Biology

विखंडन खमीर में Cytokinetic घटनाक्रम spatiotemporal विश्लेषण

Published: February 20, 2017 doi: 10.3791/55109

Bin Wei¹, Brian S. Hercyk¹, Julius Habiyaremye¹, Maitreyi Das¹

¹Department of Biochemistry & Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee

Summary

विखंडन खमीर, Schizosaccharomyces pombe cytokinesis अध्ययन करने के लिए एक शानदार मॉडल प्रणाली, कोशिका विभाजन में अंतिम चरण में है। यहाँ हम लाइव विखंडन खमीर कोशिकाओं में अलग cytokinetic घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए एक माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण का वर्णन।

Abstract

Cytokinesis, कोशिका विभाजन में अंतिम चरण के जीनोम अखंडता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। उचित cytokinesis सेल भेदभाव और विकास के लिए महत्वपूर्ण है। Cytokinesis घटनाओं है कि अच्छी तरह से समय और अंतरिक्ष में समन्वय कर रहे हैं की एक श्रृंखला शामिल है। Cytokinesis विभाजन स्थल पर एक actomyosin अंगूठी के गठन, अंगूठी कसना, झिल्ली कुंड गठन और अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स remodeling के द्वारा पीछा करना शामिल है। विखंडन खमीर, Schizosaccharomyces pombe (एस pombe) एक अच्छी तरह से अध्ययन मॉडल प्रणाली है कि पर्याप्त स्पष्टता के साथ cytokinesis में प्रारंभिक घटनाओं से पता चला है है। हालांकि, हम स्पष्ट रूप से समझ में नहीं आता कि किस तरह अलग cytokinetic घटनाओं spatiotemporally समन्वय कर रहे हैं। यह निर्धारित करने के लिए, एक दोनों समय में और अंतरिक्ष में महान विवरण में अलग cytokinetic घटनाओं का विश्लेषण करने की जरूरत है। यहाँ हम अलग cytokinetic EV जांच करने के लिए एक माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण का वर्णनजीवित कोशिकाओं में दस्तावेजों। इस दृष्टिकोण के साथ यह अलग cytokinetic घटनाओं के समय और cytokinesis के दौरान विभिन्न प्रोटीन की भर्ती के समय निर्धारित करने के लिए संभव है। इसके अलावा, हम कोशिका विभाजन के स्थल पर प्रोटीन स्थानीयकरण, और वितरण तुलना करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस विखंडन खमीर में cytokinesis अध्ययन करने के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल है और भी अन्य yeasts और फंगल सिस्टम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

Cytokinesis, कोशिका विभाजन में अंतिम कदम है, उचित भेदभाव, विकास, और एक जीव के अस्तित्व के लिए एक जटिल प्रक्रिया के लिए आवश्यक है। Cytokinesis कई घटनाओं है कि सफल सेल जुदाई सुनिश्चित करने के लिए है, जबकि जीनोमिक अखंडता को बनाए रखने के ¹ आयोजित कर रहे हैं शामिल है। Cytokinesis घटनाओं में जहां एक actomyosin अंगूठी एक बार इकट्ठे कसना है, जो झिल्ली विस्तार और furrowing, और बाह्य सेलुलर मैट्रिक्स remodeling, अंत में सेल अलगाव ^{^1,} ^{^2,} ³ के द्वारा पीछा के साथ समवर्ती है undergoes शामिल है। Cytokinetic घटनाओं की अनुचित संगठन सेल जुदाई और ploidy दोषों को जन्म दे सकता है, और कैंसर ^{^4,} ^{^5,} ^{^6,} ^{^7,} ⁸ जैसी बीमारियों का कारण बन सकता है। बुनियादी सिद्धांत है कि सक्षम ओcytokinetic घटनाओं के rganization अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं, इस प्रकार इन रोगों के एटियलजि के बारे में हमारी समझ में बाधाओं के लिए अग्रणी।

