Summary
Klyvningsjäst, är Schizosaccharomyces pombe ett utmärkt modellsystem för att studera cytokines, den sista etappen i celldelning. Här beskriver vi en mikroskopi metod för att analysera olika cytokinetic händelser i levande fission jästceller.
Abstract
Cytokines, är det sista steget i celldelning kritisk för att upprätthålla genomet integritet. Korrekt cytokines är viktig för celldifferentiering och utveckling. Cytokines innebär en serie av händelser som är väl samordnade i tid och rum. Cytokines involverar bildningen av en aktomyosin ring vid divisionen stället, följt av rings sammandragning, membran fåra bildning och extracellulär matrix remodeling. Den fissionsjäst, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) är ett väl studerat modellsystem som har visat med stor tydlighet de inledande händelserna i cytokines. Men vi förstår inte klart hur olika cytokinetic händelser samordnas spatiotemporally. För att avgöra detta måste man analysera olika cytokinetic händelserna i stora detaljer i både tid och rum. Här beskriver vi en mikroskopi metod för att undersöka olika cytokinetic evmedelsingredienser i levande celler. Med denna metod är det möjligt att tajma olika cytokinetic händelser och bestämma tidpunkten för rekryteringen av olika proteiner under cytokines. Dessutom beskriver vi protokoll för att jämföra proteinlokalisering, och distribution vid stället för celldelning. Detta är en grundläggande protokoll för att studera cytokines i fissionsjäst och kan även användas för andra jästsvampar och svampsystem.
Introduction
Cytokines, det sista steget i celldelning, är en komplex process nödvändig för korrekt differentiering, utveckling och överlevnad av en organism. Cytokines innebär flera händelser som är organiserade för att säkerställa ett framgångsrikt cellseparation bibehållen genomisk integritet 1. Cytokines innebär evenemang där en aktomyosin ring en gång monterade genomgår sammandragning, som är samtidig med membran expansion och plöjer, och extracellulära cellmatris ombyggnad, slutligen följt av cell AMPUTATION en, två, tre. Felaktig organisationen av cytokinetic händelser kan leda till cellseparations och ploidi defekter, och kan orsaka sjukdomar som cancer 4, 5, 6, 7, 8. De grundläggande principer som gör det möjligt för organisation av cytokinetic händelser inte väl förstått, vilket leder till hinder i vår förståelse av etiologin av dessa sjukdomar.
Den fissionsjäst Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) är ett utmärkt modellsystem för att studera cytokines på grund av den konserverade naturen hos de proteiner som är inblandade ett. I fissionsjäst efter aktomyosin ringenheten, går in i ringen en mognad / uppehålls fas där det inte tygla 9. Mognad slutar med initiering av aktomyosin ring sammandragning, samtidigt med membran furrowing och septum inträngning. Banbrytande arbete genom åren har gett oss en ganska god förståelse för aktomyosin ringenheten i fissionsjäst 1, 9, 10. I vissa eukaryoter, inklusive fissionsjäst är framgångsrik montering av aktomyosin ringen inte tillräckligt för membran furrowing. i fission jäst, ring sammandragning ensam inte ger tillräcklig kraft för att övervinna interna saftspänningen för fåra bildning 11. En färsk modell indikerar att denna kraft i stället från septum inträngningen 11. I en annan modell, har betydelsen av plasmamembranet förlängning föreslagits att bidra till fåra bildning 12, 13. Ring sammandragning och membran furrowing förekommer inte i Bgs1 / Cps1 temperaturkänslig mutant cps1-191, det viktigaste enzymet för primär septum bildning 14, 15. Celler som saknar Bgs1 visar defekt primära septum och långvarig ring förträngning 15, 16. Bgs1 rekryteras till celldelning plats för septum inträngning under mognaden efter aktomyosin ringaggregatet 17, 18. Similarly under cellularization i Drosophila embryon, är ring sammandragning bifasiskt med en betydligt långsam initial sammandragning hastighet 19, liknar mognadsfasen observerades i fissionsjäst. Bifasisk ring sammandragning kan bromsa membran furrowing att tillåta tillräcklig membranexpansions 20 och modifiering av extracellulära matrisen. Detta tyder på att efter aktomyosin ringenheten, sker ring sammandragning effektivt endast när cellen har uppfyllt kraven för fåra bildning. Det är inte väl förstått vilka villkor som krävs för aktomyosin ring sammandragning efter ringenheten, eller de molekylära händelser som reglerar denna process. Vi har nyligen visat att efter aktomyosin ringenheten små GTPas Cdc42 genomgår en unik Spatiotemporal aktivering mönster 21. Detta mönster är fastställd av den unika lokaliseringen mönstret av Cdc42 guanidin nukleotid utbytesfaktorer (GEFs) som aktiverar Cdc42. GEF Gef1 lokaliserar till den monterade aktomyosin ringen och främjar uppkomsten av ring sammandragning och septum inträngning, medan Scd1 lokaliserar till furrowing membranet och främjar normal septum bildning. Vi finner att Cdc42 aktiveringsmönster som inrättas genom dess GEFs leda till reglering av olika cytokinetic händelser.
