Summary
Fisyon maya, Schizosaccharomyces pombe sitokinezi incelemek için mükemmel bir model sistemi, hücre bölünmesi son aşamasıdır. Burada canlı fisyon maya hücreleri farklı cytokinetic olayları analiz etmek için bir mikroskop yaklaşım açıklar.
Abstract
Sitokinler, hücre bölünmesi son aşama genom bütünlüğünü korumak için önemlidir. Uygun sitokinez hücre farklılaşması ve gelişimi için önemlidir. Sitokinez iyi zaman ve mekan içinde koordine edilmiş bir dizi etkinlik gerektirir. Sitokinez halka daralmasının, membran karık oluşumu ve hücre dışı matriks yeniden izledi bölünme yerinde bir actomyosin halkasının oluşumunu kapsar. Fisyon maya, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) önemli bir açıklıkla sitokinez ilk olaylar ortaya koymuştur iyi çalışılmış bir model sistemidir. Ancak, biz cytokinetic olaylar spatiotemporally koordine açıkça nasıl farklı anlamıyorum. Bunu belirlemek için, bir hem zaman ve uzayda büyük ayrıntılarda farklı cytokinetic olayları analiz gerekiyor. Burada farklı cytokinetic EV incelemek için bir mikroskop yaklaşımı tanımlamakCanlı hücrelerdeki hastalar. Bu yaklaşımla farklı cytokinetic olayları zaman ve sitokinez sırasında farklı proteinlerin işe zamanını belirlemek mümkündür. Buna ek olarak, hücre bölünmesinin yerinde protein lokalizasyonu ve dağıtım karşılaştırma protokolleri açıklanmıştır. Bu füzyon mayada sitokinezi çalışma için temel bir protokoldür ve diğer maya ve mantar sistemleri için de kullanılabilir.
Introduction
Sitokinez, hücre bölünmesi son adımı, bir organizmanın uygun farklılaşması, geliştirme ve hayatta kalmak için karmaşık bir süreçtir esastır. Sitokinez genomik bütünlüğünü 1 korurken başarılı hücre ayrımı sağlamak için düzenlenen birden fazla etkinlik içerir. Sitokinez kez oluşturulan bir aktomiyosin halkası son olarak hücreyi absisyon 1, 2, 3, ardından membran genişleme ve yarıklar, ve hücre dışı matriks yeniden modellenmesi ile eş zamanlı bir daralma, maruz etkinlikleri kapsar. Cytokinetic olayların yanlış organizasyon hücre ayırma ve Ploidi kusurlarına yol açabilir ve kanser 4, 5, 6, 7, 8 gibi hastalıklara neden olabilir. etkinleştirmek temel ilkeler ocytokinetic olayların rganization iyi böylece bu hastalıkların etiyolojisinde anlayışımız içinde barikatlar yol anlaşılamamıştır.
Yank mayası Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) nedeniyle 1 ilgili proteinlerin korunmuş doğası sitokinezi incelemek için mükemmel bir model sistemidir. Fizyon maya, halka düzeneğini actomyosin sonra, halka bu 9 sıkmak olmayan bir olgunlaşma / bekleme aşamaya girer. Olgunlaşma membran furrowing ve septum Ingression'a ile eş zamanlı actomyosin halka daralmasının, başlaması ile sona erer. Yılda seminal iş fisyon maya 1, 9, 10, bize actomyosin halka montaj oldukça iyi bir anlayış verdik. füzyon maya da dahil olmak üzere, bazı ökaryotlarda ise, aktomiyosin halkasının başarılı bir montaj membran yarıklar için yeterli değildir. fission maya halka daralması, tek başına veya ark oluşumu 11 iç turgor basıncının üstesinden gelmek için yeterli bir kuvvet sağlamamaktadır. Son zamanlarda modeli bu kuvvet yerine septum Ingression'a 11 tarafından sağlanır belirtir. Başka bir modelde, plazma membranı uzantısı rolü oluşumu 12, 13 karık katkıda önerilmiştir. Halka konstriksiyon ve membran yarıklar Bgs1 / CPS1 ısıya duyarlı bir mutant cps1-191 primer septum oluşumu 14, 15 için büyük bir enzim meydana gelmez. Bgs1 eksik Hücreler arızalı birincil septum ve uzun süreli halka daralma 15, 16 göstermektedir. Bgs1 halka takımını 17, 18 actomyosin sonra olgunlaşma sırasında septum Ingression'a için hücre bölünmesi sitesine işe alınır. Similarly Drosophila embriyolar Hücreselleştirmeden sırasında, halka daralma fisyon maya gözlenen olgunlaşma evresini benzeyen bir ölçüde yavaş başlangıç daralma oranı 19 ile bifazik olduğunu. Bifazik halka daralma yeterli membran genişleme 20 ve hücre dışı matris modifikasyonu için izin vermek için membran furrowing yavaşlatabilir. Bu halka düzeneğini actomyosin sonra, halka daralma hücre karık oluşumu için gereksinimleri tatmin etti verimli yalnızca oluşur düşündürmektedir. İyi actomyosin halka halka montaj sonrası daralma, ne de bu süreci düzenleyen moleküler olaylar için gerekli olan hangi koşullar anlaşılamamıştır. Biz son zamanlarda actomyosin halka aşağıdaki montaj küçük GTPaz Cdc42 eşsiz uzaysal aktivasyon deseni 21 uğradığını göstermiştir. Bu model Cdc42 guanidin nükleotid değişimi faktörlerin benzersiz yerelleştirme deseni (tarafından kurulmuşturCdc42 aktive gefs). GEF Gef1 monte aktomiyosin halkasına lokalize ve SCD1 furrowing membrana lokalize ve normal septum oluşumu teşvik ederken, halka daralmasının ve septum Ingression'a başlamasını teşvik eder. Biz onun gefs tarafından kurulan Cdc42 aktivasyon deseni farklı cytokinetic olayların düzenlenmesinde yol açtığını bulmak.
