Summary
分裂酵母は、 分裂酵母は、細胞質分裂を研究するための優れたモデル系、細胞分裂の最終段階です。ここでは、ライブ分裂酵母細胞内の異なる細胞質分裂のイベントを分析するために、顕微鏡のアプローチを説明します。
Abstract
細胞質分裂、細胞分裂の最後のステップは、ゲノムの完全性を維持するために重要です。適切な細胞質分裂は、細胞分化と発展のために重要です。細胞質分裂がよく、時間と空間にコーディネートされた一連のイベントを伴います。細胞質分裂は、リング収縮、膜の溝の形成と細胞外マトリックスリモデリングに続く分割サイトでのアクトミオシン環の形成を伴います。分裂酵母、 シゾサッカロミセス・ポンベ （S.ポンベ）は 、実質的な明快さと細胞質分裂の最初のイベントを明らかにした十分に研究モデルシステムです。しかし、我々は、細胞質分裂のイベントが時空間的に調整されている方法の異なる明確に理解していません。これを決定するためには、両方の時間と空間で素晴らしい詳細で異なる細胞質分裂のイベントを分析する必要があります。ここでは、異なる細胞質分裂のEVを調べるために顕微鏡のアプローチを説明します生きた細胞内でエント。このアプローチでは、異なる細胞質分裂のイベントの時間および細胞質分裂中に異なるタンパク質の動員の時間を決定することが可能です。また、我々は、細胞分裂の部位でのタンパク質の局在化、および分布を比較するためのプロトコルを説明します。これは、分裂酵母において細胞質分裂を研究するための基本的なプロトコルであり、また、他の酵母および真菌システムのために使用することができます。
Introduction
細胞質分裂、細胞分裂の最後のステップは、適切な分化、開発、および生物の生存に不可欠複雑なプロセスです。細胞質分裂は、ゲノムの完全性1を維持しながら、成功した細胞分離を確実にするために編成されている複数のイベントが含まれます。細胞質分裂は、一旦組み立てアクトミオシンリングは、最終的に細胞器官脱離1、2、3、続いて膜の拡大とfurrowing、および細胞外細胞マトリックスリモデリング、と同時であるくびれを受けるイベントを伴います。細胞質分裂のイベントの不適切な組織は、細胞分離および倍数性の欠陥につながることができ、そして癌4、5、6、7、8のような疾患を引き起こす可能性があります。 Oを有効にする基本原則細胞質分裂のイベントのrganizationがよく、したがって、これらの疾患の病因の我々の理解に障害物につながる、理解されていません。
分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ （S.ポンベ）が原因で1関与するタンパク質の保存された性質のために細胞質分裂を研究するための優れたモデルシステムです。分裂酵母では、リングアセンブリをアクトミオシンた後、リングは、9を収縮しない成熟/ドウェル段階に入ります。成熟は、膜furrowingとセプタム侵入と同時にアクトミオシンリング収縮の開始に終了します。年間の独創的な研究は、分裂酵母1、9、10に私たちのアクトミオシンリングアセンブリのかなり良い理解を与えています。分裂酵母を含むいくつかの真核生物では、アクトミオシンリングの成功のアセンブリは、膜furrowingのために十分ではありません。 Fでission酵母、単独のリング収縮は、溝形成の11のための内部膨圧を克服するのに十分な力を提供していません。最近のモデルは、この力は、代わりに隔壁侵入11によって提供されることを示しています。別のモデルでは、原形質膜の延長の役割が形成12,13の畝間に寄与することが示唆されています。リング狭窄および膜furrowingはBgs1 / CPS1の温度感受性変異体cps1-191、一次中隔形成14、15の主要な酵素では発生しません。 Bgs1を欠く細胞は、欠陥の一次中隔と延長リングくびれ15、16を示しています 。 Bgs1は、リング組立体17,18のアクトミオシン後成熟の間に隔壁進入のための細胞分裂部位に補充されます。 Similarlyは、 ショウジョウバエの胚における細胞化の際に、リング収縮は、分裂酵母で観察された成熟期に似た、かなり遅い初期収縮率19二相性です。