विखंडन खमीर Schizosaccharomyces pombe (एस pombe) ¹ शामिल प्रोटीन की प्रकृति के कारण संरक्षित cytokinesis अध्ययन करने के लिए एक शानदार मॉडल प्रणाली है। विखंडन खमीर में, अंगूठी विधानसभा actomyosin के बाद, अंगूठी एक परिपक्वता / ध्यान केन्द्रित करना चरण में जहां यह ⁹ कसना नहीं है प्रवेश करती है। परिपक्वता actomyosin अंगूठी कसना, झिल्ली furrowing और पट ingression साथ समवर्ती की दीक्षा के साथ समाप्त होता है। पिछले कुछ वर्षों में मौलिक काम हमें विखंडन खमीर ^{^1,} ^{^9,} ¹⁰ में actomyosin अंगूठी विधानसभा के एक काफी अच्छी समझ दे दिया है। विखंडन खमीर सहित कुछ eukaryotes, में, actomyosin अंगूठी के सफल विधानसभा झिल्ली furrowing के लिए पर्याप्त नहीं है। एफ मेंission खमीर, अंगूठी कसना अकेले कुंड गठन ^{11 के} लिए आंतरिक स्फीत दबाव से उबरने के लिए पर्याप्त बल प्रदान नहीं करता है। हाल ही में एक मॉडल इंगित करता है कि इस बल के बजाय पट ingression ¹¹ से प्रदान की जाती है। एक और मॉडल में, प्लाज्मा झिल्ली विस्तार की भूमिका गठन ^{^12,} ¹³ कुंड में योगदान करने का सुझाव दिया गया है। रिंग कसना और झिल्ली furrowing Bgs1 / CPS1 तापमान संवेदनशील उत्परिवर्ती cps1-191, प्राथमिक पट गठन के ^{^14,} ¹⁵ के लिए प्रमुख एंजाइम में नहीं होती है। Bgs1 कमी प्रकोष्ठों दोषपूर्ण प्राथमिक पट और लंबे समय तक रिंग कसना ^{^15,} ¹⁶ दिखा। Bgs1 अंगूठी विधानसभा ^{^17,} ¹⁸ actomyosin के बाद परिपक्वता के दौरान पट ingression के लिए कोशिका विभाजन साइट के लिए भर्ती किया गया है। Similarlवाई, ड्रोसोफिला भ्रूण में cellularization के दौरान, अंगूठी कसना एक काफी धीमी गति से प्रारंभिक कसना दर ^19, परिपक्वता चरण विखंडन खमीर में मनाया दिखने के साथ biphasic है। Biphasic अंगूठी कसना पर्याप्त झिल्ली विस्तार ²⁰ और बाह्य मैट्रिक्स के संशोधन के लिए अनुमति देने के लिए झिल्ली furrowing धीमा हो सकता है। यह पता चलता है अंगूठी विधानसभा actomyosin के बाद, अंगूठी कसना होता है कि कुशलतापूर्वक केवल जब सेल कुंड गठन के लिए आवश्यकताओं को संतुष्ट है। यह अच्छी तरह से समझ नहीं है क्या शर्तों अंगूठी विधानसभा के बाद actomyosin अंगूठी कसना, और न ही आणविक घटनाओं है कि इस प्रक्रिया को विनियमित करने के लिए आवश्यक हैं। हमने हाल ही में पता चला है कि actomyosin अंगूठी निम्नलिखित विधानसभा छोटे GTPase Cdc42 एक अनूठा spatiotemporal सक्रियण पैटर्न ²¹ से गुज़रता है। यह पैटर्न Cdc42 guanidine न्यूक्लियोटाइड विनिमय कारकों की अनूठी स्थानीयकरण पैटर्न (द्वारा स्थापित हैGEFs) कि Cdc42 को सक्रिय करें। जीईएफ Gef1 इकट्ठे actomyosin अंगूठी के लिए localizes और जब Scd1 furrowing झिल्ली को localizes और सामान्य पट गठन को बढ़ावा, अंगूठी कसना और पट ingression की शुरुआत को बढ़ावा देता है। हम जानते हैं कि Cdc42 सक्रियण पैटर्न इसकी GEFs द्वारा स्थापित अलग cytokinetic घटनाओं के नियमन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

घटनाओं है कि अंततः actomyosin अंगूठी विधानसभा निम्नलिखित सेल जुदाई के लिए नेतृत्व की आणविक तंत्र को समझने के लिए, एक समय और अंतरिक्ष में अलग cytokinetic घटनाओं का पालन करने की जरूरत है। विखंडन खमीर में, cytokinesis पहले नाभिक के चारों ओर अग्रदूत नोड्स, जो कि अंत में भर्ती प्रकार द्वितीय मायोसिन, formin Cdc12, और अन्य actomyosin अंगूठी विधानसभा के लिए आवश्यक प्रोटीन की विधानसभा शामिल है। समय के लिए अलग cytokinetic घटनाओं और संदर्भ के फ्रेम प्रदान करते हैं धुरी पोल शरीर मार्कर (धुरी गठन) की जुदाई समय 0 ²² के रूप में माना जाता है। वें के विधानसभाई actomyosin अंगूठी एक fluorescently टैग actomyosin अंगूठी प्रोटीन की तीव्रता इस प्रकार द्वितीय मायोसिन नियामक प्रकाश श्रृंखला Rlc1 के रूप में समय के साथ निगरानी के द्वारा पीछा किया जा सकता। यहाँ हम समय के साथ cytokinesis के विभिन्न चरणों का विश्लेषण करने के लिए एक सूक्ष्म दृष्टिकोण का वर्णन।

