Summary
Fisjons gjær, er Schizosaccharomyces pombe en utmerket modellsystem for å studere cytokinese, den siste etappen i celledeling. Her beskriver vi en mikros tilnærming til å analysere ulike cytokinetic hendelser i levende fisjonsgjærceller.
Abstract
Cytokinese, er det siste trinnet i celledeling avgjørende for å opprettholde genom integritet. Riktig cytokinese er viktig for celledifferensiering og utvikling. Cytokinese innebærer en serie av hendelser som er godt koordinert i tid og rom. Cytokinese innebærer dannelsen av en actomyosin ring ved divisjon området, etterfulgt av ring innsnevring, membran fure formasjon og ekstracellulær matriks remodeling. Fisjons gjær, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) er et godt studert modellsystem som har avdekket med betydelig klarhet de innledende hendelsene i cytokinese. Men vi forstår ikke helt klart hvordan ulike cytokinetic arrangementer koordineres spatiotemporally. For å finne ut dette, må man analysere de ulike cytokinetic hendelsene i flotte detaljer i både tid og rom. Her beskriver vi en mikros tilnærming til å undersøke forskjellige cytokinetic eventene i levende celler. Med denne tilnærmingen er det mulig å gang ulike cytokinetic hendelser og bestemme tidspunktet for rekruttering av ulike proteiner under cytokinese. I tillegg beskriver vi protokollene å sammenligne protein lokalisering og fordeling på stedet av celledeling. Dette er en grunnleggende protokollen for å studere cytokinese i fisjon gjær og kan også brukes for andre gjær og sopp-systemer.
Introduction
Cytokinese, det siste trinnet i celledeling, er en kompleks prosess avgjørende for riktig differensiering, utvikling og overlevelse av en organisme. Cytokinese involverer flere hendelser som er organisert for å sikre en vellykket celle separasjon og samtidig opprettholde genomisk integritet 1. Cytokinese innebærer arrangementer hvor en actomyosin ring en gang samlet gjennomgår innsnevring, som er sammenfallende med membran ekspansjon og furrowing, og ekstracellulær matriks remodellering, til slutt etterfulgt av celle avsnøring 1, 2, 3. Uriktig organisering av cytokinetic hendelser kan føre til celleseparasjons og ploidinummer defekter, og kan føre til sykdommer som kreft 4, 5, 6, 7, 8. De grunnleggende prinsipper som muliggjør organization av cytokinetic hendelser er ikke godt forstått, og dermed fører til veisperringer i vår forståelse av etiologien av disse sykdommene.
Fisjons gjær Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) er et utmerket modellsystem for å studere cytokinese på grunn av den konserverte natur av de involverte en proteiner. I fisjon gjær, etter actomyosin ringsammenstillingen, går inn i ring et modnings / oppholdstid fase hvor det ikke innsnevre 9. Modning ender med oppstart av actomyosin ring innsnevring, samtidig med membran furrowing og septum inntrengning. Banebrytende arbeid gjennom årene har gitt oss en ganske god forståelse av actomyosin ring montering i fisjon gjær 1, 9, 10. I noen eukaryoter, inkludert gjær fisjon, er vellykket montering av actomyosin ringen ikke er tilstrekkelig for membran furrowing. i fission gjær, ring innsnevring alene ikke gir tilstrekkelig kraft til å overvinne indre turgor press for fure formasjon 11. En fersk Modellen tilsier at denne kraften er i stedet gitt av septum inntrengning 11. I en annen modell, har rollen til plasmamembranen forlengelse blitt foreslått for å bidra til dannelsen fure 12, 13. Ring innsnevring og membranen furrowing ikke forekommer i Bgs1 / CPS1 temperaturfølsom mutant cps1-191, det viktigste enzymet for primær skillevegg formasjon 14, 15. Celler som mangler Bgs1 viser defekt primære septum og forlenget ring innsnevring 15, 16. Bgs1 er rekruttert til celledeling stedet for septum inntrengning under modning etter actomyosin ring montering 17, 18. Similarly, under cellularization i Drosophila embryoer, er ring innsnevring bifasisk med en betydelig treg første innsnevring rente 19, likner modningsfasen observert i fisjon gjær. Bifasisk ring innsnevring kan forsinke membran furrowing for tilstrekkelig membran utvidelse 20 og modifikasjon av ekstracellulære matrise. Dette tyder på at etter actomyosin ring montering, oppstår ring innsnevring effektivt bare når cellen har oppfylt kravene til fure formasjon. Det er ikke godt forstått hvilke betingelser er nødvendige for actomyosin ring innsnevring etter ring montering, eller de molekylære hendelser som regulerer denne prosessen. Vi har nylig vist at følgende actomyosin ring forsamlingen den lille GTPase Cdc42 gjennomgår en unik spatiotemporal aktivitetsmønsteret 21. Dette mønsteret er etablert av den unike lokaliseringen mønster av Cdc42 guanidin nukleotid utvekslings faktorer (GEFs) som aktiverer Cdc42. GEF Gef1 lokaliserer til den sammensatte actomyosin ring og fremmer utbruddet av ringen innsnevring og septum inntrengning, mens Scd1 lokaliserer til furrowing membran og fremmer normal septum formasjon. Vi finner at Cdc42 aktivering mønster etablert av sine GEFs føre til regulering av forskjellige cytokinetic hendelser.