二相性リング収縮は、十分な膜膨張20と細胞外マトリックスの修正を可能にするために、膜furrowingが遅くなる場合があります。このリングアセンブリアクトミオシン後、リング狭窄は、細胞は、溝形成のための要件を満たした効率的にのみ発生することを示唆しています。これは、アクトミオシンリングリング組立後の収縮、また、このプロセスを制御する分子事象のために必要とされるどのような条件のよく理解されていません。我々は最近、アクトミオシンリングアセンブリ以下の低分子量GTPaseのCdc42はユニークな時空間活動パターン21を受けることが示されています。このパターンは、（Cdc42のグアニジンヌクレオチド交換因子の独特の局在パターンによって確立されますCdc42のを活性化させるのGEF）。 GEF Gef1は、組み立てられたアクトミオシンリングに局在し、SCD1がfurrowing膜に局在化し、通常の隔壁形成を促進しながら、リングのくびれとセプタム侵入の発症を促進します。私たちは、そのGEFにによって確立されたCdc42の活性化パターンは明確な細胞質分裂のイベントの規制につながることがわかります。
最終的にはアクトミオシンリングアセンブリ以下の細胞分離につながる事象の分子機構を理解するためには、時間と空間の明確な細胞質分裂のイベントに従ってくださいする必要があります。分裂酵母では、細胞質分裂は、まず最終的には、II型ミオシン、formin Cdc12、およびアクトミオシンリングアセンブリのために必要な他のタンパク質を動員する、核の周りの前駆体ノードの組み立てを伴います。時間に明確な細胞質分裂のイベントや参照のフレームを提供し、紡錘体極体マーカー（紡錘体形成）の分離は、時間0 22として考えられています。目の組立電子のアクトミオシンリングは、時間の経過とともに蛍光II型ミオシン調節軽鎖RLC1としてアクトミオシンリングタンパク質をタグ付けの強度をモニターすることによって追跡することができます。ここでは、時間をかけて細胞質分裂のさまざまな段階を分析するために微細なアプローチについて説明します。
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Protocol
サンプルの調製
- 8世代のために32℃でYE液体培地で24スピンドルポール本体マーカーSAD1-mCherryを23とII型ミオシン調節軽鎖RLC1-トマトを発現している分裂酵母細胞を成長させます。
注：温度感受性変異体について、25℃で細胞を増殖させます。 YEで0.5のOD 600に対数期中期に細胞を増殖させます。分裂酵母の成長条件の詳細については分裂酵母の研究室マニュアル25を参照してください。 - 0.6％アガロースでYE（または最小限の）メディアを準備します（アガロースベースのメディアは、寒天に比べて少ない蛍光バックグラウンドを示します）。溶融した培地に、アスコルビン酸（ビタミンC）、1mMのを加えます。ビタミンCは、このように、光毒性を最小限に抑え、光退色に起因して放出されるフリーラジカルをクエンチします。
- Cは、ガラス底培養皿上に溶融メディアを混入ビタミン4mLの - 3を注ぎます。メディアを冷却しようと固めます。
注記：培養皿中のガラスの厚さは、顕微鏡に適したカバースリップの厚さに依存します。ここで、カバースリップ号1.5を使用します。 - 静かに鋭いメスの助けを借りて、培養皿から固化メディアを上げます。メディアスラブとディッシュ（ 図1）に戻って落下からスラブを防止するために、培養皿の間にピペットチップを置きます。
- 上記1.1で説明したように新鮮に増殖する細胞の1ミリリットルを取ります。 30秒間300×gで細胞を穏やかにスピン。上清を捨てます。上清を廃棄した後、チューブ内に残っている残留メディア少量の細胞を再懸濁。
- ロード2 - メディアスラブと培養皿のガラス底部との間の再懸濁細胞培養の5μL。細胞をガラスにする必要があります。メディアと皿の間に配置されたピペットチップは、細胞培養の簡単な取り付けを可能にします。
- 非常に静かにピペットチップを取り外し、背面のcuの元の位置でメディアスラブを配置lture一品。気泡を避けるようにしてください。必要であれば軽くメディアスラブの上にピペットチップの背面をスライドさせることにより気泡を押し出します。