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Protocol

1. नमूना की तैयारी

विखंडन खमीर कोशिकाओं 8 पीढ़ियों के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर धुरी पोल शरीर मार्कर Sad1-mCherry ²³ और प्रकार द्वितीय मायोसिन नियामक प्रकाश श्रृंखला Rlc1-टमाटर ²⁴ YE तरल मीडिया में व्यक्त करने के लिए आगे बढ़ें।
नोट: तापमान संवेदनशील म्यूटेंट के लिए, 25 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित। तु में 0.5 के एक आयुध डिपो _{से 600} मध्य लॉग चरण के लिए कोशिकाओं को विकसित। विखंडन पर अधिक के लिए खमीर विकास की स्थिति विखंडन खमीर प्रयोगशाला मैन्युअल ²⁵ को देखें।
0.6% agarose के साथ तु (या कम से कम) मीडिया तैयार (Agarose आधारित मीडिया अगर की तुलना में कम फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि शो)। पिघल मीडिया के एस्कॉर्बिक एसिड की 1 मिमी (विटामिन सी) जोड़ें। विटामिन सी मुक्त कण है कि तस्वीर विरंजन के कारण जारी किया जाता है, इस प्रकार के फोटो विषाक्तता को कम quenches।
विटामिन सी एक गिलास तली संस्कृति डिश पर मीडिया पिघल सजी के 4 एमएल - 3 डालो। मीडिया शांत करते हैं और जमना।
ध्यान देंसंस्कृति डिश में कांच की मोटाई कवर पर्ची माइक्रोस्कोप के लिए उपयुक्त मोटाई पर निर्भर करता है। इधर, उपयोग coverslip नं 1.5।
धीरे एक तेज छुरी की सहायता से संस्कृति पकवान से जम मीडिया बढ़ा। मीडिया स्लैब और पकवान (चित्रा 1) में वापस गिरने से रोकने के लिए पत्थर की पटिया संस्कृति पकवान के बीच एक विंदुक टिप रखें।
ऊपर 1.1 में वर्णित के रूप में हौसले बढ़ कोशिकाओं के 1 एमएल ले लो। 30 एस के लिए 300 XG पर धीरे कोशिकाओं स्पिन। सतह पर तैरनेवाला त्यागें। अवशिष्ट मीडिया की छोटी राशि है कि सतह पर तैरनेवाला discarding के बाद ट्यूब में रहता में कोशिकाओं Resuspend।
लोड 2 - मीडिया स्लैब और संस्कृति डिश के कांच नीचे के बीच resuspended सेल संस्कृति के 5 μL। कोशिकाओं कांच पर होना चाहिए। विंदुक टिप मीडिया और पकवान के बीच रखा सेल संस्कृति के लिए आसान लोड हो रहा है सक्षम बनाता है।
बहुत धीरे घन पर अपनी मूल स्थिति में वापस विंदुक टिप को हटाने और मीडिया स्लैब जगहlture पकवान। किसी भी हवाई बुलबुले से बचने के लिए सुनिश्चित करें। तो धीरे मीडिया स्लैब के शीर्ष पर एक विंदुक टिप के पीछे फिसलने से हवा के बुलबुले बाहर प्रेस की जरूरत है।
कोशिकाओं के तापमान में जो माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन किया जाएगा पर 30 मिनट से एक घंटे के लिए अंधेरे में करने के लिए संस्कृति डिश में बैठते हैं। यह किसी झटके को रोकने के लिए महत्वपूर्ण कारण कोशिकाओं के लिए विकास की स्थिति में परिवर्तन है।

2. छवि अधिग्रहण

संस्कृति डिश पर कांच के बाहरी किनारे पर तेल की एक बूंद रखें। एक औंधा माइक्रोस्कोप पर संस्कृति डिश रखें।
(- 535 एनएम 520) एक संकीर्ण तरंगदैर्ध्य रेंज के साथ एक GFP फिल्टर का उपयोग YE मीडिया के ऑटो प्रतिदीप्ति कम से कम।
कोशिकाओं की औसत दर्जे विमान पर ध्यान दें और यह सुनिश्चित करें कि वे अच्छी तरह से स्थान दिया गया है और बहुत भीड़ नहीं कर रहे हैं। सेल चक्र का उपयुक्त मंच में कोशिकाओं की छवि अधिग्रहण शुरू करने के लिए सुनिश्चित करें। इस प्रयोग के लिए, देर से G2 से कोशिकाओं का पालन करें।
छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर टी कार्यक्रमओ ले GFP, आरएफपी और कोशिकाओं के डीआईसी छवियों।
1. इस प्रयोग के लिए उपयोग करने के लिए 100 डीआईसी एमएस जोखिम समय और GFP और आरएफपी फिल्टर के लिए 75 एमएस जोखिम समय। जोखिम समय माइक्रोस्कोप, अध्ययन के तहत प्रोटीन और प्रयोग की अवधि की सेटिंग पर निर्भर करता है। दिए गए माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के लिए, 50% लेजर शक्ति का उपयोग करें।
2. 3 आयामों, जेड पैमाने इमेजिंग के लिए कार्यक्रम छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में छवियों पर कब्जा करने के लिए। एक कदम कोशिकाओं के केंद्रीय ध्यान केंद्रित बिंदु के आसपास 0.4 माइक्रोन के आकार और 3.0 माइक्रोन (कुल जेड के आधे) की दूरी का प्रयोग करें। यह 6 माइक्रोन की कुल जेड दूरी के साथ समय बिंदु प्रति 16 जेड फ्रेम का कब्जा हो जाता है।
  नोट: जेड श्रृंखला छवि अधिग्रहण धुरी पोल शव का कब्जा अनुमति देता है।
छवियों हर 2 मिनट ले लो। प्रयोग की आवश्यकताओं के अनुसार जोखिम समय बदलें। जोखिम समय भी ब्याज और सिग्नल की शक्ति के प्रोटीन के हिसाब से बदला जा सकता है। हालाँकि, ध्यान दें कि कमएर अंतराल या उससे अधिक समय जोखिम समय वृद्धि विरंजन के कारण फोटो विषाक्तता और इसलिए कोशिकाओं केवल एक कम समय के लिए पीछा किया जा सकता है।
कोशिकाओं को शारीरिक रूप से अलग रूप में डीआईसी छवियों से मनाया तक छवियों का मोल, या 90 मिनट के बाद अधिग्रहण को रोकने के लिए सॉफ्टवेयर प्रोग्राम।