För att förstå den molekylära mekanismen av händelser som slutligen leder till cellseparation efter aktomyosin ringaggregatet, måste man följa de distinkta cytokinetic händelser i tid och rum. I fissionsjäst, cytokines först innebär monteringen av utgångsnoder runt kärnan, som så småningom rekrytera typ II myosin, den formin Cdc12, och andra proteiner som krävs för aktomyosin ringaggregatet. Och då de distinkta cytokinetic händelser och ger en referensram, är separationen av spindelstångkroppsmarkörer (spindelbildning) betraktas som tiden 0 22. Monteringen av the aktomyosin ring kan följas genom övervakning över tiden intensiteten hos en fluorescerande taggade aktomyosin ring protein såsom typ Il-myosin reglerande lätta kedjan Rlc1. Här beskriver vi en mikroskopisk metod för att analysera olika stadier av cytokines över tiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av prov
- Växa klyvningsjästceller som uttrycker spindeln polkroppen markör Sad1-mCherry 23 och typ II myosin reglerande lätta kedjan Rlc1-Tomato 24 i YE flytande medier vid 32 ° C under 8 generationer.
OBS: För temperaturkänsliga mutanter, växa celler vid 25 ° C. Odla celler till mitten av log-fasen till en OD 600 av 0,5 i YE. För mer information om fissionsjäst tillväxtbetingelser avser Fission jäst lab handbok 25. - Förbered YE (eller minimala) media med 0,6% agaros (Agarose baserade medier visar mindre fluorescerande bakgrund i jämförelse med agar). Till den smälta media till 1 mM askorbinsyra (C-vitamin). C-vitamin släcker fria radikaler som frisätts på grund av fotoblekning, vilket minimerar fototoxicitet.
- Pour 3-4 ml av C-vitamin spetsad smält media på en glasbottnad odlingsskål. Låt svalna media och stelna.
OBS!tjockleken på glaset i odlingsskålen beror på locket glida tjocklek som är lämplig för mikroskopet. Här använder täck nr 1,5. - höja försiktigt stelnade media från odlingsskålen med hjälp av en vass skalpell. Placera en pipettspets mellan mediaplattan och odlingsskålen för att förhindra plattan från att falla tillbaka in i skålen (fig 1).
- Ta 1 ml av nyligen växande celler såsom beskrivits i 1.1 ovan. Snurra cellerna försiktigt vid 300 xg under 30 s. Kassera supernatanten. Resuspendera cellerna i den lilla mängden kvarvarande media som återstår i röret efter kasta supernatanten.
- Last 2 - 5 mikroliter av återsuspenderad cellodling mellan mediaplatta och glaset botten av odlingsskålen. Cellerna bör vara på glaset. Pipettspetsen placeras mellan medierna och skålen möjliggör enkel lastning av cellkulturen.
- Mycket försiktigt bort pipettspetsen och placera medieplattan tillbaka i sitt ursprungliga läge på culture skålen. Se till att undvika eventuella luftbubblor. Om det behövs tryck försiktigt ut luftbubblorna genom att skjuta på baksidan av en pipettspets ovanpå mediaplatta.