- 細胞が顕微鏡検査が実行される温度で暗所で1時間に30分間培養皿に座ってみましょう。これは、細胞の増殖条件の変化に起因する任意の衝撃を防止することが重要です。
2.画像取得
- 培養皿上のガラスの外側に油を一滴を置きます。倒立顕微鏡上で培養皿を置きます。
- （ - 535 nmの520）YEメディアの自家蛍光を最小限に抑えるために狭い波長範囲でGFPフィルターを使用します。
- 細胞の内側面に焦点を当て、彼らはあまりにも混雑十分に離間とされていないことを確認。細胞周期の適当な段階で細胞の画像取得を開始することを確認します。この実験では、後期G2からの細胞に従ってください。
- 画像取得ソフトウェアTをプログラムO GFP、RFPおよび細胞のDIC画像を取ります。
- この実験では、GFPおよびRFPフィルター用DICと75ミリ秒の露光時間を100ミリ秒の露光時間を使用します。露光時間は、顕微鏡、研究対象のタンパク質および実験期間の設定に依存します。指定された顕微鏡の設定については、50％のレーザー出力を使用しています。
- 3次元、Zスケールイメージングのためのプログラム、画像取得ソフトウェアで画像をキャプチャします。 0.4μmのステップサイズとセルの中央のフォーカスポイントの周囲3.0ミクロン（合計Zの半分）の距離を使用してください。これは、6ミクロンの合計Z距離と時間点あたり16 Z-フレームのキャプチャにつながります。
注：Zシリーズの画像取得は、紡錘体極体の取り込みを可能にします。
- 画像ごとに2分してください。実験の要件に応じて露光時間を変更します。露光時間はまた、目的と信号強度のタンパク質に応じて変更することができます。しかし、その短い点に注意してくださいえー間隔または漂白のために長い露光時間の増加、光毒性、したがって細胞は短時間しか続けることができます。
- DIC画像によって観察されるように、物理的に別々のセルまでの画像を取得、または90分後に取得を停止するためのソフトウェアをプログラムします。
3.画像解析
- 細胞質分裂のイベントの時間的解析
- 画像取得ソフトウェアを使用して、各時点のためのZ-フレームの予測を行います。取得した画像の波長毎に異なるファイルを作成します。
- この投影時点シリーズは.TIFFファイルとしてエクスポートします。
- ImageJソフトウェアを使用して画像を分析します。波長のいずれかのための画像シリーズを開きます。
- 研究対象のセルを選択します。ツールバーのラインオプションをダブルクリックします。これは、線の幅を調整する別のウィンドウを開きます。セルの幅に対応して線幅を調整します。 50ピクセル - WT細胞では、これは約40です。沿って線を引きます目的の細胞の長軸。
- 分析>ツール> ROIマネージャをクリックし、[追加]をクリックします。これは後で使用するためにROIウィンドウに選択した行を追加します。このウィンドウを閉じないでください。
- まっすぐ>興味の画像をクリックして、[編集]> [選択]を選択します。これは、別のウィンドウが開きます。 「プロセススタック全体」を確認してください。これは、水平方向にセルをまっすぐにします。
- 画像をクリックしてください>>トランスフォーム90度右回転させます。この画像は、現在縦にまっすぐにされています。
- 画像をクリックしてください>スタック>はモンタージュを作成します。これは、スタックの行と列の数、モンタージュやモンタージュのためのフレーム増分用の画像サイズ、最初と最後のスライス（フレーム）のためのスケールファクタを割り当てるためのウィンドウを開きます。ラベルのスライスを確認し、エンターキーを押します。
- 目的の細胞のモンタージュを持つウィンドウが表示されているように、他の波長のための画像シリーズを開きます。
- ROIマネージャの回線識別子をクリックします。これが選択されます第二の画像ファイル上の同じセル。 3.1.8 - を繰り返して、3.1.6を繰り返します。これは、第2の画像のモンタージュを開きます。
- 紡錘体極本体マーカーSAD1-mCherryを持つ画像に、紡錘体極体マーカーの分離の発症を探し、時間0としてその時点をマーク。