Sonunda actomyosin halka montaj aşağıdaki hücre ayrılmasına neden olayların moleküler mekanizmasını anlamak için, bir zaman ve mekan içinde farklı cytokinetic olayları takip etmek gerekiyor. fizyon maya, sitokinez ilk sonunda tip II miyozinin, formin Cdc12 ve actomyosin halka montaj için gerekli olan diğer proteinleri işe çekirdeğin etrafında habercisi düğümleri, montajını kapsamaktadır. Zaman farklı cytokinetic olaylar ve referans çerçevesi sağlamak, iğ kutup vücut belirteçleri (iğ oluşumu) ayrılması zaman 0 22 olarak kabul edilir. th montajıe aktomiyosin halkasının bir floresan etiketli aktomiyosin halkası protein yoğunluğu tip II miyosin regülatör hafif zincir Rlc1 zamanla izlenmesi ile takip edilebilir. Burada zamanla sitokinez farklı aşamalarını analiz etmek için bir mikroskopik yaklaşım açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Numune hazırlanması 1.
- 8 nesiller için 32 ° C'de YE sıvı ortamda mili kutup vücut işaretleyici Sad1 mCherry 23 ve tip II miyozin düzenleyici hafif zincir Rlc1-Domates 24 ifade fizyon maya hücreleri büyür.
Not: sıcaklığa duyarlı mutantlar için, 25 ° C'de hücreler büyür. YE 0.5 OD 600 orta log fazına hücreleri büyütün. Fisyon ilgili daha fazla bilgi için maya büyüme koşulları Bölünme maya laboratuar kılavuzuna 25 bakın. - % 0.6 agaroz ile YE (veya minimal) ortamı hazırlayın (Agaroz tabanlı medya agar göre daha az floresan arka plan göstermektedir). Erimiş ortam için askorbik asit, 1 mM (C vitamini) ekleyin. C vitamini, böylece foto-toksisite minimize foto-ağartma nedeniyle yayımlanan serbest radikalleri söndürür.
- C cam dipli kültür çanak medya erimiş bağcıklı vitamin 4 ml - 3 dökün. Medya soğuması ve katılaşması.
NOT:Kültür kabı cam kalınlığı mikroskop için uygun kapak kayma kalınlığına bağlıdır. Burada, kullanım lamel sayılı 1.5. - Yavaşça keskin bir neşter yardımıyla kültürü çanak katılaşmış medyayı yükseltmek. Medya levha ve çanak (Şekil 1) geri düşmesini slab önlemek için kültür çanak arasında bir pipet yerleştirin.
- Yukarıda 1.1'de tarif edildiği gibi, taze büyüyen hücreler 1 ml al. 30 saniye boyunca 300 xg'de hafifçe hücreleri dönerler. süpernatant atın. Süpernatant çıkarıldıktan sonra bir tüp içinde kalan artık araçlar az miktarda hücrelerin tekrar.
- Yük 2 - Medya levha ve kültür çanak cam alt kısmı arasında yeniden süspanse hücre kültürü 5 uL. Hücreler cam olmalıdır. medya ve çanak arasına yerleştirilen pipet hücre kültürü kolay yükleme sağlar.
- Çok nazikçe cu orijinal konumuna geri medya levha pipet kaldırmak ve yerleştirmeklture çanak. herhangi bir hava kabarcıklarını önlemek için emin olun. Eğer nazikçe medya levhanın üstünde bir pipet arka kaydırarak hava kabarcıkları dışarı basınız gerekmez.