- Låt cellerna sitta i odlingsskålen under 30 min till en timme i mörker vid den temperatur vid vilken mikroskopi kommer att utföras. Detta är viktigt för att förhindra varje stöt på grund av förändringar i tillväxtbetingelser för cellerna.
2. Image Acquisition
- Placera en droppe olja på den yttre sidan av glaset på odlingsskålen. Placera kulturen skålen på ett inverterat mikroskop.
- För att minimera autofluorescens av YE massmedia en GFP filter med ett smalt våglängdsområde (520-535 nm).
- Fokus på den mediala planet av cellerna och se till att de är väl placerade och inte alltför trångt. Se till att börja bild förvärv av cellerna i lämpligt steg av cellcykeln. För detta experiment, följer celler från slutet av G2.
- Programmera bilden förvärvet programvara to ta GFP, RFP och DIC bilder av cellerna.
- För detta experiment använder 100 ms exponeringstid för DIC och 75 ms exponeringstid för GFP och RFP filter. Exponeringstiden beror på inställningarna av mikroskopet, proteinet som studeras och varaktigheten av experimentet. För de givna mikroskop inställningar, använder 50% lasereffekt.
- Att ta bilder i 3 dimensioner, program bilden förvärvet programvara för Z-skala avbildning. Använda en stegstorlek av 0,4 | im och ett avstånd av 3,0 | j, m (hälften av den totala z) runt den centrala fokuspunkten av cellerna. Detta leder till gripandet av 16 Z-bilder per tidpunkt med en total Z sträcka på 6 pm.
OBS: Z-serie bildtagning tillåter fångst av kämspolepolkroppar.
- Ta bilder varje 2 min. Ändra exponeringstiden i enlighet med kraven i experimentet. Exponeringstiden kan också ändras i enlighet med det intressanta proteinet och signalstyrka. Observera dock att korter intervall eller längre exponeringstid ökar fototoxicitet på grund av blekning och därmed celler kan följas bara för en kort tid.
- Hämta bilder till cellerna fysiskt åtskilda som observeras av DIC bilder, eller programmera programvaran för att stoppa förvärvet efter 90 minuter.
3. Bildanalys
- Temporal analys av cytokinetic händelser
- Med hjälp av bilden förvärvet programvara gör prognoser för Z-ramar för varje tidpunkt. Gör olika filer för varje våglängd bild förvärvats.
- Exportera denna prognos tidspunkt serien en .tiff fil.
- Analysera bilder med hjälp av ImageJ programvara. Öppna bildserie för någon en av våglängderna.
- Markera en cell som skall studeras. Dubbelklicka på linjen möjlighet att verktygsfältet. Detta kommer att öppna ett nytt fönster för att justera linjebredden. Justera linjebredden så att den motsvarar cellbredden. För en WT cell detta är ca 40-50 pixlar. Rita en linje längslånga axeln hos cellen av intresse.
- Klicka på Analysera> Verktyg> ROI manager och klicka på Lägg till. Detta kommer att lägga till den valda raden till ROI fönster för senare användning. Stäng inte det här fönstret.
- Klicka på bilden av intresse och välj Redigera> Val> Räta. Detta kommer att öppna ett nytt fönster. Ta "Process hela stacken". Detta kommer att räta cellen horisontellt.
- Klicka på Bild> Omforma> Rotera 90 grader höger. Den här bilden är nu rätas vertikalt.
- Klicka på Bild> Staplar> Gör Montage. Detta öppnar ett fönster för att tilldela antalet rader och kolumner för stapeln, skalfaktorn för bildstorleken, den första och sista skiva (ram) för montage och ramen ökningen för montage. Kontrollera etikett skivor och tryck enter.
- Som ett fönster med en montage av cellen av intresse visas, öppna bilden serien för den andra våglängden.
- Klicka på linjen identifierare på ROI manager. Detta kommer att väljasamma cell på den andra bildfilen. Upprepa steg 3.1.6 - 3.1.8. Detta kommer att öppna ett montage av den andra bilden.
- På bilden med spindeln pole kropp markör Sad1-mCherry, leta efter uppkomsten av separation av spindelstavkroppen markör och markera denna tidpunkt som tiden 0.