- 時間をかけて画像上RLC1-トマト信号に従い、RLC1-トマトのパッチとは対照的に明確な線として現れる信号を探します。この時点ではアクトミオシンリングアセンブリ/成熟段階の開始の完了をマークします。
- RLC1-トマトリングのサイズが減少し始める時に次を決定するために時間をかけて映画をスクロールします。これは、リングくびれの成熟期/発症の最後としてマークされています。
- それは、セル軸の中央にドットとして表示されるまで、くびれを通して時間をかけてRLC1-トマト信号に従ってください。これは、セプタム侵入のリングくびれ/最後の最後としてマークされています。
- DIC画像のモンタージュに続いて、最後のセルを決定分離。セルが物理的に分離した時点を記録します。
- 紡錘体極体の分離のためのImageJでラインツールを使用して、時間をかけて2紡錘体極体間の距離を測定します。時間をかけて紡錘体極体内の距離をプロットします。
- 各細胞質分裂の相の期間を計算し、時間をかけて紡錘体極体の分離と比較するための別の細胞質分裂のイベントに対して異なる時点を記録します。
- 細胞質分裂のイベントの空間分析
- 可視アクトミオシンリングを有するセルを選択します。 ImageJのツールバーのラインオプションをダブルクリックします。これは、線の幅を調整する別のウィンドウを開きます。 （ - 20ピクセル15）リングの厚さに対応して線幅を調整します。リングの全体の厚さが含まれていることを確認するために世話をしてリングに沿って線を引きます。
- 分析>ツール> ROIマネージャをクリックし、[追加]をクリックします。これは後で使用するためにROIウィンドウに選択した行を追加します。このウィンドウを閉じないでください。
- まっすぐ>興味の画像をクリックして、[編集]> [選択]を選択します。これは、別のウィンドウが開きます。 「プロセススタック全体」を確認してください。これは、水平方向にリングをまっすぐにします。
- リセット>>明るさ/コントラストを調整>画像を使用して（3.1.6から）まっすぐにzスタックに明るい面の強度をリセットします。
- タブ•コンテキスト> 3Dプロジェクトをクリックします。これは、ダイアログボックスを開きます。ブライポイントへの投影法とスライス間隔は2または3ピクセルに変更します。最後に、XまたはY軸に回転の変化軸（これは所望の視野角に応じて変化します）、補間クリックして、画像の3D投影を生成するために、[OK]をクリックします。画像を回転する画像の下のスクロールバーを使用します。
- ImageJのを使用して他の波長のための画像シリーズを開きます。
- ROIマネージャの回線識別子をクリックします。これは、第2の画像ファイルに同じリングを選択します。繰り返しは、4.2.4と4.2.5を繰り返します。これは、他の波長の画像に3次元のリングを開きます。
- オープン両方の3D画像リングで、チャンネルをマージ>色>画像をクリックしてください。これは、ボックスを開きます。希望する対応する色のドロップダウンメニューから各画像を選択し、[OK]をクリックします。これは、異なる波長で画像の両方の複合体を開きます。
- 細胞質分裂のリングまたは着信する膜に局在に関して異なるマーカーの局在を比較します。 RLC1-GFPは細胞質分裂のリングのためのマーカーです。 RLC1-GFPシグナルの後ろにローカライズするタンパク質が着信する膜に局在しながらタンパク質RLC1-GFPとの共局在化し、リングに局在します。
注：目的のタンパク質は、リングマーカとは異なるフルオロフォアであることが必要です。 - すべての細胞質分裂を介してタンパク質の空間的局在を比較するために、細胞質分裂のさまざまな段階で3次元のリングを生成します。
- タンパク質distriの分析細胞質分裂のリングで献
- リングは、タンパク質分布の分散の共効率を測定沿って比較し、タンパク質の分布を分析します。高い共同効率的な分散のは分裂部位に沿ってタンパク質の偏在を示し、撮像されたか分析する段階に応じて、不適切なリングアセンブリ、成熟または隔膜形成を示唆しています。
