Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Yabani tip PCR Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonlar Tespiti için oldukça hassas bir yöntem olarak doğrudan bölme imkanı Kombine Engelleme

doi: 10.3791/55130 Published: March 29, 2017

Abstract

Hassas algılama ve düşük frekanslı mutasyon tanımlama tedavisi sırasında direnç mutasyonları ortaya için tarama, tedavi sonrasında kalan hastalık değerlendirilirken sorunlu olabilir, ya da hastaların birkaç dolaşımdaki tümör hücrelerinin olduğunda. dizi analizi, ardından PCR bloke Yabani tip, bu düşük frekans mutasyonları tespit etmek için bir yöntem olarak, yüksek hassasiyet, esneklik ve kolaylık sunar. tespit edilmiş bir yeni veya daha önce geleneksel PCR bazlı sıralama deneyi için nükleik asit oligonükleotid kilitli özel tasarlanmış ekleyerek, 1000 WT alel kökenli, yaklaşık 1 mutant allelin duyarlılıkları (: 1000 1) elde edilebilir. deaminasyon olaylarla ilişkili Ardışık eserler yaygın kısmen ekstraksiyon adımları sırasında urasil DNA glikosilaz kullanımı ile giderilebilir formalinde tespit edilmiş parafine gömülmüş dokularda bulunan. Optimize edilmiş protokol burada MyD88 mutasyonu tespit etmek için özeldir, ancak herhangi tasarlamak için bir şablon olarak hizmet verebilirWTB-PCR deneyi. PCR, gerçek zamanlı kantitatif PCR yanlış pozitiflerin az oluşumları, daha büyük esneklik ve uygulama kolaylığı, özel allel de dahil olmak üzere düşük frekanslı mutasyonların saptanması için yaygın olarak kullanılan deneylerde fazla WTB-PCR yöntemi avantajları, ve her ikisi de bilinen tespit yeteneği ve bilinmeyen mutasyonlar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sanger sıralama geleneksel olarak bilinen ve bilinmeyen somatik mutasyonları için test altın standart olmuştur. Sanger sekanslama sınırlamaların bir algılama onun sınırı (~ 10 - WT bir arka içinde% 20, mutant alel) 1. hassasiyet düzeyi, birkaç dolaşımdaki tümör hücreleri veya kemik iliği (BM) düzensiz olduğu zaman ile premalign dokular ya da hastalardan alınan örneklerde bulunabilen düşük seviyede somatik mutasyonları tespit etmek için uygun değildir. Bu aynı zamanda, tedavi sonrası kalan hastalık teşhisinde ya da tek başına, 2, geleneksel dizileme ile zor tedavi sırasında gelişen direnç mutasyonları tespit yapar. Kilitli nükleik asit (LNA) geleneksel PCR değiştirerek Sanger dizileme PCR'yi (WTB-PCR) ile bloke vahşi tip aracılı, WT bir arka planda% 0.1 mutant allelin hassasiyetleri 2, 3, 4 elde edilebilir. İçindeWT DNA WT DNA, bir avantaj olarak amplifikasyonuna tercihli olarak bağlanan - (14 NT ~ 10) bloke edilmesi (LNA) oligonükleotid WTB-PCR, mutant alelleri için zenginleştirme kısa eklenmesi ile elde edilir. Mutant zenginleştirilmiş WTB-PCR ürünü daha sonra sıralanabilir. WT DNA engelleme yerine belirli mutasyonların seçilerek WTB-PCR, dakikada hücre fraksiyonlarında mevcut bilinen ve bilinmeyen mutasyonlar zenginleştirilmesi için izin verir.

Çeşitli yöntemler halen küçük hücre fraksiyonlarında mutasyonları tespit etmek için kullanılır. Bu, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (DHPLC), taneler, emülsiyonlar, amplifikasyon ve manyetizma (ışık saçan), elektrik alan ile indüklenen serbest bırakılması ve ölçüm (EFIRM) denatüre allel spesifik PCR amplifikasyon refraktör mutasyon sistem (ARMS), yüksek çözünürlük içerir erime noktası ve diğerleri. Bununla birlikte, bu yöntemlerin çoğu yanlış pozitiflerin ve sadece deney 4 için tasarlanmış bir mutasyon tespit etme yeteneğine sınırlıdır 6, amplikon bazlı NGS 5 için bir problem teşkil edebilir.