- Följ Rlc1-tomat signal på bilden över tid och leta efter den signal som visas som en tydlig linje i motsats till fläckar av Rlc1-Tomato. Denna tid-punkt markerar fullbordandet av aktomyosin ringenheten / början av mognadsfasen.
- Nästa bläddra genom filmen över tiden för att avgöra när Rlc1-tomat ring börjar att minska i storlek. Detta är markerad som slutet av mognadsfasen / debut av ring sammandragning.
- Följ Rlc1-tomat signal över tiden under sammandragning tills det visas som en prick i mitten av cellaxeln. Detta markeras i slutet av ringen sammandragning / slutet av septum inträngningen.
- Efter montage av DIC bilder, bestämma den slutliga cellenseparation. Registrera den tid punkt när cellen fysiskt separerar.
- För spindel polkroppen separation mäta avståndet mellan de två kämspolepolkroppar över tiden med hjälp av linjeverktyget i ImageJ. Rita avståndet i spindeln pole kropp över tiden.
- Registrera olika tidpunkter för de olika cytokinetic händelser för att beräkna hur länge varje cytokinetic fas och jämföra med spindeln pole kropp separation över tiden.
- Rumslig analys av cytokinetic händelser
- Välj en cell med en synlig aktomyosin ring. Dubbelklicka på linjen alternativet ImageJ verktygsfältet. Detta kommer att öppna ett nytt fönster för att justera linjebredden. Justera linjebredden att motsvara den ringtjocklek (15 - 20 bildpunkter). Dra en linje längs ringen i syfte att säkerställa hela tjockleken av ringen är inkluderad.
- Klicka på Analysera> Verktyg> ROI manager och klicka på Lägg till. Detta kommer att lägga till den valda raden till ROI fönster för senare användning.Stäng inte det här fönstret.
- Klicka på bilden av intresse och välj Redigera> Val> Räta. Detta kommer att öppna ett nytt fönster. Ta "Process hela stacken". Detta kommer att räta ringen horisontellt.
- Återställ intensiteten hos den ljusplanet i uträtat z-stack (från 3.1.6) med Image> Adjust> Ljusstyrka / Kontrast> Återställ.
- Klicka på fliken Stk> 3D Project. Då öppnas en dialogruta. Ändra projektionsmetod till ljusaste punkten och Slice avståndet till 2 eller 3 pixlar. Slutligen, ändra rotationsaxel till X eller Y-axeln (detta kommer att ändras beroende på den önskade betraktningsvinkeln) klickar interpolera och klicka på OK för att generera en 3D-projektion av bilden. Använd rullningslisten under bilden för att rotera bilden.
- Öppna bildserie för andra frekvensband med ImageJ.
- Klicka på linjen identifierare på ROI manager. Detta kommer att välja samma ring på den andra bildfilen. Upprepa steg 4.2.4 och 4.2.5.Detta kommer att öppna en tre dimensionell ring i bilden med den andra våglängden.
- Med båda 3D-bildringarna öppnas, klicka på Bild> Färga> Merge kanaler. Detta kommer att öppna en låda. Välj varje bild från rullgardinsmenyn för motsvarande önskad färg och klicka på OK. Detta kommer att öppna en blandning av de båda bilderna på olika våglängder.
- Jämför lokalisering av olika markörer med avseende på lokalisering på cytokinetic ring eller tränger membran. Rlc1-GFP är en markör för cytokinetic ringen. Proteiner co-lokaliserande med Rlc1-GFP lokalisera till ringen medan proteiner lokalisera bakom Rlc1-GFP signal lokalisera till tränger membranet.
OBS: Proteinet av intresse behöver vara av en annan fluorofor än den hos den ring markör. - Generera 3-dimensionella ringar under olika stadier av cytokines att jämföra spatial lokalisering av proteinerna alla genom cytokines.
- Analys av protein distribubution vid cytokinetic ring
- Att jämföra och analysera fördelningen av proteiner längs ringen mäta koefficient variansdistributions protein. En hög koefficient av varians indikerar ojämn fördelning av proteiner längs division plats och föreslår felaktig ringaggregatet, mognad eller septum bildning, beroende på vilken fas avbildas eller analyseras.