- （3.2.2）から3次元再構成細胞質分裂のリングを使用して、リングの四半期は、各象限に現れるように、少なくとも4象限に画像を分割します。このために、画像上の垂直線を描画するラインツールを使用します。各ラインの画像をクリックした後>オーバーレイ>選択を追加するか、ショートカットのCtrl + Bを使用します。
- >セットの測定を分析するために移動します。開くボックスに平均グレー値を選択します。 [OK]をクリックします。
- ガイドは、長方形ツールを使用して、各象限を定義する矩形を描くように上方に描かれた線を使用。
- 各象限の平均強度を測定するために、クリック上の分析>ショートカットはCtrl + Mを測定し、または使用しています。
- すべての4つの象限（MG 1 -MG 4）についての平均グレー値を記録します。
- 背景の選択として、リング外の各象限の小さな領域を選択します。
- すべての4つの象限（BG 1 -BG 4）の背景を選択するための平均グレー値を測定します。
- 各象限（IRQ）中=リングの強度：定式MG 1・平均（BG 4 BG 1）以下の各象限使用するためのバックグラウンド減算についてはLI>。この段階では4 IRQ値、各象限のための1つがあります。
- /平均（IRQ 1：IRQ 4）：次に、以下の式-標準偏差（IRQ 4 IRQ 1）を使用して、各リングのための変動係数を計算します。各菌株のための分散の共同効率的な平均を計算し、他の株と比較します。
注：歪みの分散の共同効率的で統計的に有意な増加は、indは対照と比較して細胞質分裂の段階での分裂部位に沿って不均一なタンパク質分布/配信をicates。
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Representative Results
リングマーカーを発現する分裂酵母細胞は、RLC1-GFP（緑色、 図2）および紡錘体極本体マーカーSAD1-mCherryを（赤、 図2）は、細胞質分裂の際に画像化しました。紡錘体極体マーカーの発現（白矢印、 図2A、Bを図）は時刻0 RLC1-GFPシグナルとして考えられている時に表示されます-4極体の分離スピンドルを基準とした分（赤い矢印は、2A、2Bを図）。 RLC1-GFPシグナルが連続環を形成する10分後、スピンドルポール本体分離アクトミオシンリングアセンブリの終わりをマーク（白抜きの矢印は、 図2A、Bを図 ）。アクトミオシンリング（RLC1-GFP）は、紡錘体極体分離（閉じた矢印は、 図2A、Bを図 ）した後にリングアセンブリと32分が終了した後に幅22分に減少し始めます。リング収縮は、紡錘体極体分離（白asteris以来のリングアセンブリと52分の開始以来、収縮の開始後42分を20分に終了しますK、 図2A、B）。最後に、細胞器官脱離は、72分後、スピンドル極体分離（赤矢印は、 図2A、Bを図 ）が発生します。
リングマーカRLC1-トマトと隔壁膜マーカーBgs1-GFPの局在は細胞質分裂を通して分割サイトで分析しました。リングの3D再構成はRLC1-トマトが付いアクトミオシンリングがBgs1-GFPの動員（ 図3、10分）の前に組み立てられたことを明らかにしました。 RLC1-トマト（ 図3、30分）によって示されるように、リングの成熟段階の間にBgs1-GFPは、分割部位に補充されたとアクトミオシンリングと重なります。これはBgs1は募集時にリングに局在することを示しています。リングが収縮するように、Bgs1-GFPはまた、締め付けリング（ 図3、40分）に隣接して着信する膜に局在します。くびれの終わりには、Bgs1-GFPシグナルはingressed膜ゴシックで表示されていますER（ 図3、50分）。 Bgs1-GFPは、ディスクのような外観（ 図3、60分）を持つ膜障壁を通して局在化するために表示されながら最後に、くびれた後RLC1-トマト信号は、存在しません。従って、これらの観察は、17の前に報告されているように、隔壁合成酵素Bgs1は、組立後にリングに局在し、膜障壁でリング収縮後も持続することを示します。
アクトミオシンリングに沿ってタンパク質の分布は、細胞質分裂のイベント（ 図4）の効率を決定するために分析しました。アクトミオシンリングに沿ったタンパク質の不均一または不均質分布が損なわれ、シグナリングと非効率的な細胞質分裂のリングアセンブリ26と関連しています。ここでは、F-Barのタンパク質Cdc15-GFP（ 図4）を発現する成熟段階の間の2つの3D再構成された環を示します。画像右の画像は、分散の高い係数（0.226、 図 4）との不均一な分布を示しているが左側に、分散係数の低いリング（0.098）に沿ってCdc15-GFPの均一な分布を示しています。
図1：イメージング用培養皿の準備。メディアパッドを重ねたガラス底培養皿への細胞の概略について説明接種。詳細については、プロトコル（第1節）を参照してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
S.ポンベにおける細胞質分裂のイベントの図2のタイミング。 SPINDLを発現する細胞の（A）モンタージュ電子ポール本体マーカーSAD1-mCherryを（左パネル）、リングタンパク質RLC1-GFP（中央パネル）および明視野（右パネル）を受けて細胞質分裂は、2分間隔で示されています。白矢印は、17分で紡錘体極体（中心体）の分離をマーク赤い矢印が分割サイト、27分で開いた矢印マークリング成熟でRLC1-GFPの最初の募集をマーク、矢印ヘッドは、47分でリング収縮の開始をマークし、アスタリスクマーク69分でリング収縮の終わりと赤い矢印は97分で細胞器官脱離をマーク。 （B）紡錘体極体形成および分離によって決定として有糸分裂を参照して、細胞質分裂のイベントのタイムライン。細胞を、25℃で画像化しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：Ceの細胞質分裂のさまざまな段階でのLL事業部サイト。同じセル、リングアセンブリ（10分後スピンドルポール本体分離）、リング成熟（30分後に紡錘体極体の分離）、リングくびれ（40分後に紡錘体極のための細胞質分裂の異なる段階中のアクトミオシン環Z-スタックの3D再構成体分離）、くびれの終わり（50分後に紡錘体極体分離）、セプタムバリア（60分後スピンドル極体分離）。 Bgs1-GFPは、セプタムを包む形質膜をマークしながらRLC1-トマトはリングをマーク。スケールバー=5μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：リングに沿ったタンパク質の分布。 3Dの画像は、野生型cからアクトミオシンリングを再構成し4つの象限に分けCdc15-GFPを発現ells。共同効率的な各リングの分散が記載されています。スケールバー=5μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、一時的な方法で、分裂酵母における細胞質分裂のイベントを研究するためのプロトコルを記述しています。ここで説明するプロトコルは、互いを基準とした異なる細胞質分裂のイベントの時間分解能を提供します。細胞質分裂の位相を基準としたタンパク質の動員または損失のタイミング。細胞質分裂の異なる段階を通じてリングの構造;有糸分裂を参照して、細胞質分裂の進行。このプロトコルでは正確にそれによって異なる細胞質分裂の段階に関与するタンパク質のより詳細な理解を提供し、異なる変異体に変更することができる細胞質分裂の段階を定義することが可能です。また、時間的に異なる細胞質分裂の段階を区別する能力が異なる細胞質分裂の段階の組織につながる分子メカニズムの解析を可能にします。異なる細胞質分裂のイベントの時間分解能はまた、細胞質分裂の環構造とタンパク質の分布の解析を可能にしますさまざまなイベントを通して。異なるタンパク質の時空間局在を比較し、このアプローチを用いて分析することができます。適切なフルオロフォアを使用して、複数のタンパク質を研究し、互いに比較することができます。ここに加えて、我々はまた、リングに沿ったタンパク質の分布は、分割部位でタンパク質組織または送達を決定するために分析することができる方法を記載しています。ここで説明するプロトコルは、分裂酵母の細胞質分裂に適用されるが、このアプローチはまた、増殖および撮影条件に適切な変更を他の酵母および真菌に分裂を研究するために利用することができます。