- Hücreler mikroskopi yapılacaktır hangi sıcaklığında 30 dakika karanlıkta saatlik bir ila kültür kabı bekletin. hücreler için büyüme koşullarında değişiklik nedeniyle bu herhangi çarpmasını önlemek için önemlidir.
2. Görüntü Alma
- Kültür tabağına camın dış tarafında bir damla yağ yerleştirin. ters bir mikroskop kültür çanak yerleştirin.
- (- 535 nm 520) dar bir dalga boyu aralığında bir GFP filtresi kullanın YE medyanın oto floresan en aza indirmek için.
- Hücrelerin medial düzlem üzerinde odaklanın ve onlar çok kalabalık iyi aralıklı ve değil emin olun. Hücre döngüsünün uygun aşamasında hücrelerin görüntü alımı başlatabilirsiniz emin olun. Bu deney için, geç G2 hücreleri izleyin.
- Görüntü elde etme yazılımı t Programo GFP, RFP ve hücrelerin DIC görüntüleri çekmek.
- Bu deneme için DIC için 100 ms pozlama süresi ve GFP ve RFP filtreleri için 75 ms pozlama süresi kullanın. Pozlama süresi mikroskop, çalışma kapsamında protein ve deney süresince ayarlarına bağlıdır. Verilen mikroskop ayarları için,% 50 lazer gücünü kullanın.
- 3 boyutlu, Z-ölçekli görüntüleme için bir program görüntü elde etme yazılımı görüntü yakalamak için. Hücrelerin odak noktası noktası etrafında 0.4 mikron bir adım boyutu ve 3.0 mikron (toplam z yarısı) bir mesafe kullanın. Bu 6 um'lik bir toplam Z mesafesi zaman noktası başına 16 Z-kare yakalama yol açar.
NOT: Z-serisi görüntü elde etme iğ kutup organları yakalama sağlar.
- görüntüleri her 2 dakika sürer. Deneyin ihtiyaçlarına göre pozlama süresini değiştirin. maruz kalma süresi de ilgi ve sinyal gücü proteine göre değiştirilebilir. Ancak, bu kısa noter aralıklar veya ağartmaya Pozlama süresi daha uzun bir artış verilmedi-toksisite ve dolayısıyla hücreleri sadece kısa bir süre için takip edilebilir.
- DIC görüntüleri gözlenen fiziksel olarak ayrı hücrelere kadar görüntüleri Edinme veya 90 dakika sonra satın durdurmak için yazılım programı.
3. Görüntü Analizi
- Cytokinetic olayların zamansal analizi
- görüntü elde etme yazılımı kullanarak her zaman noktası için Z-kare projeksiyonlar yapmak. elde edilen görüntünün her dalga boyu için farklı dosyaları olun.
- Bir .tiff dosyası olarak projeksiyon zaman noktası serisi ihraç ediyoruz.
- ImageJ yazılımı kullanarak görüntüleri analiz edin. dalga boyu herhangi birinin resim serisi açın.
- Bir hücreyi seçin çalışılacak. Araç çubuğunun satırı seçeneğiyle çift tıklayın. Bu hat genişliğini ayarlamak için başka bir pencere açılacaktır. Hücre genişliğine karşılık çizgi genişliğini ayarlayın. 50 piksel - WT hücre için bu yaklaşık 40 olduğunu. boyunca bir çizgi çizinilgili hücrenin uzun ekseni.
- Analiz> Araçlar> ROI yöneticisi tıklayın ve eklenti tıklayın. Bu, daha sonra kullanılmak üzere ROI penceresine seçilen satır eklemek olacaktır. Bu pencereyi kapatma.
- Düzelt> ilgi resmin üzerine tıklayın ve Düzenle> Seçimi seçin. Bu başka bir pencere açılacaktır. "Tüm yığını Süreç" kontrol edin. Bu yatay hücre düzeltmek olacaktır.
- Görüntü tıklayın>> Transform 90 Derece Sağ çevirin. Bu görüntü artık dikey doğruldu edilir.
- Görüntü üzerine tıklayın> Yığınlar> Montage olun. Bu yığını için satır ve sütun numarası atamak için bir pencere açılacak, görüntü boyutu için ölçek faktörü, montaj için ilk ve son dilim (çerçeve) ve montaj için çerçeve artış. Etiket dilimleri kontrol edin ve butonu tıklayın.
- ilgi hücrenin montajı ile bir pencere gösterildiği gibi, diğer dalga boyu için görüntü serilerini açın.
- ROI yöneticisi hat tanımlayıcı tıklayın. Bu seçecekİkinci resim dosyası aynı hücre. 3.1.8 - Tekrar 3.1.6 adımları. Bu ikinci görüntünün montaj açılacaktır.
