Summary
A levedura de fissão, Schizosaccharomyces pombe é um excelente sistema modelo para estudar a citocinese, a fase final na divisão celular. Aqui nós descrevemos uma abordagem microscopia para analisar diferentes eventos cytokinetic em células de levedura de fissão ao vivo.
Abstract
A citocinese, o passo final na divisão celular é crítica para a manutenção da integridade do genoma. cytokinesis adequada é importante para a diferenciação celular e desenvolvimento. A citocinese envolve uma série de eventos que são bem coordenados no tempo e no espaço. A citocinese envolve a formação de um anel de actomiosina no local de divisão, seguido de constrição do anel, a formação de sulco de membrana e remodelação da matriz extracelular. A levedura de fissão, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) é um sistema modelo bem estudado que revelou com clareza substancial dos eventos iniciais em citocinese. No entanto, nós não entendemos claramente como diferentes eventos cytokinetic são coordenadas espaço-temporalmente. Para determinar isso, é preciso analisar os diferentes eventos cytokinetic em grandes detalhes no tempo e no espaço. Aqui nós descrevemos uma abordagem microscopia para examinar diferentes ev cytokineticentos em células vivas. Com esta abordagem, é possível de tempo diferentes eventos cytokinetic e determinar o tempo de recrutamento de proteínas diferentes durante a citocinese. Além disso, descreve-se os protocolos para comparar localização de proteínas, e de distribuição no local de divisão celular. Este é um protocolo básico para estudar citocinese na levedura de fissão e também pode ser utilizado para outras leveduras e sistemas de fungos.
Introduction
A citocinese, o passo final na divisão celular, é essencial um processo complexo para a diferenciação adequada, o desenvolvimento e sobrevivência de um organismo. Citocinese envolve vários eventos que são organizados para garantir a separação de células com sucesso, mantendo a integridade genômica 1. A citocinese envolve eventos em que um anel de actomiosina, depois de montado sofre constrição, que é simultâneo com a expansão da membrana e estrias, e remodelação da matriz celular extracelular, finalmente seguido por abscisão célula 1, 2, 3. Organização indevido de eventos cytokinetic pode levar a defeitos de separação de células e de ploidia, e pode causar doenças como câncer 4, 5, 6, 7, 8. Os princípios fundamentais que permitem SRGANIZAÇÃO de eventos cytokinetic não são bem compreendidos, conduzindo assim a bloqueios na nossa compreensão da etiologia destas doenças.
A levedura Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) é um excelente sistema modelo para estudar a citocinese devido à natureza conservada das proteínas envolvidas 1. Em levedura, após actomiosina conjunto do anel, o anel entra em uma fase de maturação / pausa onde não contraem 9. Maturação termina com o início da constrição do anel actomiosina, concomitante com franzindo a membrana e ingresso septo. Trabalho seminal ao longo dos anos deram-nos uma boa compreensão do conjunto do anel actomiosina na fissão de levedura 1, 9, 10. Em alguns eucariotas, incluindo levedura de fissão, a montagem bem-sucedida do anel actomiosina não é suficiente para franzir membrana. na flevedura issão, anel de constrição por si só não fornece força suficiente para superar a pressão de turgescência interna para a formação do sulco 11. Um modelo recente indica que esta força é, em vez fornecido pelo septo ingresso 11. Noutro modelo, o papel da extensão da membrana de plasma tem sido sugerido para contribuir para a formação de sulco 12, 13. Constrição do anel e franzindo a membrana não ocorrem na temperatura Bgs1 / CPS1 cps1-191 mutante sensível, a principal enzima para a formação do septo primário 14, 15. Células sem Bgs1 mostrar septo primário defeituoso e prolongada constrição do anel 15, 16. Bgs1 é recrutado para o site da divisão celular para ingresso septo durante a maturação após actomiosina conjunto do anel 17, 18. Similarly, durante celularização em embriões de Drosophila, anel de constrição é bifásica com um significativamente lenta taxa de constrição inicial 19, assemelhando-se a fase de maturação observada em levedura. Constrição anel bifásica pode abrandar franzindo a membrana para permitir a expansão suficiente membrana 20 e a modificação da matriz extracelular. Isto sugere que, após actomiosina conjunto de anel, anel de constrição ocorre de forma eficiente apenas quando a célula tenha satisfeito os requisitos para a formação de sulco. Não está bem compreendido que as condições são necessárias para a constrição do anel actomiosina após a montagem do anel, nem os eventos moleculares que regulam este processo. Temos demonstrado recentemente que, após anel actomiosina montagem da pequena GTPase Cdc42 sofre um padrão de ativação espaço-temporal única 21. Este padrão é estabelecido pelo padrão de localização única dos factores de troca de nucleótidos de guanidina CDC42 (GEFs) que activam Cdc42. O GEF Gef1 localiza ao anel actomiosina montado e promove aparecimento da constrição do anel e ingresso de septo, enquanto SCD1 localiza na membrana franzindo e promove a formação normal septo. Nós achamos que o padrão de ativação Cdc42 estabelecida por seus GEFs levar à regulamentação de eventos cytokinetic distintas.