Burada Albitar ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi miyeloid farklılaşma faktörü 88 geninde mutasyon taranmasında WTB-PCR ile elde edilen duyarlılık artışı göstermektedir. 3 MyD88 mutations Waldenstrom Makroglobulinemı (WM) bilinmeyen önemi (IgM-MGUS'u) arasında, IgM monoklonal gammapati, dalak marjinal zon lenfoma (SMZL) önemli tanısal ve prognostik faktörlerdir ve büyük B hücreli lenfoma (DBBHL) dağınık. MyD88 mutasyonları WM hemen hemen tüm vakalarda ve İmmünoglobulin M (IgM) MGUS salgılayan olan hastaların yaklaşık% 50'sinde bulunur. Çelişkili, MyD88 mutasyonlar SMZL hastaların sadece% 0-6 bulunan ve çok merkezli miyelom 7, 8 mevcut olmayan. Üst üste binen morfolojik, immünofenotipik sitogenetik ve WM ve SMZL ya da çoğu zaman diferansiyel teşhisleri karmaşık IgM, multipl miyelom ile klinik özellikleri nedeniyle, bir MyD88 mutasyonun varlığı faydalı bir tanımlama faktör 9 olarak hizmet edebilir. MyD88 mutasyonlar, tedavi 7 Aşağıdaki DLBCL ve kötü genel sağkalımla hastalarda daha fazla hastalık yükü ile ilişkilidir 10. Ayrıca, MyD88 mutasyonları daha sık aktive B hücreli benzeri (ABC) DBBHL bulunur çünkü B-hücresi benzeri (GCB) DBBHL veya primer mediastinal B hücreli lenfoma (PMBL), MyD88 mutasyon durumu olarak hizmet edebilir germinal merkez ABC alt tipi 11, 12, surrogate markın.

burada sağlanan detaylı bir protokol, yeni analizler geliştirilebilir ya da Varolan dizilim deneyleri kolayca doğru çeşitli örnek tipler, düşük frekanslı mutasyonları tespit etmek için adapte edilebilir bir şablon olarak hizmet vermektedir. yaklaşım izleme ve tümör veya hasta hedefli bir tedavi ya da antibiyotikler ile tedavi ediliyor ise gelişebilir bakterilerde bile gelişebilir dirençli mutasyonları tespit etmek için kullanılabilmektedir. Ayrıca, adresleri ve özellikle formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) dokusu içinde, mutasyon zenginleştirme ile ilişkili sorunların çoğu ilaçlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etik Beyanı: İnsan numunelerinin tamamı test Kurumsal İnceleme Kurulu (KİK) onayı alındıktan sonra yapıldı.

1. FFPE Doku DNA ekstraksiyonu, Periferal Kan ve Kemik İliği aspire

  1. DNA, FFPE ekstraksiyon kiti ile kemik iliği FFPE dokusu için
    1. boyanmamış Slaytlardan FFPE doku ile başlayın (5-5, 10 bölümleri - 10 um kalınlıkta).
      Not: Doku talaşı ile başlangıç, 3 kullanıldığında - 5 6 bölümleri - 10 um kalınlıkta ve 1.1.6 adıma geçin.
    2. slayt sepet içinde kayarak ve dört yıkama hazneleri (Ksilen için iki ve% 100 Alkol için iki adet) hazırlanması. Her bir sepetin çözelti 600 mL minimum hacim.
    3. ilk tepsiye 5 dakika ksilen yıkama yaparak slaytlar deparafınize. ilave bir 5 dakika boyunca ikinci bir ksilen yıkama haznesine slaytlar aktarın.
    4. Parafinden arındırmadan sonra, 5 dakika% 100 alkol ile slaytlar yıkayın. ikinci slaytlar aktarınilave bir 5 dakika daha alkol yıkama haznesi.
    5. slaytları mikrosantrifüj tüpe bir jilet ile bunları kazıma önce başlık altında tamamen kurumaya bırakın.
      NOT: Tümör bölgesi ile bir H & E slayt gösterdiyseniz kullanılabilir, slaytlar hizalamak ve sadece tümör bölgesini kazıyın.
    6. Set içinde yer alan üretici sadaka gelen talimatlarla devam edin.
  2. BM aspire ve Periferik Kan için
    1. Bu özellikleri ile üreticinin talimatları sadaka göre Özü.
      NOT: çok sayıda ticari olarak temin edilebilir kitler ve FFPE doku ve hücrelerin DNA ekstraksiyonu için yöntemler bulunmaktadır. Pratik olarak, tüm kullanılabilir. Laboratuvarda kurulan bir yöntemi kullanın.
      1. 200 uL periferal kan (PB) ya da 100 uL BM + 100 uL PBS kullanın.
      2. 4 mL RNaz A stok solüsyonu kullanın.
      3. 100 uL yıkama tamponu ile seyreltilir.
  3. DNA miktar
    1. (Saf DNA için) yaklaşık 1.8'lik bir 260 nm / 280 nm oranı sağlayan bir spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonları ölçülür. oranı tercihan daha düşük ise, bu, bir sonraki uygulamada engel olabilir protein, fenol veya başka kirleticilerin varlığına işaret edebilir.
    2. uygun bir yıkama tampon maddesi ile 100 ng / uL - yaklaşık 50 DNA konsantrasyonları ayarlayın.