彼らは分裂としてこのプロトコルは、イメージング生細胞が関与します。このプロトコルを用いて画像化細胞は、任意の多面的影響を回避するために最適な条件の下で成長する必要があります。ケアは、過剰な細胞が急速な栄養損失につながる可能性として、視野内の細胞を群衆ないように注意しなければなりません。また、細胞内イメージング蛍光団が原因自由に毒性につながりますラジカルは、光漂白の結果として放出します。これは、アスコルビン酸などのフリーラジカルクエンチング化合物を添加して最小限に抑えることができます。アスコルビン酸の添加は、顕微鏡下で細胞の長期間の画像化を可能にします。画像取得中に、セルの全体のZ軸は、紡錘体極体の捕捉を確実にするために画像化される必要があります。紡錘体極体のための適切な信号の不在は、細胞質分裂の適切な時間分解能を許可しません。このよう紡錘体極体マーカーの最初の分離は時間であり、特に、注意が正確に画像に取られるべきであるZ軸に沿った細胞の0適切な捕獲もリングとセプタムの適切な3次元再構成のために重要です。
画像にリングおよび隔壁の断面を、ここで説明するプロトコルは、棒状分裂酵母細胞は、CEの長軸に沿ってイメージング用の上下方向の場所であることを可能にする微細加工十分で修飾することができますLLここ27に報告されているように。このプロトコルは、非常に正確に細胞分裂サイトで時間をかけてタンパク質の動員およびローカライズをキャプチャすることができますが、画像の空間分解能は、使用される顕微鏡の解像度に制限されています。超解像顕微鏡の空間分解能を向上させることができるが、時間分解能に影響を与えることができます。このような格子状シート光顕微鏡などの顕微鏡の最近の進歩は、時間分解能28を損なうことなく、空間分解能を向上させることができます。光学顕微鏡の他に、分裂酵母における細胞質分裂はまた、ラマン分光法29、30を用いて経時的に研究することができます。
このアプローチを用いて、我々は、低分子量GTPaseのCdc42は細胞質分裂21の間に独特の時空的活性化パターンを受けることを報告しています。このアプローチは、異なる細胞質分裂のイベントの組織を研究することを可能に時間の経過秒とは、これらのイベントの分子の詳細を説明します。レポートは、単独で組み立てられたアクトミオシンリングの存在は、効率的な膜furrowingと細胞質分裂11、21、31には十分ではないことを示唆しています。ここで説明するプロトコルは、リング組立体のアクトミオシンの後に適切な分裂をもたらす分子事象を調査するために使用することができます。また、アクトミオシンリング及び膜furrowingと隔壁侵入に対する効果の完全性を検査することができます。これは、一緒に成功した分離につながる異なる分子事象のより深い理解を提供します。
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Disclosures
著者には、競合する金融利益を宣言しません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract media | Sunrise Science Products | YES 225 | 0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine |
| Agarose | SeaKem LE agarose, Lonza | 50001 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Glass Bottomed culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used. |
| VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system | Visitech International, UK | with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu). | |
| ImageJ | NIH | Image analysis software |
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