Summary
Die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe ist ein ausgezeichnetes Modellsystem cytokinesis studieren, die letzte Stufe in der Zellteilung. Hier haben wir einen Mikroskopie-Ansatz beschreiben verschiedene zytokinetischen Ereignisse in Live-Spalthefezellen analysieren.
Abstract
Zytokinese, der letzte Schritt in der Zellteilung ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Integrität Genoms. Proper Zytokinese ist wichtig für die Zelldifferenzierung und Entwicklung. Cytokinesis beinhaltet eine Reihe von Ereignissen, die in Zeit und Raum gut aufeinander abgestimmt sind. Cytokinesis beinhaltet die Bildung eines Aktomyosin Ring an der Teilungsebene, gefolgt von Ringverengung, Membran Furche Bildung und extrazellulären Matrixumbau. Die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) ist ein gut untersuchtes Modellsystem , das mit erheblichen Klarheit die ersten Ereignisse in cytokinesis offenbart hat. Allerdings verstehen wir nicht klar, wie verschiedene zytokinetischen Ereignisse räumlich-zeitlich aufeinander abgestimmt sind. Um dies zu bestimmen, muss man die verschiedenen zytokinetischen Ereignisse in großen Details sowohl zeitlich als auch räumlich zu analysieren. Hier haben wir einen Mikroskopie-Ansatz beschreiben verschiedene zytokinetischen ev zu untersuchenents in lebenden Zellen. Mit diesem Ansatz ist es möglich, verschiedene zytokinetischen Ereignisse und bestimmen den Zeitpunkt der Rekrutierung von verschiedenen Proteinen während der Zellteilung zu Zeit. Darüber hinaus beschreiben wir Protokolle Proteinlokalisierung und Verteilung an der Stelle der Zellteilung zu vergleichen. Dies ist ein einfaches Protokoll Zytokinese in Spalthefe zu studieren, und kann auch für andere Hefen und Pilzsystemen verwendet werden.
Introduction
Cytokinesis, der letzte Schritt bei der Zellteilung, ist ein komplexer Prozess essentiell für die Differenzierung, die Entwicklung und das Überleben eines Organismus. Cytokinesis umfasst mehrere Veranstaltungen , die organisiert werden erfolgreiche Zelltrennung zu gewährleisten , während genomische Integrität beibehalten 1. Cytokinesis beinhaltet Veranstaltungen , bei denen ein Aktomyosin Ring einmal Einschnürung montiert erfährt, die mit Membranausdehnungs und Runzeln gleichzeitig ist, und die extrazelluläre zelluläre Matrix Umbau, gefolgt schließlich von Zelle abscission 1, 2, 3. Eine falsche Organisation von zytokinetischen Ereignisse können zu Zellseparation und Ploidie Defekten führen und können Krankheiten wie Krebs 4 verursachen, 5, 6, 7, 8. Die grundlegenden Prinzipien, die ermöglichen organisation von zytokinetischen Ereignisse sind nicht gut verstanden, was zu Straßensperren in unserem Verständnis der Ätiologie dieser Krankheiten führt.
Die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) ist ein ausgezeichnetes Modellsystem cytokinesis aufgrund der konservierten Natur der beteiligten Proteine 1 studieren. In Spalthefe, nachdem Aktomyosin Ringanordnung tritt der Ring eine Reifung / Ruhephase , wo es nicht 9 nicht einengen. Ausreifung endet mit Beginn Actomyosinaktivität Schnürring, gleichzeitig mit Membran Runzeln und Septum ingression. Seminal Arbeit im Laufe der Jahre haben wir 1, ein ziemlich gutes Verständnis Actomyosinaktivität Ringanordnung in Spaltung 9, 10 Hefe gegeben. In einigen Eukaryonten, einschließlich Spalthefe, erfolgreiche Montage des Aktomyosin Ring ist für die Membran Runzeln nicht ausreichend. in fission Hefe, allein Schnürring ist jedoch nicht ausreichend Druckkraft interne turgor zu überwinden für Furche Bildung 11. Ein aktuelles Modell zeigt , dass diese Kraft anstelle von Septum ingression 11 vorgesehen ist. In einem anderen Modell hat sich die Rolle der Plasmamembran Erweiterung vorgeschlagen Bildung 12, 13 zu furchen beizutragen. Ring Verengung und Membran Runzeln treten nicht in Bgs1 / Cps1 temperaturempfindliche Mutante cps1-191, das Hauptenzym für die primäre Septenbildung 14, 15. Die Zellen Bgs1 zeigen defekte primäre Septum und verlängerte Ringverengung 15, fehlt 16. Bgs1 für Septum ingression während der Reifung zur Zellteilung Ort rekrutiert nach Aktomyosin Ringanordnung 17, 18. Similarly, während Zellularisierung in Drosophila - Embryos ist Schnürring zweiphasige mit einer deutlich langsamer initialer Einschnürung Rate 19, die Reifephase ähnelt in Spalthefe beobachtet. Biphasische Schnürring verlangsamen Membran Runzeln für eine ausreichende Membranausdehnungs 20 und Modifikation von extrazellulären Matrix zu ermöglichen. Dies deutet darauf hin, dass nach Aktomyosin Ringanordnung tritt Schnürring effizient nur dann, wenn die Zelle die Anforderungen für die Furche Bildung erfüllt hat. Es ist nicht gut verstanden, welche Bedingungen für Aktomyosin Schnürring nach Ringanordnung erforderlich sind, noch die molekularen Ereignisse, die diesen Prozess regulieren. Wir haben kürzlich gezeigt , dass Montage folgende Aktomyosin Ring die kleine GTPase Cdc42 ein einzigartiges Muster Raum - Zeit - Aktivierung unterzogen 21. Dieses Muster wird durch die einzigartige Lokalisierungsmuster der Austauschfaktoren Cdc42 Guanidin Nukleotid etabliert (GEFs), die Cdc42 aktivieren. Die GEF Gef1 lokalisiert an den Aktomyosin Ring montiert und fördert Einsetzen der Ringverengung und Septum ingression, während scd1 auf die furch Membran lokalisiert und fördert die normale Septenbildung. Wir finden, dass das Muster Cdc42 Aktivierung durch seine GEFs der Regulierung verschiedener zytokinetischen Ereignisse führen etabliert.