For å forstå den molekylære mekanismen av hendelser som til slutt fører til celleseparasjon følgende actomyosin ring montering, må man følge de forskjellige cytokinetic hendelser i tid og rom. I fisjon gjær, cytokinese innebærer først montering av forløper noder rundt kjernen, som til slutt rekruttere type II myosin, det formin Cdc12, og andre proteiner som kreves for actomyosin ring montering. Til annen distinkte cytokinetic hendelser og gi en referanseramme, separasjon av spindel pol kropp markører (spindel Formasjonen) er regnet som tiden 0 22. Monteringen av the actomyosin ring kan følges ved å overvåke over tid intensiteten av en fluorescerende merket actomyosin ring protein slik som type II-myosin lettkjede-regulerende Rlc1. Her beskriver vi en mikroskopisk tilnærming til å analysere ulike stadier av cytokinese over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av prøve
- Grow fisjonsgjærceller uttrykker spindel pol kropp markør Sad1-mCherry 23 og type II myosin regulatoriske lett kjede Rlc1-Tomato 24 i YE væske ved 32 ° C i 8 generasjoner.
MERK: For temperaturfølsomme mutanter, vokser cellene ved 25 ° C. Grow celler til midt-log fase til en OD 600 på 0,5 i YE. For mer om fisjon gjær vekstvilkår refererer til Fisjon gjær lab manual 25. - Forbered YE (eller minimalt) media med 0,6% agarose (Agarose baserte medier viser mindre fluorescerende bakgrunn i forhold til agar). Til den smeltede media tilsett 1 mM askorbinsyre (vitamin C). Vitamin C slukker frie radikaler som frigjøres som følge av foto-bleking, og dermed minimere foto-toksisitet.
- Hell 3-4 ml av vitamin C flettet smeltet media på en glassbunn kultur parabolen. La media kjølig og stivne.
MERK:tykkelsen av glasset i dyrkningsskålen avhenger av dekkglass tykkelse egnet til mikroskopet. Her, bruk dekk No. 1.5. - Forsiktig heve størknet media fra kulturen fatet ved hjelp av en skarp skalpell. Plasser en pipettespiss mellom mediene skive og kulturskålen for å hindre at platen fra å falle tilbake i formen (figur 1).
- Ta 1 ml nylig voksende celler, som beskrevet i 1.1 ovenfor. Spinn cellene forsiktig ved 300 xg i 30 s. Kast supernatanten. Resuspender cellene i den lille mengde restmateriale som forblir i røret etter kassering av supernatanten.
- Belastning 2 - 5 ul av resuspenderte cellekultur mellom mediene plate og glass bunnen av kulturskålen. Cellene bør være på glasset. Pipettespissen plassert mellom mediene og formen muliggjør enkel lasting av cellekulturen.
- Veldig forsiktig fjerne pipettespissen og plasser media skive tilbake i sin opprinnelige posisjon på cuLTURE parabolen. Sørg for å unngå luftbobler. Hvis behovet være forsiktig presse ut luftbobler ved å skyve på baksiden av en pipette på toppen av media skive.
