BRCA2. Science. 306 (5697), 876-879 (2004).
- Storchova, Z., Pellman, D. From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (1), 45-54 (2004).
- Lee, I. J., Coffman, V. C., Wu, J. Q. Contractile-ring assembly in fission yeast cytokinesis: Recent advances and new perspectives. Cytoskeleton (Hoboken). 69 (10), 751-763 (2012).
- Balasubramanian, M. K., Bi, E., Glotzer, M. Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells. Curr Biol. 14 (18), R806-R818 (2004).
- Proctor, S. A., Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Contributions of turgor pressure, the contractile ring, and septum assembly to forces in cytokinesis in fission yeast. Curr Biol. 22 (17), 1601-1608 (2012).
- Munoz, J., et al. Extracellular cell wall beta(1,3)glucan is required to couple septation to actomyosin ring contraction. J Cell Biol. 203 (2), 265-282 (2013).
- Wang, N., Lee, I. J., Rask, G., Wu, J. Q. Roles of the TRAPP-II Complex and the Exocyst in Membrane Deposition during Fission Yeast Cytokinesis. PLoS Biol. 14 (4), e1002437 (2016).
- Liu, J., Wang, H., McCollum, D., Balasubramanian, M. K. Drc1p/Cps1p, a 1,3-beta-glucan synthase subunit, is essential for division septum assembly in Schizosaccharomyces pombe. Genetics. 153 (3), 1193-1203 (1999).
- Cortes, J. C., et al. The (1,3)beta-D-glucan synthase subunit Bgs1p is responsible for the fission yeast primary septum formation. Mol Microbiol. 65 (1), 201-217 (2007).
- Cortes, J. C., et al. Cooperation between Paxillin-like Protein Pxl1 and Glucan Synthase Bgs1 Is Essential for Actomyosin Ring Stability and Septum Formation in Fission Yeast. PLoS Genet. 11 (7), e1005358 (2015).
- Cortes, J. C., Ishiguro, J., Duran, A., Ribas, J. C. Localization of the (1,3)beta-D-glucan synthase catalytic subunit homologue Bgs1p/Cps1p from fission yeast suggests that it is involved in septation, polarized growth, mating, spore wall formation and spore germination. J Cell Sci. 115 (Pt 21), 4081-4096 (2002).
- Liu, J., Tang, X., Wang, H., Oliferenko, S., Balasubramanian, M. K. The localization of the integral membrane protein Cps1p to the cell division site is dependent on the actomyosin ring and the septation-inducing network in Schizosaccharomyces pombe. Mol Biol Cell. 13 (3), 989-1000 (2002).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15 (2), 838-850 (2004).
- Figard, L., Xu, H., Garcia, H. G., Golding, I., Sokac, A. M. The plasma membrane flattens out to fuel cell-surface growth during Drosophila cellularization. Dev Cell. 27 (6), 648-655 (2013).
- Wei, B., et al. Unique Spatiotemporal Activation Pattern of Cdc42 by Gef1 and Scd1 Promotes Different Events during Cytokinesis. Mol Biol Cell. , (2016).
- Nabeshima, K., et al. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9 (11), 3211-3225 (1998).
- Johnson, A. E., Gould, K. L. Dma1 ubiquitinates the SIN scaffold, Sid4, to impede the mitotic localization of Plo1 kinase. EMBO J. 30 (2), 341-354 (2011).
- Yonetani, A., Chang, F.
- Fission Yeast: A laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
- Hachet, O., Simanis, V. Mid1p/anillin and the septation initiation network orchestrate contractile ring assembly for cytokinesis. Genes Dev. 22 (22), 3205-3216 (2008).
- Zhou, Z., et al. The contractile ring coordinates curvature-dependent septum assembly during fission yeast cytokinesis. Mol Biol Cell. 26 (1), 78-90 (2015).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Huang, Y. S., Karashima, T., Yamamoto, M., Hamaguchi, H. O. Molecular-level investigation of the structure, transformation, and bioactivity of single living fission yeast cells by time- and space-resolved Raman spectroscopy. Biochemistry. 44 (30), 10009-10019 (2005).
- Huang, C. K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging. Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).
- Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe. Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).