Para entender o mecanismo molecular de eventos que, eventualmente, levar à separação de células após a montagem do anel de actomiosina, é preciso seguir os eventos cytokinetic distintas no tempo e no espaço. Em levedura, citocinese envolve primeiro o conjunto de nós precursoras ao redor do núcleo, que acabou por recrutar a miosina tipo II, o formin Cdc12 e outras proteínas necessárias para a montagem do anel actomiosina. Para tempo os eventos cytokinetic distintas e fornecem um quadro de referência, a separação de marcadores de corpos polares de fusos (formação do fuso) é considerado como tempo de 0 22. A montagem do the actomiosina anel pode ser seguida por monitorização ao longo do tempo a intensidade de uma proteína de anel de actomiosina fluorescente etiquetado, tais como o tipo de cadeia leve reguladora da miosina II Rlc1. Aqui nós descrevemos uma abordagem microscópica para analisar diferentes estágios de citocinese ao longo do tempo.
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Protocol
1. Preparação da Amostra
- Cultivar células de levedura de fissão que expressam o marcador fuso pólo corpo Sad1-mCherry 23 e tipo de cadeia leve reguladora da miosina II Rlc1-Tomate 24 em meios líquidos YE a 32 ° C durante 8 gerações.
NOTA: Para mutantes sensíveis à temperatura, crescer as células a 25 ° C. Cultivar células à fase mid-log a uma DO600 de 0,5 em YE. Para saber mais sobre a fissão condições de crescimento de levedura consulte o manual de laboratório levedura 25. - Preparai-vos (ou mínimos) de mídia com 0,6% de agarose (media baseados Agarose mostrar fundo menos fluorescente em comparação com agar). Ao meio de cultura derretido adicionar 1 mM de ácido ascórbico (vitamina C). A vitamina C extingue os radicais livres que são liberados devido ao foto-branqueamento, minimizando, assim, foto-toxicidade.
- Pour 3-4 mL da vitamina C atado derretido meios para uma placa de cultura de vidro de fundo. Deixe o fresco de mídia e solidificar.
Note oespessura do vidro no prato de cultura depende da espessura da lâmina de cobertura apropriada para o microscópio. Aqui, o uso lamela No. 1.5. - Suavemente elevar a meios solidificado a partir do prato de cultura com a ajuda de um bisturi afiado. Coloque uma ponta de pipeta entre a laje e meios da placa de cultura para evitar que a laje de cair de volta para o prato (Figura 1).
- Tomar 1 ml de células em crescimento fresco como descrito em 1.1 acima. Girar suavemente as células a 300 xg durante 30 s. Descartar o sobrenadante. Ressuspender as células na pequena quantidade de material residual que permanece no tubo depois de descartar o sobrenadante.
- Carga 2 - 5 ul da cultura de células ressuspenso entre a laje e a meios de comunicação com fundo de vidro da placa de cultura. As células devem estar sobre o vidro. A ponteira colocada entre a mídia e o prato permite o carregamento fácil da cultura de células.