- La cellene sitter i dyrkningsskålen i 30 minutter til en time i mørket ved den temperatur ved hvilken mikros vil bli utført. Dette er viktig for å hindre støt på grunn av endringer i vekstbetingelser for cellene.
2. Image Acquisition
- Plassere en dråpe olje på den ytre siden av glasset på dyrkningsskålen. Sett kulturskålen på et invertert mikroskop.
- For å minimere auto fluorescens av YE media bruker en GFP filter med et smalt bølgelengdeområdet (520-535 nm).
- Fokus på den mediale planet av cellene og sørge for at de er godt plassert og ikke altfor overfylt. Sørg for å starte bilde oppkjøpet av cellene i passende stadium av cellesyklusen. For dette eksperimentet, følg celler fra sent G2.
- Programmere image oppkjøpet programvare to ta GFP, RFP og DIC bilder av cellene.
- For dette eksperimentet bruke 100 ms eksponeringstid for DIC og 75 ms eksponeringstid for GFP og RFP filtre. Eksponeringstiden avhenger av innstillingene av mikroskop, proteinet som studeres og varigheten av forsøket. For de gitte mikroskop innstillingene, bruker 50% laser makt.
- Å ta bilder i 3 dimensjoner, program bildeinnlastingen programvare for Z-skala imaging. Bruke en trinnstørrelse på 0,4 pm og en avstand på 3,0 mikrometer (halvparten av total z) rundt den sentrale fokuspunktet av cellene. Dette fører til fangst av 16 Z-rammer per tidspunkt med en total Z avstand på 6 um.
MERK: Z-serie image oppkjøpet tillater fangst av spindel pole organer.
- Ta bilder hver 2 min. Endre eksponeringstiden i henhold til kravene i eksperimentet. Eksponeringstiden kan også endres i henhold til proteinet av interesse, og signalstyrken. Vær imidlertid oppmerksom på at korter intervaller eller lengre eksponeringstid økning fototoksisitet på grunn av bleking og dermed celler kan følges bare for en kort tid.
- Hente bilder til cellene fysisk atskilte som observert av DIC bilder, eller programmere programvare for å stoppe oppkjøpet etter 90 min.
3. Bildeanalyse
- Temporal analyse av cytokinetic hendelser
- Bruk av bildet oppkjøpet programvaren gjør projeksjoner av Z-rammer for hver gang-punkt. Lag forskjellige filer for hver bølgelengde på bilde ervervet.
- Eksportere dette projeksjon tids punkt serien som en .tiff fil.
- Analyser bilder ved hjelp ImageJ programvare. Åpne bildet serie for hvilken som helst av bølgelengder.
- Velg en celle for å bli undersøkt. Dobbeltklikk på linjen muligheten til verktøylinjen. Dette vil åpne et annet vindu for å justere linjebredde. Juster linjebredde for å svare til cellebredden. For en WT celle dette er ca 40 - 50 piksler. Tegn en linje langslange akse av cellen av interesse.
- Klikk på Analyser> Verktøy> ROI leder, og klikk på Legg til. Dette vil legge til den valgte linjen til ROI vindu for senere bruk. Ikke lukk dette vinduet.
- Klikk på bildet av interesse, og velg Rediger> Valg> Rett. Dette vil åpne et annet vindu. Sjekk "Prosess hele bunken". Dette vil rette cellen horisontalt.
- Klikk på bilde> Transformer> Roter 90 grader til høyre. Dette bildet er nå rettet vertikalt.
- Klikk på bilde> Stabler> Gjør Montage. Dette vil åpne et vindu for å tildele antall rader og kolonner for stabelen, skalafaktoren for bildestørrelse, det første og siste stykket (ramme) for montasje og rammen tilvekst for montasjen. Sjekk etiketten skiver og trykk enter.
- Som et vindu med en montasje av cellen av interesse vises, åpne bildet serien for andre bølgelengde.
- Klikk på linjen identifikator på ROI manager. Dette vil velgeden samme celle på den andre bildefilen. Gjenta trinn 3.1.6 - 3.1.8. Dette vil åpne en montasje av det andre bildet.
- På bildet med spindel pol kropp markør Sad1-mCherry, se etter utbruddet av separasjon av spindel pol kroppen markør og markere det tidspunktet som tiden 0.