3. छवि विश्लेषण

Cytokinetic घटनाओं के टेम्पोरल विश्लेषण
1. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक समय बिंदु के लिए Z-फ्रेम के अनुमानों बनाने। अधिग्रहीत छवि के प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए अलग अलग फ़ाइलों बनाओ।
2. इस प्रक्षेपण के लिए एक झगड़ा फ़ाइल के रूप में समय बिंदु श्रृंखला निर्यात करें।
3. ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण। तरंग दैर्ध्य में से किसी एक के लिए छवि श्रृंखला खोलें।
4. अध्ययन करने के लिए एक सेल का चयन करें। उपकरण पट्टी की लाइन विकल्प पर डबल क्लिक करें। इस लाइन चौड़ाई को समायोजित करने के लिए एक और खिड़की खुल जाएगा। सेल चौड़ाई के अनुरूप करने के लिए लाइन चौड़ाई को समायोजित करें। 50 पिक्सल - एक गुम्मट सेल के लिए इस बारे में 40 है। के साथ एक लाइन ड्राब्याज की सेल की लंबी अक्ष।
5. विश्लेषण> उपकरण> रॉय प्रबंधक पर क्लिक करें और ऐड पर क्लिक करें। यह बाद में उपयोग के लिए रॉय खिड़की करने के लिए चयनित लाइन जोड़ देगा। इस विंडो को बंद न करें।
6. ब्याज की छवि पर क्लिक करें और संपादित करें> चयन> सीधे हो जाएँ। यह एक और विंडो खुलेगा। "पूरे ढेर प्रक्रिया" की जाँच करें। यह सेल क्षैतिज सीधा होगा।
7. छवि पर क्लिक करें> रूपांतरण> 90 डिग्री दाएं घुमाएं। इस छवि को अब खड़ी स्ट्रेट है।
8. छवि पर क्लिक करें> ढेर> असेंबल बनाओ। यह स्टैक के लिए पंक्तियों और स्तंभों की संख्या आवंटित करने के लिए एक खिड़की खुल जाएगा, छवि आकार के लिए पैमाने कारक, असेंबल के लिए पहली और आखिरी टुकड़ा (फ्रेम) और असेंबल के लिए फ्रेम वेतन वृद्धि। लेबल स्लाइस की जाँच करें और हिट दर्ज करें।
9. ब्याज की सेल की एक असेंबल के साथ एक खिड़की दिखाया गया है के रूप में, अन्य तरंग दैर्ध्य के लिए छवि श्रृंखला खुला।
10. रॉय प्रबंधक पर लाइन पहचानकर्ता पर क्लिक करें। यह चयन करेंगेदूसरी छवि फ़ाइल पर एक ही सेल। 3.1.8 - दोहराएँ 3.1.6 कदम। यह दूसरी छवि का एक असेंबल खुल जाएगा।
11. धुरी पोल शरीर मार्कर Sad1-mCherry के साथ छवि पर, धुरी पोल शरीर मार्कर की जुदाई की शुरुआत के लिए देखने के लिए और समय 0 के रूप में उस समय बिंदु चिह्नित।
12. समय के साथ छवि पर Rlc1-टमाटर संकेत का पालन करें और संकेत है कि जैसे-Rlc1 टमाटर के धब्बे का विरोध करने के लिए एक अलग पंक्ति के रूप में प्रकट होता है के लिए देखो। इस समय बिंदु actomyosin अंगूठी विधानसभा / परिपक्वता चरण की शुरुआत के पूरा होने का प्रतीक है।
13. समय के साथ फिल्म के माध्यम से अगले स्क्रॉल निर्धारित करने के लिए जब Rlc1-टमाटर की अंगूठी के आकार में कमी करने के लिए शुरू होता है। यह परिपक्वता चरण / अंगूठी कसना की शुरुआत के अंत के रूप में चिह्नित है।
14. कसना भर में समय के साथ-Rlc1 टमाटर संकेत का पालन करें जब तक यह सेल धुरी के बीच में एक बिंदु के रूप में प्रकट होता है। इस अंगूठी कसना / पट ingression के अंत के अंत के रूप में चिह्नित है।
15. डीआईसी छवियों के असेंबल के बाद, अंतिम सेल का निर्धारणजुदाई। समय बिंदु रिकॉर्ड है जब सेल शारीरिक रूप से अलग करती है।
16. धुरी पोल शरीर अलग होने के लिए ImageJ में लाइन उपकरण का उपयोग समय के साथ दो धुरी पोल निकायों के बीच की दूरी को मापने। समय के साथ धुरी पोल शरीर में दूरी प्लॉट।
17. रिकॉर्ड अलग समय अंक अलग अलग घटनाओं cytokinetic प्रत्येक cytokinetic चरण की अवधि की गणना और समय के साथ धुरी पोल शरीर जुदाई के साथ तुलना करने के लिए।
Cytokinetic घटनाओं के स्थानिक विश्लेषण
1. एक दृश्य actomyosin की अंगूठी के साथ एक सेल का चयन करें। ImageJ उपकरण पट्टी की लाइन विकल्प पर डबल क्लिक करें। इस लाइन चौड़ाई को समायोजित करने के लिए एक और खिड़की खुल जाएगा। (- 20 पिक्सल 15) अंगूठी मोटाई के अनुरूप करने के लिए लाइन चौड़ाई को समायोजित करें। रिंग ख्याल रखने की अंगूठी की पूरी मोटाई सुनिश्चित करने के साथ-साथ एक लाइन ड्रा शामिल है।
2. विश्लेषण> उपकरण> रॉय प्रबंधक पर क्लिक करें और ऐड पर क्लिक करें। यह बाद में उपयोग के लिए रॉय खिड़की करने के लिए चयनित लाइन जोड़ देगा।इस विंडो को बंद न करें।
3. ब्याज की छवि पर क्लिक करें और संपादित करें> चयन> सीधे हो जाएँ। यह एक और विंडो खुलेगा। "पूरे ढेर प्रक्रिया" की जाँच करें। इस अंगूठी क्षैतिज सीधा होगा।