- Muito gentilmente remover a ponta da pipeta e coloque a laje de mídia de volta na sua posição original no cuprato LTURE. Certifique-se evitar quaisquer bolhas de ar. Se for necessário pressionar suavemente as bolhas de ar, fazendo deslizar a parte de trás de uma ponta de pipeta por cima da laje de meios de comunicação.
- Deixe as células sentar-se no prato de cultura durante 30 minutos a uma hora no escuro à temperatura a que a microscopia será executada. Isto é importante para evitar qualquer choque devido a alterações nas condições de crescimento para as células.
2. Aquisição de Imagem
- Coloque uma gota de óleo sobre o lado exterior do vidro no prato de cultura. Colocar a placa de cultura sobre um microscópio invertido.
- Para minimizar a auto fluorescência de meios YE usar um filtro de GFP com um intervalo de comprimento de onda estreito (520-535 nm).
- Concentre-se no plano medial das células e garantir que eles estão bem espaçados e não muito lotados. Certifique-se de iniciar a aquisição de imagem das células na fase adequada do ciclo celular. Para esta experiência, siga as células a partir de finais G2.
- Programar o software de aquisição de imagem to exame GFP, RFP e imagens DIC das células.
- Para esta experiência usar 100 tempo de exposição ms para DIC e 75 ms de tempo de exposição para filtros GFP e RFP. O tempo de exposição depende das configurações do microscópio, a proteína sob estudo e a duração da experiência. Para os dados configurações microscópio, use 50% da potência do laser.
- Para capturar imagens em 3 dimensões, o programa do software de aquisição de imagem para imagens em escala Z. Usar um tamanho de passo de 0,4 um e uma distância de 3,0 m (metade do total Z) em torno do ponto do foco central das células. Isto leva à captura de Z-16 quadros por ponto de tempo com uma distância total de Z 6 um.
NOTA: Z-série de aquisição de imagem permite a captura dos corpos polares de fusos.
- Captar imagens a cada 2 min. Mudar o tempo de exposição de acordo com as necessidades da experiência. O tempo de exposição também pode ser alterada de acordo com a proteína de interesse e a intensidade do sinal. No entanto, note que curtaer ou mais intervalos de tempo de exposição aumento foto-toxicidade devido ao branqueamento e, por conseguinte, as células podem ser seguidos apenas por um curto período de tempo.
- Adquirir imagens até que as células separadas fisicamente como observado pelas imagens DIC, ou programar o software para parar a aquisição depois de 90 min.
Análise 3. Imagem
- Análise temporal de eventos cytokinetic
- Usando o software de aquisição de imagem fazer projeções dos Z-quadros para cada ponto de tempo. Faça arquivos diferentes para cada comprimento de onda da imagem adquirida.
- Exportar esta série ponto-tempo de projeção como um arquivo .tiff.
- Analisar as imagens usando o software ImageJ. Abrir a série de imagens para qualquer um dos comprimentos de onda.
- Seleccionar uma célula a ser estudada. Dê um duplo clique sobre a opção de linha de barra de ferramentas. Isto irá abrir outra janela para ajustar a largura da linha. Ajustar a largura de linha para corresponder à largura da célula. Para uma célula WT esta é de cerca de 40 - 50 pixels. Desenhar uma linha ao longo daeixo longitudinal da célula de interesse.
- Clique em Analisar> Ferramentas> Gerenciador de ROI e clique em Adicionar. Isto irá adicionar a linha selecionada para a janela de ROI para uso posterior. Não feche esta janela.
- Clique na imagem de interesse e selecione Editar> Seleção> Endireitar. Isto irá abrir outra janela. Marque a opção "Processo pilha inteira". Isto irá endireitar a célula horizontalmente.
- Clique em Imagem> Transformar> Girar 90 graus para a direita. Esta imagem está agora esticado verticalmente.
- Clique em Imagem> Pilhas> Faça Montage. Isto irá abrir uma janela para atribuir o número de linhas e colunas para a pilha, o fator de escala para o tamanho da imagem, a primeira e última fatia (frame) para a montagem eo incremento quadro para a montagem. Verifique fatias de etiqueta e pressione enter.
- Como uma janela com uma montagem de célula de interesse é mostrado, abrir a série de imagem para o outro comprimento de onda.
- Clique no identificador de linha no gerenciador de ROI. Isso irá selecionara mesma célula no segundo arquivo de imagem. Repita os passos 3.1.6 - 3.1.8. Isto irá abrir uma montagem da segunda imagem.
- Na imagem com o fuso de marcador de corpos polares de Sad1-mCherry, olhar para o início da separação do marcador de corpos polares de fusos e marcar esse ponto de tempo como tempo 0.
- Siga o sinal Rlc1-tomate na imagem ao longo do tempo e olhar para o sinal que aparece como uma linha distinta em oposição a manchas de Rlc1-tomate. Este ponto de tempo marca a conclusão da montagem de anel actomiosina / início da fase de maturação.
- Próximo de rolagem através do filme ao longo do tempo para determinar quando o anel Rlc1-Tomate começa a diminuir em tamanho. Esta é marcado como o fim da fase de maturação / início da constrição do anel.
- Seguir o sinal Rlc1-Tomate com o tempo durante a constrição até que aparece como um ponto no meio do eixo de células. Esta é marcado como o fim do anel de constrição / fim de ingresso septo.
- Após a montagem de imagens DIC, determinar o final de célulasseparação. Grave o ponto no tempo quando a célula separa fisicamente.
- Para a separação do corpo polar do fuso medir a distância entre os dois corpos polares de fusos ao longo do tempo utilizando a ferramenta de linha em ImageJ. Traça-se a distância no corpo polar do fuso ao longo do tempo.
- Registam-se os diferentes pontos de tempo para os diferentes eventos cytokinetic para calcular a duração de cada fase cytokinetic e comparar com separação de corpos polares de fuso ao longo do tempo.
- A análise espacial de eventos cytokinetic
- Escolha de uma célula com um anel visível actomiosina. Dê um duplo clique sobre a opção de linha de barra de ferramentas ImageJ. Isto irá abrir outra janela para ajustar a largura da linha. Ajustar a largura de linha para corresponder à espessura do anel (15 - 20 pixels). Desenhar uma linha ao longo do anel tendo o cuidado de assegurar que toda a espessura do anel está incluído.
- Clique em Analisar> Ferramentas> Gerenciador de ROI e clique em Adicionar. Isto irá adicionar a linha selecionada para a janela de ROI para uso posterior.Não feche esta janela.
- Clique na imagem de interesse e selecione Editar> Seleção> Endireitar. Isto irá abrir outra janela. Marque a opção "Processo pilha inteira". Isto irá endireitar o anel horizontal.
- Redefinir a intensidade do avião brilhante no z-stack endireitou (de 3.1.6) usando Image> Adjust> Brightness / Contrast> Redefinir.
- Clique na guia Stk> Projeto 3D. Isto irá abrir uma caixa de diálogo. Alterar o método de projeção para Brightest Point e o espaçamento fatia de 2 ou 3 pixels. Finalmente, o eixo de mudança de rotação para X ou Y-axis (isso vai mudar dependendo do ângulo de visão desejado), clique em interpolação e clique em OK para gerar uma projeção 3D da imagem. Use a barra de rolagem abaixo da imagem para rodar a imagem.
- Abrir a série de imagem para o outro comprimento de onda usando ImageJ.
- Clique no identificador de linha no gerenciador de ROI. Isso irá selecionar o mesmo anel no segundo arquivo de imagem. Repita os passos 4.2.4 e 4.2.5.Isto vai abrir um anel de três dimensões na imagem com o outro comprimento de onda.
- Com os dois anéis de imagem 3D abertos, clique em Imagem> Cor> Mesclar Canais. Isto irá abrir uma caixa. Selecione cada imagem a partir do menu para a cor correspondente desejado para baixo e clique em OK. Isto irá abrir uma composição de ambos as imagens em diferentes comprimentos de onda.
- Comparar a localização de diferentes marcadores em relação à localização do anel cytokinetic ou membrana ingressing. Rlc1-GFP é um marcador para o anel cytokinetic. Proteínas co-localizar com Rlc1-GFP localizar ao anel enquanto que as proteínas localizando atrás sinal Rlc1 localizar-GFP para a membrana ingressing.