- Følg Rlc1-tomat signal på bildet over tid, og ser for signalet som fremstår som en tydelig linje i motsetning til flekker av Rlc1-tomat. Denne tids punkt markerer avslutningen av actomyosin ringsammenstilling / starten av modningsfasen.
- Neste bla gjennom filmen over tid for å avgjøre når Rlc1-Tomato ring begynner å avta i størrelse. Dette er merket som i slutten av modningsfasen / utbruddet av ring innsnevring.
- Flg Rlc1-tomat signal over tid gjennom innsnevringen inntil det blir vist som et punkt i midten av cellen aksen. Dette er merket som i slutten av ringen innsnevring / slutten av septum inntrengning.
- Etter montasje av DIC bilder, bestemme den endelige celleatskillelse. Notere tiden punktet når cellen fysisk separerer.
- For spindel pol kropp separasjons måle avstanden mellom de to spindel pole organer over tid bruker linjen verktøyet i ImageJ. Plott avstanden i spindelpolen kroppen over tid.
- Spill de forskjellige tidspunkter for de ulike cytokinetic arrangementer for å beregne varigheten av hver cytokinetic fase og sammenligne med spindel pol kropp separasjon over tid.
- Romlig analyse av cytokinetic hendelser
- Velg en celle med en synlig actomyosin ring. Dobbeltklikk på linjen muligheten ImageJ verktøylinjen. Dette vil åpne et annet vindu for å justere linjebredde. Juster linjebredde for å tilsvare ringens tykkelse (15 - 20 piksler). Trekke en linje langs ringen ta vare for å sikre at hele tykkelsen av ringen er inkludert.
- Klikk på Analyser> Verktøy> ROI leder, og klikk på Legg til. Dette vil legge til den valgte linjen til ROI vindu for senere bruk.Ikke lukk dette vinduet.
- Klikk på bildet av interesse, og velg Rediger> Valg> Rett. Dette vil åpne et annet vindu. Sjekk "Prosess hele bunken". Dette vil rette ringen horisontalt.
- Tilbake intensiteten i den lyseste planet i rettet z-stack (fra 3.1.6) ved hjelp av Image> Adjust> Brightness / Contrast> Nullstill.
- Klikk på fanen Stk> 3D Project. Dette vil åpne en dialogboks. Endre projeksjon metode for å Brightest Point og Slice avstanden til 2 eller 3 piksler. Til slutt, endre rotasjonsakse til X eller Y-aksen (dette vil endre seg avhengig av ønsket visningsvinkel), klikk interpolere og klikk OK for å generere et 3D-projeksjon av bildet. Bruk rullefeltet under bildet for å rotere bildet.
- Åpne bildeserien for andre bølgelengde ved hjelp ImageJ.
- Klikk på linjen identifikator på ROI manager. Dette vil velge samme ring på den andre bildefilen. Gjenta trinn 4.2.4 og 4.2.5.Dette vil åpne en 3-dimensjonal ring i bildet med den andre bølgelengde.
- Med både 3D-bilde ringer åpne, klikk på bilde> Farge> Slå sammen kanaler. Dette vil åpne en boks. Velg hvert bilde fra rullegardinmenyen for den tilsvarende ønsket farge og klikk på OK. Dette vil åpne en sammensetning av både bildene på forskjellige bølgelengder.
- Sammenlign lokalisering av ulike markører med hensyn til lokalisering på cytokinetic ring eller ingressing membran. Rlc1-GFP er en markør for den cytokinetic ringen. Proteiner ko-lokalisering med Rlc1-GFP lokalisere til ringen, mens proteinene lokalisering bak Rlc1-GFP signal lokalisere til ingressing membranen.
MERK: protein av interesse må være av en annen fluorofor enn den av ringen markør. - Generere 3-dimensjonal ringer under forskjellige stadier av cytokinese å sammenligne den romlige lokalisering av proteiner gjennom hele cytokinese.
- Analyse av protein distrisjon på cytokinetic ring
- For å sammenligne og analysere fordeling av proteiner langs ring måle co-effektive av variansen av protein distribusjon. En høy koeffisient variansanalyse viser ujevn fordeling av proteiner langs divisjon området og foreslår uriktig ringsammenstilling, modning eller septum dannelse, avhengig av hvilken fase avbildes eller analyseres.