PCR Engelleme 2. Vahşi Tür

  1. Astar Tasarım
    1. Daha önce göre ilgili genler için tasarım ve elde primerler PCR primeri dizayn 13 genel yönergelere tarif. M13-ileri ve PCR primerleri evrensel geri sekanslama primerleri.
      Not: MyD88 deney MyD88 ekson 5 amplifiye etmek için geliştirilmiştir (G259 - N291) 5' bulunur ve 110 nükleotit primerleri intron 4. ileri bir birleşme bölgesini ve bir kısmını kapsar ve ters intronik bölge bir 5' ile tasarlanmıştır -M13 dizisi (M13-ileri: tgt aaa ACG gcc agt; M13-ters: cag gaa aca GCT ATG ACC) (Malzeme Tablo) tamamlayıcı sıralama primerleri tavlanmasına olanak sağlamak için.
  2. Kilitli Nükleik Asit Oligonükleotid Tasarımı
    1. Mutant zenginleştirme istenen WT şablonuna 15 baz uzunluğundadır ve tamamlayıcı - yaklaşık 10 olmak bloke oligonükleotid tasarımı.
      NOT: Daha kısa bir oligo uyuşmazlığı ayrımcılık artıracaktır. yüksek hedef özgüllüğü elde etmek için, bu çok "yapışkan" oligonükleotid neden olabilir çünkü çok fazla engelleme nükleotidleri kullanmak önemlidir. içeriği ve uzunluk ve engelleme nükleotid bloke edilmesi gereken spesifik nükleotid zincirleri göre optimize edilmesi gerekir. Ikincil yapı ödün ve kendiliğinden tamamlayıcı riski olmaksızın yüksek bağlanma özgüllüğü elde etmek için önemlidir.
    2. Uzatma sıcaklığında bir 15 ° C'nin üzerinde - bir T, 10 için bloke oligo tasarımısı banyosunun sırasında ure. G veya C bazları bloke - (4 bazlar 3) ilave ya da bloke edici bazlar kaldırarak ya da uzun menziller kaçınarak DNA engelleme bazları ikame etmek suretiyle, T m ayarlayın.
      1. Oligo araçları web sitesine gidin (Materyallerin Tablo bakınız) ve "Oligo Tm Tahmin engelleme" aracını seçin.
      2. "Oligo Dizi" kutusuna bloke edilmesi istenen WT, şablon diziyi yapıştırın. bloker üsleri belirtmek için üsleri önünde "+" ekleyin.
      3. DNA Engelleyici melez yaklaşık Tm belirlemek için "hesaplama" düğmesine basın.
    3. İkincil yapı oluşumunu veya kendinden dimerleri önlemek için bloke oligo tasarlayın.
      1. Oligo araçları web sitesine gidin (Materyallerin Tablo bakınız) ve "Oligo Optimizer engelleme" aracını seçin.
      2. kutu içine bloke edilmesi istenen WT, şablon diziyi yapıştırma. üsleri engelleme belirtmek için üsleri önünde "+" ekleyin.
      3. "İkincil Yapısı" ve "Sadece Kendini" için iki kutularını seçin. Potansiyel sorunlu ikincil yapıların veya kendi dimerleri gibi oligo gözden için analiz düğmesine basın.
        NOT: skorları Tm 'ın ikincil yapılar ve kendini dimerlerın çok kaba tahminler temsil eder. Alt skorlar, uygun olan ve engelleyici bloker eşleştirme ile sınırlandırılmasıyla elde edilebilir. amino asitler, Q262-I266 kapsayacak şekilde tasarlanmıştır ve özellikleri bir 3'-ters MyD88 [(TCAGA + AG + C + G + A + C, T + G + A + T + CC / invdT / +) MYD88blocker] engelleme oligonükleotit dT 3'-ekzonükleaz ile DNA polimeraz ve bozulma ile, her iki uzatma inhibe ettikleri gösterilmiştir. Bu özel bloke oligo "+ N" olarak belirtilir 10 bloke bazlarla bir 17 mer olan. Kalan 7 baz sıradan DNA nükleotidlerdir.
  3. WTB-PCR, kurulum ve Termodongü
    1. Bir WTB-PCR master mil hazırlanmasıx / 20 mM w MgCl2, 250 uM dNTP'ler, 0.2 uM ileri 2.5 pL PCR reaksiyon tamponu 10x kullanılarak (MMX) ve ters primer, 1.2 uM MYD88blocker ve DNAse, RNAse içermeyen, ultra saf H2O nihai oluşturmak reaksiyon başına 21.75 uL çözelti hacmi.