NOTA: A proteína de interesse necessita de ser de um fluoróforo diferente do que a do anel de marcador. - Gerar 3 anéis dimensionais durante diferentes fases da citocinese para comparar a localização espacial das proteínas através de toda a citocinese.
- Análise de proteínas DISTRIbuição no anel cytokinetic
- Para comparar e analisar a distribuição de proteínas ao longo do anel medir o coeficiente de variação da distribuição da proteína. Um co-eficiente de alta variância indica distribuição desigual de proteínas ao longo do local de divisão e sugere montagem de anel imprópria, maturação ou a formação de septo, dependendo da fase em que é criada uma imagem ou analisado.
- Utilizando 3 dimensional anel cytokinetic reconstruída (a partir de 3.2.2), dividir a imagem em pelo menos 4 quadrantes de tal modo que um quarto do anel aparece em cada quadrante. Para isso, use a ferramenta de linha para desenhar linhas perpendiculares na imagem. Depois de cada linha clique> Overlay> Adicionar seleção ou usar atalho Ctrl + B.
- Ir para Analisar> medição indicados. Escolha valor de cinza médio na caixa que se abre. Clique em OK.
- Usando as linhas desenhadas acima como guias desenhar um retângulo para definir cada quadrante usando a ferramenta retângulo.
- Para medir a intensidade média de cada quadrante, clique emem Analisar> Meça ou use o atalho Ctrl + M.
- Grave o valor de cinza médio para todos os quatro quadrantes (MG 1 -MG 4).
- Escolha uma pequena área em cada quadrante fora do ringue como a seleção de fundo.
- Medir valor de cinza médio para a seleção de fundo para todos os quatro quadrantes (BG 1 -bg 4).
- li> Para subtração de fundo para cada uso quadrante a seguinte MG formulação 1 -Média (BG 1: BG 4) = intensidade do anel em cada quadrante (IRQ). Nesta fase, há 4 valores de IRQ, um para cada quadrante.
- Em seguida calcular o coeficiente de variação para cada anel com a seguinte Desvio padrão formulação (IRQ 1: IRQ 4) / Médio (IRQ 1: IRQ 4). Calcular média coeficiente de variação para cada estirpe e comparar com as outras estirpes.
NOTA: Um aumento estatisticamente significativo da co-eficiente de variância numa estirpe em comparação com controlos Indicates desigual proteína de distribuição / entrega ao longo do local divisão nessa fase da citocinese.
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Representative Results
Células de levedura que expressam o marcador de anel, Rlc1-GFP (verde, Figura 2) e o fuso marcador de corpos polares de Sad1-mCherry (vermelho, Figura 2) foram fotografadas durante citocinese. O início de marcador de corpos polares de fusos (seta branca, as Figuras 2A, B) é considerada como o tempo 0. sinal Rlc1-GFP aparece no momento -4 min com referência à separação de corpos polares de fuso (seta vermelha, as Figuras 2A, 2B). Sinal Rlc1-GFP forma um anel 10 min pós fuso de separação de corpos polares contínua (seta aberta, as Figuras 2A, B) marca o fim do conjunto de anel actomiosina. O anel de actomiosina (Rlc1-GFP) começa a decrescer em largura de 22 min após a conclusão da montagem em anel e 32 min após a separação do corpo polares de fusos (seta fechada, as Figuras 2A, B). constrição do anel termina 20 min após o início da constrição, 42 min desde o início da montagem do anel e 52 min desde a separação corpos polares de fusos (asteris brancasK, Figuras 2A, B). Finalmente, abscission celular ocorre 72 min pós fuso de separação de corpos polares (seta vermelha, as Figuras 2A, B).