- iğ kutup vücut işaretleyici Sad1 mCherry ile resim üzerinde, iğ kutup vücut marker ayrılması başlangıcı için bakmak ve zaman 0 olarak o zaman noktasını işaretlemek.
- zamanla resmin üzerine Rlc1-Domates sinyalini takip ve Rlc1-Domates yamalar karşı ayrı bir çizgi olarak görünür sinyal arayın. Bu zaman noktası actomyosin halka montaj / olgunlaşma safhasının başlangıcında tamamlandığını göstermektedir.
- Rlc1-Domates halka boyutunun küçülmesine başladığında zamanla film boyunca Sonraki kaydırma belirlemek için. Bu halka daralma olgunlaşma aşaması / başlangıçlı sonu olarak işaretlenir.
- hücre ekseni ortasında bir nokta olarak görünene kadar daralma boyunca zamanla Rlc1-Domates sinyalini takip edin. Bu septum Ingression'a halka daralma / sonu sonu olarak işaretlenir.
- DIC görüntüleri montaj ardından, nihai hücre belirlemekayırma. Hücre fiziksel olarak ayıran zaman zaman noktasını kaydedin.
- iğ kutup vücut ayrılması için ImageJ satırı aracını kullanarak zaman içinde iki iğ kutup organları arasındaki mesafeyi ölçün. zamanla mili kutup vücudun mesafeyi çizilir.
- Farklı cytokinetic olaylar her cytokinetic fazın süresini hesaplamak ve zamanla mili kutup vücut ayrılması ile karşılaştırmak için farklı zaman noktaları kaydedin.
- Cytokinetic olayların mekansal analizi
- Görünür actomyosin halkası ile bir hücre seçin. ImageJ araç çubuğunun satırı seçeneğiyle çift tıklayın. Bu hat genişliğini ayarlamak için başka bir pencere açılacaktır. (- 20 piksel 15) halka kalınlığına karşılık çizgi genişliğini ayarlayın. halka tüm kalınlığını sağlamak için özen halka boyunca bir çizgi çizin dahildir.
- Analiz> Araçlar> ROI yöneticisi tıklayın ve eklenti tıklayın. Bu, daha sonra kullanılmak üzere ROI penceresine seçilen satır eklemek olacaktır.Bu pencereyi kapatma.
- Düzelt> ilgi resmin üzerine tıklayın ve Düzenle> Seçimi seçin. Bu başka bir pencere açılacaktır. "Tüm yığını Süreç" kontrol edin. Bu yatay halka düzeltmek olacaktır.
- Image kullanarak (3.1.6 itibaren) doğruldu z yığın parlak uçağın yoğunluğunu Reset> Ayarla> Parlaklık / Kontrast> sıfırlayın.
- sekmesine Stk> 3D Projesi tıklayın. Bu bir iletişim kutusu açılacaktır. Parlak Point projeksiyon yöntemi ve 2 ya da 3 piksel Dilim aralığını değiştirmek. Son olarak, X veya Y ekseni dönme değişikliği ekseni (bu arzu edilen görüş açısına bağlı olarak değişecektir), katmak tıklayın ve görüntünün 3D projeksiyon oluşturmak için Tamam'a tıklayın. Görüntüyü döndürmek için resmin altındaki kaydırma çubuğunu kullanın.
- ImageJ kullanarak diğer dalga boyu için görüntü serisi açın.
- ROI yöneticisi hat tanımlayıcı tıklayın. Bu ikinci resim dosyası aynı halka seçecektir. Tekrarlayın 4.2.4 ve 4.2.5 adımları.Bu, diğer dalga boyuna sahip görüntüde 3 boyutlu halka açılacaktır.
- açık hem 3D görüntü halkaları, Kanallar Merge> Renk> Görüntü tıklayın. Bu bir kutu açılacaktır. İstenen renge karşılık gelen açılır menüden her görüntüyü seçin ve Tamam'a tıklayın. Bu, farklı dalga boylarında görüntü hem de bir kompozit açılacaktır.
- cytokinetic ring lokalizasyon açısından veya ingressing membran ile farklı belirteçlerin lokalizasyonu karşılaştırın. Rlc1-GFP cytokinetic halka için bir göstergedir. proteinler ingressing zarı lokalize Rlc1-GFP sinyal arkasında lokalize iken Proteinler ko-lokalize Rlc1-GFP ile halka lokalize.
Not: ilgili protein halkası markör daha farklı bir floroforla olması gerekmektedir. - Tüm sitokinez yoluyla proteinlerin mekansal yerelleştirme karşılaştırmak için sitokinez farklı aşamalarında 3 boyutlu halkaları oluşturmak.
