Summary
שמרי הביקוע, שמר החלוקה היא מערכת מודל מצוינת ללמוד cytokinesis, השלב הסופי חלוקת תא. כאן אנו מתארים גישה מיקרוסקופ לנתח אירועים cytokinetic שונים בתאי שמרים ביקוע חי.
Abstract
Cytokinesis, השלב האחרון חלוקת תא הוא קריטי לשמירה על שלמות הגנום. cytokinesis נכונה חשובה התמיינות תאים ופיתוח. Cytokinesis כולל סדרה של אירועים שמאורגנים היטב בזמן ובמרחב. Cytokinesis כרוך ההיווצרות של טבעת actomyosin באתר החלוק, ואחריו התכווצות טבעת, היווצרות תלם הממברנה שיפוץ מטריצה חוץ-תאי. שמרי הביקוע, שמר החלוקה (pombe ס) הוא מערכת מודל למדה היטב כי חשפה בבהירות ניכרת האירועים הראשוניים cytokinesis. עם זאת, אנחנו לא מבינים בבירור עד כמה שונים אירועי cytokinetic מתואמים spatiotemporally. כדי לבדוק זאת, יש צורך לנתח את אירועי cytokinetic השונים בפרטים גדולים בזמן והן במרחב. כאן אנו מתארים גישת מיקרוסקופיה לבחון ev השונה cytokineticהמציג בתאים חיים. עם גישה זו אפשר לתזמן אירועים cytokinetic שונים לקבוע את מועד הגיוס של חלבונים שונים במהלך cytokinesis. בנוסף, אנו מתארים פרוטוקולים להשוות לוקליזציה חלבון, והפצה באתר של חלוקת התא. זהו פרוטוקול בסיסי ללמוד cytokinesis בשמרי ביקוע ויכולים לשמש גם עבור שמרים אחרים ומערכות פטרייתי.
Introduction
Cytokinesis, השלב האחרון חלוקת תא, הוא חיוני תהליך מורכב לבידול נכון, פיתוח, והישרדות של אורגניזם. Cytokinesis כרוך אירועים מרובים, מבעוד מועד, להבטיח הפרדת תא מוצלחת תוך שמירה על שלמות הגנומי 1. Cytokinesis כרוך אירועים שבו טבעת actomyosin פעם התאספה עוברת מועקה, שהוא בו זמנית עם התרחבות קרום וחורש, שיפוץ מטריצה הסלולר תאי, ולבסוף ואחריו תא כריתה 1, 2, 3. ארגון נכון של אירועי cytokinetic יכול להוביל למומי הפרדת ploidy תא, ועלול לגרום למחלות כמו הסרטן 4, 5, 6, 7, 8. עקרונות היסוד המאפשרים organization של אירועים cytokinetic אינם מובנים היטב, ובכך מובילה מחסומים בהבנתנו את האטיולוגיה של מחלות אלו.
שמר החלוקה שמרים ביקוע (pombe ס) הוא מערכת מודל מצוינת ללמוד cytokinesis בשל האופי המשומר של חלבוני המעורבים 1. בשמרי ביקוע, לאחר actomyosin הרכבת טבעת, הטבעת נכנסת לשלב התבגרות / להתעכב שם זה לא להצר 9. הבשלה מסתיימת חניכה של מועקת טבעת actomyosin, במקביל תִלוּם הממברנה ingression מחץ. זרעי עבודה לאורך השנים נתנה לנו הבנה טובה למדי של טבעת הרכבת actomyosin ב ביקוע שמרים 1, 9, 10. אאוקריוטים מסוימים, כולל שמרים ביקוע, הרכבה מוצלחת של טבעת actomyosin אינו מספיק עבור תִלוּם הממברנה. ב fשמרים ission, כיווץ טבעת לבדו אינו מספק כוח מספיק כדי להתגבר על לחץ טורגור פנימי תלם היווצרות 11. הדגם אחרון עולה כי כוח זה מסופק במקום על ידי ingression מחץ 11. במודל אחר, את התפקיד של רחבת קרום הפלזמה הוצע לתרום תלם היווצרות 12, 13. התכווצות טבעת וחורשת קרום אינם מתרחשים cps1-191 מוטציה רגיש הטמפרטורה Bgs1 / CPS1, האנזים העיקרי להיווצרות מחצה העיקרי 14, 15. תאים חסרי Bgs1 להראות מחצה העיקרי פגום התכווצות טבעת ממושכת 15, 16. Bgs1 מגויסת לאתר חלוקת התא עבור ingression מחצה במהלך ההבשלה לאחר actomyosin טבעת הרכבה 17, 18. Similarly, במהלך cellularization בעוברים תסיסנית, כיווץ טבעת הוא biphasic עם שיעור התכווצות ראשוני איטי באופן משמעותי 19, שמזכיר את שלב ההבשלה שנצפה שמרי ביקוע. התכווצות טבעת Biphasic עשויה להאט תִלוּם הממברנה כדי לאפשר התרחבות קרום מספיק 20 ושינוי של מטריקס. הדבר מצביע על כך לאחר actomyosin טבעת הרכבה, כיווץ טבעת מתרחש ביעילות רק כאשר התא עמד בדרישות להיווצרות קמט. זה אינו מובן היטב מה תנאים נדרשים לתעוקת actomyosin טבעת לאחר הרכבת טבעת, ולא האירועים המולקולריים לווסת את התהליך הזה. הראינו לאחרונה כי בעקבות טבעת actomyosin ההרכבה Cdc42 GTPase הקטן עובר דפוס הפעלת spatiotemporal ייחודי 21. דפוס זה היא הוקמה על ידי דפוס הלוקליזציה הייחודי של גורמי חליפי נוקלאוטיד guanidine Cdc42 (GEFs) המפעילים Cdc42. GEF Gef1 localizes לזירת actomyosin התאספה ומקדמת הופעת התכווצות טבעת ingression מחץ, בעוד Scd1 localizes הקרום המקמט ומקדם היווצרות מחצה נורמלית. אנו מוצאים כי דפוס הפעלת Cdc42 שהקים GEFs שלה להוביל הסדרת אירועי cytokinetic ברורים.