- Ved hjelp av 3-dimensjonal rekonstruerte cytokinetic ring (fra 3.2.2), deler bildet inn i minst 4 kvadranter slik at en fjerdedel av ringen vises i hver kvadrant. For dette bruke linjeverktøyet til å tegne vinkelrette linjer på bildet. Etter hver linje klikk bilde> Overlay> Legg til utvalget eller bruke snarveien Ctrl + B.
- Gå til Analyser> Sett måling. Velg middel grå verdi i boksen som åpnes. Klikk på OK.
- Bruke linjer trukket ovenfor som guider tegne et rektangel for å definere hver kvadrant med rektangel verktøyet.
- For å måle Mean intensiteten i hver kvadrant, klikkpå Analyser> Mål eller bruk snarveien Ctrl + M.
- Spill gjennomsnitts grå verdi for alle de fire kvadrantene (MG 1 -MG 4).
- Velge et lite område i hver kvadrant utenfor ringen som bakgrunn utvalg.
- Mål gjennomsnitts grå verdi for bakgrunns valg for alle de fire kvadrantene (BG 1 -bg 4).
- li> For bakgrunn subtraksjon for hver kvadrant bruk følgende formel-MG 1 -gjennomsnittlig (BG 1: BG 4) = Intensitet ring i hver kvadrant (IRQ). På dette stadiet er det 4 IRQ-verdier, en for hver kvadrant.
- Neste beregne koeffisienten av varians for hver ring ved hjelp av følgende formel-Standardavvik (IRQ 1: IRQ 4) / Gjennomsnittlig (IRQ 1: IRQ 4). Beregn gjennomsnittlig Co-effektive av variansen for hver stamme og sammenligne med de andre stammene.
MERK: En statistisk signifikant økning i co-effektive av variansen i en belastning i forhold til kontroller Indicates ujevn protein distribusjon / levering sammen divisjonen området på det stadiet av cytokinese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fisjon gjærceller uttrykker ring markør, ble Rlc1-GFP (grønt, figur 2) og spindel pol kropp markør Sad1-mCherry (rød, figur 2) fotografert under cytokinese. Utbruddet av spindelpolen legeme markør (hvit pil, figur 2A, B) er regnet som tiden 0. Rlc1-GFP signal vises på tidspunktet -4 min med henvisning til spindel pol legeme separasjon (rød pil, figur 2A, 2B). Rlc1-GFP signal danner en sammenhengende ring 10 min post spindel pol kropp separasjon (åpen pil, figur 2A, B) som markerer slutten på actomyosin ring montering. Den actomyosin ring (Rlc1-GFP) begynner å avta i bredde 22 min etter fullførelse av ringenheten og 32 min etter at spindelpolen legeme separasjon (lukket pilspiss, figur 2A, B). Ring innsnevring avsluttes 20 minutter etter utbruddet av innsnevring, 42 min siden utbruddet av ringenheten og 52 min siden spindel pol kropp separasjon (hvite Asterisk, 2A, B). Endelig skjer celle abscission 72 minutter etter spindel pol kropp separasjon (rød pilspiss, figur 2A, B).
Lokaliseringen av ringen markør Rlc1-tomat og septum membran markør Bgs1-GFP ble analysert ved divisjon stedet hele cytokinese. 3D rekonstruksjon av ringen avdekket at actomyosin ring merket med Rlc1-tomat sammen før Bgs1-GFP rekruttering (figur 3, 10 min). Under ringen modningsfasen Bgs1-GFP ble rekruttert til delingen området og overlappes med den actomyosin ring som vist ved Rlc1-tomat (figur 3, 30 min). Dette indikerer at Bgs1 lokaliserer til ringen ved rekrutteringen. Etter hvert som ringen constricts, Bgs1-GFP lokaliserer også til ingressing membranen ved siden av innsnevrende ringen (figur 3, 40 min). Ved enden av innsnevringen, er synlig på ingressed membranen barri den Bgs1-GFP signaler (figur 3, 50 min). Til slutt, etter innsnevring den Rlc1-tomat signal er fraværende, mens Bgs1-GFP ser ut til å lokalisere gjennom membranen barriere med en skivelignende utseende (figur 3, 60 min). Dermed disse observasjonene tyder på at septum syntetisere enzymet Bgs1 lokaliserer til ringen etter montering og vedvarer etter ring innsnevring på membranen barriere som har blitt rapportert før 17.