4. स्ट्रेट Z ढेर में प्रतिभाशाली विमान की तीव्रता रीसेट (3.1.6 से) छवि का उपयोग करते हुए> समायोजित> चमक / विपरीत> रीसेट।
5. टैब Stk> 3 डी परियोजना पर क्लिक करें। यह एक संवाद बॉक्स खुलेगा। प्रतिभाशाली प्वाइंट के प्रक्षेपण विधि और 2 या 3 पिक्सल के लिए स्लाइस रिक्ति बदलें। अंत में, एक्स या वाई अक्ष के लिए रोटेशन के परिवर्तन अक्ष (यह वांछित कोण को देखने के आधार पर बदल जाएगा), बैठाना क्लिक करें और ठीक क्लिक करें छवि का एक 3 डी प्रोजेक्शन उत्पन्न करते हैं। छवि को बारी बारी करने के लिए छवि के नीचे स्क्रॉल पट्टी का प्रयोग करें।
6. अन्य तरंग दैर्ध्य ImageJ का उपयोग के लिए छवि श्रृंखला खोलें।
7. रॉय प्रबंधक पर लाइन पहचानकर्ता पर क्लिक करें। यह दूसरी छवि फ़ाइल पर ही अंगूठी का चयन करेंगे। दोहराएँ 4.2.4 और 4.2.5 कदम।यह अन्य तरंग दैर्ध्य के साथ छवि में एक 3 आयामी अंगूठी खुल जाएगा।
8. दोनों 3 डी छवि खुला रिंगों के साथ> रंग> छवि पर क्लिक चैनल मिलाएं। यह एक बॉक्स खुलेगा। इसी रंग वांछित के लिए ड्रॉप डाउन मेनू से प्रत्येक छवि का चयन करें और ठीक क्लिक करें। यह दोनों अलग तरंग दैर्ध्य में छवियों के एक समग्र खुल जाएगा।
9. cytokinetic अंगूठी पर स्थानीयकरण करने का संबंध है या ingressing झिल्ली के साथ विभिन्न मार्करों के स्थानीयकरण की तुलना करें। Rlc1-GFP cytokinetic की अंगूठी के लिए एक मार्कर है। प्रोटीन सह स्थानीयकृत Rlc1-GFP के साथ जबकि प्रोटीन Rlc1-GFP संकेत के पीछे स्थानीयकृत ingressing झिल्ली को स्थानीय बनाना अंगूठी करने के लिए स्थानीय बनाना।
  नोट: ब्याज की प्रोटीन की अंगूठी मार्कर की तुलना में एक अलग fluorophore की जरूरत है।
10. cytokinesis के विभिन्न चरणों के दौरान 3 आयामी छल्ले उत्पन्न सभी cytokinesis के माध्यम से प्रोटीन के स्थानिक स्थानीयकरण तुलना करने के लिए।
प्रोटीन वितरित की विश्लेषणcytokinetic अंगूठी पर bution
1. तुलना और प्रोटीन का वितरण का विश्लेषण करने के लिए साथ अंगूठी को मापने प्रोटीन वितरण के विचरण के सह-कुशल है। एक उच्च सह-कुशल विचरण के विभाजन साइट के साथ प्रोटीन के असमान वितरण को इंगित करता है और अनुचित अंगूठी विधानसभा, परिपक्वता या पट गठन का सुझाव है, जिस पर निर्भर करता चरण imaged या विश्लेषण किया है।
2. (3.2.2) से 3 आयामी खंगाला cytokinetic अंगूठी का उपयोग करना, कि इस तरह की अंगूठी के एक चौथाई के प्रत्येक चक्र में प्रकट होता है कम से कम 4 quadrants में छवि को विभाजित। इस के लिए छवि पर सीधा लाइनों आकर्षित करने के लिए लाइन उपकरण का उपयोग करें। प्रत्येक पंक्ति के लिए क्लिक करें छवि के बाद> ओवरले> चयन करें या शॉर्ट कट Ctrl + बी का उपयोग करें।
3. विश्लेषण करने के लिए> माप सेट जाओ। खुलने वाले बॉक्स में मतलब ग्रे मूल्य का चयन करें। ओके पर क्लिक करें।
4. लाइनों के ऊपर के रूप में गाइड एक आयत आयत उपकरण का उपयोग कर प्रत्येक चक्र को परिभाषित करने के लिए आकर्षित खींचा का उपयोग करना।
5. प्रत्येक चक्र, क्लिक का मतलब तीव्रता को मापने के लिएपर विश्लेषण> उपाय या छोटा रास्ता Ctrl + M का उपयोग करें।
6. सभी चार quadrants के लिए मतलब ग्रे मूल्य (एमजी ₁ -MG ₄₎ रिकॉर्ड।
7. पृष्ठभूमि के रूप में चयन के घेरे से बाहर प्रत्येक चक्र में एक छोटे से क्षेत्र का चयन करें।
8. सभी चार quadrants के लिए पृष्ठभूमि के चयन के लिए मतलब ग्रे मूल्य (बीजी ₁ -BG ₄₎ उपाय।
9. li> प्रत्येक चक्र उपयोग formula- एमजी ₁ -Average (बीजी _1: बीजी ₄₎ निम्नलिखित के लिए पृष्ठभूमि घटाव के लिए प्रत्येक चक्र (IRQ) में = अंगूठी की तीव्रता। इस स्तर पर वहाँ 4 आईआरक्यू मूल्यों, प्रत्येक चक्र के लिए एक है।
10. / औसत (IRQ _1: आईआरक्यू _4): अगला (IRQ ₄ IRQ ₁₎ प्रत्येक अंगूठी निम्नलिखित formula- मानक विचलन प्रयोग करने के लिए विचरण के गुणांक की गणना। प्रत्येक तनाव के लिए विचरण की औसत गुणांक की गणना और अन्य नस्लों की तुलना करें।
  नोट: एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नियंत्रण इंडस्ट्रीज़ की तुलना में एक तनाव में विचरण के सह-कुशल में वृद्धिअसमान वितरण प्रोटीन / cytokinesis के उस स्तर पर विभाजन साइट के साथ वितरण icates।

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Representative Results

विखंडन खमीर कोशिकाओं की अंगूठी मार्कर व्यक्त Rlc1-GFP (हरे, चित्रा 2) और धुरी पोल शरीर मार्कर Sad1-mCherry (लाल, चित्रा 2) cytokinesis दौरान imaged थे। धुरी पोल शरीर मार्कर की शुरुआत (सफेद तीर, 2A आंकड़े बी,) (लाल तीर 2A, 2 बी आंकड़े) समय 0. Rlc1-GFP संकेत संदर्भ पोल शरीर जुदाई धुरी के साथ समय -4 मिनट पर प्रकट होता है के रूप में माना जाता है। Rlc1-GFP संकेत एक सतत अंगूठी 10 मिनट के पोस्ट पोल धुरी शरीर जुदाई रूपों (खुला तीर, 2A आंकड़े, बी) actomyosin अंगूठी विधानसभा के अंत अंकन। Actomyosin अंगूठी (Rlc1 GFP) अंगूठी विधानसभा के पूरा होने और धुरी पोल शरीर अलग होने के बाद 32 मिनट के बाद चौड़ाई 22 मिनट में कमी करने के लिए शुरू होता है (बंद नोक 2A आंकड़े, बी)। रिंग कसना कसना की शुरुआत के बाद 20 मिनट, अंगूठी विधानसभा की शुरुआत और धुरी पोल शरीर जुदाई के बाद 52 मिनट के बाद से 42 मिनट (सफेद Asteris समाप्त होता हैकश्मीर, आंकड़े 2A, बी)। अंत में, सेल अलगाव 72 मिनट पद धुरी पोल शरीर जुदाई होती है (लाल नोक, 2A आंकड़े, बी)।

रिंग मार्कर Rlc1-टमाटर और पट झिल्ली मार्कर Bgs1-GFP के स्थानीयकरण cytokinesis भर विभाजन स्थल पर विश्लेषण किया गया। अंगूठी के 3D पुनर्निर्माण पता चला है कि actomyosin अंगूठी Rlc1-टमाटर के साथ चिह्नित पहले Bgs1-GFP भर्ती (चित्रा 3, 10 मिनट) इकट्ठे हुए। रिंग परिपक्वता चरण के दौरान Bgs1-GFP विभाजन साइट के लिए भर्ती और actomyosin अंगूठी के साथ छा गया था के रूप Rlc1-टमाटर (चित्रा 3, 30 मिनट) से दिखाया गया है। यह इंगित करता है कि Bgs1 भर्ती पर अंगूठी के लिए localizes। रिंग constricts के रूप में, Bgs1-GFP भी ingressing झिल्ली बाधा अंगूठी (चित्रा 3, 40 मिनट) से सटे लिए localizes। कसना के अंत में, Bgs1-GFP संकेत ingressed झिल्ली Barri पर दिख रहा हैईआर (चित्रा 3, 50 मिनट)। अंत में, कसना बाद Rlc1-टमाटर संकेत अनुपस्थित, Bgs1-GFP एक डिस्क की तरह उपस्थिति (चित्रा 3, 60 मिनट) के साथ झिल्ली बाधा भर स्थानीयकरण करने के लिए प्रकट होता है, जबकि है। इस प्रकार इन टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि पट synthesizing एंजाइम Bgs1 विधानसभा के बाद अंगूठी के लिए localizes और झिल्ली बाधा पर अंगूठी कसना बाद बनी रहती है ^के रूप में ¹⁷ से पहले सूचित किया गया है।

