Summary
분열 효모는, 분열의 pombe는 세포질 분열을 연구하는 훌륭한 모델 시스템, 세포 분열의 마지막 단계입니다. 여기에서 우리는 라이브 분열 효모 세포에서 다른 cytokinetic 이벤트를 분석하기 위해 현미경 방법을 설명합니다.
Abstract
세포질 분열, 세포 분열의 마지막 단계는 게놈 무결성을 유지하기 위해 중요합니다. 적절한 세포질 분열은 세포 분화 및 개발을위한 중요합니다. 세포질 분열이 아니라 시간과 공간에서 조정되는 일련의 사건을 포함한다. 세포질 분열 링 수축 멤브레인 고랑 형성 및 세포 외 기질 재 형성 하였다 분할 부위에서 액토 마이 오신 고리의 형성을 포함한다. 분열 효모,, 분열의 pombe (S.의 pombe)는 상당한 명확성과 세포질 분열의 초기 이벤트를 공개했다 잘 공부 모델 시스템입니다. 그러나, 우리는 cytokinetic 이벤트가 시공간으로 조정된다 명확 얼마나 다른지 이해하지 않습니다. 이를 확인하기 위해, 하나는 모두 시간과 공간에 훌륭한 세부에있는 다른 cytokinetic 이벤트를 분석 할 필요가있다. 여기에서 우리는 다른 cytokinetic EV를 조사하기 위해 현미경 접근 방식을 설명살아있는 세포에서 행군. 이 방법으로 다른 cytokinetic 이벤트 시간과 세포질 분열 동안 다른 단백질을 채용하는 시간을 결정하는 것이 가능하다. 또한, 우리는 세포 분열의 부위에서 단백질 지역화 및 분포를 비교하는 프로토콜을 기술한다. 이 분열 효모 세포질 분열을 연구하는 기본 프로토콜 및 다른 효모 및 곰팡이 시스템에 사용될 수있다.
Introduction
세포질 분열, 세포 분열의 마지막 단계는 유기체의 적절한 분화, 발달과 생존에 대한 복소 공정 필수적이다. 세포질 분열는 게놈 무결성 1을 유지하면서 성공적인 세포 분리를 보장하기 위해 조직 된 여러 이벤트를 포함한다. 세포질 분열 한번 조립 액토 마이 오신 링 마침내 세포 이탈 1, 2, 3,이어서 막 팽창 furrowing 및 세포 외 기질 재 형성, 동시 인 수축을 거쳐 이벤트를 포함한다. cytokinetic 이벤트 부적절한 조직 세포 분리 및 배수성 결함으로 이어질 수 있으며, 암 4, 5, 6, 7, 8과 같은 질환을 유발할 수있다. 활성화 기본 원리 오cytokinetic 이벤트 rganization 잘 따라서 이러한 질병의 원인에 대한 우리의 이해에 장애물로 이어지는 이해되지 않습니다.