Fordelingen av proteiner langs actomyosin ringen ble analysert for å bestemme effektiviteten av cytokinetic hendelser (figur 4). Ujevn eller nonhomogenous fordeling av proteiner langs actomyosin ringen har blitt forbundet med svekket signalering og ineffektiv cytokinetic ringenheten 26. Her viser vi to 3D rekonstruert ringer under modningen fasen, uttrykker F-Bar protein Cdc15-GFP (figur 4). Bildettil venstre viser jevn fordeling av Cdc15-GFP langs ringen med en lav koeffisient av varians (0,098), mens bildet på høyre viser ujevn fordeling med en høy koeffisient av varians (0,226, figur 4).
Figur 1: Utarbeidelse av Kultur oppvask for Imaging. Skjematisk beskriver inokulering av celler i en glassbunn kultur tallerken kledde med media pad. Se protokoll for detaljer (§ 1). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 Tidspunkt for Cytokinetic Begivenheter i S. pombe. (A) Montasje av en celle som uttrykker Spindle pol kroppen markør Sad1-mCherry (venstre panel), ring protein Rlc1-GFP (midtre panelet) og lyse felt (høyre panel) som gjennom cytokinese er vist 2 min intervaller. Hvite piler markerer spindel pol kropp (sentrosomen) separasjon på 17 min, rød pil markerer første rekruttering av Rlc1-GFP ved divisjon stedet, åpen pilmerkene ring modning på 27 min, markerer pil hodet utbruddet av ringen innsnevring på 47 min, stjerner merker enden av ringen innsnevring på 69 min og røde pilspiss markerer cellen abscission på 97 min. (B) Tidslinje av cytokinetic hendelser med referanse til mitosen som avgjør ved spindel pol kropp dannelse og separasjon. Celler ble fotografert ved 25 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Cell Division stedet under ulike stadier av cytokinese. 3D rekonstruksjon av actomyosin ring Z-stabler i ulike stadier av cytokinese for samme celle, ring montering (10 min post Spindel pol kroppen separasjon), ring modning (30 min post Spindel pol kroppen separasjon), ring innsnevring (40 min post Spindel polet kroppen separasjon), slutten av innsnevring (50 min post Spindel pol kroppen separasjon), septum barriere (60 min post Spindel pol kroppen separasjon). Rlc1-Tomato markerer ring mens Bgs1-GFP markerer plasmamembranen omslutter septum. Scale bar = 5 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Fordeling av Proteiner langs Ring. Bilder av 3D rekonstruert actomyosin ring fra villtype calen uttrykker Cdc15-GFP delt inn i fire kvadranter. Koeffisienten av variansen av hver ring er angitt. Scale bar = 5 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet en protokoll for å studere cytokinetic hendelser i fisjon gjær i en tidsmessig måte. Protokollen er beskrevet her gir tidsoppløsning av forskjellige cytokinetic hendelser med henvisning til hverandre; Tidspunktet for protein rekruttering eller tap under henvisning til cytokinetic fase; struktur av ringen gjennom ulike faser av cytokinese; og progresjon av cytokinese med henvisning til mitose. Med denne protokollen er det mulig å presisere cytokinetic fase som kan bli endret på ulike mutanter, for derved å gi en mer detaljert forståelse av de som er involvert i ulike faser cytokinetic proteiner. I tillegg vil muligheten til å skille mellom forskjellige tidsmessig cytokinetic faser muliggjøre analyse av molekylære mekanismer som fører til organisering av forskjellige cytokinetic faser. Tidsoppløsning forskjellige cytokinetic hendelser gjør det også mulig å analysere cytokinetic ringstruktur og proteiner distribusjongjennom de ulike arrangementene. Den tid og rom lokalisering av ulike proteiner kan sammenlignes og analyseres med denne tilnærmingen. Med bruk av egnede fluoroforer, kan flere proteiner bli studert og sammenlignet med hverandre. I tillegg her har vi også beskrevet hvordan fordelingen av proteiner langs ringen kan bli analysert for å fastslå protein organisasjon eller levering på divisjonen nettstedet. Mens den protokoll som er beskrevet her gjelder spalting gjær cytokinese, kan denne fremgangsmåten også benyttes for å studere cytokinese i andre gjær og sopp med egnede endringer i vekst og avbildningsforhold.