- Protein göre dağılımın analizicytokinetic ring Katkı
- halka proteini dağılımının varyans katsayısı ölçümü boyunca karşılaştırmak ve proteinlerin dağılımını analiz etmek. Yüksek katsayısı varyans bölümü sitenin boyunca proteinlerin eşitsiz dağılımını gösterir ve faz görüntülü veya analiz edildiği bağlı, yanlış halka montaj, olgunlaşma ya da septum oluşumu göstermektedir.
- (3.2.2 itibaren) 3 boyutlu yeniden cytokinetic halkasını kullanarak, halka dörtte her kadranda görünür şekilde en az 4 parçaya bölünür görüntüyü bölün. Bunun için resmin üzerine dik çizgiler çizmek için satırı aracını kullanın. her satır için tıklayın Image sonra> Yerleşimi> seçimi ekleme veya kısa kesilmiş Ctrl + B kullanın.
- > Set ölçümü Analiz gidin. Açılan kutuda ortalama gri değeri seçin. Tamam'a tıklayın.
- kılavuzları bir dikdörtgen dikdörtgen aracını kullanarak her kadranı tanımlamak için çizerken yukarıda çizilen çizgiler kullanarak.
- Her kadranda, tıklama ortalama yoğunluğunu ölçmek içinAnaliz üzerinde> ölçün ya da kestirme Ctrl + M kullanın.
- Dört çeyrek daire için ortalama gri değeri (MG 1 -MG 4) kaydediniz.
- Arka plan seçimi gibi halka dışında her kadranda küçük bir alan seçin.
- Dört çeyrek daire için arka plan seçimi için ortalama gri değeri (BG 1 -BG 4) ölçün.
- Her kadranda (IRQ) içinde = halka Şiddeti: formülasyonu MG 1 -Ortalama (BG 4 BG 1) Aşağıdaki her bir çeyrek kullanım için arka plan çıkarma için li>. Bu aşamada 4 IRQ değerleri, her kadranda için bir tane vardır.
- / Ortalama (IRQ 1: IRQ 4): Sonraki aşağıdaki formülasyonlar Standart sapma kullanılarak her halka için (IRQ 4 IRQ 1) varyans katsayısını hesaplamak. her bir suş için Varyans ortalama Co-verimli hesaplamak ve diğer suşları karşılaştırın.
NOT: kontrollere ind kıyasla gerginlik varyansın katsayısı istatistiksel olarak anlamlı bir artışsitokinez bu aşamada bölünme sitesi boyunca düzensiz protein dağıtım / teslimat icates.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Halka işaretleyiciyi ifade füzyon maya hücreleri, Rlc1-GFP (yeşil, Şekil 2) ve iğ cisimciği kutup gövdesi markör Sad1 mCherry (kırmızı, Şekil 2) sitokinez sırasında görüntülenmiştir. Iğ kutup vücut marker Başlangıcı (kırmızı ok 2A, 2B Rakamlar) 0 Rlc1-GFP sinyali kutup vücut ayrımını mili referansla zaman -4 dk görünen zaman olarak kabul edilir (beyaz ok, B, 2A Şekiller). Rlc1-GFP sinyali actomyosin halka montaj sonuna işaretleme (B, açık ok 2A Rakamlar) sürekli bir halka 10 dk sonrası mili kutup vücut ayrımı oluşturur. Actomyosin halkası (Rlc1-GFP) halka montajının tamamlanmasından ve iğ kutup vücut ayırma sonra 32 dakika sonra genişliği 22 dakika içinde azalmaya başlar (kapalı ok ucu 2A Şekiller, B). Halka daralma daralma başlangıcından sonra 20 dakika, halka montaj başlangıcı ve iğ kutup vücut ayrılması beri 52 dakika beri 42 dk (beyaz Asteris biterk, Şekil 2A, B). Son olarak, hücre kesilme 72 dk sonrası mili kutup vücut ayrımı oluşur (kırmızı ok ucu 2A Şekiller, B).
halka işaretleyici Rlc1-Domates ve septum membran işaretleyici Bgs1-GFP lokalizasyonu sitokinez boyunca bölünme yerinde incelendi. Halka 3D rekonstrüksiyon Rlc1-Domates ile işaretlenmiş actomyosin halka Bgs1-GFP işe (Şekil 3, 10 dk) önce monte ortaya koymuştur. Rlc1-Domates (Şekil 3, 30 dk) ile gösterildiği gibi halka olgunlaşma aşamasında Bgs1-GFP bölümü sitesine işe alındı ve actomyosin halkası ile örtüştü. Bu Bgs1 işe çalacak şekilde lokalize olduğunu gösterir. Halka daraltır gibi Bgs1-GFP da daraltıcı halkası (Şekil 3, 40 dakika) ile bitişik ingressing zara lokalize eder. daralma sonunda Bgs1-GFP sinyali ingressed membran Barri görünür olduğuER (Şekil 3, 50 dakika). Bgs1-GFP, bir disk gibi bir görünüm (Şekil 3, 60 dakika) ile membran bariyeri boyunca lokalize görünürken Son olarak, sıkıştırmadan sonra Rlc1-Domates sinyali yoktur. Bu nedenle, bu gözlemler 17 önce rapor edildiği gibi septum sentezleme enzim Bgs1 montaj sonra halka lokalize ve membran bariyer de halka daralması sonrasında devam ettiğini göstermektedir.
Actomyosin halka boyunca proteinlerin dağılımı cytokinetic olaylar (Şekil 4) etkinliğini belirlemek için analiz edilmiştir. Actomyosin halka boyunca proteinlerin Dengesiz ya da homojen olmayan dağılımı bozulmuş sinyalizasyon ve verimsiz cytokinetic halka düzeneği 26 ile ilişkili olmuştur. Burada F-Bar proteini Cdc15-GFP (Şekil 4) ifade olgunlaşma aşamasında iki 3D yeniden halkaları göstermektedir. Görüntüsağ görüntü varyansın yüksek katsayısı (0.226, Şekil 4) ile dengesiz dağılımı gösterirken solda, varyans (0.098) düşük katsayısı ile halka boyunca Cdc15-GFP bile dağılımını göstermektedir.
Şekil 1: Görüntüleme Kültür Bulaşık hazırlanması. Bir bardak dipli bir kültür çanak içine hücreleri şematik açıklayan aşılama medya pad ile kaplanmış. ayrıntıları (Bölüm 1) için protokol bakın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
S. pombe'de Cytokinetic Olayların Şekil 2 Zamanlama. Hücre ifade Spindl (A) MontajE kutup vücut işaretleyici Sad1 mCherry (sol panel), halka proteini Rlc1-GFP (orta panel) ve parlak alan (sağ panel) sitokinezi geçiren 2 dakika aralıklarla gösterilir. Beyaz oklar 17 dk iğ kutup gövdesi (sentrozom) ayrılık işaretleri, kırmızı ok 27 dakikada bölünme yerinde Rlc1-GFP ilk işe, açık ok işaretleri halka olgunlaşmasını işaretler, ok başı 47 dk, yıldız işaretleri de halka daralması başlangıcına işaret 69 dakika ve kırmızı ok de halka daralması sonu 97 dakikada hücre kesilmesini işaretler. Iğ cisimciği kutup gövdesi oluşumu ve ayırma belirlendiği gibi mitoz referansla cytokinetic etkinlikleri (B) zaman çizelgesi. Hücreler, 25 ° C 'de görüntülenmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: CeSitokinez Farklı Aşamaları sırasında ll Bölümü Sitesi. Aynı hücre için sitokinez farklı aşamalarında, halka düzeneği (10 dk sonrası Mil kutup vücut ayırma), halka olgunlaşması (30 dakika sonrası Mil kutup vücut ayırma), halka daralma (40 dk sonrası Mil kutup sırasında actomyosin halka Z-yığınlarının 3D rekonstrüksiyon vücut ayırma), daralma sonu (50 dk sonrası Mil kutup vücut ayırma), septum bariyer (60 dakika sonrası Mil kutup vücut ayırma). Bgs1-GFP septum saran plazma membranını işaret ederken Rlc1-Domates halka işaretler. Ölçek çubuğu = 5 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Yüzük boyunca Proteinlerin dağılımı. 3D görüntüleri vahşi tip c actomyosin halka yenidenCdc15-GFP ifade arşın çeyreklere bölünür. katsayısı her halkanın varyansın belirtilmiştir. Ölçek çubuğu = 5 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada bir zamansal bir şekilde fisyon maya cytokinetic olayları incelemek için bir protokol tanımlanmıştır. Burada açıklanan protokol birbirine göre farklı cytokinetic olayların zamansal çözünürlüğü sağlar; Protein alımı veya cytokinetic faza referansla kaybı zamanlaması; sitokinez farklı aşamalarında halkanın yapısı; ve mitoz referansla sitokinez ilerlemesi. Bu protokol sayesinde hassas ve böylece farklı cytokinetic aşamalarında yer proteinlerin daha ayrıntılı bir anlayış sağlayarak, farklı mutantların değişmiş olabilir cytokinetic faz tanımlamak mümkündür. Buna ek olarak, zamansal farklı cytokinetic evrelerini ayırt yeteneği farklı cytokinetic fazların organizasyonu yol moleküler mekanizmaların analizini sağlayacaktır. Farklı cytokinetic olayların zamansal çözünürlüğü de cytokinetic halka yapısı ve proteinler dağılımı analiz sağlarfarklı etkinlikler boyunca. Farklı proteinlerin zamanmekansal lokalizasyonu karşılaştırılmış ve bu yaklaşımla analiz edilebilir. uygun floroforlar kullanımı ile, çoklu protein incelenmiştir ve birbirleri ile karşılaştırılabilir. Burada ek olarak aynı zamanda halka boyunca protein dağılımı bölümü yerinde protein organizasyonu ya da teslimat belirlemek için analiz nasıl tanımlamışlardır. Burada açıklanan protokol bölünmüş maya sitokinez için geçerli olmakla birlikte, bu yaklaşım, aynı zamanda büyüme ve görüntüleme koşullarına uygun değişikliklerle başka mayalarda sitokinezi ve mantarları çalışma için kullanılabilir.