Um den molekularen Mechanismus der Ereignisse zu verstehen, die schließlich folgende Aktomyosin Ringanordnung zur Trennung von Zellen führen, muss man die unterschiedlichen zytokinetischen Ereignisse in Zeit und Raum zu folgen. In Spalthefe beinhaltet Zytokinese zunächst die Montage von Vorläuferknoten um den Kern, die schließlich den Typ II Myosin rekrutieren, die formin CDC12 und anderen erforderlichen Proteine zur Actomyosin Ringanordnung. Um Zeit einen Bezugsrahmen, ist die deutliche zytokinetischen Ereignisse und liefern die Trennung von Spindel Polkörper Marker (Spindelbildung) als Zeitpunkt 0 22 betrachtet. Die Montage von the Aktomyosin Ring kann durch die Überwachung im Laufe der Zeit die Intensität eines fluoreszierend markierten Aktomyosin Ring Protein wie der Typ-II-Myosin regulatorische leichte Kette RLC1 folgen. Hier haben wir einen mikroskopischen Ansatz beschreiben zu verschiedenen Stadien der Zellteilung im Laufe der Zeit zu analysieren.
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Protocol
1. Herstellung der Probe
- Wachsen Spalthefe - Zellen, die die Spindel Polkörper Marker SAd1-mCherry 23 und Typ - II - Myosin regulatorische leichte Kette RLC1-Tomate 24 in YE flüssigen Medien bei 32 ° C für 8 Generationen.
HINWEIS: Bei temperaturempfindlichen Mutanten wachsen Zellen bei 25 ° C. Wachsen Zellen bis zur mittleren logarithmischen Phase bis zu einer OD 600 von 0,5 in YE. Weitere Informationen über die Spaltung beziehen Hefe Wachstumsbedingungen der Spalthefe Laborhandbuch 25. - Bereitet (oder minimal) Medien mit 0,6% Agarose (Agarose basierte Medien zeigen weniger fluoreszierenden Hintergrund im Vergleich zu Agar). Um das geschmolzene Medien hinzufügen 1 mM Ascorbinsäure (Vitamin C). Das Vitamin C quencht freie Radikale, die durch Photobleaching freigesetzt werden, wodurch Phototoxizität zu minimieren.
- Gießen Sie 3 bis 4 ml der Vitamin-C-Medien geschmolzen geschnürt auf einen Glasboden Kulturschale. Lassen Sie die Medien kühl und zu verfestigen.
Beachten Sie dasDicke des Glases in der Kulturschale, hängt von der Deckglasdicke geeignet für das Mikroskop. Hier Gebrauch Deck Nr 1.5. - erhöhen Sie vorsichtig die verfestigte Medien aus der Kulturschale mit Hilfe eines scharfen Skalpell. Legen Sie eine Pipettenspitze zwischen dem Medienplatte und der Kulturschale die Platte zu verhindern , fallen zurück in die Schale (Abbildung 1).
- Nehmen Sie 1 ml frisch wachsenden Zellen, wie in 1.1 oben beschrieben. Drehen Sie die Zellen vorsichtig bei 300 g für 30 s. Überstand verwerfen. Resuspendieren der Zellen in der geringen Menge an Rest Medien, das nach dem Verwerfen des Überstandes in der Röhre verbleibt.
- Last von 2 bis 5 & mgr; l der resuspendierten Zellkultur zwischen dem Medienplatte und den Glasboden der Kulturschale. Die Zellen sollten auf dem Glas sein. Die Pipettenspitze zwischen den Medien gegeben und die Schale ermöglicht eine einfache Beladung der Zellkultur.