Denne protokollen innebærer bildebehandling levende-celler som de deler. Cellene avbildes med denne protokollen trenger for å vokse under optimale forhold for å unngå eventuelle pleotropic effekter. Forsiktighet bør utvises for å ikke mengden cellene i synsfeltet, som overdreven celler kan føre til rask tap av næringsstoffer. I tillegg er bilde fluoroforer i celler fører til toksisitet på grunn av friradikaler utgitt som et resultat av foto-bleking. Dette kan reduseres ved tilsetning av en fri-radikal bråkjøling forbindelse, slik som askorbinsyre. Tilsetningen av askorbinsyre tillater forlenget avbildning av celler i mikroskop. Under bildeoverføring, hele Z-akse av cellen må avbildes for å sikre oppfanging av spindelen pole organer. Fraværet av et passende signal for spinde pol organer vil ikke tillate riktig tidsmessig oppløsning på cytokinese. Spesielt bør man sørge for å presist bilde innledende separasjon av spindel pole kroppen markører som dette er tiden 0. Riktig fangst av cellene langs Z-aksen er også avgjørende for riktig 3 dimensjonale rekonstruksjoner av ringene og septa.
Å bilde av tverrsnitt av ringer og septa, kan protokollen beskrevet her modifiseres med en microfabricated vel som tillater de stavformede fisjonsgjærceller til å være plass vertikalt for avbildning langs den lange aksen av cell som har blitt rapportert her 27. Selv om denne protokollen kan meget nøyaktig fange protein rekruttering og lokalisering over tid ved celledeling området romlig oppløsning på bildene er begrenset på grunn av oppløsningen av mikroskop. Super-oppløsning mikroskopi kan bidra til å forbedre romlig oppløsning, men kan påvirke tidsoppløsning. Nylige fremskritt innen mikroskopi som gitter lys ark mikroskopi kan bidra til å forbedre romlig oppløsning uten at det går tidsoppløsning 28. Foruten lysmikroskopi, kan cytokinese i fisjon gjær også bli studert over tid ved hjelp av Raman-spektroskopi 29, 30.
Ved hjelp av denne tilnærmingen har vi rapportert at den lille GTPase Cdc42 gjennomgår en unik spatiotemporal aktivitetsmønsteret under cytokinese 21. Denne tilnærmingen gjør oss i stand til å studere organiseringen av forskjellig cytokinetic arrangements over tid og beskrive de molekylære detaljene i disse hendelsene. Rapporter har antydet at nærværet av en sammensatt actomyosin ring alene ikke er tilstrekkelig for effektiv membran furrowing og cytokinese 11, 21, 31. Protokollen er beskrevet her kan brukes til å undersøke de molekylære hendelser som fører til riktig cytokinese etter actomyosin ring montering. I tillegg kan integriteten til actomyosin ringen og dens virkning på membranen furrowing og septum inntrengning skal undersøkes. Dette vil gi en dypere forståelse av de ulike molekylære hendelser som til sammen fører til vellykket separasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract media | Sunrise Science Products | YES 225 | 0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine |
| Agarose | SeaKem LE agarose, Lonza | 50001 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Glass Bottomed culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used. |
| VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system | Visitech International, UK | with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu). | |
| ImageJ | NIH | Image analysis software |
References
- Pollard, T. D.
- Guertin, D. A., Trautmann, S., McCollum, D.
- Xu, X., Vogel, B. E. A secreted protein promotes cleavage furrow maturation during cytokinesis. Curr Biol. 21 (2), 114-119 (2011).
- Sagona, A. P., Stenmark, H.
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437 (7061), 1043-1047 (2005).
- Li, R. Cytokinesis in development and disease: variations on a common theme. Cell Mol Life Sci. 64 (23), 3044-3058 (2007).