Onlar bölmek gibi bu protokol görüntüleme canlı hücreleri içerir. Bu protokolü kullanarak görüntülü hücreler herhangi bir pleotropik etkileri önlemek için optimum koşullar altında büyümek gerekir. Aşırı hücreler hızlı besin kaybına yol açabilir olarak bakım, görüş alanında hücreleri kalabalık değil alınmalıdır. Ayrıca hücrelerde görüntüleme fluorophores nedeniyle serbest toksisite yol açarradikaller foto-beyazlatmanın bir sonucu olarak yayınladı. Bu askorbik asit gibi bir serbest radikal söndürücü madde ilavesi ile en aza indirilebilir. askorbik asit ilavesi mikroskop altında hücre uzun görüntüleme sağlar. Görüntü alma esnasında, tüm hücre Z ekseni mili kutup gövdeleri yakalanmasını sağlamak için görüntülü gerekmektedir. iğ kutup organları için uygun bir sinyal yokluğu sitokinez uygun zamansal çözünürlüğe izin vermez. Özellikle, bakım tam görüntü bu Z ekseni boyunca hücrelerinin 0. Uygun yakalama de yüzük ve septa uygun 3 boyutlu rekonstrüksiyon için kritik zaman olduğu gibi iğ kutup vücut belirteçlerinin ilk ayrılmasını alınmalıdır.
görüntü yüzük ve septa kesitleri, burada açıklanan protokol ce uzun ekseni boyunca görüntüleme için dikey bir yer olması için çubuk şekilli fisyon maya hücreleri izin veren bir microfabricated kuyu ile modifiye edilebilirll burada 27 rapor edildiği gibi. Bu protokol çok hassas hücre bölünme yerinde zamanla protein işe alma ve yerelleştirme yakalayabilir iken görüntülerin uzaysal çözünürlüğü nedeniyle kullanılan mikroskop çözünürlüğü ile sınırlıdır. Süper çözünürlük mikroskopi uzaysal çözünürlüğü artırmak yardımcı olabilir, ancak zamansal çözünürlüğe etkileyebilir. Böyle kafes ışık levha mikroskopisi olarak mikroskopi son gelişmeler zamansal çözünürlüğü 28 ödün vermeden uzaysal çözünürlüğü artırmak yardımcı olabilir. Işık mikroskobu yanı sıra, fisyon maya sitokinez da Raman spektroskopisi 29, 30 kullanılarak zamanla ele alınabilir.
Bu yaklaşımı kullanarak biz küçük GTPaz Cdc42 sitokinez 21 sırasında eşsiz bir uzaysal aktivasyon deseni uğradığını bildirdi. Bu yaklaşım, farklı cytokinetic olayın organizasyonunu incelemek için bize sağlarzamanla s ve bu olayların moleküler açıklanacaktır. Raporlar tek başına monte aktomiyosin halkanın varlığı, verimli bir zar yarıklar ve sitokinez 11, 21, 31 için yeterli olmadığını düşündürmektedir. Burada açıklanan protokol actomyosin halka montajdan sonra uygun sitokinez yol moleküler olayları incelemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, aktomiyosin halkası ve membran yarıklar ve septum Ingression'a üzerindeki etkisi bütünlüğü incelenebilir. Bu arada başarılı ayrılmasına neden farklı moleküler olayların daha derin bir anlayış sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının beyan ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract media | Sunrise Science Products | YES 225 | 0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine |
| Agarose | SeaKem LE agarose, Lonza | 50001 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Glass Bottomed culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used. |
| VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system | Visitech International, UK | with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu). | |
| ImageJ | NIH | Image analysis software |
References
- Pollard, T. D.
- Guertin, D. A., Trautmann, S., McCollum, D.
- Xu, X., Vogel, B. E. A secreted protein promotes cleavage furrow maturation during cytokinesis. Curr Biol. 21 (2), 114-119 (2011).
- Sagona, A. P., Stenmark, H.
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437 (7061), 1043-1047 (2005).
- Li, R. Cytokinesis in development and disease: variations on a common theme. Cell Mol Life Sci. 64 (23), 3044-3058 (2007).
- Daniels, M. J., Wang, Y., Lee, M., Venkitaraman, A. R. Abnormal cytokinesis in cells deficient in the breast cancer susceptibility protein BRCA2. Science. 306 (5697), 876-879 (2004).
- Storchova, Z., Pellman, D. From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (1), 45-54 (2004).
- Lee, I. J., Coffman, V. C., Wu, J. Q. Contractile-ring assembly in fission yeast cytokinesis: Recent advances and new perspectives. Cytoskeleton (Hoboken). 69 (10), 751-763 (2012).
- Balasubramanian, M. K., Bi, E., Glotzer, M. Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells. Curr Biol. 14 (18), R806-R818 (2004).
- Proctor, S. A., Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Contributions of turgor pressure, the contractile ring, and septum assembly to forces in cytokinesis in fission yeast. Curr Biol. 22 (17), 1601-1608 (2012).
- Munoz, J., et al. Extracellular cell wall beta(1,3)glucan is required to couple septation to actomyosin ring contraction. J Cell Biol. 203 (2), 265-282 (2013).
- Wang, N., Lee, I. J., Rask, G., Wu, J. Q. Roles of the TRAPP-II Complex and the Exocyst in Membrane Deposition during Fission Yeast Cytokinesis. PLoS Biol. 14 (4), e1002437 (2016).
- Liu, J., Wang, H., McCollum, D., Balasubramanian, M. K. Drc1p/Cps1p, a 1,3-beta-glucan synthase subunit, is essential for division septum assembly in Schizosaccharomyces pombe. Genetics. 153 (3), 1193-1203 (1999).
- Cortes, J. C., et al. The (1,3)beta-D-glucan synthase subunit Bgs1p is responsible for the fission yeast primary septum formation. Mol Microbiol. 65 (1), 201-217 (2007).
- Cortes, J. C., et al. Cooperation between Paxillin-like Protein Pxl1 and Glucan Synthase Bgs1 Is Essential for Actomyosin Ring Stability and Septum Formation in Fission Yeast. PLoS Genet. 11 (7), e1005358 (2015).
- Cortes, J. C., Ishiguro, J., Duran, A., Ribas, J. C. Localization of the (1,3)beta-D-glucan synthase catalytic subunit homologue Bgs1p/Cps1p from fission yeast suggests that it is involved in septation, polarized growth, mating, spore wall formation and spore germination. J Cell Sci. 115 (Pt 21), 4081-4096 (2002).
- Liu, J., Tang, X., Wang, H., Oliferenko, S., Balasubramanian, M. K. The localization of the integral membrane protein Cps1p to the cell division site is dependent on the actomyosin ring and the septation-inducing network in Schizosaccharomyces pombe. Mol Biol Cell. 13 (3), 989-1000 (2002).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15 (2), 838-850 (2004).
- Figard, L., Xu, H., Garcia, H. G., Golding, I., Sokac, A. M. The plasma membrane flattens out to fuel cell-surface growth during Drosophila cellularization. Dev Cell. 27 (6), 648-655 (2013).
- Wei, B., et al. Unique Spatiotemporal Activation Pattern of Cdc42 by Gef1 and Scd1 Promotes Different Events during Cytokinesis. Mol Biol Cell. , (2016).
- Nabeshima, K., et al. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9 (11), 3211-3225 (1998).
- Johnson, A. E., Gould, K. L. Dma1 ubiquitinates the SIN scaffold, Sid4, to impede the mitotic localization of Plo1 kinase. EMBO J. 30 (2), 341-354 (2011).
- Yonetani, A., Chang, F.
- Fission Yeast: A laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
- Hachet, O., Simanis, V. Mid1p/anillin and the septation initiation network orchestrate contractile ring assembly for cytokinesis. Genes Dev. 22 (22), 3205-3216 (2008).
- Zhou, Z., et al. The contractile ring coordinates curvature-dependent septum assembly during fission yeast cytokinesis. Mol Biol Cell. 26 (1), 78-90 (2015).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Huang, Y. S., Karashima, T., Yamamoto, M., Hamaguchi, H. O. Molecular-level investigation of the structure, transformation, and bioactivity of single living fission yeast cells by time- and space-resolved Raman spectroscopy. Biochemistry. 44 (30), 10009-10019 (2005).
- Huang, C. K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging. Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).
- Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe. Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).