כדי להבין את המנגנון המולקולרי של אירועים שבסופו של דבר להוביל לפרידת התא הבא טבעת הרכבת actomyosin, צריך לעקוב אחר אירועי cytokinetic ברורים בזמן ובמרחב. בשמרים ביקוע, cytokinesis הראשון כולל את הרכבה של בלוטות מבשר סביב הגרעין, אשר בסופו של דבר לגייס את שרירן סוג II, formin Cdc12, וחלבונים אחרים הדרושים להרכבה טבעת actomyosin. לעת אירועי cytokinetic הברורים ולספק מסגרת ההתייחסות, הפרדת סמני גוף מוט ציר (היווצרות ציר) נחשב זמן 0 22. ההרכבה של הטבעת דואר actomyosin יכול להיות מלווה ניטור לאורך זמן עוצמת חלבון טבעת fluorescently מתויג actomyosin כגון שרשרת אור רגולטוריות מסוג II שרירן Rlc1. כאן אנו מתארים גישה מיקרוסקופית לנתח בשלבים שונים של cytokinesis לאורך זמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת המדגם
- לגדל תאים שמרים ביקוע להביע את הסמן בגוף מוט ציר Sad1-mCherry 23 שרשרת אור רגולטוריות מסוג II שרירן 24 Rlc1-עגבניות בתקשורת נוזלת YE ב 32 מעלות צלזיוס למשך 8 דורות.
הערה: לקבלת מוטנטים רגישים לטמפרטורה, לגדל תאים של 25 מעלות צלזיוס. לגדל תאים לשלב יומן האמצע כדי OD 600 של 0.5 YE. למידע נוסף על תנאי גידול שמרים ביקוע לעיין במדריך מעבדה שמרים ביקוע 25. - כן YE (או מינימאלית) תקשורת עם 0.6% agarose (מבוסס Agarose תקשורת להראות רקע פלורסנט פחות בהשוואה אגר). לתקשורת המומסת להוסיף 1 מ"מ של חומצה אסקורבית (ויטמין C). ויטמין C מרווית רדיקלים חופשיים המשתחררים עקב צילום לבן, ובכך לצמצם רעילות צילום.
- יוצקים 3 - 4 מ"ל של ויטמין C שילב נמס התקשורת על צלחת תרבות תחתית זכוכית. תן מגניב מדיה לחזק.
הערה:עובי הזכוכית בצלחת התרבות תלוי בעובי להחליק הכיסוי מתאים המיקרוסקופ. הנה, מס coverslip השימוש 1.5. - בעדינות להעלות התקשורת הקרושה מצלחת התרבות בעזרת אזמל חד. מניח קצה פיפטה בין לוח התקשורת ואת מנת התרבות למנוע הלוח מהנפילה בחזרה לתוך הצלחת (איור 1).
- קח 1 מ"ל של תאים טרי גדל כמתואר 1.1 לעיל. ספין התאים בעדינות XG ב 300 במשך 30 s. בטל supernatant. Resuspend התאים כמות קטנה של התקשורת שיורית שנשאר בצינור לאחר השלכת supernatant.
- טען 2 - 5 μL של תרבית תאים מושעה בין לוח התקשורת ואת תחתית הזכוכית של מנת התרבות. התאים צריכים להיות על הזכוכית. קצה פיפטה ממוקם בין התקשורת לבין הצלחת מאפשר טעינה קלה של תרבית התאים.
- מאוד בעדינות להסיר את קצה פיפטה ומקום לוח התקשורת בחזרה למקומו המקורי על המ"קצלחת lture. הקפד למנוע בועות אוויר. אם יהיה בכך צורך ללחוץ את בועות אוויר בעדינות על ידי הזזה האחורי של קצה פיפטה על גבי לוח התקשורת.
- בואו התאים לשבת בצלחת התרבות למשך 30 דקות עד שעה אחת בחושך בטמפרטורה שבה מיקרוסקופיה תבוצע. זה חשוב כדי למנוע זעזועים עקב שינוי בתנאי הגידול של התאים.
2. Image Acquisition
- מניח טיפת שמן על הצד החיצוני של הזכוכית על צלחת התרבות. מניחים את צלחת תרבות על מיקרוסקופ הפוכה.
- כדי למזער קרינה אוטומטית של תקשורת YE להשתמש במסנן GFP עם טווח אורכי גל צר (520 - 535 ננומטר).
- דגש על המטוס המדיאלי של התאים ולהבטיח כי הם מרווחים היטב ולא צפופים מדי. הקפד להתחיל רכישת תמונה של התאים בשלב המתאים של מחזור התא. לצורך ניסוי זה, בצע את התאים מפני G2 מאוחר.
- לתכנת את t תוכנת רכישת התמונהo לקחת GFP, RFP ותמונות DIC של התאים.
- לצורך ניסוי זה לנצל את זמן חשיפת 100 ms עבור דסק"ש 75 ms זמן חשיפה למסנני GFP ו RFP. זמן החשיפה תלוי בהגדרות של המיקרוסקופ, החלבון נחקר ואת תקופת הניסוי. לקבלת הגדרות מיקרוסקופ הנתונה, להשתמש כוח ליזר 50%.
- כדי ללכוד תמונות ב 3 מימדים, תוכנית התוכנה רכישת התמונה עבור הדמיה בקנה מידה Z. השתמש גודל צעד של 0.4 מיקרומטר ו במרחק של 3.0 מיקרומטר (מחצית z סה"כ) סביב נקודת המיקוד המרכזית של התאים. זה מוביל את לכידתו של 16 Z-מסגרות לכל נקודת זמן, תוך שמירת מרחק Z סך של 6 מיקרומטר.
הערה: רכישת תמונת Z-series מאפשרת ללכוד של גופי מוט הציר.
- קח תמונות כל 2 דקות. שנה את זמן החשיפה בהתאם לדרישות של הניסוי. זמן החשיפה ניתן גם לשנות בהתאם את החלבון של עניין עוצמת אות. עם זאת, יש לציין כי קצראה במרווחים או חשיפה ארוכה יותר זמן עלייה רעיל צילום בשל הלבנה ומכאן תאים ניתן בעקבות רק לזמן קצר.
- לרכוש תמונות עד התא פיזי הנפרד כפי שנצפה על ידי תמונות דסק"ש, או לתכנת את התוכנה כדי לעצור רכישה לאחר 90 דקות.
ניתוח תמונה 3.
- ניתוח זמני של אירועי cytokinetic
- השימוש בתוכנת רכישת תמונה עושה תחזיות של המסגרות-Z עבור כל נקודת זמן. הפוך קבצים שונים עבור כל אורך גל של תמונה הנרכשת.
- לייצא היטל זה סדרות עתיות נקודות כקובץ .tiff.
- לנתח את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ. פתח את סדרת תמונה עבור כל אחד של אורכי גל.
- בחר תא להיחקר. לחץ לחיצה כפולה על אפשרות הקו של סרגל כלים. פעולה זו תפתח חלון נוסף כדי להתאים את רוחב קו. לשנות את עובי הקו להתכתב לרוחב התא. עבור תא WT מדובר 40 - 50 פיקסלים. צייר קו לאורךציר זמן של התא של עניין.
- הקש על לנתח> כלים> מנהל ROI ולחץ על הרחבה. זה יוסיף את הקו הנבחר אל חלון ROI לשימוש מאוחר יותר. אל תסגור חלון זה.
- לחץ על התמונה של עניין ובחר ערוך> בחירה> יישר. פעולה זו תפתח חלון נוסף. בדוק "תהליך הערימה כולה". זה יישר את התא באופן אופקי.
- לחץ על תמונה> Transform> סובב 90 מעלות ימינה. תמונה זו כעת יישר אנכית.
- לחץ על תמונה> סטאקס> הפוך Montage. פעולה זו תפתח חלון להקצות את מספר שורות ועמודות עבור מחסנית, הגורם בקנה מידה בהתאם לגודל התמונה, את הפרוסה הראשונה והאחרונה (מסגרת) עבור מונטאז והתוספת מסגרת עבור מונטאז. בדוק פרוסות תווית, והקש על Enter.
- כחלון עם מונטאז 'של תא העניין מוצג, פתח את סדרת התמונה עבור אחרים הגל.
- הקישו על מזהה קו על מנהל ROI. זה יבחרבאותו התא על קובץ התמונה השני. חזור על שלבי 3.1.6 - 3.1.8. פעולה זו תפתח מונטאז 'של התמונה השנייה.
- על התמונה עם סמן גוף מוט ציר Sad1-mCherry, לחפש הופעת פרידה של הסמן בגוף מוט ציר ולסמן כי נקודת הזמן ככל שזמן 0.
- בצע את האות Rlc1-עגבניות על התמונה לאורך זמן ולחפש את האות שמופיעה כקו מובהק בניגוד כתמי Rlc1-עגבניות. זמן-נקודה זו מסמנת השלמת הרכבת טבעת actomyosin / תחילת שלב הבשלה.
- הגלילה הבאה דרך הסרט לאורך זמן כדי לקבוע מתי טבעת Rlc1-העגבניות מתחילה ירידה בגודל. זה מסומן כמו הסוף של התבגרות שלב / תחילת התכווצות טבעת.
- בצע את האות Rlc1-עגבניות לאורך זמן לאורך התכווצות עד להופעתה כנקודה באמצע ציר התא. זה מסומן כמו סוף טבעת התכווצות / סוף ingression מחץ.
- בעקבות מונטאז 'של תמונות DIC, לקבוע את התא הסופיהַפרָדָה. רשום את נקודת הזמן כאשר התא מפריד פיזי.
- עבור הפרדת גוף מוט ציר למדוד את המרחק בין שני גופי מוט הציר לאורך זמן באמצעות כלי שורת ImageJ. מגרש את המרחק בגוף מוט ציר לאורך זמן.
- רשום את זמן נקודות השונות לאירועי cytokinetic השונים לחישוב משך כל שלב cytokinetic ולהשוות עם פרדת גוף מוט ציר לאורך זמן.
- ניתוח מרחבים של אירועי cytokinetic
- בחר תא עם טבעת actomyosin גלויה. לחץ לחיצה כפולה על אפשרות הקו של סרגל כלי ImageJ. פעולה זו תפתח חלון נוסף כדי להתאים את רוחב קו. לשנות את עובי הקו כדי מתאים עובי הטבעת (15 - 20 פיקסלים). צייר קו לאורך הטבעת מקפידה להבטיח את כל העובי של הטבעת כלולה.
- הקש על לנתח> כלים> מנהל ROI ולחץ על הרחבה. זה יוסיף את הקו הנבחר אל חלון ROI לשימוש מאוחר יותר.אל תסגור חלון זה.
- לחץ על התמונה של עניין ובחר ערוך> בחירה> יישר. פעולה זו תפתח חלון נוסף. בדוק "תהליך הערימה כולה". זה יישר את הטבעת אופקית.
- אפס את עוצמת המטוס הבהיר ביותר Z- מחסנית יישר (מ 3.1.6) באמצעות תמונה> התאם> בהירות / ניגודיות> איפוס.
- הקש על הכרטיסייה STK> פרויקט 3D. פעולה זו תפתח תיבת דו-שיח. שנה את שיטת ההקרנה כדי צבע הבהיר ואת המרווח הפרוס 2 או 3 פיקסלים. לבסוף, שינוי ציר הסיבוב כדי X או ציר Y (זה ישתנה בהתאם לזווית הצפייה הרצויה), לחץ לשרבב ולחץ על אישור כדי ליצור השלכת 3D של התמונה. השתמש בפס הגלילה מתחת לתמונה כדי לסובב את התמונה.
- פתח את סדרת תמונה עבור אחרים גל באמצעות ImageJ.
- הקישו על מזהה קו על מנהל ROI. זה יבחר את אותה טבעת על קובץ התמונה השנייה. חזור על שלבים 4.2.4 ו 4.2.5.פעולה זו תפתח טבעת 3 ממדים בתמונה עם אחרים הגל.
- עם טבעות תמונת 3D של חלל פתוח, לחץ על תמונה> צבע> Merge ערוצים. פעולה זו תפתח תיבה. בחר כל תמונה מתוך התפריט הנפתח עבור הצבע המתאים הרצוי ולחץ על אישור. פעולה זו תפתח מרוכבים הן של תמונות באורכי גל שונים.
- השווה את הלוקליזציה של סמנים שונים לגבי לוקליזציה בטבעת cytokinetic או קרום ingressing. Rlc1-GFP הוא סמן את הטבעת cytokinetic. חלבונים שיתוף לוקליזציה עם Rlc1-GFP למקם את הזירה, בעוד חלבונים לוקליזציה מאחורי האות Rlc1-GFP למקם את הממברנה ingressing.