A localização do marcador anel Rlc1-tomate e marcador de membrana septo Bgs1-GFP foram analisados no local de divisão ao longo da citocinese. Reconstrução em 3D do anel revelou que o anel de actomiosina marcado com Rlc1-Tomate montado antes do recrutamento Bgs1-GFP (Figura 3, 10 min). Durante a fase de maturação anel Bgs1-GFP foi recrutado para o local de divisão e sobreposto com o anel de actomiosina, como mostrado por Rlc1-tomate (Figura 3, 30 min). Isso indica que Bgs1 localiza ao anel aquando do recrutamento. Como o anel contrai, Bgs1-GFP também se localiza na membrana ingressing adjacente ao anel de constrição (Figura 3, 40 min). No final da constrição, o sinal Bgs1-GFP é visível na membrana Barri ingressouer (Figura 3, 50 min). Finalmente, depois de o sinal de constrição Rlc1-Tomate está ausente, enquanto Bgs1-GFP parece localizar por toda a membrana de barreira, com uma aparência semelhante de disco (Figura 3, 60 min). Assim, estas observações indicam que a enzima septo síntese Bgs1 localiza ao ringue após a montagem e persiste após a constrição do anel na barreira de membrana como tem sido relatado antes de 17.
A distribuição das proteínas ao longo do anel de actomiosina foi analisado para determinar a eficiência de eventos cytokinetic (Figura 4). Distribuição desigual ou não homogênos de proteínas ao longo do anel actomiosina tem sido associada com a sinalização deficiente e montagem de anel 26 cytokinetic ineficiente. Aqui mostramos dois anéis de reconstrução 3D durante a fase de maturação, que expressam a proteína F-Bar Cdc15-GFP (Figura 4). A imagemà esquerda mostra a distribuição uniforme de Cdc15-GFP ao longo do anel com um baixo coeficiente de variância (0,098), enquanto que a imagem da direita mostra a distribuição irregular com um elevado coeficiente de variância (0,226, Figura 4).
Figura 1: Preparação da Cultura Dish for Imaging. Esquemática inoculação descrevendo de células em um prato de cultura com fundo de vidro revestida com almofada de mídia. Ver protocolo para detalhes (Seção 1). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 Tempo de Cytokinetic Eventos em S. pombe. (A) Montagem de um Spindl expressar celulare marcador de corpos polares Sad1-mCherry (painel esquerdo), proteína anel Rlc1-GFP (painel do meio) e de campo brilhante (painel direito) submetidos a citocinese é mostrado em intervalos de 2 min. setas brancas marca pólo corpo de separação (centrossoma) fuso em 17 min, seta vermelha marca de recrutamento inicial de Rlc1-GFP no local divisão, aberta marcas de seta anel de maturação aos 27 min, cabeça da seta marca início da constrição do anel em 47 min, marcas asteriscos final de constrição do anel aos 69 min e ponta de seta vermelha marca abscission celular em 97 min. (B) Cronograma dos eventos cytokinetic com referência a mitose como determinar por formação de corpos polares de fusos e separação. As células foram fotografadas a 25 ° C. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: CeSítio Divisão ll durante as diferentes fases de Citocinese. reconstrução 3D do anel actomiosina Z-stacks durante as diferentes fases de citocinese para a mesma célula, conjunto de anel (10 min pós Spindle pólo de separação do corpo), maturação anel (30 min separação pós Spindle corpo pólo), constrição do anel (40 min pós Spindle pólo separação do corpo), o fim da constrição (50 min pós Spindle pólo separação do corpo), a barreira de septo (60 min pós Spindle pólo separação do corpo). Rlc1-Tomate marca anel enquanto Bgs1-GFP marca a membrana de plasma que envolve o septo. Barra de escala = 5 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Distribuição das proteínas ao longo do anel. Imagens de reconstrução 3D anel actomiosina de tipo selvagem cells expressam Cdc15-GFP dividido em quatro quadrantes. O coeficiente de variação de cada anel é indicado. Barra de escala = 5 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui nós descrevemos um protocolo para estudar eventos cytokinetic em levedura de fissão de uma forma temporal. O protocolo aqui descrito fornece resolução temporal de diferentes eventos cytokinetic com referência um ao outro; calendário de recrutamento de proteínas ou perda com referência à fase de cytokinetic; estrutura do anel ao longo das diferentes fases de citocinese; e a progressão da citocinese com referência a mitose. Com este protocolo, é possível definir com precisão a fase cytokinetic que podem ser alteradas em diferentes mutantes, proporcionando assim uma compreensão mais detalhada das proteínas envolvidas em diferentes fases cytokinetic. Além disso, a capacidade de distinguir diferentes fases temporalmente cytokinetic irá permitir a análise dos mecanismos moleculares que conduzem à organização de diferentes fases cytokinetic. A resolução temporal de diferentes eventos cytokinetic também permite a análise da distribuição estrutura do anel e proteínas cytokineticao longo das diferentes eventos. A localização espaço-temporal das proteínas diferentes podem ser comparados e analisados com esta abordagem. Com a utilização de fluoróforos adequados, proteínas múltiplas podem ser estudados e comparados uns com os outros. Além disso, também aqui se têm descrito como a distribuição de proteínas ao longo do anel pode ser analisada para determinar a organização da proteína ou de entrega no local de divisão. Embora o protocolo aqui descrito aplica-se a citocinese levedura de fissão, esta abordagem também pode ser utilizada para estudar a citocinese em outras leveduras e fungos com alterações adequadas às condições de crescimento e formação de imagens.