      NOT: Çalışma konsantrasyonları (DNA şablonu ve polimeraz ilavesinden sonra), 25 uL nihai reaksiyon hacminde içindir. Geleneksel PCR MMX sadece engelleyicinin ilave atlanması ile hazırlanır. Tüm protokol safhaları WTB ve geleneksel PCR için birbirinin aynısıdır kalır. Bu doğrulama kullanılabilir ve belirleyici zenginleştirme engelleyicinin ilave edilmesiyle elde.
      1. MMX'in miktarı hesaplanırken (kontaminasyonunu kontrol etmek üzere, pozitif ve negatif kontrol ve bir şablon olmayan kontrol) ve pipetleme hata için en az 1 ilave reaksiyon 3 ek reaksiyonlar için hesap emin hazırlamak.
    2. İyice Girdap MMX. MMX AY kadar -80 ° C'de muhafaza edilebilirkulak.
    3. MMX'in tepki 0.25 uL Taq DNA polimeraz ilave et ve karıştır için ters. polimeraz MMX eklendikten sonra, buz üzerinde tutun.
    4. her bir reaksiyon için polimeraz ile soğuk plaka ve pipet ile MMX'in 22 uL, yeni bir 96 gözlü PCR plaka koyun.
    5. polimeraz ile MMX ihtiva eden yuvaların her birine 100 ng / ml - 3 uL genomik DNA (50 ekleyin.
    6. Çözelti her bir alt ulaşmasını sağlamak için levha ve kısa bir süre santrifüj kapatın.
    7. Bir ısıl üzerinde PCR plakası yükleyin.
      1. aşağıdaki gibi WTB-PCR reaksiyonu için ısı döngüsü şartları ayarlama: ilk denatürasyon 6 dakika boyunca 95 ° C'de; 1 dakika 20 saniye boyunca 72 ° C sıcaklıkta 30 saniye boyunca 56 ° C'de 30 saniye, primer tavlama için 95 ° C 'de denatürasyon, ve uzantının 40 döngü; 10 dakika boyunca 72 ° C'de son uzatma.
        NOT: En iyi uygulama amplikon kirlenmesini önlemek için fiziksel olarak ayrı bir alanda protokol kalanını tamamlama içerir in gelecekteki kurulumları.
  4. WTB-PCR reaksiyonunun başarılı olup olmadığını belirlemek için ve şablon olmayan kontrol amplifikasyonunun bir eksikliği teyit edebilmek için, daha önce tarif edilen protokollere 14'e göre jel elektroforezi gerçekleştirin.
  5. manyetik boncuklar ile PCR Ürünü saflaştırılması
    1. 4 ° C ila manyetik boncuk çıkarın ve oda sıcaklığına getirin.
    2. yeni bir PCR plakaya 10 uL PCR ürünü aktarın.
    3. Vorteks manyetik boncuklar kuvvetli bir şekilde tam olarak, manyetik tanecikleri yeniden sübyeleştirmek için.
    4. Yeni plaka üzerinde her kuyuya 18 ul manyetik boncuk ekleyin. Pipet 10 kez karıştırın.
    5. 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
    6. çözeltiden ayrı boncuklara 2 dakika boyunca yan etekli mıknatıs plakası üzerine, PCR plaka koyun.
    7. Boncuk pelet kaçınarak, çok kanallı bir pipet ile süpernatant aspire.
    8. her birine 150 uL% 70 etanol de koyun ve oda sıcaklığında fo inkübeen az 30 s r. Bir çok kanallı pipet ile etanol aspire ve ipuçları atın. bir kez daha bu yıkama işlemi tekrarlayın.
    9. Bir 20 uL çok kanallı pipet her bir kalan etanol aspire ipuçları atmak kullanılması.
    10. kuyular (~ 10 dakika), kuru, 15 kez veya girdap Mıknatıs plakasından çıkarın ve her bir oyuğa ve pipet karışımına 40 uL nükleaz serbest su ekleyin.
    11. 2 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
    12. çözeltiden ayrı boncuklara 1 dakika için mıknatıs plakası üzerine, PCR plaka koyun.
    13. yeni bir PCR plakaya saflaştırılmış ürün devri 35 uL. Bu saflaştırılmış PCR ürünü, artık çift yönlü serisi için kullanılmak üzere hazır olduğunu veya ihtiyaç duyulana kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
      Not: yeni tahlil geliştirme, saflaştırılmış PCR ürünü ölçümü gerekebilir. 1-3 ng / uL amplikon DNA çift yönlü sıralama için en uygunudur. konsantrasyonu sürekli olarak düşükse, PCR ürünü ve manyetik boncuk artırmak orantonally (1: 1.8). konsantrasyonu sürekli olarak yüksek ise, daha büyük bir su hacmi ile elüt.

