Abstract
Nøjagtig detektion og identifikation af lavfrekvente mutationer kan være problematisk ved vurderingen tilbageværende sygdom efter terapi, screening for nye resistens-mutationer under behandling, eller når patienter har få cirkulerende tumorceller. Vildtype blokering PCR efterfulgt af sekvensanalyse giver høj følsomhed, fleksibilitet og enkelhed som en metode til detektering af disse lavfrekvente mutationer. Ved tilsætning af en specialdesignet låst nukleinsyre oligonukleotid til en ny eller tidligere konstaterede konventionel PCR baseret sekventering assay kan opnås følsomheder på ca. 1 mutant allel i en baggrund af 1000 WT-alleler (1: 1.000). Sekventeringsreaktioner artefakter forbundet med deaminerings- arrangementer almindeligvis findes i formalinfikserede paraffinindlejrede væv kan delvis afhjælpes ved anvendelse af uracil-DNA-glycosylase under ekstraktionstrin. Den optimerede protokol her er specifik til påvisning af MyD88 mutation, men kan tjene som en skabelon til at designe nogetWTB-PCR analyse. Fordele ved WTB-PCR-assayet i forhold til andre almindeligt anvendte assays til påvisning af lavfrekvente mutationer, herunder allelspecifik PCR og kvantitativ realtids-PCR omfatter færre forekomster af falske positiver, større fleksibilitet og lette implementering, og evnen til at detektere både kendte og ukendte mutationer.
Introduction
Sanger-sekventering har traditionelt været guldstandarden inden for testning for både kendte og ukendte somatiske mutationer. En af begrænsningerne ved Sanger-sekventering er dens detektionsgrænse (~ 10 - 20% mutant allel i en baggrund af WT) 1. Dette niveau af følsomhed er uhensigtsmæssig til påvisning lavt niveau somatiske mutationer, som kan være til stede i prøver fra præmaligne væv eller patienter med få cirkulerende tumorceller, eller når knoglemarv (BM) er fragmentarisk. Dette gør det også vurdere residual sygdom efter terapi eller påvisning nye resistens-mutationer under behandling vanskeligt ved konventionel sekventering alene 2. Ved at erstatte konventionel PCR med låst nukleinsyre (LNA) -medieret vildtype blokerende PCR (WTB-PCR) i Sanger-sekventering, kan opnås følsomheden af op til 0,1% mutantallel i en baggrund af WT 2, 3, 4. IWTB-PCR, berigelse for mutantalleler opnås via tilsætning af en kort (~ 10-14 NT) blokering (LNA) oligonukleotid, der binder fortrinsvis til WT DNA derved forhindre amplifikation af WT DNA. Mutanten beriget WTB-PCR-produkt kan derefter sekventeret. Ved at blokere WT DNA stedet for at vælge for specifikke mutationer WTB-PCR tillader berigelse af både kendte og ukendte mutationer i ganske små cellefraktioner.
Flere metoder anvendes for tiden til påvisning af mutationer i små celler fraktioner. Dette omfatter allel-specifik PCR amplifikation-mutationssystemanalyse (ARMS), denaturerende højtryksvæskekromatografi (DHPLC), perler, emulsioner, amplifikation, og magnetics (strålede), elektrisk felt-inducerede frigivelse og måling (EFIRM), høj opløsning smeltepunkt og andre. De fleste af disse fremgangsmåder er begrænset af falske positive og evnen til kun at detektere en mutation at assayet var designet til 4 5, 6.
Her demonstrerer vi stigningen i følsomhed opnås ved WTB-PCR i screening for mutationer i den myeloide differentieringsfaktor 88-genet som beskrevet af Albitar et al. 3 MyD88 mutations er vigtige diagnostiske og prognostiske faktorer i Waldenströms makroglobulinæmi (WM), IgM monoklonal gammopati af ukendt betydning (IgM-MGUS), miltmarginalzonen lymfom (SMZL), og diffust storcellet B-celle lymfom (DLBCL). MyD88 mutationer findes i næsten alle tilfælde af WM og ca. 50% af patienter med Immunoglobulin M (IgM) -secreting MGUS. Contrastingly, er MyD88 mutationer findes i kun 0-6% af patienterne med SMZL og er fraværende i myelomatose 7, 8. Fordi overlappende morfologisk, immunfænotypisk, cytogenetiske og kliniske karakteristika mellem WM og SMZL eller IgM-myelomatose kan ofte komplicere differentierede diagnoser, kan tilstedeværelsen af en MyD88 mutation tjene som en nyttig identificere faktor 9. MyD88 mutationer er også blevet forbundet med større sygdomsbyrde hos patienter med DLBCL og dårlig samlet overlevelse efter terapi 7, 10. Desuden, fordi MyD88 mutationer hyppigere findes i aktiverede B-celle-lignende (ABC) DLBCL end kimcenter B-celle-lignende (GCB) DLBCL eller primær mediastinal B-celle lymfom (PMBL), kan MyD88 mutation status tjene som en surrogatmarkør for ABC undertype 11, 12.