Este protocolo envolve células vivas de imagem como se dividem. As células fotografada usando este protocolo precisa para crescer em condições óptimas para evitar quaisquer efeitos pleotropic. Cuidados devem ser tomados para não multidão as células no campo de visão, como células excessivas podem levar à perda de nutrientes rápida. Além disso fluoróforos de imagem em células leva à toxicidade devido à livreradicais liberados como resultado de foto-branqueamento. Isto pode ser minimizado com a adição de um composto de extinção de radicais livres tais como ácido ascórbico. A adição de ácido ascórbico permite imagens prolongada das células ao microscópio. Durante a aquisição de imagem, todo o eixo Z da célula tem de ser trabalhada para assegurar a captura dos corpos polares de fusos. A ausência de um sinal apropriado para os corpos polares de fusos não irá permitir que a resolução temporal adequada de citocinese. Em particular, deve ser tomado cuidado para precisamente imagem a separação inicial dos marcadores de corpos polares de fusos como este é o tempo 0. captura adequada das células ao longo do eixo Z também é crítico para 3 reconstruções tridimensionais adequados dos anéis e septos.
Para imagem das secções transversais dos anéis e dos septos, o protocolo descrito aqui pode ser modificado com um poço microfabricado que permite que as células de levedura de fissão em forma de haste a ser lugar verticalmente para imagiologia ao longo do eixo do cell como foi relatado aqui 27. Embora este protocolo pode capturar de forma muito precisa o recrutamento de proteínas e localização ao longo do tempo no local de divisão celular a resolução espacial da imagem é limitada devido à resolução do microscópio utilizado. microscopia de super-resolução pode ajudar a melhorar a resolução espacial, mas pode afetar a resolução temporal. Recentes avanços em microscopia como a microscopia folha de luz rede pode ajudar a melhorar a resolução espacial sem comprometer a resolução temporal 28. Além de microscopia de luz, citocinese em levedura também podem ser estudados ao longo do tempo usando espectroscopia Raman 29, 30.
Usando essa abordagem que relataram que a pequena GTPase Cdc42 sofre um padrão de ativação espaço-temporal única durante citocinese 21. Esta abordagem permite-nos estudar a organização de diferentes eventos cytokinetics ao longo do tempo e descrever os detalhes moleculares desses eventos. Relatórios sugerem que a presença de um anel de actomiosina montado por si só não é suficiente para franzir membrana eficiente e citocinese 11, 21, 31. O protocolo aqui descrito pode ser utilizado para investigar os eventos moleculares que levam a citocinese adequada após a montagem do anel actomiosina. Além disso, a integridade do anel actomiosina e seu efeito sobre a membrana e franzindo a ingressão septo pode ser examinada. Isto irá proporcionar uma compreensão mais profunda dos diferentes eventos moleculares que em conjunto levam a separação bem sucedida.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract media | Sunrise Science Products | YES 225 | 0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine |
| Agarose | SeaKem LE agarose, Lonza | 50001 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Glass Bottomed culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used. |
| VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system | Visitech International, UK | with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu). | |
| ImageJ | NIH | Image analysis software |
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