분열 효모, 분열의 pombe (S.의 pombe)이 때문에 1 관련 단백질의 보존 된 자연 세포질 분열을 연구하는 훌륭한 모델 시스템입니다. 분열 효모에서, 링 어셈블리를 액토 마이 오신 후, 링은 9 수축하지 않는 성숙 / 드웰 단계로 들어갑니다. 성숙은 막 furrowing 및 격벽 ingression와 동시 액토 마이 오신 링 수축의 시작과 끝납니다. 지난 몇 년 동안 독창적 인 작품은 분열 효모 1, 9, 10, 우리에게 액토 마이 오신 링 어셈블리의 상당히 좋은 이해를 주었다. 분열 효모 등 일부 진핵 생물에서의 액토 마이 오신 링을 성공적으로 조립 막 furrowing 충분하지 않습니다. F에서ission 효모는, 링 수축 혼자 고랑 형성 (11) 내부 팽압을 극복하기에 충분한 힘을 제공하지 않습니다. 최근 모델이 힘 대신 격벽 ingression (11)에 의해 제공되는 것을 나타냅니다. 다른 모델에있어서, 세포막 연장 부의 역할을 형성 (12, 13)를 밭고랑에 기여 제안되었다. 반지의 수축과 막 furrowing는 Bgs1 / CPS1 온도에 민감한 돌연변이 cps1-191, 주 격벽 형성 (14), (15)의 주요 효소 발생하지 않습니다. Bgs1 부족한 세포에 결함이 주 격벽 및 연장 링 수축 (15, 16)을 보여줍니다. Bgs1은 링 어셈블리 (17), (18) 액토 마이 오신 후 성숙 중에 격벽 ingression 대한 세포 분열 사이트에 채용된다. SimilarlY는 초파리 배아에서 cellularization 동안, 링 수축은 분열 효모에서 관찰 된 성숙 단계를 닮은 상당히 느린 초기 수축 속도 (19)과 이상성입니다. 바이 페이 링 수축이 충분 막 확장 (20)과 세포 외 기질의 수정을 허용하는 막 furrowing 느려질 수 있습니다. 이것은 링 조립체 액토 마이 오신 후에, 링이 수축 셀 고랑 형성을위한 요구 사항을 만족할 효율적 때만 발생하는 것을 의미한다. 잘 액토 마이 오신 링 링 조립 한 후 수축 없으며,이 과정을 조절하는 분자 이벤트에 필요한 어떤 조건 이해되지 않습니다. 우리는 최근 액토 마이 오신 링을 다음을 조립 소는 GTPase Cdc42 고유 시공간 활성화 패턴 (21)을 겪는 것으로 나타났습니다. 이 패턴은 Cdc42 구아니딘 뉴클레오타이드 교환 인자의 고유 파악 패턴 (기준 확립Cdc42을 활성화 GEFs). 지구 환경 기금 (GEF) Gef1는 조립 액토 마이 오신 링에 지역화 및 Scd1가 furrowing 막에 지역화 정상 격벽 형성을 촉진하면서, 링 수축 및 격벽 ingression의 발병을 촉진한다. 우리는 그 GEFs에 의해 설립 된 Cdc42 활성화 패턴이 독특한 cytokinetic 이벤트의 규제로 이어질 것을 찾을 수 있습니다.
결국 액토 마이 오신 링 조립체 다음 세포 분리가 발생할 이벤트의 분자 메커니즘을 이해하기 위해, 하나의 시간과 공간의 고유 cytokinetic 이벤트를 수행 할 필요가있다. 분열 효모에서 세포질 분열 먼저 결국 유형 II 미오신의 formin Cdc12 및 액토 마이 오신 링 조립에 필요한 다른 단백질을 모집 핵 주위 전구체 노드의 어셈블리를 포함한다. 시간으로 구별 cytokinetic 이벤트 및 참조 프레임을 제공는 스핀들 극 몸 마커 (스핀들 형성)의 분리는 시간 0 (22)로 간주됩니다. 일의 조립전자 액토 마이 오신 링은 형광 태그 액토 마이 오신 링 단백질의 강도와 같은 타입 II 규제 미오신 경쇄 Rlc1 시간이 지남에 모니터링 하였다 될 수있다. 여기에서 우리는 시간이 지남에 따라 세포질 분열의 다른 단계를 분석하는 미시적 접근 방법을 설명합니다.
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Protocol
예제 1. 준비
- 8 세대에 32 ° C에서 YE 액체 미디어 스핀들 극 몸 마커 SAD1-mCherry (23)와 유형 II 마이 오신 규제 경쇄 Rlc1 - 토마토 (24)을 표현 분열 효모 세포를 성장.
참고 : 온도에 민감한 돌연변이를 들어, 25 ° C에서 세포를 성장. YE 0.5의 OD 600 중반 로그 단계로 세포를 성장. 핵분열에 대한 자세한 내용은 효모의 성장 조건은 분열 효모 실험 매뉴얼 (25)을 참조하십시오. - 0.6 % 아가로 오스와 YE (또는 최소) 미디어를 준비 (아가로 오스 기반 미디어는 한천에 비해 적은 형광 배경을 표시). 용융 된 미디어에 아스 코르 빈산의 1 ㎜ (비타민 C)를 추가합니다. 비타민 C 따라서 사진 독성을 최소화, 사진 표백으로 인해 방출되는 활성 산소를 소멸.