- Använda tre dimensionell rekonstruerade cytokinetic ring (från 3.2.2), dela upp bilden i minst 4 kvadranter så att en fjärdedel av ringen visas i varje kvadrant. För detta använder linjeverktyget för att rita vinkelräta linjer på bilden. Efter varje rad Klicka på bilden> Overlay> Lägg till val eller använda genvägen Ctrl + B.
- Gå till Analysera> Ställ mätning. Välj medelvärdet grå värde i rutan som öppnas. Klicka på OK.
- Med hjälp av linjer dragna ovan som guider rita en rektangel för att definiera varje kvadrant med hjälp av rektangelverktyget.
- För att mäta medelintensiteten hos varje kvadrant, klickpå Analysera> Mät eller använd genvägen Ctrl + M.
- Anteckna medelvärdet grå värde för alla fyra kvadranter (MG 1 Mg 4).
- Välj ett litet område i varje kvadrant utanför ringen som bakgrund val.
- Mät medelvärdet grå värde för bakgrunds val för alla fyra kvadranter (BG en -BG 4).
- li> För bakgrunds subtraktion för varje kvadrant användning av följande formulering MG en -Genomsnittlig (BG 1: BG 4) = intensitet av ringen i varje kvadrant (IRQ). I detta skede finns det 4 IRQ värden, ett för varje kvadrant.
- Nästa beräkna variationskoefficient för varje ring med följande formuleringen Standardavvikelse (IRQ 1: IRQ 4) / Vanlig (IRQ 1: IRQ 4). Beräkna genomsnittliga Koefficient varians för varje stam och jämför med de andra stammar.
ANMÄRKNING: En statistiskt signifikant ökning av koefficient av varians i en stam jämfört med kontroller Indicates ojämn protein distribution / leverans längs divisionen plats i detta skede av cytokines.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fission jästceller som uttrycker ringen markör, var Rlc1-GFP (grön, figur 2) och spindel polkroppen markör Sad1-mCherry (röd, figur 2) avbildas under cytokines. Debut av spindel polkroppen markör (vit pil, fig 2A, B) betraktas som tiden 0. Rlc1-GFP-signal uppträder vid tiden -4 min med hänvisning till spindel polkroppen separation (röd pil, Figurerna 2A, 2B). Rlc1-GFP-signal bildar en kontinuerlig ring 10 min efter spindel polkroppen separation (öppen pil, fig 2A, B) som markerar slutet av aktomyosin ringsammansättningen. Den aktomyosin ringen (Rlc1-GFP) börjar minska i bredd 22 minuter efter avslutad ringenheten och 32 min efter spindeln polkroppen separation (sluten pilspets, fig 2A, B). Ring sammandragning slutar 20 minuter efter starten av sammandragning, 42 minuter sedan starten av ringenheten och 52 minuter sedan spindel polkroppen separation (vita Asterisk, Fig 2A, B). Slutligen inträffar cell AMPUTATION 72 min efter spindel polkroppen separation (röd pil, fig 2A, B).
Lokaliseringen av ringmarkören Rlc1-tomat och septum membranmarkör Bgs1-GFP analyserades på avdelningen plats under hela cytokines. 3D-rekonstruktion av ringen avslöjade att aktomyosin ring märkt med Rlc1-tomat ihopsatt innan Bgs1-GFP rekrytering (Figur 3, 10 min). Under ringmognadsfasen Bgs1-GFP rekryteras till division platsen och överlappade med aktomyosin ring såsom visas av Rlc1-Tomato (Figur 3, 30 min). Detta tyder på att Bgs1 lokaliserar till ringen vid rekrytering. Som ringen constricts, Bgs1-GFP lokaliserar också till tränger membranet angränsande till den sammandragna ringen (figur 3, 40 min). Vid slutet av sammandragning, är den Bgs1-GFP-signal synlig vid ingressed membran barriER (fig 3, 50 min). Slutligen, efter förträngning den Rlc1-tomat-signalen är frånvarande, medan Bgs1-GFP förefaller att lokalisera genom hela membranbarriär med en skivliknande utseende (fig 3, 60 min). Således dessa observationer tyder på att septum syntetiserande enzymet Bgs1 lokaliserar till ringen efter montering och kvarstår efter ring sammandragning i membranbarriär som har rapporterats före 17.