- Daniels, M. J., Wang, Y., Lee, M., Venkitaraman, A. R. Abnormal cytokinesis in cells deficient in the breast cancer susceptibility protein BRCA2. Science. 306 (5697), 876-879 (2004).
- Storchova, Z., Pellman, D. From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (1), 45-54 (2004).
- Lee, I. J., Coffman, V. C., Wu, J. Q. Contractile-ring assembly in fission yeast cytokinesis: Recent advances and new perspectives. Cytoskeleton (Hoboken). 69 (10), 751-763 (2012).
- Balasubramanian, M. K., Bi, E., Glotzer, M. Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells. Curr Biol. 14 (18), R806-R818 (2004).
- Proctor, S. A., Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Contributions of turgor pressure, the contractile ring, and septum assembly to forces in cytokinesis in fission yeast. Curr Biol. 22 (17), 1601-1608 (2012).
- Munoz, J., et al. Extracellular cell wall beta(1,3)glucan is required to couple septation to actomyosin ring contraction. J Cell Biol. 203 (2), 265-282 (2013).
- Wang, N., Lee, I. J., Rask, G., Wu, J. Q. Roles of the TRAPP-II Complex and the Exocyst in Membrane Deposition during Fission Yeast Cytokinesis. PLoS Biol. 14 (4), e1002437 (2016).
- Liu, J., Wang, H., McCollum, D., Balasubramanian, M. K. Drc1p/Cps1p, a 1,3-beta-glucan synthase subunit, is essential for division septum assembly in Schizosaccharomyces pombe. Genetics. 153 (3), 1193-1203 (1999).
- Cortes, J. C., et al. The (1,3)beta-D-glucan synthase subunit Bgs1p is responsible for the fission yeast primary septum formation. Mol Microbiol. 65 (1), 201-217 (2007).
- Cortes, J. C., et al. Cooperation between Paxillin-like Protein Pxl1 and Glucan Synthase Bgs1 Is Essential for Actomyosin Ring Stability and Septum Formation in Fission Yeast. PLoS Genet. 11 (7), e1005358 (2015).
- Cortes, J. C., Ishiguro, J., Duran, A., Ribas, J. C. Localization of the (1,3)beta-D-glucan synthase catalytic subunit homologue Bgs1p/Cps1p from fission yeast suggests that it is involved in septation, polarized growth, mating, spore wall formation and spore germination. J Cell Sci. 115 (Pt 21), 4081-4096 (2002).
- Liu, J., Tang, X., Wang, H., Oliferenko, S., Balasubramanian, M. K. The localization of the integral membrane protein Cps1p to the cell division site is dependent on the actomyosin ring and the septation-inducing network in Schizosaccharomyces pombe. Mol Biol Cell. 13 (3), 989-1000 (2002).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15 (2), 838-850 (2004).
- Figard, L., Xu, H., Garcia, H. G., Golding, I., Sokac, A. M. The plasma membrane flattens out to fuel cell-surface growth during Drosophila cellularization. Dev Cell. 27 (6), 648-655 (2013).
- Wei, B., et al. Unique Spatiotemporal Activation Pattern of Cdc42 by Gef1 and Scd1 Promotes Different Events during Cytokinesis. Mol Biol Cell. , (2016).
- Nabeshima, K., et al. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9 (11), 3211-3225 (1998).
- Johnson, A. E., Gould, K. L. Dma1 ubiquitinates the SIN scaffold, Sid4, to impede the mitotic localization of Plo1 kinase. EMBO J. 30 (2), 341-354 (2011).
- Yonetani, A., Chang, F.
- Fission Yeast: A laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
- Hachet, O., Simanis, V. Mid1p/anillin and the septation initiation network orchestrate contractile ring assembly for cytokinesis. Genes Dev. 22 (22), 3205-3216 (2008).
- Zhou, Z., et al. The contractile ring coordinates curvature-dependent septum assembly during fission yeast cytokinesis. Mol Biol Cell. 26 (1), 78-90 (2015).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Huang, Y. S., Karashima, T., Yamamoto, M., Hamaguchi, H. O. Molecular-level investigation of the structure, transformation, and bioactivity of single living fission yeast cells by time- and space-resolved Raman spectroscopy. Biochemistry. 44 (30), 10009-10019 (2005).
- Huang, C. K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging. Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).
- Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe. Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).