- C는 유리 바닥 배양 접시에에 미디어를 용융 레이스 비타민의 4 mL의 - 3를 따르십시오. 미디어 멋진하자 응고.
참고 :배양 접시에 유리의 두께는 현미경에 적합한 커버 슬립 두께에 따라 달라집니다. 여기에서 사용 coverslip에 제 1.5. - 부드럽게 날카로운 메스의 도움으로 배양 접시에서 응고 미디어를 올립니다. 미디어 슬래브와 접시 (그림 1)에 다시 떨어지는 슬래브를 방지하기 위해 배양 접시 사이에 피펫 팁을 배치합니다.
- 위의 1.1에 설명 된대로 갓 성장하는 세포의 1 mL를 취하여. 30 초 동안 300 XG에 부드럽게 세포를 스핀. 상층 액을 버린다. 상청액을 폐기 한 후, 튜브에 남아있는 잔여 미디어 소량의 세포를 재현 탁.
- 로드 2 - 미디어 슬래브 및 배양 접시의 유리 바닥 사이에 재 부유 세포 배양의 5 μL. 세포는 유리에 있어야합니다. 미디어와 요리 사이에 피펫 팁은 세포 배양 쉽게 적재 할 수 있습니다.
- 아주 부드럽게 세제곱에 원래의 위치에 다시 미디어 슬래브를 피펫 팁을 제거하고 배치lture 요리입니다. 공기 방울을 방지해야합니다. 경우 부드럽게 미디어 슬라브 위에 피펫 팁의 후방으로 밀어 기포를 누르 될 필요가있다.
- 세포를 현미경이 수행 될 때의 온도에서 30 분간 어둠 속에서 시간에 대한 한 배양 접시에 앉게. 세포에 대한 성장 조건의 변경이 때문에 어떤 충격을 방지하기 위해 중요하다.
2. 이미지 인식
- 배양 접시에 유리의 외측에 기름 한 방울을 놓습니다. 거꾸로 현미경의 배양 접시를 놓습니다.
- (- 535 내지 520)이 좁은 파장 범위의 GFP 필터를 사용 YE 매체 자동 형광을 최소화한다.
- 세포의 안쪽면에 초점이 너무 붐비는 잘 간격이 아닌 것을 확인합니다. 세포주기의 적절한 단계에서 세포의 이미지 획득을 시작해야합니다. 이 실험을 위해, 후반 G2에서 세포를 따릅니다.
- 화상 획득 소프트웨어 t 프로그램오 GFP, RFP 및 세포의 DIC 이미지를 가져 가라.
- 이 실험을 위해 DIC 100 밀리 노출 시간과 GFP 및 RFP 필터 75 밀리 노출 시간을 사용합니다. 노출 시간은 현미경 연구중인 단백질 및 실험 기간의 설정에 의존한다. 주어진 현미경 설정에 대해서는 50 %의 레이저 파워를 사용한다.
- 3 차원 Z 스케일 이미징 프로그램 화상 획득 소프트웨어 이미지를 캡처한다. 셀의 중앙 포커스 포인트 약 0.4 ㎛의 단계 크기 및 3.0 ㎛의 (총 Z의 절반)의 거리를 사용한다. 이 6 ㎛의 총 Z 거리와 시점 당 16 Z-프레임 캡처로 연결됩니다.
참고 : Z 시리즈 이미지 수집 스핀들 극 기관의 캡처를 할 수 있습니다.
- 이미지마다 2 분 가져 가라. 실험의 요구에 따라, 노광 시간을 변경한다. 노출 시간은 관심 및 신호 강도의 단백질에 따라 변경 될 수있다. 그러나, 짧은주의ER 간격 또는 탈색으로 인한 긴 노출 시간 증가 광 독성이 때문에 셀은 단지 짧은 시간 동안 추적 될 수있다.
- DIC 이미지에 의해 관찰 물리적으로 분리 된 세포까지 이미지를 획득, 90 분 후 획득을 정지 할 수있는 소프트웨어 프로그램.