- Sehr sanft die Pipettenspitze entfernen und die Medienplatte wieder in seine ursprüngliche Position auf dem culture Gericht. Achten Sie darauf, alle Luftblasen zu vermeiden. Wenn die Notwendigkeit, die Luftblasen durch Verschieben der Rückseite einer Pipettenspitze auf der Oberseite der Medienplatte herausdrücken sanft werden.
- Lassen sich die Zellen bei der Temperatur für 30 min bis eine Stunde in der Dunkelheit in der Kulturschale sitzen, an der Mikroskopie durchgeführt wird. Dies ist wichtig, jeden Schlag zu vermeiden aufgrund der Wachstumsbedingungen für die Zellen zu ändern.
2. Image Acquisition
- Einen Tropfen von Öl auf der Außenseite des Glases auf der Kulturschale. Legen Sie die Kulturschale auf einem inversen Mikroskop.
- (- 535 nm 520) Autofluoreszenz von YE Medien verwenden, um eine GFP-Filter mit einem schmalen Wellenlängenbereich zu minimieren.
- Konzentrieren Sie sich auf der medialen Ebene der Zellen und sicherzustellen, dass sie gut verteilt sind und nicht zu voll. Stellen Sie sicher, Bildaufnahme der Zellen in der geeigneten Phase des Zellzyklus zu starten. Für dieses Experiment folgen Zellen vom späten G2.
- Programmieren Sie die Bildaufnahme - Software to nehmen GFP, RFP und DIC Bilder der Zellen.
- Für dieses Experiment wurden 100 ms Belichtungszeit für die DIC verwenden und 75 ms Belichtungszeit für GFP und RFP-Filter. Die Belichtungszeit hängt von den Einstellungen des Mikroskops, das Protein untersucht und der Dauer des Experiments. Für den gegebenen Mikroskopeinstellungen, verwenden 50% der Laserleistung.
- So erfassen Bilder in 3 Dimensionen, Programm der Bilderfassungssoftware für Z-Skala Bildgebung. Verwenden Sie einen Schrittgröße von 0,4 um und einem Abstand von 3,0 um (die Hälfte der gesamten z) um den zentralen Fokuspunkt der Zellen. Dies führt zur Erfassung von 16 Z-Frames pro Zeitpunkt mit insgesamt Z-Abstand von 6 um.
HINWEIS: Z-Serie Bildaufnahme ermöglicht die Erfassung der Spindel Polkörper.
- Nehmen Sie Bilder alle 2 min. Verändern der Belichtungszeit entsprechend den Anforderungen des Experiments. Die Belichtungszeit kann auch nach dem interessierenden Protein und der Signalstärke verändert werden. Beachten Sie jedoch, dass die kurzeer Intervallen oder längere Belichtungszeit Erhöhung Phototoxizität aufgrund Bleichen und daher können die Zellen nur für eine kurze Zeit verfolgt werden.
- Erwerben Sie Bilder bis in die Zellen physikalisch getrennt, wie durch die DIC Bilder beobachtet, oder die Software programmieren, um Erwerb nach 90 min zu stoppen.
3. Bildanalyse
- Zeitliche Analyse der zytokinetischen Ereignisse
- Mit Hilfe der Bildaufnahme-Software machen Projektionen der Z-Frames für jeden Zeitpunkt. Machen Sie verschiedene Dateien für jede Wellenlänge des Bildes erfasst.
- Exportieren Sie diese Projektion Zeitpunkt Serie als Tiff-Datei.
- Analysieren Sie die Bilder ImageJ-Software. Öffnen der Bilderserie für jede eine der Wellenlängen.
- Wählen Sie eine Zelle untersucht werden. Klicken Sie doppelt auf die Zeile Option der Symbolleiste. Dies wird ein weiteres Fenster öffnen, um Linienbreite anpassen. Stellen Sie die Linienbreite zur Zellenbreite entspricht. Für eine WT-Zelle ist dies etwa 40 - 50 Pixel. Zeichnen Sie eine Linie entlang derlangen Achse der Zelle von Interesse.
- Klicken Sie auf Analysieren> Tools> ROI-Manager und klicken Sie auf Hinzufügen. Dadurch wird die ausgewählte Zeile in die ROI-Fenster für den Einsatz später hinzufügen. Sie dieses Fenster nicht schließen.
- Klicken Sie auf das Bild von Interesse und wählen Sie Bearbeiten> Auswahl> Begradigen. Dies wird ein weiteres Fenster öffnen. Check "gesamte Stapel verarbeiten". Dadurch wird die Zelle horizontal auszurichten.
- Klicken Sie auf Bild> Transformieren> Drehen um 90 Grad nach rechts. Dieses Bild ist nun vertikal gestreckt.
- Klicken Sie auf Bild> Stacks> Make Montage. Dadurch wird ein Fenster geöffnet, um die Anzahl der Zeilen und Spalten für den Stapel, der Skalierungsfaktor für die Bildgröße, die erste und die letzte Scheibe (Rahmen) für die Montage und der Rahmen Schrittweite für die Montage zuordnen. Überprüfen Etikett Scheiben und drücken Sie die Eingabetaste.
- Als ein Fenster mit einer Montage der Zelle von Interesse gezeigt wird, öffnen Sie die Bildserien für die andere Wellenlänge.
- Klicken Sie auf die Zeilennummer auf ROI-Manager. Dies wird wählendie gleiche Zelle auf der zweiten Bilddatei. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.6 - 3.1.8. Dies wird eine Montage des zweiten Bildes öffnen.
- Auf dem Bild mit dem Körper Marker Spindelpoltrennung SAd1-mCherry, suchen Sie nach Beginn der Trennung der Spindel Polkörper Marker und diesem Zeitpunkt als Zeitpunkt 0 zu markieren.
- Folgen Sie dem RLC1-Tomato-Signal auf das Bild im Laufe der Zeit und suchen Sie nach dem Signal, das als eigenständige Linie erscheint im Gegensatz zu Patches von RLC1-Tomaten. Diese Zeitpunkt markiert Abschluss Actomyosinaktivität Ringanordnung / Beginn der Reifephase.
- Weiter blättern durch den Film über die Zeit zu bestimmen, wann der RLC1-Tomate Ring in der Größe zu sinken beginnt. Dies wird als das Ende der Reifungsphase / Einsetzen der Ringverengung gekennzeichnet.
- Folgen der RLC1-Tomato-Signal über die Zeit im ganzen Einschnürung bis es als ein Punkt in der Mitte der Zellenachse erscheint. Dies wird als das Ende der Ringverengung / Ende Septum ingression markiert.
- Nach der Montage der DIC Bilder, bestimmen die endgültige ZellTrennung. Notieren Sie sich den Zeitpunkt, wenn die Zelle physikalisch trennt.
- Für Spindel Polkörper Trennung messen Sie den Abstand zwischen den beiden Spindel Polkörper im Laufe der Zeit das Linienwerkzeug in ImageJ. Zeichnen Sie die Strecke in Spindel Polkörper über die Zeit.
- Notieren Sie die verschiedenen Zeitpunkte für die verschiedenen zytokinetischen Ereignisse die Dauer der einzelnen zytokinetischen Phase zu berechnen und zu vergleichen mit Spindel Polkörper Trennung über die Zeit.
- Räumliche Analyse von zytokinetischen Veranstaltungen
- Wählen Sie eine Zelle mit einem sichtbaren Aktomyosin Ring. Klicken Sie doppelt auf die Zeilenoption von ImageJ Symbolleiste. Dies wird ein weiteres Fenster öffnen, um Linienbreite anpassen. Stellen Sie die Linienbreite auf die Ringdicke zu entsprechen (15 bis 20 Punkte). Zeichnen Sie eine Linie entlang des Rings kümmert sich die gesamte Dicke des Rings, um sicherzustellen, ist im Preis inbegriffen.
- Klicken Sie auf Analysieren> Tools> ROI-Manager und klicken Sie auf Hinzufügen. Dadurch wird die ausgewählte Zeile in die ROI-Fenster für den Einsatz später hinzufügen.Sie dieses Fenster nicht schließen.
- Klicken Sie auf das Bild von Interesse und wählen Sie Bearbeiten> Auswahl> Begradigen. Dies wird ein weiteres Fenster öffnen. Check "gesamte Stapel verarbeiten". Dadurch wird der Ring horizontal auszurichten.
- Setzen Sie die Intensität der hellsten Ebene in der gestreckten Z-Stapel (von 3.1.6) Bild mit> Anpassen> Helligkeit / Kontrast> Zurücksetzen.
- Klicken Sie auf die Registerkarte Stk> 3D-Projekt. Dadurch wird ein Dialogfeld geöffnet. Ändern Sie den Projektionsverfahren auf hellste Punkt und dem Slice-Abstand auf 2 oder 3 Pixel. Schließlich ändern Drehachse X oder Y-Achse (dies hängt von der gewünschten Betrachtungswinkel ändern, je nachdem), klicken Sie interpolieren und OK klicken, um eine 3D-Projektion des Bildes zu erzeugen. Verwenden Sie die Bildlaufleiste unter dem Bild, um das Bild zu drehen.
- Öffnen Sie das Bild Serie für die andere Wellenlänge mit ImageJ.
- Klicken Sie auf die Zeilennummer auf ROI-Manager. Dies wird den gleichen Ring auf dem zweiten Bild-Datei auswählen. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.4 und 4.2.5.Dies wird mit der anderen Wellenlänge, die eine 3-dimensionale Ring im Bild zu öffnen.
- Mit den beiden 3D-Bild Ringe öffnen, klicken Sie auf das Bild> Farbe> Kanäle zusammenführen. Dies wird eine Box zu öffnen. Wählen Sie jedes Bild aus dem Dropdown-Menü für die entsprechende Farbe gewünscht und klicken Sie auf OK. Es öffnet sich ein Verbund aus den beiden Bildern bei unterschiedlichen Wellenlängen.