Den detaljerede protokol billede her tjener som en skabelon, som kan udvikles nye assays eller de fleste eksisterende sekventeringsreaktioner assays kan let tilpasses nøjagtigt at detektere lavfrekvente mutationer i forskellige prøvetyper. Den fremgangsmåde kan også anvendes til overvågning og detektion af resistente mutationer, som kan udvikle sig i tumorer eller endda bakterier, der kan udvikle mens patienterne behandles med målrettet terapi eller antibiotika. Endvidere omhandler den og retsmidler mange af de spørgsmål, der er forbundet med mutation berigelse, især i formalin-fikseret paraffin-indstøbt (FFPE) væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Alle testning af humane prøver blev udført efter at have indhentet Institutional Review Board (IRB) godkendelse.
1. DNA Ekstraktion fra FFPE Tissue, perifert blod, og knoglemarvsaspirat
- Til knoglemarvstransplantation FFPE væv med DNA FFPE ekstraktionskit
- Begynde med FFPE væv fra ufarvede objektglas (5 - 10 sektioner ved 5 - 10 um tykkelse).
BEMÆRK: Hvis der begynder med væv spåner, bruge 3 - 6 sektioner ved 5 - 10 um tykkelse og spring til trin 1.1.6. - Placere objektglassene i et dias kurv og forberede fire vaske reservoirer (to for Xylen og to for 100% alkohol). Tilføj et minimalt volumen af 600 ml opløsning til hver kurv.
- Afparaffiniser objektglassene ved at gøre en 5 min xylen vask i den første bakke. Overfør objektglassene til anden xylen vask reservoir i yderligere 5 min.
- Efter afparaffinering vaskes objektglassene med 100% alkohol i 5 min. Overfør dias til den andenalkohol vask reservoir i yderligere 5 min.
- Tillad objektglassene tørre helt under en hætte før skrabning dem med et barberblad i et mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: Hvis en H & E slide med tumor anførte region er tilgængelig ved at justere de objektglas og skrabe kun tumor region. - Fortsæt med instruktioner fra producenten handout inkluderet i sættet.
- Begynde med FFPE væv fra ufarvede objektglas (5 - 10 sektioner ved 5 - 10 um tykkelse).
- For BM aspirat og perifert blod
- Uddrag i henhold til producentens anvisninger handout med disse specifikationer.
BEMÆRK: Der er mange kommercielt tilgængelige kits og fremgangsmåder til DNA-ekstraktion fra FFPE væv og celler. Praktisk, kan alle anvendes. Brug en metode, der er etableret i laboratoriet.- Anvende 200 pi perifert blod (PB) eller 100 pi BM + 100 pi PBS.
- Bruge 4 pi RNase A stamopløsning.
- Eluer med 100 pi elueringspuffer.
- Uddrag i henhold til producentens anvisninger handout med disse specifikationer.
- DNA Kvantificering
- Måle DNA-koncentrationer under anvendelse af et spektrofotometer sikrer en 260 nm / 280 nm forhold på ca. 1,8 (for rent DNA). Hvis forholdet er væsentligt lavere, kan det indikere tilstedeværelsen af protein, phenol, eller andre forureninger, som kan forstyrre efterfølgende anvendelser.
- Justere DNA-koncentrationer til ca. 50 - 100 ng / pl med passende elueringsbuffer.
2. Wild-Type Blokering PCR
- Primer design
- Design og opnå primere for gener af interesse ifølge tidligere beskrevne generelle retningslinjer for PCR-primer design 13. Omfatter M13-forward og reverse universelle sekventeringsprimere i PCR-primere.
BEMÆRK: MyD88 assay blev udviklet til at opformere exon 5 i MyD88 (G259 - N291) og 110 nukleotider beliggende i 5'intronisk region til dækning splejsningsstedet og en del af intron 4. forward og reverse primere blev udformet med en 5' -M13 sekvens (M13-forward: tgt aaa acg acg gcc agt; M13-revers: cag gaa aca gct atg acc) for at muliggøre annealing af komplementære sekventeringsprimere (se Materialer tabel).
- Design og opnå primere for gener af interesse ifølge tidligere beskrevne generelle retningslinjer for PCR-primer design 13. Omfatter M13-forward og reverse universelle sekventeringsprimere i PCR-primere.
- Locked Nucleic Acid Oligonucleotide Design
- Designe blokerende oligonucleotid til at være ca. 10 - 15 baser i længden og komplementære til WT skabelon, hvor der ønskes mutant berigelse.
BEMÆRK: En kortere oligo vil forbedre misforhold diskrimination. At opnå høj målspecificitet, er det vigtigt ikke at bruge for meget blokerende nukleotider da dette kan resultere i en meget "klistret" oligonukleotid. Indholdet og længden og blokerende nukleotid senest bør være optimere overensstemmelse med den specifikke nukleotid, som skal blokeres. Det er vigtigt at opnå en høj bindingsspecificitet uden at kompromittere sekundære struktur og risikere selvkomplementaritet. - Designe blokerende oligo at have en T m 10 - 15 ° C over forlængelsen Temperature under termocykling. Juster Tm ved at tilføje eller fjerne blokerende baser eller ved at substituere blokerende baser til DNA samtidig undgå lange strækninger (3 - 4 baser) på blokerende G eller C-baser.
- Naviger til oligo værktøjer hjemmeside (se tabel of Materials) og vælg "blokering Oligo Tm Prediction" værktøj.
- Indsæt sekvensen af WT skabelon, ønskes at blive blokeret i feltet "Oligo Sequence". Tilføj "+" foran baser for at indikere blocker baser.
- Vælg knappen "Beregn" for at bestemme den omtrentlige Tm af DNA-Blocker hybrid.
- Designe blokerende oligo at undgå sekundær strukturdannelse eller selv-dimerer.
- Naviger til oligo værktøjer hjemmeside (se tabel of Materials) og vælg "blokering Oligo Optimizer" værktøj.
- Indsæt sekvensen af WT skabelon, ønskes at blive blokeret ind i feltet. Tilføj "+" foran baser for at indikere at blokere baser.
- Vælg de to bokse til "Sekundær struktur" og "Self Only". Tryk på knappen Analyser for at gennemgå oligo for potentielt besværlige sekundære strukturer eller selvstændig dimerer.
BEMÆRK: scorer repræsenterer meget groft skøn over Tm af de sekundære strukturer og selv-dimerer. Lavere score er derfor optimal og kan opnås ved at begrænse blokker-blokker parring. Den blokerende oligonucleotid for MyD88 [MYD88blocker (TCAGA + AG + C + G + A + C + T + G + A + T + CC / invdT /)] blev designet til at dække aminosyrerne Q262-I266 og har en 3'-inverteret dT at inhibere både forlængelse med DNA-polymerase og nedbrydning ved 3'-exonuklease. Denne specifikke blokerende oligo er en 17-mer med 10 blokerende baser, der betegnes som "+ N". De resterende 7 baser er almindelige DNA nukleotider.
- Designe blokerende oligonucleotid til at være ca. 10 - 15 baser i længden og komplementære til WT skabelon, hvor der ønskes mutant berigelse.
- WTB-PCR opsætning og Termocykling
- Forbered en WTB-PCR Master mix (MMX) under anvendelse af 2,5 pi PCR reaktion buffer 10x vægt / 20 mM MgCl2, 250 pM dNTP'er, 0,2 uM fremadrettet og revers primer, 1,2 pM MYD88blocker, og DNAse, RNAse-fri, ultrarent H2O for at skabe en endelig opløsning volumen på 21.75 pi per reaktion.
BEMÆRK: Arbejde koncentrationer er ved den endelige reaktionsvolumen på 25 pi (efter tilsætning af DNA-template og polymerase). Konventionel PCR MMX fremstilles ved simpelthen at udelade tilsætningen af blocker. Alle protokoltrin forbliver identisk for både WTB og konventionel PCR. Dette kan anvendes i validering og bestemmelse berigelse opnås ved tilsætning af blocker.- Ved beregningen af MMX at forberede sørge for at tegne sig for 3 yderligere reaktioner (positive og negative kontroller, og en ikke-template-kontrol for at kontrollere for kontamination) og mindst 1 yderligere reaktion til pipetteringsfejl.
- Vortex MMX grundigt. Den MMX kan opbevares ved -80 ° C i op til ayøre.
- Tilføje 0.25 pi Taq DNA polymerase per reaktion på MMX og invertsukker at blande. Når polymerasen er blevet tilføjet til MMX, holde det på is.
- Sætte en ny 96-brønds PCR-plade på en kold plade og pipetten 22 pi MMX med polymerase til hver reaktion godt.
- Tilsæt 3 pi genomisk DNA (50 - 100 ng / pl til hver af brøndene indeholdende MMX med polymerase.
- Forsegle kortvarigt pladen og centrifuge for at sikre opløsningen når bunden af hver brønd.
- Indlæse PCR plade på en thermocycler.
- Indstil Termocyklusbetingelserne for WTB-PCR-reaktion som følger: indledende denaturering ved 95 ° C i 6 minutter; 40 cykler af denaturering ved 95 ° C i 30 s, primerannealing ved 56 ° C i 30 s og forlængelse ved 72 ° C i 1 min 20 s; endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 min.
BEMÆRK: Bedste praksis indebærer færdiggøre resten af protokollen i et fysisk adskilt område for at undgå amplikon forurening in fremtidige opsætninger.
- Indstil Termocyklusbetingelserne for WTB-PCR-reaktion som følger: indledende denaturering ved 95 ° C i 6 minutter; 40 cykler af denaturering ved 95 ° C i 30 s, primerannealing ved 56 ° C i 30 s og forlængelse ved 72 ° C i 1 min 20 s; endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 min.
- Forbered en WTB-PCR Master mix (MMX) under anvendelse af 2,5 pi PCR reaktion buffer 10x vægt / 20 mM MgCl2, 250 pM dNTP'er, 0,2 uM fremadrettet og revers primer, 1,2 pM MYD88blocker, og DNAse, RNAse-fri, ultrarent H2O for at skabe en endelig opløsning volumen på 21.75 pi per reaktion.
- Udføre gelelektroforese ifølge tidligere beskrevne protokoller 14 for at bestemme, om WTB-PCR var vellykket og til at bekræfte en manglende amplifikation i den ikke-template-kontrol.
- Oprensning af PCR-produktet ved magnetiske perler
- Fjerne magnetiske perler fra 4 ° C og bringe til stuetemperatur.
- Overfør 10 pi PCR-produkt til en ny PCR-plade.
- Vortex de magnetiske perler kraftigt til fuldt ud at resuspendere de magnetiske partikler.
- Tilføj 18 uL magnetiske perler til hver brønd på den nye plade. Pipette bland 10 gange.
- Inkubere ved stuetemperatur i 5 minutter.
- Placer PCR-plade på siden-skørt magnet plade i 2 minutter til separate perler fra opløsning.
- Aspirer supernatanten med en multikanalpipette, undgå perlen pellet.
- Dispensere 150 pi 70% ethanol til hver brønd og inkubere ved stuetemperatur for mindst 30 s. Aspirer ethanol med en multikanal pipette og kassér tip. Gentag denne vaskeprocedure en gang mere.
- Anvendelse af en 20 pi multikanalpipette aspirere den resterende ethanol fra hver brønd og kassere tips.
- Når brønde er tørre (~ 10 min), fjernes fra magnetpladen og tilsættes 40 pi nuclease frit vand til hver brønd og pipette mix 15 gange eller vortex forsigtigt.
- Inkubere ved stuetemperatur i 2 minutter.
- Placer PCR-plade på magnetpladen i 1 minut til separate perler fra opløsning.
- Overførsel 35 pi oprenset produkt til en ny PCR-plade. Dette er oprensede PCR produkt er nu klar til at fortsætte med tovejs sekventering eller kan opbevares ved -20 ° C indtil brug.
BEMÆRK: Når udviklingen af et nyt assay, kan være påkrævet kvantificering af oprenset PCR-produkt. 1 - 3 ud ng / uL amplikon DNA er optimalt for tovejs sekventering. Hvis koncentrationen er konstant lav, øge PCR-produktbånd og magnetiske perler proportionally (1: 1,8). Hvis koncentrationen er konstant høj, eluer med et større volumen af vand.
3. Sekventering af WTB-PCR Product
- Tovejs Sekventering
BEMÆRK: Følgende protokol er en modificeret form af fabrikantens anvisninger, der er blevet optimeret til at anvende færre reagenser.- Forberede frem og bak sekventeringsreaktion blander med 0,25 pi Ready Reaction mix, 1,88 pi Sequencing Buffer, 1,78 uM M13-F eller M13-R sekventeringsprimere og tilføje og DNAse, RNAse-fri, ultrarent H2O for at skabe en endelig opløsning volumen på 9 pi per reaktion. Denne sekventeringsreaktion mix kan opbevares ved -20 ° C i op til et år.
- Pipetter 9 pi den fremadgående sekventering reaktionsblandingen i hver brønd i en ny 96 brønds PCR-plade til den fremadgående sekventeringsreaktion. Gentag på en separat plade for den omvendte sekventeringsreaktion.
- Tilsæt 1 pi af det oprensede WTB-PCR-produkt to hver brønd på både fremad og bagud plader.
- Forsegle kortvarigt pladen og centrifuge for at sikre opløsningen når bunden af hver brønd.
- Indlæse PCR plade på en thermocycler.
- Indstil Termocyklusbetingelserne for sekventeringsreaktionen som følger: 96 ° C i 1 min; 30 cykler af 96 ° C i 10 s, 50 ° C i 5 s, 60 ° C i 4 minutter; hold ved 4 ° C indtil den er klar til oprensning.
- Rens Sekventeringsprodukterne
- Forberede en frisk 1:25 opløsning af 3 M natriumacetat (pH 5,2) og 100% ethanol.
- Forberede en frisk 70% ethanol-opløsning.
- Tilsæt 30 pi af natriumacetat / 100% ethanol til hver brønd af både den fremadrettede og bagudrettede sekventerings plader og pipette mix 5 gange.
- Genforsegle plade og inkuber i mørke ved stuetemperatur i 20 minutter.
- Centrifugeres pladen ved 2.250 xg i 15 minutter.
- Fjern pladeforsegleren og vend over en affaldbeholder.
BEMÆRK: Inverter kun én eller pillen kan løsne fra såvel bunde. - Placer den omvendte plade på en ren papirserviet og der centrifugeres ved 150 xg i 1 min.
- Tilsæt 150 pi 70% ethanol til hver brønd.
- Genforsegle pladen og centrifugering ved 2.250 xg i 5 min.
- Gentag trin 3.2.6 og 3.2.7.
- Hvis brøndene ikke er helt tørt, tillade dem at lufttørre ved stuetemperatur. Sørg for, at prøverne er beskyttet mod lys, mens tørring.
- Tilsæt 10 uL Formamid til hver brønd og pipette mix 10 gange. Genlukke pladen.
- Denaturer på thermocycler ved 95 ° C i 3 minutter efterfulgt af 4 ° C i 5 minutter.
- Efter denatureringen, udskifte pladeforsegleren med en septa og sekvens på sekventering platform ifølge producentens anvisninger 15.
4. Analyse af sekventeringsresultaterne
- Visualisere sekventeringsreaktioner spor ved anvendelse af en sekventering daten analysesoftware ifølge producentens anvisninger 16 og tilpasse til de respektive referencesekvenserne. Juster MyD88 til NCBI referencesekvens "NM_002468".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En begrebsmæssig oversigt over WTB-PCR under udstrækning er præsenteret i figur 1. Fordi et enkelt nukleotid mismatch i blokker-DNA hybrid spænder formindsker dets smeltetemperatur (ATm = 20 - 30 ° C), amplifikation af WT allel er blokeret mens mutant template DNA er fri til at fuldføre forlængelsen 17. På denne måde er mutant DNA amplificeret eksponentielt mens WT DNA amplificeres lineært.
En demonstration af mutanten berigelse opnås ved WTB-PCR er vist i figur 2. Genomisk DNA fra patienter med og uden mutationer blev testet ved både konventionel og WTB-PCR og derefter sekventeret for at demonstrere den typiske berigelse opnås ved WTB-PCR og mangel på falske positive i WT DNA. Arbejdsmiljøet koncentration af blokker anvendes i WTB-PCR MMX bør fastsættes af titreringsforsøg og should opnå det ønskede niveau af mutant berigelse mens ikke resulterer i falske positive eller blokere amplifikation af WT DNA helt. Sekvensanalyse af WTB-PCR-produkt viser berigelse for den mutante allel og en detektionsgrænse på over 0,5% mutant allel i en baggrund af WT sammenlignet med 16% i konventionel PCR 3.
Virkningerne af denne stigning i følsomhed i kliniske forsøg kan variere afhængigt af den relative mængde af neoplastiske celler i de testede prøver. I en metoder sammenligning undersøgelse har WTB-PCR analysen beskrevet her viste, at 64% af MyD88 mutationer ville blive savnet af konventionel testning af patienter med WM eller MGUS 3.
Et karakteristisk drop-off i signalintensitet (figur 3) ses ofte hvis en for høj koncentration af blokker anvendes, eller hvis post-PCR renstion undladt at fjerne blokker forud for tovejs sekventering. Sidstnævnte påvises når magnetiske perler oprensning er substitueret for enzymatisk oprensning. Selvom enzymatisk oprensning er en attraktiv mulighed, når der arbejdes med større prøveantal, det er uhensigtsmæssigt til anvendelse med WTB-PCR som det mislykkes at fjerne blocker fra opløsning inden sekventering.
Et eksempel på sekvens artefakter hyppigt findes i FFPE-afledte DNA som et resultat af cytosin deaminering (C: G> T: A) er vist i figur 4 3, 18, 19, 20. Selvom de faktiske årsager til cytosin deaminering forstås dårligt, vil enhver PCR-baseret assay, som beriger for mutantalleler detektere disse lavfrekvente artefakter 21, 22. Falske positiver på grund af deamelse er bedst undgås ved at starte med høj kvalitet skabelon materiale; i de mange tilfælde, hvor dette ikke er muligt, kan behandling med uracil-DNA-glycosylase (UDG) under ekstraktion hjælpe med at begrænse hyppigheden og intensiteten af deaminerings- artefakter. UDG behandling af FFPE væv under ekstraktion (som del af DNA FFPE kit) udskærer deamineres cytosinrester derved at forhindre kunstigt fremkaldt C: G> T: A-mutationer. Imidlertid 5-methylcytosin rester, der ofte forekommer ved CpG-dinukleotider deamineres til thymin, der ikke kan udskæres af UDG. De resulterende sekventerings artefakter er temmelig genkendelige og ofte vises som tandem mutationer, som det ses i figur 4. Hvis prøverne allerede er blevet udvundet, kan UDG behandling implementeres i en sekundær ekstraktion med relativt lav DNA tab.
Figur 1: Conceptual Oveig t af WTB-PCR. En enkelt nukleotid mismatch i Blocker-DNA hybrid formindsker T m med op til 30 ° C. Ved at udforme den blokerende oligonucleotid til at have en T m på 10 - 15 ° C over temperaturen under udstrækning, er amplifikation af WT DNA blokeret samtidig med at amplifikation af mutant-DNA. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Genomisk DNA fra patienter med og uden mutationer blev testet ved både konventionel og WTB-PCR og derefter sekventeret for at demonstrere den typiske berigelse opnås ved WTB-PCR. Slutkoncentrationen af blokker anvendes til at opnå WTB-PCR blev valgt for at opnå maksimal mutant berigelse uden at forårsage falske positiver i WT DNA eller blokering amplificaning WT DNA helt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Karakteristisk drop-off i signalintensitet ses, når enzymatisk PCR oprensning anvendes i stedet for magnetiske perler. Dette er sandsynligvis, fordi enzymatisk rensning ikke fjerner blokker forud for tovejs sekventering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: C: G> T: opstår en sekventeringsgel artefakter i FFPE væv, når cytosin eller methyleret cytosin deamineres via formalinfiksering til uracil eller thymin, hhv. Uracil-DNA-glycosylase (UDG) kan udskære uracil før WTB-PCR med til at mindske sekventeringsreaktioner artefakter. Dog thymin følge af deaminerede 5-methylcytosin, som ofte forekommer ved CpG-øer, ikke kan udskæres ved UDG. Reducere koncentrationen af blokker anvendes i WTB-PCR kan bidrage til at reducere forekomsten af sekventering af artefakter, som ikke afhjælpes ved UDG-behandling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den WTB-PCR analysen beskrevet her anvender en generisk sæt primere med en blokerende oligo designet til at blokere opformering af WT DNA under forlængelse (figur 1). Den WTB-PCR-produkt sekventeres derefter for mutationsanalyse. Anvendeligheden af WTB-PCR / Sanger ligger i dets enkelhed, høj følsomhed og høj kapacitet. Under anvendelse af de retningslinjer, der er beskrevet her, kan de fleste eksisterende Sanger baserede assays simpelthen ændres ved hjælp af tilsætning af et blokerende oligonucleotid i høj grad at øge følsomheden. I eksemplet assay præsenteres her tilsætning af en enkelt blokerende oligonucleotid til PCR øget detektionsgrænsen fra ca. 16% mutant allel i en baggrund af WT for traditionelle assay til> 0,5% i WTB-PCR-assayet 3. Hvis virkning er en reduktion i falske negative set i klinisk afprøvning 3 64%. Bekræfter tilstedeværelsen af mutationer i MyD88 har betydelig diagnostisk og prognostisk imploner; falsk anmeldelse af en sag som negativ kan få alvorlige konsekvenser for den samlede terapi og patientbehandling. Testning med WTB-PCR er derfor af stor betydning, især hos patienter med relativt lav unormal cellularitet.
WTB-PCR-teknikker varierer betydeligt og er undertiden benævnt flæng med LNA, BNA, eller PNA-medieret PCR-clamping eller PCR-clamp-probeassays 2, 4, 23, 24. Nogle variationer anvender WTB-PCR involverer en qPCR assay, som nødvendiggør designe en yderligere fluorescerende probe for hver specifik mutation. En væsentlig udfordring i forbindelse med denne teknik omfatter behovet for at udvikle kompetitivt bindende prober, der nøjagtigt diskriminerer mellem WT og mutante alleler. På grund af en mutation specifik probe er påkrævet, qPCR tilgang mangler evnen til at opdage ukendte mutations. En anden variation af WTB-PCR blokke WT amplifikation i en allel-specifik måde. Stedet for at bruge mutationsspecifikke primere imidlertid en blokerende probe specifik for WT allelen inhiberer fuldstændig primer binding. Selv om denne fremgangsmåde ikke kræver en mutation-specifik probe ligesom qPCR, den undlader at skelne mellem mutationer og polymerase inducerede fejl kan føre til øget falske positiver. Eksponentiel amplifikation af disse polymerase inducerede fejl gennem PCR kan tilsløre påvisning af sjældne mutationsbegivenheder. Enhver tilgang, der anvender PCR amplifikation for at berige for mutationer har sin nøjagtighed begrænset af hyppigheden af PCR-fejl 25, 26, 27. En grundlæggende fordel ved WTB-PCR / Sanger over mange andre højfølsomme metoder er, at det forhindrer amplifikation af både WT skabelon og mutant template hvis mutationer forekommer uden for genregion målrettet ved blokeringen oligonucleotide. Derfor er PCR-fejl indført ved polymeraser filtreres effektivt ud sammen med WT DNA. Modsætning til AS-PCR eller qPCR imidlertid berigelse opbevares til ukendte mutationer, der forekommer inden for regionen dækket af blokerende oligo. I tilfælde af MyD88, WTB-PCR tillod detektion af både L265P og R264 * mutationer 3. Andre har ligeledes rapporteret påvisningen af multiple, lavfrekvente mutationer med brug af WTB-PCR 4, 28. Dette gør WTB-PCR ideel til både forskning og kliniske formål.
Sammen med høj følsomhed og iboende interne kontroller for at eliminere falske positiver, WTB-PCR fleksibilitet til at tilpasse en eksisterende sekventering assay med meget få yderligere trin med blokker design gør det attraktiv mulighed for mange laboratorier med etablerede analyser. Det samme sæt af PCR-primere, der anvendes i en konventionel assay kan typisk anvendes i WTB-PCR variation. othendes protokolændringer der er stærkt anbefales til WTB-PCR-herunder UDG behandling af FFPE væv og passende post PCR oprensningsfremgangsmåder metoder-er lige overføres. Blokker design, derfor er det kritiske element i gennemførelsen af en WTB-PCR-assay. Selvom de retningslinjer, der præsenteres i denne protokol repræsenterer de mest relevante faktorer i, at design, bør forskellige blokerende oligonukleotider blive testet for at finde en, der blokerer WT forstærkning effektivt uden sekundære effekter til PCR. Dette omfatter at tilføje eller fjerne blocker baser til at justere Tm, flytte placeringen af det blokerende oligo forhold til WT skabelon, og ændre den samlede længde af oligo. bør også anvendes Blocker titreringsforsøg at skabe ligevægt mellem acceptable forekomster af sekventering af artefakter og detektionsgrænse.
Valg af en passende metode til påvisning af mutationer, der er til stede i ganske små cellefraktioner afhænger meget af the ansøgning og sygdom / mutation typer. Hvis der ønskes mutant kvantificering kan qPCR eller digital PCR tilbyde mere fordelagtige løsninger end WTB-PCR / Sanger. Selvom WTB-PCR er primært en kvalitativ analyse, er det muligt at bestemme et groft skøn af den mutante allel frekvens ved at teste en prøve med konventionelt og WTB-PCR parallelt. Fordi detektionsgrænsen for traditionelle assay er ~ 10 - 20% mutant allel i en baggrund af WT, er det rimeligt at konkludere, at mutationer detekteret af WTB-PCR-assay, men ikke den konventionelle er til stede i en koncentration på mindre end grænseværdien for påvisning for traditionelle assay. Få assays tilbyde den alsidighed, enkelhed og robusthed WTB-PCR. De lave omkostninger og kort ekspeditionstid gør den ideel til at vurdere residual sygdom efter terapi eller overvågning af nye resistente mutationer under behandlingen. Derudover evnen til at opdage ikke tidligere beskrevet mutationer gør WTB-PCR ideel til forskningsformål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05-402-25 | |
| 100% alcohol | VWR | 89370-084 | Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol |
| 3730XL sequencer | ABI | or equivalent | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | For magnetic bead PCR purification |
| Aluminum sealing foils | GeneMate | T-2451-1 | For PCR and cold storage |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit | Life Technologies | 4337455 | For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer |
| Centrifuge 5804 Series | Eppendorf | A-2-DWP rotor (for PCR plate) | |
| Cold plate for 96 well plates | Eppendorf | Z606634 | |
| DNAse, RNAse-free, ultra-pure water | |||
| dNTPs (100 mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
| DynaMag-96 Side-Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | For use in PCR Purification. |
| Ethanol Absolute | Sigma | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| Exiqon website Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
| FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL) | Roche | 12032937001 | With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2 |
| Gel electrophoresis apparatus | 2% agarose gel | ||
| GeneRead DNA FFPE extraction Kit | Qiagen | 180134 | Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts |
| Hi-Di Formamide | ABI | 4311320 | For sequencing. |
| LNA oligonucleotide | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases) |
| M13-F Sequencing Primer | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
| M13-R Sequencing Primer | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
| Mastercycler Pro S Thermocycler | Eppendorf | E950030020 | |
| Microcentrifuge Model 5430 | Eppendorf | FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes) | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| PCR forward primer | IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG | |
| PCR reverse primer | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
| PCR plates | GeneMate | T-3107-1 | |
| Pipettors | 20, 200, 1,000 µL | ||
| Plate septa, 96 well | ABI | 4315933 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | For BM aspirate and peripheral blood |
| SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | For sequencing analysis |
| Slide basket | |||
| Sodium Acetate (3 M, pH 5.2) | Sigma | S7899 | |
| Sterile filtered pipette tips | 20, 200, 1,000 µL | ||
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash reservoir | ~ 1,000 mL | ||
| Xylene | VWR | 89370-088 | Histology grade |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
- Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).
- Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).
- Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).
- Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15 (8), 420 (2014).
- Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).
- Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).
- Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).
- Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).
- Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).
- Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).
- Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).
- Applied Biosystems. User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).
- Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).
- Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).
- Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).
- Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).
- Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).
- Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).
- Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).
- Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).
- Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).
- Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).
- Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).
- Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126 (23), 716 (2015).