3. 이미지 분석
- cytokinetic 사건의 시간적 분석
- 화상 획득 소프트웨어를 사용하여 각 시간 점에 대해 Z 프레임의 돌기를 만든다. 획득 된 이미지의 각 파장에 대해 서로 다른 파일을 확인합니다.
- .TIFF 파일로이 투사 시간 소수점 시리즈를 보냅니다.
- ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석한다. 파장 중 어느 하나의 이미지 시리즈를 연다.
- 셀을 선택하는 공부합니다. 도구 모음의 줄 옵션을 더블 클릭합니다. 이 선 폭을 조정하는 또 다른 창이 열립니다. 셀의 폭에 해당하는 라인 폭을 조정한다. 50 픽셀 - WT 세포의 경우이 약 40이다. 을 따라 선을 그립니다관심있는 셀의 장축.
- 분석> 도구> 투자 수익 (ROI) 관리자를 클릭하고 추가를 클릭합니다. 이것은 나중에 사용하기 위해 투자 수익 (ROI) 창에 선택한 행을 추가합니다. 이 창을 닫지 마십시오.
- 직선화> 관심있는 이미지를 클릭하고 편집> 선택을 선택합니다. 이것은 또 다른 창이 열립니다. "전체 스택을 처리"확인합니다. 이는 가로 셀 정돈된다.
- 이미지를 클릭> 변형> 90도 오른쪽으로 돌립니다. 이 이미지는 이제 수직으로 곧게된다.
- 이미지를 클릭> 스택> 몽타주를 확인합니다. 이 스택에 대한 행과 열의 개수를 할당하는 창이 열리고, 화상 크기에 대한 스케일 팩터의 몽타주 처음과 마지막 조각 (프레임)와 몽타주 프레임 증가. 라벨 조각을 확인하고 Enter 키를 누릅니다.
- 관심 셀의 몽타주와 윈도우가 도시 된 바와 같이, 다른 파장에 대한 화상 시리즈를 연다.
- 투자 수익 (ROI) 관리자의 라인 식별자를 클릭합니다. 이 선택한다두 번째 화상 파일에 대해 동일한 셀. 3.1.8 - 반복 3.1.6 단계를 반복합니다. 이것은 두 번째 이미지의 몽타주를 엽니 다.
- 스핀들 극 몸 마커 SAD1-mCherry와 이미지에, 스핀들 극 몸 마커의 분리의 발병을 찾을 시간이 0으로 그 시점을 표시합니다.
- 시간이 지남에 따라 이미지에 Rlc1 - 토마토 신호에 따라 Rlc1 - 토마토의 패치는 달리 뚜렷한 선으로 표시되는 신호를 찾습니다. 이 시간-점은 액토 마이 오신 링 조립 / 성숙 단계의 시작의 완료를 표시합니다.
- Rlc1 - 토마토 링의 크기가 감소하기 시작하면 시간이 지남에 따라 영화를 통해 다음 스크롤 확인합니다. 이것은 링 수축의 성숙 단계 / 시작의 끝으로 표시됩니다.
- 이 셀 축의 중간에 점으로 표시 될 때까지 수축을 통해 시간에 Rlc1 - 토마토 신호를 따르십시오. 이는 격벽 ingression의 링 수축 / 끝의 끝으로 표시됩니다.
- DIC 이미지의 몽타주 후, 최종 세포 결정할분리. 세포가 물리적으로 분리 할 때 시각을 기록한다.
- 스핀들 기둥 체 분리 ImageJ에의 선 도구를 사용하여 시간에 따른 두 개의 스핀들 자극 체 사이의 거리를 측정한다. 시간이 지남에 따라 스핀들 극 몸에 거리를 플롯.
- 다른 cytokinetic 이벤트가 각 cytokinetic 단계의 기간을 계산하고 시간이 지남에 따라 스핀들 극 신체 분리와 비교하기 위해 서로 다른 시간 포인트를 기록합니다.
- cytokinetic 이벤트 공간 분석
- 눈에 보이는 액토 마이 오신 반지와 셀을 선택합니다. ImageJ에 도구 모음의 줄 옵션을 더블 클릭합니다. 이 선 폭을 조정하는 또 다른 창이 열립니다. (- 20 픽셀 15), 링의 두께에 대응하여 선폭을 조정한다. 반지의 전체 두께를 보장하기 위해 돌보는 링을 따라 선을 그립니다 것이 포함되어 있습니다.