הערה: החלבון של עניין צריך להיות של fluorophore שונה מזו של סמן הטבעת. - צור 3 טבעות ממדיות במהלך שלבים שונים של cytokinesis להשוות הלוקליזציה המרחבי של החלבונים כל דרך cytokinesis.
- ניתוח של distri חלבוןbution בטבעת cytokinetic
- כדי להשוות ולנתח הפצה של חלבונים לאורך הטבעת למדוד את השיתוף היעיל של שונות של חלוקת חלבון. עמית יעיל גבוה מהשונות מציין חלוקה לא שווה של חלבונים לאורך באתר החלוק ומציע טבעת הרכבה פסולה, התבגרות או היווצרות מחץ, תלוי באיזה שלב הוא צלם או מנותח.
- באמצעות 3 טבעת cytokinetic משוחזרת ממדי (מ 3.2.2), לחלק את התמונה לתוך 4 רביעים לפחות כך רבע הטבעת מופיע בכל רבע. לשם כך השתמש בכלי הקו לצייר קווים ניצבים על התמונה. לאחר כל תמונה בלחיצת קו> שכבה <הוספת בחירה או להשתמש ב Ctrl + קיצור.
- עבור אל לנתח> מדידת גדר. בחר ערך אפור ממוצע בתיבה שנפתחת. לחץ על אישור.
- באמצעות הקווים נמשכים מעל כמדריכים לצייר מלבן להגדיר בכל רבע השימוש באפשרות המלבנת.
- כדי למדוד את עוצמת הממוצע של כל רביע, לחץעל נתח> מדוד או להשתמש לגזור קצר Ctrl + M.
- רשום את הערך האפור הממוצע עבור כל ארבעת הרביעים (MG 1 -MG 4).
- בחר אזור קטן בכל רבע מחוץ לזירה כמו בחירה ברקע.
- מדוד ערך אפור ממוצע לבחירת רקע עבור כל ארבעת הרביעים (BG 1 -BG 4).
- li> עבור חיסור רקע עבור כל שימוש ברבע הבאות הניסוח MG 1 -Average (BG 1: BG 4) = אינטנסיביות של הטבעת בכל רבע (IRQ). בשלב זה יש 4 ערכים IRQ, אחד לכל ברבע.
- הבא לחשב את המקדם שונה עבור כל טבעת באמצעות סטיית התקן את הניסוח הבא (IRQ 1: IRQ 4) / ממוצע (IRQ 1: IRQ 4). חישוב ממוצע שיתוף היעיל של וריאנס עבור כל זן ולהשוות לצלילים האחרים.
הערה: עלייה משמעותית סטטיסטית שיתוף יעיל של מהשונות זן בהשוואה לקבוצת ביקורת INDicates הספקות הפצה / חלבון אחידה לאורך באתר החטיבה באותו שלב של cytokinesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תאי שמרים ביקוע להביע את הסמן טבעת, Rlc1-GFP (ירוק, איור 2), סמן הגוף מוט ציר Sad1-mCherry (אדום, איור 2) הם צילמו במהלך cytokinesis. הופעת סמן גוף מוט ציר (חץ לבן, דמויות 2A, B) נחשב זמן 0. אות Rlc1-GFP מופיעה דקות זמן -4 בהתייחס ציר הפרדת גוף מוט (חץ אדום, דמויות 2A, 2B). Rlc1-GFP אות יוצרת פרדת גוף מוט ציר פוסט דקות רצופות טבעת 10 (חץ פתוח, איורי 2A, B) שהביאה לסיום טבעת הרכבת actomyosin. טבעת actomyosin (Rlc1-GFP) מתחילה ירידה ברוחב 22 דקות לאחר השלים הרכבת טבעת ו -32 דקות לאחר הפרדת גוף מוט ציר (חץ סגור, איורי 2A, B). התכווצות טבעת מסתיימת 20 דקות אחרי תחילת ההתכווצות, 42 דקות מאז תחילת טבעת ההרכבה ו -52 דקות מאז פרידת גוף מוט ציר (Asteris הלבןk, דמויות 2A, B). לבסוף, כריתת תא מתרחשת 72 הפרדת גוף מוט דק פוסט כישור (חץ אדום, דמויות 2A, B).
הלוקליזציה של סמן טבעת Rlc1-עגבניות סמן קרום מחצה Bgs1-GFP נותחו באתר החלוק ברחבי cytokinesis. 3D שחזור של טבעת גילה כי טבעת actomyosin המסומנות Rlc1-עגבניות התאספו לפני גיוס Bgs1-GFP (איור 3, 10 דק '). במהלך שלב ההתבגרות טבעת Bgs1-GFP גויס לאתר חטיבת בחפיפה על טבעת actomyosin כפי שמוצג על ידי Rlc1-עגבניות (איור 3, 30 דק '). זה מצביע על כך Bgs1 localizes לזירה על גיוס. כמו הטבעת מכווצת, Bgs1-GFP גם לוקליזציה קרום ingressing סומך טבעת ההצרה (איור 3, 40 דק '). בסוף ההתכווצות, אות Bgs1-GFP גלויה על Barri הקרום חלחל ביאה (איור 3, 50 דק '). לבסוף, לאחר התכווצות אות Rlc1-עגבניות תיאור, תוך Bgs1-GFP נראה למקם ברחבי מחסום הקרום עם מראה דיסק כמו (איור 3, 60 דק '). לכן תצפיות אלו מצביעות כי אנזים סינתזת מחץ Bgs1 localizes לזירה לאחר ההרכבה נמשך לאחר התכווצות טבעת במחסום הקרום כפי דווח לפני 17.
חלוקת חלבונים לאורך טבעת actomyosin נותחה כדי לקבוע את היעילות של אירועי cytokinetic (איור 4). חלוקה לא שווה או nonhomogenous של חלבונים לאורך טבעת actomyosin נקשרה עם איתות לקויה והרכבת טבעת cytokinetic היעיל 26. כאן אנו מראים שתי טבעות משוחזרות 3D בשלב ההתבגרות, המבטאים את חלבון ה- F-בר Cdc15-GFP (איור 4). התמונהמשמאל מראת חלוקה שווה של Cdc15-GFP לאורך הטבעת עם מקדם נמוך של שונות (0.098), בעוד התמונה מהימין מראה חלוקה לא שווה עם מקדם גבוה של שונות (0.226, איור 4).
איור 1: הכנת צלחת תרבות הדמיה. חיסון של תאי סכמטי המתאר לתוך צלחת תרבות תחתית זכוכית ועליהן כרית תקשורת. ראה פרוטוקול לפרטים (סעיף 1). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תזמון איור 2 אירועים Cytokinetic ב pombe ס. (א) Montage של spindl להביע תאדואר מוט גוף סמן Sad1-mCherry (פאנל משמאל), טבעת חלבון Rlc1-GFP (פאנל באמצע) ו-שדה בהיר (פאנל מימין) עוברת cytokinesis מוצג ב 2 מרווחי דקות. חיצים לבנים מסמנים ציר מוט גוף (centrosome) פרדה ב 17 דקות, חץ אדום מסמן גיוס ראשוני של Rlc1-GFP באתר החלוק, התבגרות טבעת סימני חץ פתוחה 27 דק ', ראש החץ מסמן תחילתה של התכווצות טבעת ב -47 דקים', סימני כוכביות סוף התכווצות טבעת ב 69 דק 'ו חץ אדום מסמן כריתת תא ב 97 דקות. (ב) קו זמן של אירועי cytokinetic בהתייחס מיטוזה כמו לקבוע על ידי היווצרות ופרדת גוף מוט ציר. התאים היו צילמו על 25 מעלות צלזיוס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: Cell אתר אגף במהלך שלבים שונים של cytokinesis. שחזור 3D של ערימות-Z טבעת actomyosin במהלך שלבים שונים של cytokinesis עבור באותו התא, טבעת הרכבה (10 הפרדת גוף מוט ציר דקות פוסט), התבגרות טבעת (פרדת גוף מוט 30 דקות פוסט ציר), התכווצות טבעת (מוט ציר 40 דקות פוסט הפרדת גוף), סוף ההתכווצות (50 דקות פוסט הפרדת גוף ציר קוטב), מחסום מחצה (60 דקות פוסט הפרדת ציר מוט גוף). Rlc1-עגבניות מסמנות טבעת תוך Bgs1-GFP מסמן את הממברנה העוטפת את מחץ. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: התפלגות חלבונים לאורך הטבעת. תמונות של 3D משוחזר טבעת actomyosin מ C סוג בראמות להביע Cdc15-GFP ומחולקת לארבעה רבעים. השיתוף היעיל של שונות של כל טבעת נאמר. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן יש לנו תיאר פרוטוקול ללמוד אירועים cytokinetic בשמרים ביקוע באופן זמני. הפרוטוקול המתואר כאן מספק פתרון זמני של אירועי cytokinetic שונים תוך התייחסות לזה; עיתוי גיוס חלבון או הפסד תוך התייחסות לשלב cytokinetic; מבנה הטבעת לאורך השלבים השונים של cytokinesis; וכן את התקדמות cytokinesis בהתייחס מיטוזה. עם פרוטוקול זה ניתן להגדיר את שלב cytokinetic בדיוק שעשוי להשתנות מוטנטים שונים, ובכך לספק הבנה מפורטת יותר של החלבונים מעורבים בשלבי cytokinetic שונים. בנוסף, את היכולת להבחין שלבי cytokinetic שונים זמנית תאפשר הניתוח של מנגנונים מולקולריים המובילים לארגון של שלבי cytokinetic שונים. החלטה זמנית של אירועי cytokinetic שונים גם מאפשרת הניתוח של חלוקת חלבוני מבנה טבעת cytokineticברחבי האירועים השונים. לוקליזציה spatiotemporal של חלבונים שונים ניתן להשוות ונותחה עם גישה זו. עם השימוש של fluorophores המתאים, חלבונים מרובים ניתן ללמוד ולעומת זה לזה. בנוסף כאן גם שתארנו איך חלוקת חלבונים לאורך הטבעת ניתן לנתח כדי לקבוע ארגון חלבון או מסיר באתר החלוק. בעוד הפרוטוקול המתואר כאן חל על cytokinesis שמרים ביקוע, גישה זו יכולה גם להיות מנוצלת כדי ללמוד cytokinesis ב שמרים ופטריות אחרים עם שינויים מתאימים לתנאי גידול והדמיה.
פרוטוקול זה כרוך תאי חי הדמיה כפי שהם מחלקים. התאים צילמו באמצעות פרוטוקול זה צריך לגדול בתנאים אופטימליים כדי למנוע תופעות pleotropic. יש להקפיד לא לדחוס את תאי שדה הראייה, כמו תאים מופרזים עלולים להוביל לאובדן מזין מהיר. בנוסף fluorophores הדמיה בתאים מוביל רעיל עקב חינםרדיקלים שוחררו כתוצאת צילום לבן. זה יכול להיות ממוזער בתוספת תרכובת מרווה רדיקלים חופשיים כגון חומצה אסקורבית. התוספת של חומצה אסקורבית מאפשרת הדמיה ממושכת של התאים תחת המיקרוסקופ. במהלך רכישת תמונה, ציר Z כולו של התא צריך להיות צלם כדי להבטיח את תפיסתו של גופי מוט הציר. עדר אות נכונה עבור גופי מוט הציר לא יאפשר פתרון זמני הולם של cytokinesis. בפרט, יש להיזהר לתמונה בדיוק ההפרדה הראשונית של סמני גוף מוט ציר כמו זו הפעם 0. ללכוד התקין של התאים לאורך הציר-Z הנו עניין מהותי 3 שחזורים ממדיים התקינים של הטבעות septa.
כדי לדמות את בחיתוכים של טבעות septa, הפרוטוקול המתואר כאן יכולים להיות שונה עם באר microfabricated המאפשר לתאי שמרים ביקוע בצורת המוט להיות מקום אנכי הדמיה לאורך ציר זמן של ceLL כפי דווח כאן 27. בעוד פרוטוקול זה יכול דווקא מאוד ללכוד את גיוס חלבון ולוקליזציה לאורך זמן באתר חלוקת התא ברזולוציה מרחבית של התמונות מוגבלת בשל הרזולוציה של המיקרוסקופ משמש. מיקרוסקופיה סופר-הרזולוציה עשוי לעזור לשפר רזולוציה מרחבית, אך עשוי להשפיע על ההחלטה הזמנית. התפתחויות אחרונות במיקרוסקופ כגון מיקרוסקופיה גיליון אור הסריג עשויות לעזור לשפר רזולוציה מרחבית מבלי להתפשר החלטה זמנית 28. מלבד מיקרוסקופ אור, cytokinesis בשמרים ביקוע יכול להיות גם למד לאורך זמן באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן 29, 30.
בגישה זו דיווחנו כי Cdc42 GTPase הקטן עובר דפוס הפעלת spatiotemporal ייחודי במהלך cytokinesis 21. גישה זו מאפשרת לנו לחקור ארגון אירוע cytokinetic השונהים לאורך זמן ולתאר את הפרטים המולקולריים של אירועים אלה. דוחות הראו כי נוכחות של טבעת actomyosin התאספו לבדו אינו מספיק עבור תִלוּם קרום יעיל cytokinesis 11, 21, 31. הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להשתמש כדי לחקור את האירועים המולקולריים להוביל cytokinesis הנכונה לאחר הרכבת טבעת actomyosin. בנוסף, על שלמות טבעת actomyosin והשפעתה על תִלוּם הממברנה ingression מחץ יכולה להיבחן. זה יספק הבנה עמוקה יותר של האירועים המולקולריים השונים שיחד להוביל לפרידה מוצלחת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract media | Sunrise Science Products | YES 225 | 0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine |
| Agarose | SeaKem LE agarose, Lonza | 50001 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Glass Bottomed culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used. |
| VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system | Visitech International, UK | with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu). | |
| ImageJ | NIH | Image analysis software |
References
- Pollard, T. D.