Actomyosin अंगूठी के साथ प्रोटीन का वितरण cytokinetic घटनाओं (चित्रा 4) की क्षमता का निर्धारण करने के लिए विश्लेषण किया गया था। Actomyosin अंगूठी के साथ प्रोटीन की असमान या nonhomogenous वितरण बिगड़ा संकेतन और अक्षम cytokinetic अंगूठी विधानसभा ^{26 के} साथ संबद्ध किया गया है। यहाँ हम परिपक्वता चरण के दौरान दो 3 डी खंगाला के छल्ले, एफ-बार प्रोटीन Cdc15-GFP (चित्रा 4) व्यक्त दिखा। छविबाईं तरफ, विचरण (0.098) की एक कम गुणांक के साथ अंगूठी के साथ Cdc15-GFP का भी वितरण से पता चलता है, जबकि सही में छवि विचरण के एक उच्च गुणांक (0.226, चित्रा 4) के साथ असमान वितरण से पता चलता।

आकृति 1
चित्रा 1: इमेजिंग के लिए संस्कृति पकवान की तैयारी। एक गिलास तली संस्कृति डिश में कोशिकाओं के योजनाबद्ध का वर्णन टीका मीडिया पैड से मढ़ा। विवरण (खंड 1) के लिए प्रोटोकॉल देखें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
एस pombe में Cytokinetic घटनाक्रम चित्रा 2 समय। (ए) एक सेल व्यक्त spindl के असेंबलई पोल शरीर मार्कर Sad1-mCherry (बाएं पैनल), अंगूठी प्रोटीन Rlc1-GFP (मध्यम पैनल) और उज्ज्वल क्षेत्र (सही पैनल) के दौर से गुजर cytokinesis 2 मिनट के अंतराल पर दिखाया गया है। व्हाइट तीर 17 मिनट पर निशान धुरी पोल शरीर (केंद्रपिंड) जुदाई, लाल तीर 27 मिनट पर विभाजन स्थल पर Rlc1-GFP के प्रारंभिक भर्ती, खुला तीर के निशान अंगूठी परिपक्वता का प्रतीक है, तीर सिर 47 मिनट, तारों के निशान पर अंगूठी कसना की शुरुआत के निशान 69 मिनट और लाल नोक पर अंगूठी कसना के अंत में 97 मिनट पर सेल अलगाव के निशान। (बी) बँटवारा के संदर्भ में cytokinetic घटनाओं के समय के रूप में धुरी पोल शरीर के गठन और जुदाई द्वारा निर्धारित। प्रकोष्ठों 25 डिग्री सेल्सियस पर imaged थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: CeCytokinesis के विभिन्न चरणों के दौरान करूँगा डिवीजन साइट। एक ही सेल के लिए cytokinesis के विभिन्न चरणों, अंगूठी विधानसभा (10 मिनट पद तकला पोल शरीर जुदाई), अंगूठी परिपक्वता (30 मिनट पद तकला पोल शरीर जुदाई), अंगूठी कसना (40 मिनट पद तकला पोल दौरान actomyosin अंगूठी जेड के ढेर के 3D पुनर्निर्माण शरीर जुदाई), कसना के अंत (50 मिनट पद तकला पोल शरीर जुदाई), पट बाधा (60 मिनट पद तकला पोल शरीर जुदाई)। Rlc1-टमाटर की अंगूठी के निशान जबकि Bgs1-GFP पट घेर प्लाज्मा झिल्ली के निशान। स्केल बार = 5 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4: अंगूठी के साथ प्रोटीन का वितरण। 3 डी की छवियाँ जंगली प्रकार सी से actomyosin अंगूठी खंगालाCdc15-GFP व्यक्त एल चार quadrants में विभाजित है। सह-कुशल प्रत्येक अंगूठी के विचरण का कहा गया है। स्केल बार = 5 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ हम एक लौकिक ढंग से विखंडन खमीर में cytokinetic घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक-दूसरे के संदर्भ में अलग-अलग घटनाओं cytokinetic का अस्थायी समाधान प्रदान करता है; प्रोटीन भर्ती या cytokinetic चरण के संदर्भ में हानि के समय; cytokinesis के विभिन्न चरणों के दौरान रिंग की संरचना; और बँटवारा के संदर्भ में cytokinesis की प्रगति। इस प्रोटोकॉल के साथ यह ठीक cytokinetic चरण है कि विभिन्न म्यूटेंट में परिवर्तित किया जा सकता है, जिससे विभिन्न cytokinetic चरणों में शामिल प्रोटीन की एक अधिक विस्तृत समझ प्रदान परिभाषित करने के लिए संभव है। इसके अलावा, अस्थायी विभिन्न चरणों cytokinetic भेद करने की क्षमता है कि विभिन्न चरणों cytokinetic के संगठन का नेतृत्व करने के आणविक तंत्र के विश्लेषण के लिए सक्षम हो जाएगा। अलग-अलग घटनाओं cytokinetic का अस्थायी समाधान भी cytokinetic अंगूठी संरचना और प्रोटीन वितरण के विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता हैअलग घटनाओं भर में। अलग प्रोटीन के spatiotemporal स्थानीयकरण तुलना में और इस दृष्टिकोण के साथ विश्लेषण किया जा सकता है। उपयुक्त fluorophores के उपयोग के साथ, कई प्रोटीन का अध्ययन किया और एक दूसरे के साथ तुलना की जा सकती। इसके अलावा यहां हम यह भी बताया कि कैसे अंगूठी के साथ प्रोटीन का वितरण विभाग स्थल पर प्रोटीन संगठन या वितरण निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल विखंडन खमीर cytokinesis पर लागू होता है, वहीं इस दृष्टिकोण भी विकास और इमेजिंग की स्थिति के लिए उपयुक्त परिवर्तन के साथ अन्य yeasts में cytokinesis और कवक अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