- Vergleichen Sie die Lokalisierung von verschiedenen Markern in Bezug auf die Lokalisierung am zytokinetischen Ring oder eindringende Membran. RLC1-GFP ist ein Marker für die zytokinetischen Ring. Proteine co-lokalisierenden mit RLC1-GFP in den Ring zu lokalisieren während Proteine hinter RLC1-GFP-Signal zu lokalisieren, um die eindringenden Membran zu lokalisieren.
HINWEIS: Das Protein von Interesse muss von einem anderen Fluorophor zu sein, als die des Ringmarkierung. - Generieren 3-dimensionale Ringe während verschiedener Stadien der Zellteilung die räumliche Lokalisierung der Proteine alle durch cytokinesis zu vergleichen.
- Analyse von Protein distriteilung bei zytokinetischen Ring
- Zu vergleichen und zu analysieren Verteilung von Proteinen entlang des Rings der Koeffizient der Varianz der Proteinverteilung messen. Ein hoher Koeffizient der Varianz zeigt eine ungleichmäßige Verteilung von Proteinen entlang der Teilungsstelle und schlägt vor unsachgemäßen Ringanordnung, Reifung oder Septum Bildung, je nachdem, welche Phasen abgebildet oder analysiert wird.
- Unter Verwendung von 3 dimensionalen rekonstruierten zytokinetischen Ring (ab 3.2.2), teilen sich das Bild in mindestens vier Quadranten, so dass ein Viertel des Rings in jedem Quadranten erscheint. Dazu das Linienwerkzeug verwenden, um senkrechte Linien auf dem Bild zeichnen. Nach jedem Klick Bildzeile> Overlay> Auswahl hinzufügen oder Abkürzung Strg + B verwenden.
- Zum Analysieren> Set-Messung. Wählen mittleren Grauwert in dem Feld, das sich öffnet. OK klicken.
- Mit den gezogenen Linien oben als Führer zeichnen ein Rechteck jedem Quadranten mit dem Rechteck-Werkzeug zu definieren.
- Zur Messung der mittleren Intensität jedes Quadranten, klickenAnalysieren Sie auf> Messen oder die Abkürzung Strg + M verwenden.
- Notieren Sie den mittleren Grauwert für alle vier Quadranten (MG 1 -MG 4).
- Wählen Sie einen kleinen Bereich in jedem Quadranten außerhalb des Rings als Hintergrund Auswahl.
- Messen mittleren Grauwert für die Hintergrundauswahl für alle vier Quadranten (BG 1 -BG 4).
- li> Für Untergrundsubtraktion für jeden Quadranten verwenden Sie die folgende Formel- MG 1 -Average (BG 1: BG 4) = Intensität des Rings in jedem Quadranten (IRQ). In diesem Stadium gibt es 4 IRQ-Werte, einen für jeden Quadranten.
- Als nächstes berechnen die folgende Formel- Standardabweichung (IRQ 1: IRQ 4) unter Verwendung der Variationskoeffizient für jeden Ring / Normal (IRQ 1: IRQ 4). Berechnen durchschnittliche Co effiziente Varianz für jeden Stamm und vergleichen, um zu den anderen Stämmen.
ANMERKUNG: Eine statistisch signifikante Zunahme der Koeffizient der Varianz in einem Stamm im Vergleich zu Kontrollen indicates uneben Proteinverteilung / Lieferung entlang der Teilungsebene in diesem Stadium der Zellteilung.
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Representative Results
Spalthefezellen den Ring Marker, RLC1-GFP (grün, Abbildung 2) und Spindel Polkörper Marker SAd1-mCherry (rot, Abbildung 2) exprimieren , wurden während der Zytokinese abgebildet. Einsetzen der Spindel - Pol - Körper - Marker (weißer Pfeil, Figuren 2A, B) mit der Zeit betrachtet wird 0. RLC1-GFP - Signal zum Zeitpunkt -4 min mit Bezug erscheint Polkörper Trennung der Spindel (roter Pfeil, 2A, 2B). RLC1-GFP - Signal bildet einen kontinuierlichen Ring 10 min nach Spindel Polkörper Trennung (offener Pfeil, die 2A, B) markiert das Ende Actomyosinaktivität Ringanordnung. Der Aktomyosin Ring (RLC1-GFP) beginnt in der Breite 22 min nach Beendigung der Ringanordnung und 32 min nach der Spindel- Polkörper Trennung zu verringern (geschlossene Pfeilspitze, die 2A, B). Ring Verengung endet 20 Minuten nach Beginn der Einschnürung, 42 min seit Beginn der Ringanordnung und 52 min seit Spindel Polkörper Trennung (weiß asterisk, 2A, B). Schließlich Zelle abscission tritt 72 min nach Spindel Polkörper Trennung (rote Pfeilspitze, die 2A, B).
Die Lokalisierung der Ringsignator RLC1-Tomaten und Septummembran Marker Bgs1-GFP wurden in der Abteilung Standort in ganz cytokinesis analysiert. 3D - Rekonstruktion des Rings ergab , dass Aktomyosin Ring markiert mit RLC1-Tomate montiert vor Bgs1-GFP Rekrutierung (Abbildung 3, 10 min). Während der Ringreifungsphase Bgs1-GFP wurde auf die Teilungsebene angeworben und mit dem Aktomyosin Ring überlappt , wie durch RLC1-Tomate (Abbildung 3, 30 min) gezeigt. Dies zeigt, dass Bgs1 in den Ring bei der Einstellung lokalisiert. Da der Ring einengt, lokalisiert Bgs1-GFP auch auf die eindringenden Membran benachbart zu dem Verengungsring (3, 40 min). Am Ende der Verengung ist das Bgs1-GFP-Signal sichtbar am eingedrungenen Membran barrier (Figur 3, 50 min). Schließlich, nach Einengung der RLC1-Tomato - Signal fehlt, während Bgs1-GFP erscheint mit einem scheibenartigen Aussehen (Abbildung 3, 60 min) in der gesamten Membranbarriere zu lokalisieren. So zeigen diese Beobachtungen , dass das Septum Synthetisierung Enzym Bgs1 in den Ring lokalisiert nach der Montage und bleibt nach Ringverengung an der Barrieremembran wie vor 17 berichtet.
Die Verteilung der Proteine entlang des Actomyosin Ring wurde Effizienz zytokinetischen Ereignissen (Figur 4) zu bestimmen , analysiert. Ungleiche oder inhomogene Verteilung von Proteinen entlang der Aktomyosin Ring hat mit gestörter Signal und ineffiziente zytokinetischen Ringanordnung 26 in Verbindung gebracht. Hier zeigen wir zwei rekonstruierten 3D - Ringe während der Reifephase, mit dem Ausdruck der F-Bar - Protein Cdc15-GFP (Abbildung 4). Das Bildauf der linken Seite zeigt eine gleichmäßige Verteilung von Cdc15-GFP entlang des Ringes mit einem niedrigen Variationskoeffizient (0,098), während das Bild in der rechten Seite mit einem hohen Koeffizienten der Varianz (0,226, Abbildung 4) eine ungleichmäßige Verteilung zeigt.
Abbildung 1: Herstellung von Kulturschale für Imaging. Schematische beschreibt Inokulation von Zellen in einen Glasboden Kulturschale überlagert mit Medien-Pad. Siehe Protokoll für Details (Abschnitt 1). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 Zeitpunkt der zytokinetischen Ereignisse in S. pombe. (A) Montage einer Zelle exprimiert Spindle Polkörper Marker SAd1-mCherry (linkes Bild), Ring Protein RLC1-GFP (Mitte) und Hellfeld (rechts) unterzogen Zytokinese ist 2-Minuten-Intervallen gezeigt. Weiße Pfeile markiert Spindel Polkörper (Zentrosom) Trennung bei 17 min, rote Pfeil markiert anfängliche Einstellung von RLC1-GFP an der Teilungsebene, offene Pfeilmarkierungen Ring Reifung bei 27 min, Pfeilspitze markiert Beginn der Ringverengung bei 47 min, Sternchen Marken Ende der Ringverengung bei 69 min und roten Pfeilspitze markiert Zelle abscission bei 97 min. (B) Timeline von zytokinetischen Ereignisse mit Bezug auf die Mitose , wie durch Spindelpoltrennung Körperbildung und Trennung bestimmen. Die Zellen wurden bei 25 ° C abgebildet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Cell Abteilung Standort während verschiedener Phasen der Cytokinesis. 3D-Rekonstruktion Actomyosinaktivität Ring Z-Stapel während verschiedener Stadien der Zellteilung für die gleiche Zelle, Ringanordnung (10 min nach Spindle Polkörper-Trennung), Ring Reifung (30 min nach Spindle Polkörper-Trennung), Ringverengung (40 min nach Spindelpoltrennung Körper-Trennung), das Ende der Engstelle (50 min nach Spindle Polkörper-Trennung), Septum Barriere (60 min nach Spindle Polkörper-Trennung). RLC1-Tomate markiert Ring während Bgs1-GFP, die Plasmamembran, das Septum markiert umhüllt. Maßstabsbalken = 5 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Verteilung von Proteinen entlang des Ring. Bilder von 3D-Rekonstruktions Aktomyosin Ring von Wildtyp-cells Cdc15-GFP exprimieren, in vier Quadranten unterteilt. Der Koeffizient der Varianz jedes Rings angegeben. Maßstabsbalken = 5 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hier haben wir ein Protokoll zu studieren zytokinetischen Ereignisse in Spalthefe in einer zeitlichen Weise beschrieben. Das hier beschriebene Protokoll liefert zeitliche Auflösung verschiedener zytokinetischen Ereignisse mit Bezug zueinander; Timing der Protein Rekrutierung oder Verlust in Bezug auf zytokinetischen Phase; Struktur des Rings in den verschiedenen Phasen der Zytokinese; und das Fortschreiten der Zytokinese mit Bezug auf die Mitose. Bei diesem Protokoll ist es möglich, die zytokinetischen Phase genau zu definieren, die in verschiedenen Mutanten verändert werden kann, wodurch ein detaillierteres Verständnis der in verschiedenen Phasen zytokinetischen beteiligten Proteine bereitstellt. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, zeitlich unterschiedlichen zytokinetischen Phasen unterscheiden wird die Analyse der molekularen Mechanismen ermöglichen, die für die Organisation von verschiedenen zytokinetischen Phasen führen. Zeitliche Auflösung verschiedener zytokinetischen Ereignisse ermöglicht auch die Analyse von zytokinetischen Ringstruktur und Proteine Verteilungin den verschiedenen Veranstaltungen. Die Raum-Zeit-Lokalisierung der verschiedenen Proteine können verglichen und mit diesem Ansatz analysiert werden. Mit der Verwendung von geeigneten Fluorophoren können mehrere Proteine untersucht und miteinander verglichen werden. Darüber hinaus haben wir hier auch beschrieben, wie Verteilung von Proteinen entlang des Rings analysiert werden können Proteinorganisation oder die Lieferung an der Teilungsebene zu bestimmen. Während das hier beschriebene Protokoll zu Spalthefe Zytokinese gilt, kann dieser Ansatz auch Zytokinese in anderen Hefen und Pilzen mit geeigneten Änderungen an Wachstum und Abbildungsbedingungen zu studieren, werden verwendet.