Fördelningen av proteiner längs aktomyosin ringen analyserades för att bestämma effektiviteten hos cytokinetic händelser (Figur 4). Ojämn eller nonhomogenous fördelning av proteiner längs aktomyosin ringen har förknippats med nedsatt signalering och ineffektiv cytokinetic ringaggregatet 26. Här visar vi två 3D-rekonstruerade ringar under mognadsfasen, som uttrycker F-Bar protein Cdc15-GFP (Figur 4). Bildentill vänster visar jämn fördelning av Cdc15-GFP längs ringen med en låg koefficient av varians (0,098), medan bilden i den högra visar ojämn fördelning med en hög variationskoefficient (0,226, figur 4).
Figur 1: Beredning av odlingsskål för Imaging. Schematisk beskriver ympning av celler i ett glas botten odlingsskål övertäckt med media pad. Se protokoll för mer information (avsnitt 1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 Tidpunkt för Cytokinetic händelser i S. pombe. (A) Montage av en cell som uttrycker spindle pole kropp markör Sad1-mCherry (till vänster), ring protein Rlc1-GFP (mellersta panel) och ljusfält (högra panelen) genomgår cytokines visas vid 2 minuters intervall. Vita pilar markerar spindelstolpkroppen (centrosom) separation vid 17 min, röd pil markerar första rekrytering av Rlc1-GFP på avdelningen platsen, öppna pilmarkeringarna ring mognad vid 27 min, markerar pilspets uppkomsten av ring sammandragning vid 47 min, asterisker markerar änden av ring sammandragning på 69 minuter och röd pil markerar cell AMPUTATION på 97 min. (B) Timeline av cytokinetic händelser med hänvisning till mitos som bestämmer genom spindeln pole kropp bildning och separation. Cellerna avbildades vid 25 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Cell Division Site under olika skeden av cytokines. 3D-rekonstruktion av aktomyosin ring Z-stackar under olika skeden av cytokines för samma cell, ringaggregatet (10 min efter Spindel polkroppen separations), ringmognads (30 min efter Spindel polkroppen separation), ring konstriktion (40 min efter Spindle pole kroppen separation), slutet av sammandragning (50 minuter efter Spindel polkroppen separation), septum barriär (60 minuter efter Spindel polkroppen separation). Rlc1-Tomat markerar ring medan Bgs1-GFP markerar plasmamembranet omsluter septum. Skalstreck = 5 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Fördelning av proteiner längs Ring. Bilder från 3D rekonstruerade aktomyosin ring från vild typ Calnar som uttrycker Cdc15-GFP indelad i fyra kvadranter. Den koefficient av variansen för varje ring anges. Skalstreck = 5 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi beskrivit ett protokoll för att studera cytokinetic händelser i fissionsjäst på ett tids sätt. Protokollet som beskrivs här ger temporal upplösning på olika cytokinetic händelser med hänvisning till varandra; tidpunkten för protein rekrytering eller förlust med hänvisning till cytokinetic fas; struktur ringen under de olika faserna av cytokines; och utvecklingen av cytokines med hänvisning till mitos. Med detta protokoll är det möjligt att exakt definiera cytokinetic fas som kan ändras i olika mutanter, vilket ger en mer detaljerad förståelse av de proteiner som är involverade i olika cytokinetic faser. Dessutom kommer möjligheten att tillfälligt särskilja olika cytokinetic faser möjliggör analys av molekylära mekanismer som leder till att organisera olika cytokinetic faser. Tidsupplösning olika cytokinetic händelser gör det också möjligt att analysera cytokinetic ringstruktur och proteiner fördelningi de olika händelserna. Den Spatiotemporal lokaliseringen av olika proteiner kan jämföras och analyseras med denna metod. Med användning av lämpliga fluoroforer kan flera proteiner studeras och jämföras med varandra. Dessutom här har vi också beskrivit hur fördelningen av proteiner längs ringen kan analyseras för att bestämma protein organisation eller leverans på avdelningen platsen. Medan det protokoll som beskrivs här gäller för fissionsjäst cytokines, kan även utnyttjas denna metod för att studera cytokines i andra jäster och svampar med lämpliga ändringar av tillväxt- och avbildningsbetingelser.
Detta protokoll innebär imaging levande celler som de delar. Cellerna avbildas med detta protokoll behöver växa under optimala förhållanden för att undvika eventuella pleotropic effekter. Försiktighet bör vidtas för att inte trängs på celler i synfältet, som alltför stora celler kan leda till snabb förlust av näringsämnen. Dessutom avbildnings fluoroforer i celler leder till toxicitet på grund av friradikaler frigörs till följd av fotoblekning. Detta kan minimeras genom tillsats av en fri radikal-släckande föreningen, såsom askorbinsyra. Tillsatsen av askorbinsyra möjliggör långvarig avbildning av cellerna under mikroskop. Under bildinhämtning, behöver hela Z-axeln av cellen som skall avbildas för att säkerställa infångning av de kämspolepolkroppar. Frånvaron av en riktig signal för kämspolepolkroppar kommer inte att tillåta en korrekt tidsupplösning av cytokines. I synnerhet bör man vara noga med att exakt bild den initiala separationen av spindel polkroppen markörer eftersom detta är tiden 0. Korrekt infångning av cellerna längs Z-axeln är också kritisk för korrekt 3-dimensionella rekonstruktioner av ringarna och septa.
Till bilden tvärsnitt av ringar och skiljeväggar, kan det protokoll som beskrivs här modifieras med en mikro väl som tillåter de stavformade fission jästceller att vara plats vertikalt för avbildning längs den långa axeln av ceLL som har rapporterats här 27. Även om detta protokoll kan mycket exakt fånga protein rekrytering och lokalisering över tid vid celldelning platsen den rumsliga upplösningen av bilderna är begränsad på grund av upplösningen av mikroskop som används. Super-upplösning mikroskopi kan bidra till att förbättra rumslig upplösning men kan påverka den temporala upplösningen. Senaste framstegen inom mikroskopi såsom gitter ljus ark mikroskop kan bidra till att förbättra rumslig upplösning utan att kompromissa med tidsupplösning 28. Förutom ljusmikroskop kan cytokines i fissionsjäst också studeras över tiden med hjälp av Raman-spektroskopi 29, 30.
Med hjälp av denna metod har vi rapporterat att den lilla GTPas Cdc42 genomgår en unik Spatiotemporal aktivering mönster under cytokines 21. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för oss att studera organisation av olika cytokinetic händelses över tiden och beskriva de molekylära detaljerna i dessa händelser. Rapporter har antytt att närvaron av en monterad aktomyosin ensam ring är inte tillräckligt för effektiv membran furrowing och cytokines 11, 21, 31. Protokollet som beskrivs här kan användas för att undersöka de molekylära händelser som leder till korrekt cytokines efter aktomyosin ringaggregatet. Dessutom kan integriteten i aktomyosin ringen och dess effekt på membran furrowing och septum inträngning undersökas. Detta kommer att ge en djupare förståelse för de olika molekylära händelser som tillsammans leder till framgångsrik separation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract media | Sunrise Science Products | YES 225 | 0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine |
| Agarose | SeaKem LE agarose, Lonza | 50001 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Glass Bottomed culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used. |
| VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system | Visitech International, UK | with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu). | |
| ImageJ | NIH | Image analysis software |
References
- Pollard, T. D.
- Guertin, D. A., Trautmann, S., McCollum, D.
- Xu, X., Vogel, B. E. A secreted protein promotes cleavage furrow maturation during cytokinesis. Curr Biol. 21 (2), 114-119 (2011).
- Sagona, A. P., Stenmark, H.
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437 (7061), 1043-1047 (2005).
- Li, R. Cytokinesis in development and disease: variations on a common theme. Cell Mol Life Sci. 64 (23), 3044-3058 (2007).
- Daniels, M. J., Wang, Y., Lee, M., Venkitaraman, A. R. Abnormal cytokinesis in cells deficient in the breast cancer susceptibility protein BRCA2. Science. 306 (5697), 876-879 (2004).
- Storchova, Z., Pellman, D. From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (1), 45-54 (2004).
- Lee, I. J., Coffman, V. C., Wu, J. Q. Contractile-ring assembly in fission yeast cytokinesis: Recent advances and new perspectives. Cytoskeleton (Hoboken). 69 (10), 751-763 (2012).
- Balasubramanian, M. K., Bi, E., Glotzer, M. Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells. Curr Biol. 14 (18), R806-R818 (2004).
- Proctor, S. A., Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Contributions of turgor pressure, the contractile ring, and septum assembly to forces in cytokinesis in fission yeast. Curr Biol. 22 (17), 1601-1608 (2012).
- Munoz, J., et al. Extracellular cell wall beta(1,3)glucan is required to couple septation to actomyosin ring contraction. J Cell Biol. 203 (2), 265-282 (2013).
- Wang, N., Lee, I. J., Rask, G., Wu, J. Q. Roles of the TRAPP-II Complex and the Exocyst in Membrane Deposition during Fission Yeast Cytokinesis. PLoS Biol. 14 (4), e1002437 (2016).
- Liu, J., Wang, H., McCollum, D., Balasubramanian, M. K. Drc1p/Cps1p, a 1,3-beta-glucan synthase subunit, is essential for division septum assembly in Schizosaccharomyces pombe. Genetics. 153 (3), 1193-1203 (1999).
- Cortes, J. C., et al. The (1,3)beta-D-glucan synthase subunit Bgs1p is responsible for the fission yeast primary septum formation. Mol Microbiol. 65 (1), 201-217 (2007).
- Cortes, J. C., et al. Cooperation between Paxillin-like Protein Pxl1 and Glucan Synthase Bgs1 Is Essential for Actomyosin Ring Stability and Septum Formation in Fission Yeast. PLoS Genet. 11 (7), e1005358 (2015).
- Cortes, J. C., Ishiguro, J., Duran, A., Ribas, J. C. Localization of the (1,3)beta-D-glucan synthase catalytic subunit homologue Bgs1p/Cps1p from fission yeast suggests that it is involved in septation, polarized growth, mating, spore wall formation and spore germination. J Cell Sci. 115 (Pt 21), 4081-4096 (2002).
- Liu, J., Tang, X., Wang, H., Oliferenko, S., Balasubramanian, M. K. The localization of the integral membrane protein Cps1p to the cell division site is dependent on the actomyosin ring and the septation-inducing network in Schizosaccharomyces pombe. Mol Biol Cell. 13 (3), 989-1000 (2002).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15 (2), 838-850 (2004).
- Figard, L., Xu, H., Garcia, H. G., Golding, I., Sokac, A. M. The plasma membrane flattens out to fuel cell-surface growth during Drosophila cellularization. Dev Cell. 27 (6), 648-655 (2013).
- Wei, B., et al. Unique Spatiotemporal Activation Pattern of Cdc42 by Gef1 and Scd1 Promotes Different Events during Cytokinesis. Mol Biol Cell. , (2016).
- Nabeshima, K., et al. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9 (11), 3211-3225 (1998).
- Johnson, A. E., Gould, K. L. Dma1 ubiquitinates the SIN scaffold, Sid4, to impede the mitotic localization of Plo1 kinase. EMBO J. 30 (2), 341-354 (2011).
- Yonetani, A., Chang, F.
- Fission Yeast: A laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
- Hachet, O., Simanis, V. Mid1p/anillin and the septation initiation network orchestrate contractile ring assembly for cytokinesis. Genes Dev. 22 (22), 3205-3216 (2008).
- Zhou, Z., et al. The contractile ring coordinates curvature-dependent septum assembly during fission yeast cytokinesis. Mol Biol Cell. 26 (1), 78-90 (2015).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Huang, Y. S., Karashima, T., Yamamoto, M., Hamaguchi, H. O. Molecular-level investigation of the structure, transformation, and bioactivity of single living fission yeast cells by time- and space-resolved Raman spectroscopy. Biochemistry. 44 (30), 10009-10019 (2005).
- Huang, C. K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging. Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).
- Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe. Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).