- 분석> 도구> 투자 수익 (ROI) 관리자를 클릭하고 추가를 클릭합니다. 이것은 나중에 사용하기 위해 투자 수익 (ROI) 창에 선택한 행을 추가합니다.이 창을 닫지 마십시오.
- 직선화> 관심있는 이미지를 클릭하고 편집> 선택을 선택합니다. 이것은 또 다른 창이 열립니다. "전체 스택을 처리"확인합니다. 이 수평 반지를 똑 바르게됩니다.
- 이미지를 사용하여 (3.1.6에서) 곧게 Z 스택의 밝은면의 강도를 재설정> 조정> 밝기 / 대비> 재설정합니다.
- 탭 STK> 3D 프로젝트를 클릭합니다. 이 대화 상자가 열립니다. 밝은 포인트 투영 방법 및 2 또는 3 픽셀로 슬라이스 간격을 변경합니다. 마지막으로, X 또는 Y 축 회전의 변화 축 (이 원하는 시야각에 따라 변경됩니다), 보간 클릭하고 이미지의 3D 프로젝션을 생성하기 위해 확인을 클릭합니다. 이미지를 회전하는 이미지 아래에있는 스크롤 막대를 사용합니다.
- ImageJ에를 사용하여 다른 파장의 이미지 시리즈를 엽니 다.
- 투자 수익 (ROI) 관리자의 라인 식별자를 클릭합니다. 이 제 2 화상 파일의 동일한 고리를 선택할 것이다. 반복 4.2.4와 4.2.5 단계를 반복합니다.이것은 다른 파장 이미지의 3 차원 링을 엽니 다.
- 열린 두 3D 이미지 링으로, 채널 병합> 색상> 이미지를 클릭하십시오. 이 상자가 열립니다. 원하는 해당 색상에 대한 드롭 다운 메뉴에서 각 이미지를 선택하고 확인을 클릭합니다. 이것은 서로 다른 파장의 이미지를 모두의 합성을 엽니 다.
- cytokinetic 링에서 현지화에 관해서 또는 ingressing 막 서로 다른 마커의 현지화를 비교. Rlc1-GFP는 cytokinetic 링 마커입니다. 단백질은 ingressing 막에 지역화 Rlc1-GFP 신호 뒤에 현지화하는 동안 단백질은 공동 현지화 Rlc1-GFP로하면 링에 지역화.
주 : 관심 단백질 링 마커의 상이한 형광 물질로 할 필요가있다. - 모든 세포질 분열을 통해 단백질의 공간 지역화 비교 세포질 분열의 다른 단계 동안 3 차원 고리를 생성한다.
- 단백질 DISTRI 분석cytokinetic 링에서 bution
- 링 단백질 분포의 분산의 공동 효율을 측정 따라 비교해 단백질의 분포를 분석한다. 높은 CO 효율적인 분산은 분할 부위에 따라서 단백질의 불균일 한 분포를 나타내고 상이 결상되고 분석에 따라, 부적절한 링 조립체 성숙 또는 격벽의 형성을 제안한다.
- (3.2.2)에서 3 차원 재구성 cytokinetic 링을 사용하여 링의 4 분의 각 사분면에 표시되도록 적어도 4 사분면으로 이미지를 나눕니다. 이를 위해 이미지에 수직으로 선을 그립니다 줄 도구를 사용합니다. 각 라인 이미지를 클릭 한 후> 오버레이> 선택을 추가 지름길 Ctrl 키 +의 B를 사용합니다.
- > 설정 측정 분석로 이동합니다. 열린 상자에 평균 회색 값을 선택합니다. 확인을 클릭합니다.
- 가이드 직사각형 직사각형 도구를 사용하여 각각의 사분면을 정의하는 그릴 위에 그려진 선을 사용.
- 각 사분면 클릭의 평균 강도를 측정하기 위해,분석에> 측정하거나 바로 가기 Ctrl 키 + M을 사용합니다.
- 네 개의 사분면에 대한 평균 회색 값 (MG 1 -mg 4)를 기록한다.
- 배경 선택과 같은 링 밖에서 각 사분면에있는 작은 영역을 선택합니다.
- 네 사분면의 배경 선택을위한 평균 회색 값 (BG 1 -bg 4)을 측정한다.
- 각 사분면 (IRQ)에서 = 링의 강도 다음 공식에 MG 1 - 평균 (BG 4 BG 1) 다음 각 사분면을위한 배경 공제 리>. 이 단계에서 4 IRQ 값, 각 사분면에 대해 하나가 있습니다.
- / 평균 (IRQ 1 : IRQ 4) : 다음 다음 제형 표준 편차를 사용하여 각 반지 (IRQ 4 IRQ 1) 분산의 계수를 계산한다. 각 변형에 대한 분산의 평균 공동 효율을 계산하고 다른 균주에 비교합니다.
주 : 제어 IND 비교 균주 분산 공동 효율적인 통계적으로 유의 한 증가세포질 분열의 단계에서 분할 사이트를 따라 고르지 단백질 배포 / 전달을 icates.
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Representative Results
링 마커를 발현하는 분열 효모 세포는 Rlc1-GFP (녹색, 그림 2)와 스핀들 극 몸 마커 SAD1-mCherry (빨강, 그림 2) 세포질 분열하는 동안 몇 군데 있었다. 스핀들 극 몸 마커의 발병 (빨간색 화살표 2A, 2B 피규어) 0 Rlc1-GFP 신호가 극 몸의 분리를 스핀들 참조하여 시간 -4 분에 나타납니다 시간으로 간주된다 (흰색 화살표, B, 2A 피규어). Rlc1-GFP 신호는 액토 마이 오신 링 어셈블리의 끝을 표시하는 (B, 오픈 화살표 2A 피규어) 연속 링 10 분 후 스핀들 극 신체 분리를 형성한다. 액토 마이 오신 링 (Rlc1-GFP)이 링 조립 완료 및 스핀들 극 신체 분리 후 32 분 후 폭 22 분에 감소하기 시작 (폐쇄 화살표 2A 피규어, B). 반지의 수축은 수축의 발병 후 20 분, 반지 어셈블리의 발병 및 스핀들 극 본체 분리 이후 52 분부터 42 분 (흰색 asteris을 종료K,도 2A, B). 마지막으로, 세포 이탈 72 분 후 스핀들 극 본체 분리 발생 (빨간색 화살표를 2A 피규어, B).
링 마커 Rlc1 - 토마토와 격벽 막 마커 Bgs1-GFP의 현지화는 세포질 분열에 걸쳐 분할 사이트에서 분석 하였다. 반지의 3D 재건은 Rlc1 - 토마토 표시 액토 마이 오신 링 Bgs1-GFP 모집 (그림 3, 10 분) 전에 조립 된 것으로 나타났습니다. Rlc1 - 토마토 (도 3, 30 분)에 의해 도시 된 바와 같이, 링 성숙 단계 동안 Bgs1-GFP는 분할 사이트에 고용하고, 액토 마이 오신 링 중첩. 이 Bgs1는 채용시 링에 지역화 나타냅니다. 반지 수축으로 Bgs1-GFP는 수축 링 (그림 3, 40 분)에 인접한 ingressing 막에 지역화. 수축이 끝나면 Bgs1-GFP 신호는 ingressed 막 BARRI 가시어 (그림 3, 50 분). Bgs1-GFP는 디스크와 같은 모양 (그림 3, 60 분)와 막 장벽에 걸쳐 현지화 표시하면서 마지막으로, 수축 후 Rlc1 - 토마토 신호는 존재하지 않는다. 따라서, 이러한 관찰은 17 이전에보고 된 바와 같이 격벽 합성 효소 Bgs1 조립 후에 링 편재 멤브레인 장벽에서 링 수축 후 지속 것을 나타낸다.
액토 마이 오신 링 따라 단백질의 분포 cytokinetic 이벤트 (도 4)의 효율을 결정하기 위해 분석 하였다. 액토 마이 오신 링을 따라 단백질의 고르지 또는 nonhomogenous 분포는 장애 신호 비효율적 cytokinetic 링 조립체 (26)와 연결되었습니다. 여기에서 우리는 F-바 단백질 Cdc15-GFP (그림 4) 발현하는 성숙 단계에서 두 개의 3D 재구성 반지를 보여줍니다. 이미지오른쪽에있는 이미지 변화의 높은 계수 (0.226, 그림 4)와 고르지 못한 분포를 나타낸다 동안 왼쪽에, 분산 (0.098)의 낮은 계수 링을 따라 Cdc15-GFP의 고른 분포를 보여줍니다.
그림 1 : 이미징을위한 문화 요리의 준비. 유리 바닥 배양 접시에 세포의 개략적 인 설명 접종 미디어 패드와 겹쳐. 세부 사항 (제 1 절)에 대한 프로토콜을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
S.의 pombe에서 Cytokinetic 이벤트의 그림 2 타이밍. 셀 표현 spindl의 (A) 몽타주전자 극 몸 마커 SAD1-mCherry (왼쪽 패널), 링 단백질 Rlc1-GFP (가운데 패널) 및 밝은 필드 (오른쪽 패널) 세포질 분열을받은 것은 2 분 간격으로 표시됩니다. 흰색 화살표는 17 분에서 스핀들 극 본체 (중심체) 분리를 표시, 빨간색 화살표는 27 분에서 분할 사이트에서 Rlc1-GFP의 초기 모집, 오픈 화살표 표시 링 성숙을 표시, 화살표 머리는 47 분, 별표 표시에 링 수축의 시작을 표시한다 69 분, 빨간색 화살표에서 링 수축의 끝은 97 분에서 세포의 이탈을 표시합니다. 스핀들 극 몸 형성과 분리에 의해 결정으로 유사 분열을 참조 cytokinetic 이벤트 (B) 타임 라인. 세포는 25 ° C에서 몇 군데 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 세륨세포질 분열의 다른 단계 동안 LL 부문 사이트. 같은 셀의 세포질 분열의 다른 단계, 링 어셈블리 (10 분 후 스핀들 극 본체 분리), 링 성숙 (30 분 후 스핀들 극 본체 분리), 링 수축 (40 분 후 스핀들 극 중 액토 마이 오신 링 Z-스택의 3D 재구성 신체 분리), 수축의 끝 (50 분 후 스핀들 극 본체 분리), 격막 장벽 (60 분 후 스핀들 극 본체 분리). Bgs1-GFP가 격막을 감싸는 세포막을 표시하면서 Rlc1 - 토마토 링을 표시합니다. 스케일 바 = 5 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 반지를 따라 단백질의 분포. 3D의 이미지는 야생형 C에서 액토 마이 오신 링을 재구성Cdc15-GFP를 표현 ELL 학생은 네 개의 사분면으로 나누어. 공동 효율적 각 링의 분산이 적혀있다. 스케일 바 = 5 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 우리는 시간적인 방식으로 분열 효모에서 cytokinetic 이벤트를 연구하기 위해 프로토콜을 설명했다. 여기에 설명 된 프로토콜은 서로 다른 참조 cytokinetic 이벤트의 시간 해상도를 제공한다; 단백질 모집 또는 cytokinetic 위상을 참조하여 손실의 타이밍; 세포질 분열의 여러 단계에 걸쳐 반지의 구조; 유사 분열을 참조하여 세포질 분열의 진행. 이 프로토콜로 정확히 cytokinetic하여 다른 단계에 관여하는 단백질의보다 상세한 이해를 제공하는 다른 돌연변이 변경 될 수 cytokinetic 위상을 정의 할 수있다. 또한, 시간적으로 다른 cytokinetic 상을 구별하는 능력은 다른 cytokinetic 상 조직으로 이어질 분자 메커니즘의 분석을 가능하게 할 것이다. 다른 cytokinetic 이벤트의 시간 해상도는 cytokinetic 고리 구조 단백질 분포의 분석을 가능하게다른 이벤트에 걸쳐. 상이한 단백질의 시공간 지역화 비교하여이 방법으로 분석 할 수있다. 적합한 형광 물질의 사용과, 다중 단백질 연구 서로 비교 될 수있다. 여기에 더하여 또한 링 따라 단백질의 분포를 분할 부위에서 단백질 조직 또는 전달을 결정하기 위해 분석 할 수있는 방법을 설명 하였다. 여기에 설명 된 프로토콜이 분열 효모 세포질 분열에 적용하지만,이 방법은 성장과 촬상 조건에 적합한 다른 변화에서 세포질 분열 효모 및 곰팡이를 연구하는데 이용 될 수있다.