WTB-PCR Ürünü 3. Sekans

  1. Çift Yönlü Sıralama
    NOT: Aşağıdaki protokol az reaktif kullanacak şekilde optimize edilmiştir üreticinin talimatlarına değiştirilmiş şeklidir.
    1. İleri hazırlanması ve geri sekanslama reaksiyonu son bir çözelti oluşturmak için ekleme ve DNAse, RNAse içermeyen, ultra saf H2O 0.25 uL Hazır Reaksiyon karışımı, 1.88 uL Dizileme Tamponu, 1.78 uM M13-F ya da M13-R sıralama primerleri ile karışır reaksiyon başına 9 uL hacmi. Bu dizileme, reaksiyon karışımı, bir yıla kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
    2. İleri dizileme reaksiyonu için yeni bir 96 gözlü PCR plakanın her oyuğuna ileri dizilenmesi tepkime karışımı pipet 9 uL. Ters dizileme reaksiyonu için ayrı bir plak üzerinde tekrarlayın.
    3. Saflaştırılmış WTB-PCR ürünü, t 1 uL ekleyino her bir öne ve plakalar ters hem.
    4. Çözelti her bir alt ulaşmasını sağlamak için levha ve kısa bir süre santrifüj kapatın.
    5. Bir ısıl üzerinde PCR plakası yükleyin.
      1. aşağıdaki gibi sıralama reaksiyonu için ısı döngüsü şartları ayarlama: 1 dakika için 96 ° C; 10 sn için 96 ° C 30 döngü, 5 s için 50 ° C, 4 dakika için 60 ° C; saflaştırma için hazır olana kadar 4 ° C'de tutun.
  2. Sıralama Ürünleri arındırın
    1. 3 M sodyum asetat (pH 5.2) ve% 100 etanol içinde taze 01:25 çözelti hazırlayın.
    2. taze% 70 etanol çözeltisi hazırlayın.
    3. sodyum asetat, 30 uL dizileme plakaları ve pipet karışımı 5 kat hem ileri ve geri her oyuğuna /% 100 etanol çözeltisi ekleyin.
    4. plaka şekilde kapatılıp ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edilir.
    5. 15 dakika boyunca 2,250 x g'de plaka santrifüjleyin.
    6. Plaka kapatıcıyı çıkarın ve atık üzerinde tersbir kap.
      NOT: İnvert sadece bir veya pelet kuyu diplerinde gelen gevşeyebilir.
    7. 1 dakika boyunca 150 x g'de temiz bir kağıt havlu ve santrifüj ile, ters çevrilmiş plakanın yerleştirin.
    8. Her bir oyuğa 150 uL% 70 etanol ekleme.
    9. 5 dakika boyunca 2.250 x g'de plaka ve spin yeniden mühürlemek.
    10. Tekrarlayın 3.2.6 ve 3.2.7 adımları tekrarlayın.
    11. oyuklar tamamen kuru değilse, oda sıcaklığı hava kurumalarına olanak. Kurutma sırasında numuneler ışıktan korumalı olduğundan emin olun.
    12. Her kuyu ve pipet karışımına 10 kez 10 mcL Formamid ekleyin. plaka kapatın.
    13. 5 dakika boyunca 4 ° C'de, ardından 3 dakika süre ile, 95 ° C'de ısıl ile denatüre.
    14. Denatüre sonra imalatçının talimatlarına 15'e göre sıralama platform üzerinde bölmelerden ve dizisi ile Plaka kapatıcıyı değiştirin.

Ardışık Sonuçlar 4. analizi

  1. Bir dizileme dat kullanılarak dizileme izleri Görselleştirinimalatçının talimatlarına 16 ve ilgili referans dizileri hizalamak için uygun bir analiz yazılımı. NCBI referans bir dizi "NM_002468" için MyD88 hizalayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Uzantısı boyunca WTB-PCR kavramsal bir genel görünüşü Şekil 1'de gösterilmiştir. Bloker-DNA melezi tek nükleotid uyumsuzluğu büyük ölçüde erime sıcaklığını düşürür çünkü (AT m = 20-30 ° C), WT alel amplifikasyon mutan DNA şablonu uzantısı 17 tamamlamak için serbesttir ki bu engellenir. WT DNA, lineer yükseltilir ise, bu şekilde, mutan DNA katlanarak yükseltilir.

WTB-PCR ile elde edilen mutant zenginleşme bir gösteri Şekil 2 'de gösterilmektedir. ve mutasyon olmayan hastalardan alınan genomik DNA ile test edilmiştir hem geleneksel hem de WTB-PCR ve WTB-PCR ile elde edilebilen tipik bir zenginleştirme ve WT DNA yanlış pozitif bir eksikliği göstermek için dizilenmiştir. WTB-PCR, MMX'li kullanılan engelleyicinin çalışma konsantrasyonu titrasyon deneyleri ve s belirlenmelidiryanlış pozitif sonuçlanan ya da tamamen WT DNA'nın amplifikasyonunu engelleyen değil ise hould mutant zenginleşme arzu edilen düzeyinin elde. WTB-PCR ürünü dizi analizi, mutant alel için zenginleştirme ve geleneksel PCR 3% 16 ile karşılaştırıldığında, WT bir arka içinde% 0.5 mutant allelin fazla tespit sınırı göstermektedir.

klinik olarak test duyarlılığında bu artışın etkisi test edilen numunelerde bulunan neoplastik hücrelerin nispi miktarına bağlı olarak değişkenlik gösterebilir. Bir yöntem karşılaştırması çalışmada, burada tarif edilen WTB-PCR deneyi MyD88 mutasyonların% 64 WM veya MGUS'u 3 hastaların geleneksel testlerle cevapsız olacağını göstermiştir.