Dieses Protokoll beinhaltet Imaging Live-Zellen, wie sie sich teilen. Die Zellen, die dieses Protokoll abgebildet verwenden, müssen unter optimalen Bedingungen wachsen alle pleotropic Effekte zu vermeiden. Achten Sie darauf, die Zellen im Blickfeld nicht drängen genommen werden, da übermäßige Zellen zu einer schnellen Nährstoffverlust führen kann. Darüber hinaus Bildgebung Fluorophore in Zellen führt zu einer Toxizität durch freieRadikale als Ergebnis der photobleich freigegeben. Dies kann mit der Zugabe eines radikalischen Quencher-Verbindung wie Ascorbinsäure minimiert werden. Die Zugabe von Ascorbinsäure ermöglicht verlängerte Bildgebungs der Zellen unter dem Mikroskop. Während der Bildaufnahme, muss die gesamte Z-Achse der Zelle abgebildet werden, um die Erfassung der Spindel-Pol-Körpern zu gewährleisten. Das Fehlen eines richtigen Signal für die Spindel Polkörper wird nicht die richtige zeitliche Auflösung von cytokinesis ermöglichen. Insbesondere ist darauf zu genau Bild die anfängliche Trennung der Spindel-Pol-Körper-Marker genommen werden, da diese Zeit ist 0. Proper Einfangen der Zellen entlang der Z-Achse auch für die richtige 3-dimensionale Rekonstruktion der Ringe und Septen kritisch ist.
Dem Bild die Querschnitte der Ringe und der Septa, das hier beschriebene Protokoll kann mit einem mikrofabrizierten auch modifiziert werden, die die stabförmigen Spalthefezellen ermöglicht statt vertikal zur Bebilderung entlang der langen Achse des cell wie bereits hier 27 berichtet. Während dieses Protokoll sehr genau das Protein Rekrutierung und Lokalisierung im Laufe der Zeit an der Zellteilung Stelle die räumliche Auflösung der Bilder erfassen kann, ist aufgrund der Auflösung des Mikroskops begrenzt verwendet. Super-Resolution-Mikroskopie helfen räumliche Auflösung verbessern kann, sondern kann die zeitliche Auflösung beeinflussen. Jüngste Fortschritte in der Mikroskopie wie Gitterlichtblatt Mikroskopie helfen räumliche Auflösung verbessern kann , ohne 28 zeitlicher Auflösung zu beeinträchtigen. Neben der Lichtmikroskopie kann cytokinesis in Spalthefe auch im Laufe der Zeit unter Verwendung der Raman - Spektroskopie 29, 30 untersucht werden.
Unter Verwendung dieses Ansatzes haben wir berichtet , dass die kleine GTPase Cdc42 ein einzigartiges Muster räumlich - zeitliche Aktivierung erfährt während der Zytokinese 21. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, Organisation verschiedener zytokinetischen Veranstaltung zu studierens im Laufe der Zeit und beschreiben die molekularen Details dieser Ereignisse. Berichte haben vorgeschlagen , daß die Gegenwart eines zusammengebauten Actomyosin Ring allein für eine effiziente Membran Furchung nicht ausreicht und Zytokinese 11, 21, 31. Das hier beschriebene Protokoll kann die molekularen Ereignisse zu untersuchen, verwendet werden, die nach Aktomyosin Ringanordnung, um eine ordnungsgemäße cytokinesis führen. Außerdem kann die Integrität des Actomyosin Ring und seine Wirkung auf die Membran Furchung und Septum ingression sucht werden. Dies wird ein tieferes Verständnis der verschiedenen molekularen Ereignisse schaffen, die zusammen für eine erfolgreiche Trennung führen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract media | Sunrise Science Products | YES 225 | 0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine |
| Agarose | SeaKem LE agarose, Lonza | 50001 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Glass Bottomed culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used. |
| VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system | Visitech International, UK | with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu). | |
| ImageJ | NIH | Image analysis software |
References
- Pollard, T. D.