그들은 분할로이 프로토콜은 이미징 살아있는 세포를 포함한다. 이 프로토콜을 이용하여 이미징 된 세포는 pleotropic 효과를 방지하기 위해 최적의 조건 하에서 성장해야한다. 과도한 세포가 급속 영양소가 손실 될 수 있으므로주의가 시야에 세포를 무리하지 않도록주의해야한다. 또한 세포 이미징 형광 인해 무료로 독성에 이르게라디칼은 사진 표백의 결과로 발표했다. 이는 아스코르브 산 등의 자유 라디칼 소광 화합물을 추가로 최소화 할 수있다. 아스코르브 산의 첨가는 현미경으로 세포의 장기간의 이미지를 허용한다. 화상 취득 동안에, 셀의 전체 Z 축 스핀들 기둥 체의 포착을 보장하기에 이미징되어야한다. 스핀들 극 기관에 대한 적절한 신호의 부재는 세포질 분열의 적절한 시간 해상도를 허용하지 않습니다. 특히, 의료 정밀 화상이이 Z 축을 따라 셀 0 적절한 캡쳐 또한 고리 및 격막의 적절한 3 차원 재구성을위한 중요한 시간으로 스핀들 기둥 체 마커의 초기 분리를주의해야한다.
이미지 고리와 격벽의 단면은, 여기에 설명 된 프로토콜은 CE의 장축을 따라 수직으로 촬상 장소로 막대 형상 분열 효모 세포를 허용하는 미세 웰으로 변형 될 수있다LL 여기에서 27로보고되었다. 이 프로토콜은 매우 정밀하게 세포 분열 사이트에서 시간에 따른 단백질 채용 현지화를 캡처 할 수 있지만 이미지의 공간 해상도로 인해 사용되는 현미경의 해상도가 제한된다. 슈퍼 해상도 현미경 공간 분해능을 향상시킬 수 있지만 시간 해상도에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 격자 빛 시트 현미경 등 현미경의 최근 발전은 시간 해상도 (28)을 손상시키지 않고 공간 분해능을 향상하는 데 도움이 될 수 있습니다. 광학 현미경 외에도, 분열 효모의 세포질 분열는 라만 분광법 (29), (30)를 사용하여 시간이 지남에 공부하실 수 있습니다.
이 방법을 사용하여 우리는 작은는 GTPase Cdc42는 세포질 분열 21시 고유의 시공간 활성화 패턴을 겪는 것으로보고있다. 이 방법은 다른 cytokinetic 이벤트의 조직을 연구하기 위해 우리를 수시간이 지남들과 이러한 이벤트의 분자 세부 사항을 설명합니다. 보고서는 단독 조립 액토 마이 오신 링의 존재는 효율적인 멤브레인 및 세포질 분열 furrowing 11, 21, 31 충분하지 않은 것을 제안했다. 여기에 설명 된 프로토콜 액토 마이 오신 링 조립 후 적절한 세포질 분열로 이어질 분자 사건을 조사 할 수있다. 또한 액토 마이 오신 링 furrowing 막 및 격벽 ingression에 미치는 영향의 무결성을 검사 할 수있다. 이것은 함께 성공적인 분리로 이어질 다른 분자 이벤트의 깊은 이해를 제공 할 것입니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract media | Sunrise Science Products | YES 225 | 0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine |
| Agarose | SeaKem LE agarose, Lonza | 50001 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Glass Bottomed culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used. |
| VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system | Visitech International, UK | with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu). | |
| ImageJ | NIH | Image analysis software |
References
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