- Guertin, D. A., Trautmann, S., McCollum, D.
- Xu, X., Vogel, B. E. A secreted protein promotes cleavage furrow maturation during cytokinesis. Curr Biol. 21 (2), 114-119 (2011).
- Sagona, A. P., Stenmark, H.
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437 (7061), 1043-1047 (2005).
- Li, R. Cytokinesis in development and disease: variations on a common theme. Cell Mol Life Sci. 64 (23), 3044-3058 (2007).
- Daniels, M. J., Wang, Y., Lee, M., Venkitaraman, A. R. Abnormal cytokinesis in cells deficient in the breast cancer susceptibility protein BRCA2. Science. 306 (5697), 876-879 (2004).
- Storchova, Z., Pellman, D. From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (1), 45-54 (2004).
- Lee, I. J., Coffman, V. C., Wu, J. Q. Contractile-ring assembly in fission yeast cytokinesis: Recent advances and new perspectives. Cytoskeleton (Hoboken). 69 (10), 751-763 (2012).
- Balasubramanian, M. K., Bi, E., Glotzer, M. Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells. Curr Biol. 14 (18), R806-R818 (2004).
- Proctor, S. A., Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Contributions of turgor pressure, the contractile ring, and septum assembly to forces in cytokinesis in fission yeast. Curr Biol. 22 (17), 1601-1608 (2012).
- Munoz, J., et al. Extracellular cell wall beta(1,3)glucan is required to couple septation to actomyosin ring contraction. J Cell Biol. 203 (2), 265-282 (2013).
- Wang, N., Lee, I. J., Rask, G., Wu, J. Q. Roles of the TRAPP-II Complex and the Exocyst in Membrane Deposition during Fission Yeast Cytokinesis. PLoS Biol. 14 (4), e1002437 (2016).
- Liu, J., Wang, H., McCollum, D., Balasubramanian, M. K. Drc1p/Cps1p, a 1,3-beta-glucan synthase subunit, is essential for division septum assembly in Schizosaccharomyces pombe. Genetics. 153 (3), 1193-1203 (1999).
- Cortes, J. C., et al. The (1,3)beta-D-glucan synthase subunit Bgs1p is responsible for the fission yeast primary septum formation. Mol Microbiol. 65 (1), 201-217 (2007).
- Cortes, J. C., et al. Cooperation between Paxillin-like Protein Pxl1 and Glucan Synthase Bgs1 Is Essential for Actomyosin Ring Stability and Septum Formation in Fission Yeast. PLoS Genet. 11 (7), e1005358 (2015).
- Cortes, J. C., Ishiguro, J., Duran, A., Ribas, J. C. Localization of the (1,3)beta-D-glucan synthase catalytic subunit homologue Bgs1p/Cps1p from fission yeast suggests that it is involved in septation, polarized growth, mating, spore wall formation and spore germination. J Cell Sci. 115 (Pt 21), 4081-4096 (2002).
- Liu, J., Tang, X., Wang, H., Oliferenko, S., Balasubramanian, M. K. The localization of the integral membrane protein Cps1p to the cell division site is dependent on the actomyosin ring and the septation-inducing network in Schizosaccharomyces pombe. Mol Biol Cell. 13 (3), 989-1000 (2002).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15 (2), 838-850 (2004).
- Figard, L., Xu, H., Garcia, H. G., Golding, I., Sokac, A. M. The plasma membrane flattens out to fuel cell-surface growth during Drosophila cellularization. Dev Cell. 27 (6), 648-655 (2013).
- Wei, B., et al. Unique Spatiotemporal Activation Pattern of Cdc42 by Gef1 and Scd1 Promotes Different Events during Cytokinesis. Mol Biol Cell. , (2016).
- Nabeshima, K., et al. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9 (11), 3211-3225 (1998).
- Johnson, A. E., Gould, K. L. Dma1 ubiquitinates the SIN scaffold, Sid4, to impede the mitotic localization of Plo1 kinase. EMBO J. 30 (2), 341-354 (2011).
- Yonetani, A., Chang, F.
- Fission Yeast: A laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
- Hachet, O., Simanis, V. Mid1p/anillin and the septation initiation network orchestrate contractile ring assembly for cytokinesis. Genes Dev. 22 (22), 3205-3216 (2008).
- Zhou, Z., et al. The contractile ring coordinates curvature-dependent septum assembly during fission yeast cytokinesis. Mol Biol Cell. 26 (1), 78-90 (2015).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Huang, Y. S., Karashima, T., Yamamoto, M., Hamaguchi, H. O. Molecular-level investigation of the structure, transformation, and bioactivity of single living fission yeast cells by time- and space-resolved Raman spectroscopy. Biochemistry. 44 (30), 10009-10019 (2005).
- Huang, C. K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging. Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).
- Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe. Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).