के रूप में वे विभाजित इस प्रोटोकॉल इमेजिंग लाइव कोशिकाओं शामिल है। कोशिकाओं इस प्रोटोकॉल का उपयोग imaged इष्टतम स्थितियों के तहत विकसित करने के लिए किसी भी pleotropic प्रभाव से बचने के लिए की जरूरत है। के रूप में अत्यधिक तेजी से कोशिकाओं को पोषक तत्वों की हानि का कारण बन सकता केयर, देखने के क्षेत्र में कोशिकाओं भीड़ नहीं लिया जाना चाहिए। इसके अलावा कोशिकाओं में इमेजिंग fluorophores मुक्त करने के कारण विषाक्तता की ओर जाता हैकण तस्वीर विरंजन का एक परिणाम के रूप में जारी किया। इस तरह के एस्कॉर्बिक एसिड के रूप में एक नि: शुल्क कट्टरपंथी शमन परिसर के अलावा के साथ कम किया जा सकता है। एस्कॉर्बिक एसिड के अलावा खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं के लंबे समय तक इमेजिंग की अनुमति देता है। छवि अधिग्रहण के दौरान सेल की पूरी जेड अक्ष धुरी पोल शव का कब्जा सुनिश्चित करने के लिए imaged किया जाना चाहिए। धुरी पोल निकायों के लिए एक उचित संकेत के अभाव cytokinesis के समुचित अस्थायी समाधान अनुमति नहीं दी जाएगी। विशेष रूप से, देखभाल ठीक छवि की धुरी पोल शरीर मार्कर की प्रारंभिक जुदाई के रूप में इस समय 0. जेड अक्ष के साथ कोशिकाओं के समुचित कब्जा भी बजता है और सेप्टा के समुचित 3 आयामी पुनर्निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है करने के लिए लिया जाना चाहिए।

छवि के छल्ले और सेप्टा के पार वर्गों, यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक microfabricated अच्छी तरह से है कि छड़ के आकार का विखंडन खमीर कोशिकाओं परमिट सीई की लंबी अक्ष के साथ इमेजिंग के लिए खड़ी होने की जगह के साथ संशोधित किया जा सकताटू के रूप में यहाँ ²⁷ सूचित किया गया है। इस प्रोटोकॉल बहुत ठीक कोशिका विभाजन स्थल पर प्रोटीन भर्ती और समय के साथ स्थानीयकरण कब्जा कर सकते हैं जबकि छवियों के स्थानिक संकल्प इस्तेमाल माइक्रोस्कोप के संकल्प के कारण सीमित है। सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी स्थानिक संकल्प में सुधार करने में मदद कर सकते हैं लेकिन अस्थायी समाधान प्रभावित कर सकता है। इस तरह के जाली प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी के रूप में माइक्रोस्कोपी में हाल के अग्रिमों अस्थायी समाधान ²⁸ से समझौता किए बिना स्थानिक संकल्प में सुधार करने में मदद कर सकता है। प्रकाश माइक्रोस्कोपी इसके अलावा, विखंडन खमीर में cytokinesis भी अधिक समय रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी ^{^29,} ³⁰ का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है।

इस दृष्टिकोण का उपयोग हम रिपोर्ट है कि छोटे GTPase Cdc42 cytokinesis ²¹ के दौरान एक अद्वितीय spatiotemporal सक्रियण पैटर्न से होकर गुजरती है है। यह दृष्टिकोण अलग cytokinetic घटना के संगठन का अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता हैसमय खत्म हो चुका है और इन घटनाओं की आणविक विवरण का वर्णन। रिपोर्ट में सुझाव दिया है कि अकेले एक इकट्ठे actomyosin अंगूठी की उपस्थिति कुशल झिल्ली furrowing और cytokinesis ^{^11,} ^{^21,} ³¹ के लिए पर्याप्त नहीं है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल आणविक घटनाओं है कि actomyosin अंगूठी विधानसभा के बाद उचित cytokinesis के लिए नेतृत्व कर जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, actomyosin अंगूठी और झिल्ली furrowing और पट ingression पर उसके प्रभाव की अखंडता की जांच की जा सकती है। यह अलग आणविक घटनाओं है कि एक साथ सफल जुदाई के लिए नेतृत्व की एक गहरी समझ प्रदान करेगा।

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Disclosures

लेखकों ने प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की अनुपस्थिति की घोषणा की।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast extract media	Sunrise Science Products	YES 225	0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine
Agarose	SeaKem LE agarose, Lonza	50001
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544
Glass Bottomed culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used.
VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system	Visitech International, UK		with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu).
ImageJ	NIH		Image analysis software