- Guertin, D. A., Trautmann, S., McCollum, D.
- Xu, X., Vogel, B. E. A secreted protein promotes cleavage furrow maturation during cytokinesis. Curr Biol. 21 (2), 114-119 (2011).
- Sagona, A. P., Stenmark, H.
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437 (7061), 1043-1047 (2005).
- Li, R. Cytokinesis in development and disease: variations on a common theme. Cell Mol Life Sci. 64 (23), 3044-3058 (2007).
- Daniels, M. J., Wang, Y., Lee, M., Venkitaraman, A. R. Abnormal cytokinesis in cells deficient in the breast cancer susceptibility protein BRCA2. Science. 306 (5697), 876-879 (2004).
- Storchova, Z., Pellman, D. From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (1), 45-54 (2004).
- Lee, I. J., Coffman, V. C., Wu, J. Q. Contractile-ring assembly in fission yeast cytokinesis: Recent advances and new perspectives. Cytoskeleton (Hoboken). 69 (10), 751-763 (2012).
- Balasubramanian, M. K., Bi, E., Glotzer, M. Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells. Curr Biol. 14 (18), R806-R818 (2004).
- Proctor, S. A., Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Contributions of turgor pressure, the contractile ring, and septum assembly to forces in cytokinesis in fission yeast. Curr Biol. 22 (17), 1601-1608 (2012).
- Munoz, J., et al. Extracellular cell wall beta(1,3)glucan is required to couple septation to actomyosin ring contraction. J Cell Biol. 203 (2), 265-282 (2013).
- Wang, N., Lee, I. J., Rask, G., Wu, J. Q. Roles of the TRAPP-II Complex and the Exocyst in Membrane Deposition during Fission Yeast Cytokinesis. PLoS Biol. 14 (4), e1002437 (2016).
- Liu, J., Wang, H., McCollum, D., Balasubramanian, M. K. Drc1p/Cps1p, a 1,3-beta-glucan synthase subunit, is essential for division septum assembly in Schizosaccharomyces pombe. Genetics. 153 (3), 1193-1203 (1999).
- Cortes, J. C., et al. The (1,3)beta-D-glucan synthase subunit Bgs1p is responsible for the fission yeast primary septum formation. Mol Microbiol. 65 (1), 201-217 (2007).
- Cortes, J. C., et al. Cooperation between Paxillin-like Protein Pxl1 and Glucan Synthase Bgs1 Is Essential for Actomyosin Ring Stability and Septum Formation in Fission Yeast. PLoS Genet. 11 (7), e1005358 (2015).
- Cortes, J. C., Ishiguro, J., Duran, A., Ribas, J. C. Localization of the (1,3)beta-D-glucan synthase catalytic subunit homologue Bgs1p/Cps1p from fission yeast suggests that it is involved in septation, polarized growth, mating, spore wall formation and spore germination. J Cell Sci. 115 (Pt 21), 4081-4096 (2002).
- Liu, J., Tang, X., Wang, H., Oliferenko, S., Balasubramanian, M. K. The localization of the integral membrane protein Cps1p to the cell division site is dependent on the actomyosin ring and the septation-inducing network in Schizosaccharomyces pombe. Mol Biol Cell. 13 (3), 989-1000 (2002).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15 (2), 838-850 (2004).
- Figard, L., Xu, H., Garcia, H. G., Golding, I., Sokac, A. M. The plasma membrane flattens out to fuel cell-surface growth during Drosophila cellularization. Dev Cell. 27 (6), 648-655 (2013).
- Wei, B., et al. Unique Spatiotemporal Activation Pattern of Cdc42 by Gef1 and Scd1 Promotes Different Events during Cytokinesis. Mol Biol Cell. , (2016).
- Nabeshima, K., et al. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9 (11), 3211-3225 (1998).
- Johnson, A. E., Gould, K. L. Dma1 ubiquitinates the SIN scaffold, Sid4, to impede the mitotic localization of Plo1 kinase. EMBO J. 30 (2), 341-354 (2011).
- Yonetani, A., Chang, F.
- Fission Yeast: A laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
- Hachet, O., Simanis, V. Mid1p/anillin and the septation initiation network orchestrate contractile ring assembly for cytokinesis. Genes Dev. 22 (22), 3205-3216 (2008).
- Zhou, Z., et al. The contractile ring coordinates curvature-dependent septum assembly during fission yeast cytokinesis. Mol Biol Cell. 26 (1), 78-90 (2015).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Huang, Y. S., Karashima, T., Yamamoto, M., Hamaguchi, H. O. Molecular-level investigation of the structure, transformation, and bioactivity of single living fission yeast cells by time- and space-resolved Raman spectroscopy. Biochemistry. 44 (30), 10009-10019 (2005).
- Huang, C. K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging. Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).
- Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe. Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).