PCR sonrası purifica halinde engelleyicinin çok yüksek bir konsantrasyon kullanılmıştır ya da sinyal yoğunluğu (Şekil 3) karakteristik bir ayrılma sık görülmektedirsiyon iki yönlü sıralama öncesinde engelleyici kaldırmak için başarısız oldu. manyetik boncuk arındırma enzimatik saflaştırma için ikame edildiğinde ikinci gösterilmiştir. Enzimatik saflaştırma büyük örnek numaraları ile çalışan bir çekici bir seçenek olmakla birlikte bu çözeltiden önce sekanslamaya engelleyici kaldırma başarısız olarak, bu WTB-PCR ile uygulama için uygun değildir.

Dizisi eserler bir örnek çoğunlukla sitosin deaminasyon sonucu FFPE türetilmiş DNA bulunan (C: G> T: A), Şekil 4 3, 18, 19, 20 olarak sunulmuştur. Sitosin deaminasyon gerçek nedenleri tam olarak anlaşılamamıştır rağmen, mutant alelleri için zenginleştiren bir PCR bazlı deney, bu düşük frekans eserler 21, 22 tespit eder. nedeniyle dea için Yanlış pozitifermesi, en kaliteli model materyal ile başlatarak kaçınılır; Eğer bu mümkün değildir, birçok durumda, ekstre etme esnasında urasil DNA glikosilaz (Yeraltı) ile işlem deaminasyon eserler sıklığını ve şiddetini sınırlamada yardımcı olabilir. (DNA, FFPE kitinin bir parçası olarak) ekstraksiyon sırasında FFPE doku Yeraltı tedavi excises böylece yapay olarak başlatılan bir C önlenmesi sitosin kalıntıları deamine G> T: bir mutasyon. Ancak, sıkça CpG dinükleotidleri meydana 5-metilsitozin artıkları UDG suretiyle kesilerek edilemez timin, deamine edilir. Elde edilen dizilim eserler oldukça tanınabilir ve Şekil 4'te görüldüğü gibi, genellikle ikili mutasyon olarak görünür. Örnekler daha önce ekstre edilmiş ise, Yeraltı işlem oldukça düşük bir DNA kaybı ile ikinci bir öz olarak uygulanabilir.

Şekil 1
Şekil 1: Kavramsal OveWTB-PCR rView. Engelleyici-DNA'ya bir tek nükleotid uyumsuzluğu kadar 30 ° C ile Tm azaltır. Bloke edici oligonükleotit tasarımı 10 bir Tm'ye sahip olarak - uzama esnasında sıcaklık 15 ° C'nin üzerinde mutant DNA amplifikasyon izin verirken, WT DNA amplifikasyonu engellenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: ve mutasyon olmayan hastalardan gelen genomik DNA ile test edilmiştir hem geleneksel hem de WTB-PCR ve WTB-PCR ile elde edilebilen tipik bir zenginleştirme göstermek için dizilenmiştir. WTB-PCR elde etmek için kullanılan blokerinin nihai konsantrasyon WT DNA yanlış pozitif neden olan veya amplifica engellemediğini, maksimum mutant zenginleştirme elde etmek için seçildiTamamen WT DNA tion. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: Enzimatik PCR saflaştırma yerine, manyetik boncuk kullanıldığında sinyal yoğunluğundaki karakteristik bırakma görülmektedir. Enzimatik arıtma iki yönlü sekanslama önce engelleyici kaldırma başarısız olduğundan, bu muhtemeldir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4: C: G> T: Bir sıralama eserler FFPE dokusunda da ortaya çıkabilir sitozin veya metillenmiş sitozin deamine edilir hacsırasıyla urasil veya timin, ia formalin sabitleme. Urasil DNA glikosilaz (Yeraltı) dizileme yapaylıkları azaltmak için yardımcı olacak şekilde önceki WTB-PCR'ye urasil tüketim olabilir. Ancak, sıkça CpG adalarının gerçekleşir deaminlenmiş 5-metil kaynaklanan timin, UDG suretiyle kesilerek edilemez. WTB-PCR kullanılan engelleyicinin konsantrasyonu azalan Yeraltı işlenerek giderilmemesi dizileme eserler oluşumunu azaltmaya yardımcı olabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada tarif edilen WTB-PCR deneyi uzatma (Şekil 1) sırasında WT DNA'nın amplifikasyonunu engellemek üzere tasarlanmış bir bloke etme oligo primerler genel bir kümesini kullanır. WTB-PCR ürünü daha sonra mutasyon analizi için sekanslanır. WTB-PCR / Sanger yardımcı sadeliği, yüksek hassasiyet ve yüksek verimli olarak bulunur. Burada tarif edilen kurallara kullanılarak, çoğu mevcut Sanger bazlı deneyler sadece büyük ölçüde hassasiyeti artırmak için bir bloke edici oligonükleotidin ilavesi ile değiştirilebilir. Burada sunulan örnek deneyinde PCR için tek engelleme oligonükleotid eklenmesi WTB-PCR deneyinde, 3>% 0.5, geleneksel tahlil için WT bir arka yaklaşık% 16, mutant alel ile ilgili saptama limitini artmıştır. Bunun etkisi, klinik testlerde 3'te görüldüğü yanlış negatif bir% 64 azalmasıdır. MyD88 mutasyonların varlığını teyit önemli tanısal ve prognostik impl vardırications; yanlış genel tedavisi ve hasta yönetimi konusunda ciddi sonuçlara yol açabilir negatif olarak olgusunu. WTB-PCR ile test özellikle nispeten düşük bir anormal hücresellik olan hastalarda, bu nedenle büyük bir önem taşımaktadır.

WTB-PCR teknikleri önemli ölçüde değişebilir ve bazen LNA, BNA, ya da PNA-aracılı PCR sıkıştırma ya da PCR-kelepçe prob deneyleri 2, 4, 23, 24, birbirinin adlandırılır. WTB-PCR kullanılarak bazı varyasyonlar her özel mutasyon için ek bir flüoresan sonda ile tasarlanması zorunlu kılmaktadır bir qPCR deneyi içerir. Bu teknikle ile ortaya çıkan önemli bir meydan okuma doğru WT ve mutant alleller arasındaki ayrım rekabetçi bağlayıcı problar geliştirme ihtiyacını içerir. Bir mutasyon spesifik prob gereklidir çünkü Dahası, qPCR yaklaşımı bilinmeyen mutatio algılamak yeteneğinden mahrumns. bir allel-spesifik bir şekilde WTB PCR blok WT amplifikasyonu bir başka varyasyonu. Bunun yerine ancak mutasyon özgü primerler kullanılarak, WT alel için bir blokaj prob spesifik bağlanma tam primer inhibe eder. Bu yaklaşım qPCR gibi bir mutasyon-spesifik prob gerektirmez da, artan yanlış pozitif yol açabilir mutasyonlar ve polimeraz kaynaklı hatalar arasında ayrım başarısız olur. PCR ile bu polimeraz neden olduğu hataların Üstel amplifikasyon nadir mutasyon olayları saptanmasını gizleyebilir. Mutasyon için zenginleştirmek üzere PCR amplifikasyonu kullanan herhangi bir yaklaşım, PCR hatalarının 25, 26, 27 sıklığı tarafından doğruluk derecesi sınırlıdır. Birçok başka yüksek hassasiyet metodolojileri fazla WTB-PCR / Sanger temel bir avantajı, WT şablonu olan ve mutasyonlar bloke oligonucleoti hedef gen bölgesinin dışında meydana mutan şablon hem amplifikasyon önlemesidirde. Bu nedenle, polimerazlar ile getirilen PCR hatalarını etkili bir WT DNA ile birlikte filtrelenir. Ancak AS-PCR veya qPCR aksine, zenginleştirme engelleme oligo kapsadığı bölge içinde meydana bilinmeyen mutasyonlar için korunur. MyD88 durumunda, WTB-PCR, her ikisi de L265P ve R264 * mutasyonlar 3 saptanmasına olanak. Diğer benzer şekilde WTB-PCR 4, 28 kullanımı ile çok sayıda, düşük frekanslı mutasyonların saptanmasına bildirmiştir. Bu araştırma ve klinik amaçlar için WTB-PCR idealdir.

yüksek hassasiyet ve yanlış pozitif ortadan kaldırmak için doğal iç kontroller ile birlikte, engelleyici tasarımı ile çok az ek adımlarla varolan sıralama deneyi adapte için WTB-PCR esnekliği Yerleşik tahlilleri ile birçok laboratuvarları için cazip bir seçenek olun. geleneksel bir deneyde kullanılan PCR primerleri ile aynı grubu tipik olarak WTB-PCR, varyasyon kullanılabilir. Otyüksek FFPE doku ve uygun post-PCR saflaştırma ve Yeraltı tedavisi WTB-PCR ile dahil olmak üzere önerilen onun protokol değişiklikleri aynı devir sonrasında metodolojiler-bulunmaktadır. Engelleyici tasarım, bu nedenle WTB-PCR deneyi uygulanmasında kritik bir elementtir. Bu protokol sunulan ilkeler bu tasarımda en önemli faktörleri temsil rağmen, çeşitli engelleme oligonükleotidler PCR ikincil etkileri olmadan verimli bir engelleyen WT amplifikasyon bulmak için test edilmelidir. Bu ekleme veya Tm ayarlamak için bloke edici bazlar kaldırma WT şablonuna bloke oligo göre konumunu kaydırılması ve oligo'nun uzunluğunun değiştirilmesi içerir. Engelleyici titrasyon deneyleri de sekanslama eserler ve saptama limitinin kabul edilebilir olaylar arasında bir denge kurmak için kullanılması gerekmektedir.

dakikalık bir hücre fraksiyonlarında mevcut olan mutasyonları tespit etmek için uygun olan bir yöntem seçilmesi th büyük ölçüde bağlıdırE uygulama ve hastalık / mutasyon tipleri. Mutant ölçümü isteniyorsa, qPCR veya dijital PCR WTB PCR / Sanger daha uygun çözümler sunabilir. WTB-PCR, niteliksel bir deney esas olmasına rağmen, paralel olarak ve geleneksel WTB-PCR ile bir numunenin test edilmesi ile mutant alel frekansının kaba bir tahminini belirlemek mümkündür. klasik bir deneyle tespit limiti ~ 10 olduğu için - WT bir arka içinde% 20 mutant alel, mutasyonlar WTB-PCR yöntemi ile tespit sonucuna uygun ancak geleneksel olmayan sınırından daha düşük bir konsantrasyonda mevcut olan geleneksel analizin saptama. Birkaç deneyler WTB-PCR çok yönlülüğünü, basitlik ve sağlamlığı vardır. düşük maliyetli ve kısa gerçekleştirme süresi terapisinden sonra rezidüel hastalığın değerlendirilmesi veya tedavi sırasında ortaya çıkan direnç mutasyonları izlenmesi için idealdir. Ayrıca, daha önce tanımlanmamış mutasyonları tespit etmek yeteneği araştırma amaçlı WTB-PCR idealdir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes Eppendorf 05-402-25
100% alcohol VWR 89370-084 Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol
3730XL sequencer ABI or equivalent
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 For magnetic bead PCR purification
Aluminum sealing foils GeneMate T-2451-1 For PCR and cold storage
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit Life Technologies 4337455 For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 Series Eppendorf A-2-DWP rotor (for PCR plate)
Cold plate for 96 well plates Eppendorf Z606634
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water
dNTPs (100 mM) Invitrogen 10297-117
DynaMag-96 Side-Skirted Magnet Thermo Fisher Scientific 12027 For use in PCR Purification.
Ethanol Absolute  Sigma E7023 200 proof, for molecular biology
Exiqon website Oligo Tools www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL) Roche 12032937001 With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2
Gel electrophoresis apparatus 2% agarose gel
GeneRead DNA FFPE extraction Kit  Qiagen 180134 Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts
Hi-Di Formamide ABI 4311320 For sequencing.
LNA oligonucleotide Exiqon 500100 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)
M13-F Sequencing Primer ABI 5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequencing Primer ABI 5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S Thermocycler Eppendorf E950030020
Microcentrifuge Model 5430 Eppendorf FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes)
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
PCR forward primer IDT 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primer IDT 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR plates GeneMate T-3107-1
Pipettors 20, 200, 1,000 µL
Plate septa, 96 well ABI 4315933
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen 51304 For BM aspirate and peripheral blood
SeqScape Sortware v3.0 ABI 4474978 For sequencing analysis
Slide basket
Sodium Acetate (3 M, pH 5.2)  Sigma S7899
Sterile filtered pipette tips 20, 200, 1,000 µL
Thermomixer C  Eppendorf 5382000023
Vortex genie Scientific Industries SI-0236
Wash reservoir ~ 1,000 mL
Xylene VWR 89370-088 Histology grade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96, (16), 9236-9241 (1999).
  2. Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55, (4), 632-640 (2009).
  3. Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38, (2), 133-140 (2016).
  4. Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24, (45), 6830-6834 (2005).
  5. Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7, (3), 1313-1332 (2015).
  6. Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15, (8), 420 (2014).
  7. Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121, (13), 2522-2528 (2013).
  8. Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121, (11), 2051-2058 (2013).
  9. Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87, (5), 503-510 (2012).
  10. Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124, (21), 1690-1690 (2014).
  11. Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470, (7332), 115-119 (2011).
  12. Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43, (9), 830-837 (2011).
  13. Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3, (3), S30-S37 (1993).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  15. Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. (2014).
  16. Applied Biosystems. User Guide for SeqScape Software 3. (2012).
  17. Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3, (1), 27-38 (2003).
  18. Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4, (1), (2004).
  19. Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29, (3), 257-264 (2007).
  20. Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12, (5), 3191-3204 (2011).
  21. Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40, (14), e107-e107 (2012).
  22. Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59, (9), 1376-1383 (2013).
  23. Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128, (2), 398-402 (2008).
  24. Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17, (2), 179-184 (2015).
  25. Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387, (2), 97-121 (1997).
  26. Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33, (1), 129-139 (2002).
  27. Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17, (5), 365-374 (2002).
  28. Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126, (23), 716 (2015).
Yabani tip PCR Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonlar Tespiti için oldukça hassas bir yöntem olarak doğrudan bölme imkanı Kombine Engelleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Albitar, A. Z., Ma, W., Albitar, M. Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations. J. Vis. Exp. (121), e55130, doi:10.3791/55130 (2017).More

Albitar, A. Z., Ma, W., Albitar, M. Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations. J. Vis. Exp. (121), e55130, doi:10.3791/55130 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter