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Genetics

जंगली प्रकार अवरुद्ध पीसीआर कम आवृत्ति दैहिक उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक अति संवेदनशील विधि के रूप में प्रत्यक्ष अनुक्रमण के साथ संयुक्त

doi: 10.3791/55130 Published: March 29, 2017

Abstract

सटीक पता लगाने और कम आवृत्ति म्यूटेशन की पहचान समस्याग्रस्त जब उपचार के बाद अवशिष्ट रोग का आकलन करने, उपचार के दौरान प्रतिरोध उत्परिवर्तन उभरते के लिए स्क्रीनिंग हो सकता है, या रोगियों कुछ घूम ट्यूमर कोशिकाओं है जब। जंगली प्रकार अवरुद्ध पीसीआर अनुक्रमण विश्लेषण के बाद इन कम आवृत्ति म्यूटेशन का पता लगाने के लिए एक पद्धति के रूप में उच्च संवेदनशीलता, लचीलापन, और सरलता प्रदान करता है। एक कस्टम एक नया या पहले से स्थापित पारंपरिक पीसीआर आधारित अनुक्रमण परख करने के लिए न्यूक्लिक एसिड oligonucleotide बंद कर दिया तैयार किया गया जोड़कर, 1000 WT जेनेटिक तत्व की पृष्ठभूमि में लगभग 1 उत्परिवर्ती एलील की संवेदनशीलता प्राप्त किया जा सकता (1: 1,000)। अनुक्रमण deamination घटनाओं के साथ जुड़े कलाकृतियों सामान्यतः formalin तय आयल एम्बेडेड ऊतकों में पाया आंशिक रूप से निकासी चरणों के दौरान uracil डीएनए glycosylase के उपयोग के द्वारा ठीक किया जा सकता है। अनुकूलित प्रोटोकॉल यहाँ MYD88 उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए विशिष्ट है, लेकिन किसी भी डिजाइन करने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में सेवा कर सकतेWTB पीसीआर परख। एलील विशिष्ट पीसीआर और वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर झूठे सकारात्मक के कम पाया जाना, अधिक लचीलापन और कार्यान्वयन में आसानी शामिल सहित कम आवृत्ति परिवर्तन के पता लगाने के लिए अन्य सामान्य रूप से उपयोग किया assays से अधिक WTB पीसीआर परख के लाभ, और दोनों ज्ञात पता लगाने की क्षमता और अज्ञात म्यूटेशन।

Introduction

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सेंगर अनुक्रमण पारंपरिक रूप से दोनों ज्ञात और अज्ञात दैहिक उत्परिवर्तन के लिए परीक्षण में स्वर्ण मानक किया गया है। सेंगर अनुक्रमण की सीमाओं में से एक का पता लगाने की अपनी सीमा है (~ 10 - WT की पृष्ठभूमि में 20% उत्परिवर्ती युग्मजीविकल्पी) 1। संवेदनशीलता का यह स्तर निम्न स्तर दैहिक उत्परिवर्तन कि कुछ घूम ट्यूमर कोशिकाओं, या जब अस्थि मज्जा (बीएम) विचित्र है साथ premalignant ऊतकों या रोगियों से नमूनों में मौजूद हो सकता है पता लगाने के लिए अनुचित है। यह भी उपचार के बाद अवशिष्ट रोग का आकलन करने या अकेले 2 पारंपरिक अनुक्रमण द्वारा कठिन उपचार के दौरान विकसित प्रतिरोधक क्षमता के म्यूटेशन का पता लगाने में आता है। बंद न्यूक्लिक एसिड (LNA) के साथ पारंपरिक पीसीआर बदलकर जंगली प्रकार सेंगर अनुक्रमण में पीसीआर (WTB पीसीआर) को अवरुद्ध मध्यस्थता, WT की पृष्ठभूमि में अप करने के लिए 0.1% उत्परिवर्ती एलील की संवेदनशीलता 2, 3, 4 प्राप्त किया जा सकता। में(- 14 NT ~ 10) को अवरुद्ध (LNA) oligonucleotide कि WT डीएनए के WT डीएनए जिससे रोकने प्रवर्धन के लिए प्राथमिक रूप से बांधता है WTB पीसीआर, उत्परिवर्ती युग्मविकल्पी के लिए संवर्धन एक छोटी के अलावा के माध्यम से हासिल की है। उत्परिवर्ती समृद्ध WTB पीसीआर उत्पाद तो अनुक्रम जा सकता है। WT डीएनए को अवरुद्ध करने के बजाय विशिष्ट म्यूटेशन के लिए चयन करके WTB पीसीआर मिनट सेल अंशों में मौजूद दोनों ज्ञात और अज्ञात म्यूटेशन के संवर्धन के लिए अनुमति देता है।

एकाधिक तरीकों वर्तमान में छोटे कोशिकाओं अंशों में परिवर्तन का पता लगाने के लिए किया जाता है। इस एलील विशिष्ट पीसीआर, प्रवर्धन-दुर्दम्य उत्परिवर्तन प्रणाली (हाथों), उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (DHPLC), मोती, इमल्शन, प्रवर्धन, और आकर्षणविद्या (प्रसारित), बिजली के क्षेत्र प्रेरित जारी है और माप (EFIRM) denaturing, उच्च संकल्प भी शामिल है गलनांक और अन्य। हालांकि, इन तरीकों में से सबसे झूठी सकारात्मक और केवल एक ही उत्परिवर्तन कि परख 4 के लिए डिजाइन किया गया था पता लगाने की क्षमता द्वारा सीमित हैं 5 के लिए एक समस्या पैदा कर सकते हैं, 6।

यहाँ हम के रूप में Albitar एट अल द्वारा वर्णित माइलॉयड भेदभाव कारक 88 जीन में परिवर्तन के लिए स्क्रीनिंग में WTB पीसीआर द्वारा प्राप्त संवेदनशीलता में वृद्धि का प्रदर्शन। 3 MYD88 mutatioएनएस Waldenström के Macroglobulinemia (WM) अज्ञात महत्व (आईजीएम-MGUS) की, आईजीएम मोनोक्लोनल gammopathy, प्लीहा सीमांत क्षेत्र लिंफोमा (SMZL) में महत्वपूर्ण निदान और शकुन कारकों कर रहे हैं, और बड़े बी कोशिका लिंफोमा (DLBCL) फैलाना। MYD88 म्यूटेशन WM के लगभग सभी मामलों और इम्युनोग्लोबुलिन एम (आईजीएम) MGUS -secreting के साथ रोगियों के लगभग 50% में पाए जाते हैं। इसके विपरित्त MYD88 म्यूटेशन SMZL के साथ रोगियों के केवल 0-6% में पाया जाता है और एकाधिक myeloma 7, 8 में अनुपस्थित रहे हैं कर रहे हैं। क्योंकि ओवरलैपिंग शब्द के भागों, immunophenotypic, सितोगेनिक क, और WM और SMZL या आईजीएम-एकाधिक myeloma अक्सर विभेदक निदान को मुश्किल कर सकते हैं के बीच नैदानिक विशेषताओं, एक MYD88 उत्परिवर्तन की उपस्थिति एक उपयोगी की पहचान कारक 9 के रूप में काम कर सकते हैं। MYD88 म्यूटेशन भी चिकित्सा 7 निम्नलिखित DLBCL और गरीब समग्र अस्तित्व के साथ रोगियों में अधिक से अधिक इस बीमारी के बोझ के साथ संबद्ध किया गया है 10। इसके अलावा, MYD88 म्यूटेशन अधिक बार सक्रिय बी कोशिका की तरह (एबीसी) से DLBCL में पाए जाते हैं कीटाणु केंद्र बी कोशिका की तरह (GCB) DLBCL या प्राथमिक mediastinal बी कोशिका लिंफोमा (PMBL), MYD88 उत्परिवर्तन स्थिति एक के रूप में सेवा कर सकता है एबीसी उप प्रकार 11, 12 के लिए किराए की मार्कर।

विस्तृत यहाँ प्रदान प्रोटोकॉल एक टेम्पलेट है जहाँ से नई assays विकसित किया जा सकता है या सबसे मौजूदा अनुक्रमण assays आसानी से सही रूप में विभिन्न नमूना प्रकार में कम आवृत्ति म्यूटेशन पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता के रूप में कार्य करता है। दृष्टिकोण भी निगरानी और प्रतिरोधी म्यूटेशन कि ट्यूमर या यहाँ तक कि बैक्टीरिया है कि जब तक रोगियों लक्षित चिकित्सा या एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज किया जा रहा है विकास हो सकता है में विकसित हो सकता है पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। इसके अलावा, यह संबोधित करते हैं और विशेष रूप से formalin निर्धारित पैराफिन एम्बेडेड (FFPE) ऊतकों में, उत्परिवर्तन संवर्धन के साथ जुड़े कई मुद्दों को उपचार।

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Protocol

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आचार कथन: मानव नमूनों के सभी परीक्षण संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) अनुमोदन प्राप्त करने के बाद किया गया था।

1. FFPE ऊतक से डीएनए निष्कर्षण, परिधीय रक्त, और अस्थि मज्जा महाप्राण

  1. डीएनए FFPE निष्कर्षण किट के साथ अस्थि मज्जा FFPE ऊतक के लिए
    1. बेदाग स्लाइड से FFPE ऊतक के साथ शुरू (5 - 5 में 10 वर्गों - 10 सुक्ष्ममापी मोटाई)।
      नोट: ऊतक की कतरन के साथ शुरुआत, 3 का उपयोग करते हैं - 5 में 6 वर्गों - 10 सुक्ष्ममापी मोटाई और कदम 1.1.6 को छोड़ दें।
    2. एक स्लाइड टोकरी में स्लाइड रखें और चार धोने जलाशयों (ज़ाइलीन के लिए दो और 100% शराब के लिए दो) तैयार करते हैं। प्रत्येक टोकरी का हल की 600 एमएल की एक न्यूनतम मात्रा जोड़ें।
    3. पहले ट्रे में एक 5 मिनट xylene धोने करके स्लाइड Deparaffinize। एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए दूसरी xylene धोने जलाशय के लिए स्लाइड स्थानांतरित करें।
    4. deparaffinization के बाद, 5 मिनट के लिए 100% शराब के साथ स्लाइड धोने। दूसरे करने के लिए स्लाइड स्थानांतरणएक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए शराब धोने जलाशय।
    5. स्लाइड एक microcentrifuge ट्यूब में एक रेजर ब्लेड के साथ उन्हें स्क्रैप से पहले एक हुड के नीचे पूरी तरह सूख जाने की अनुमति दें।
      नोट: यदि ट्यूमर क्षेत्र के साथ एक एच एंड ई स्लाइड संकेत दिया उपलब्ध है, स्लाइड संरेखित और केवल ट्यूमर क्षेत्र स्क्रैप।
    6. निर्माता हैंडआउट से निर्देश किट में शामिल के साथ आगे बढ़ें।
  2. बी.एम. महाप्राण और परिधीय रक्त के लिए
    1. इन विशेषताओं के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार परचा निकालें।
      नोट: कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट और FFPE ऊतकों और कोशिकाओं से डीएनए निष्कर्षण के लिए तरीके हैं। व्यावहारिक रूप से, सभी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक विधि है कि प्रयोगशाला में स्थापित है का उपयोग करें।
      1. 200 μL परिधीय रक्त (PB) या 100 μL बी.एम. + 100 μL पीबीएस का प्रयोग करें।
      2. 4 μL RNase एक शेयर समाधान का उपयोग करें।
      3. 100 μL क्षालन बफर के साथ Elute।
  3. डीएनए मात्रा
    1. उपाय एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर लगभग 1.8 की एक 260 एनएम / 280 एनएम अनुपात (शुद्ध डीएनए के लिए) यह सुनिश्चित करना का उपयोग कर डीएनए सांद्रता। अनुपात कोई उल्लेखनीय कम है, तो यह प्रोटीन, फिनोल, या अन्य प्रदूषकों की उपस्थिति है कि नीचे की ओर अनुप्रयोगों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं संकेत हो सकता है।
    2. 100 एनजी / μL उचित क्षालन बफर के साथ - लगभग 50 करने के लिए डीएनए सांद्रता समायोजित करें।

2. जंगली प्रकार पीसीआर को अवरुद्ध करने

  1. प्राइमर डिजाइन
    1. पहले के अनुसार ब्याज की जीन के लिए डिजाइन और प्राप्त प्राइमरों पीसीआर प्राइमर डिजाइन 13 के सामान्य दिशा निर्देशों का वर्णन किया। M13 आगे को शामिल करें और पीसीआर प्राइमरों में सार्वभौमिक अनुक्रमण प्राइमरों रिवर्स।
      नोट: MYD88 परख MYD88 की एक्सॉन 5 बढ़ाना विकसित किया गया था (G259 - N291) और 110 न्यूक्लियोटाइड 5 में स्थित 'intronic क्षेत्र intron 4. आगे की जोड़ साइट और हिस्से को कवर और प्राइमरों उल्टा करने के लिए एक 5 के साथ डिजाइन किए गए थे' -M13 अनुक्रम (एम13-आगे: TGT aaa ACG ACG जीसीसी AGT; M13-रिवर्स: सीएजी GAA aca GCT ATG एसीसी) पूरक अनुक्रमण प्राइमरों की annealing के लिए अनुमति देने के लिए (देखें सामग्री तालिका)।
  2. लॉक्ड न्यूक्लिक एसिड प्रोटोकॉल डिजाइन
    1. डिजाइन अवरुद्ध oligonucleotide लगभग 10 होने के लिए - 15 जहां उत्परिवर्ती संवर्धन वांछित है WT टेम्पलेट के लिए लंबाई में ठिकानों और पूरक।
      ध्यान दें: एक संक्षिप्त oligo बेमेल भेदभाव में सुधार होगा। उच्च लक्ष्य विशिष्टता प्राप्त करने के लिए, यह बहुत ज्यादा अवरुद्ध न्यूक्लियोटाइड का उपयोग नहीं करने के बाद से यह एक बहुत ही "स्टिकी" oligonucleotide में परिणाम कर सकते महत्वपूर्ण है। सामग्री और लंबाई और अवरुद्ध न्यूक्लियोटाइड विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड जरूरत है कि अवरुद्ध होने के अनुसार अनुकूलन किया जाना चाहिए। यह माध्यमिक संरचना समझौता और आत्म संपूरकता का जोखिम लिए बिना उच्च बंधन विशिष्टता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    2. डिजाइन अवरुद्ध oligo एक टी एम 10 के लिए - विस्तार temperat ऊपर 15 डिग्री सेल्सियसthermocycling दौरान ure। जी या सी अड्डों अवरुद्ध - (4 ठिकानों 3) जोड़ने या अवरुद्ध ठिकानों को हटाने के द्वारा या डीएनए के लिए अवरुद्ध ठिकानों प्रतिस्थापन, जबकि लंबी विस्तृत परहेज द्वारा टी मीटर को समायोजित करें।
      1. Oligo उपकरण वेबसाइट पर नेविगेट करें (सामग्री की तालिका देखें) और "अवरुद्ध Oligo Tm भविष्यवाणी" उपकरण का चयन करें।
      2. कि "Oligo अनुक्रम" बॉक्स में अवरुद्ध होने वांछित है WT टेम्पलेट के अनुक्रम पेस्ट करें। जोड़ें "+" अड्डों के सामने अवरोधक अड्डों से संकेत मिलता है।
      3. डीएनए अवरोधक संकर की अनुमानित टी मीटर निर्धारित करने के लिए "की गणना करें" बटन का चयन करें।
    3. डिजाइन अवरुद्ध oligo माध्यमिक संरचना गठन या आत्म dimers से बचने के लिए।
      1. Oligo उपकरण वेबसाइट पर नेविगेट करें (सामग्री की तालिका देखें) और "Oligo अनुकूलक अवरुद्ध" उपकरण का चयन करें।
      2. कि बॉक्स में अवरुद्ध होने वांछित है WT टेम्पलेट के अनुक्रम पेस्ट करें। जोड़ें "+" अड्डों के सामने अड्डों अवरुद्ध इंगित करने के लिए।
      3. "माध्यमिक संरचना" और "स्व केवल" के लिए दो बक्से का चयन करें। संभावित परेशानी माध्यमिक संरचनाओं या आत्म dimers के लिए oligo समीक्षा करने के लिए बटन का विश्लेषण करें दबाएं।
        नोट: स्कोर टी एम 'माध्यमिक संरचनाओं और आत्म dimers के एस के बहुत अनुमान प्रतिनिधित्व करते हैं। कम स्कोर इसलिए इष्टतम हैं और अवरोधक अवरोधक जोड़ी को सीमित करके प्राप्त किया जा सकता। MYD88 [MYD88blocker (TCAGA + एजी + सी + जी + A + सी + टी + जी + A + टी + सीसी / invdT /)] अमीनो एसिड Q262-I266 कवर करने के लिए बनाया गया है और सुविधाओं था एक 3'-औंधा के लिए अवरुद्ध oligonucleotide dT डीएनए पोलीमरेज़ और गिरावट से दोनों विस्तार 3'-exonuclease द्वारा बाधित करने के लिए। यह विशिष्ट अवरुद्ध oligo जो "+ N" चिह्नित हैं 10 अवरुद्ध अड्डों के साथ एक 17mer है। शेष 7 ठिकानों साधारण डीएनए न्यूक्लियोटाइड हैं।
  3. WTB पीसीआर सेटअप और Thermocycling
    1. एक WTB पीसीआर मास्टर मील तैयारएक्स (MMX) 2.5 μL पीसीआर प्रतिक्रिया बफर 10x का उपयोग कर w / 20 मिमी 2 MgCl, 250 सुक्ष्ममापी dNTPs, 0.2 माइक्रोन आगे और रिवर्स प्राइमर, 1.2 माइक्रोन MYD88blocker, और DNase, RNase मुक्त, अल्ट्रा शुद्ध एच 2 हे एक अंतिम बनाने के लिए प्रतिक्रिया प्रति 21.75 μL के समाधान मात्रा।
      नोट: कार्य सांद्रता 25 μL के अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा (डीएनए टेम्पलेट और पोलीमर्स के अलावा के बाद) के लिए कर रहे हैं। पारंपरिक पीसीआर MMX बस अवरोधक के अलावा छोड़ते हुए तैयार किया जाता है। सभी प्रोटोकॉल चरणों दोनों WTB और पारंपरिक पीसीआर के लिए समान रहते हैं। इस सत्यापन में इस्तेमाल किया जा सकता है और निर्धारित करने संवर्धन अवरोधक के अलावा द्वारा हासिल की।
      1. जब MMX की राशि की गणना (संदूषण के लिए जाँच करने के लिए सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण और एक गैर टेम्पलेट नियंत्रण) और pipetting त्रुटि के लिए कम से कम 1 अतिरिक्त प्रतिक्रिया 3 अतिरिक्त प्रतिक्रियाओं के लिए खाते में यह सुनिश्चित कर लें तैयार करने के लिए।
    2. भंवर MMX अच्छी तरह से। MMX अप प्र करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकताकान।
    3. 0.25 प्रतिक्रिया प्रति μL Taq डीएनए पोलीमरेज़ MMX में जोड़े और मिश्रण करने को उलटने के। एक बार जब पोलीमर्स MMX में जोड़ा गया है, बर्फ पर रखें।
    4. एक नया 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली एक ठंडा प्लेट और पिपेट पर अच्छी तरह से प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए पोलीमर्स के साथ MMX के 22 μL रखो।
    5. 100 एनजी / μL पोलीमर्स के साथ MMX युक्त कुओं से प्रत्येक के लिए - 3 μL जीनोमिक डीएनए (50 जोड़े।
    6. सुनिश्चित करने के लिए समाधान अच्छी तरह से प्रत्येक के नीचे तक पहुँच जाता है प्लेट और अपकेंद्रित्र संक्षेप में सील।
    7. एक thermocycler पर पीसीआर प्लेट लोड करें।
      1. 6 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण;: इस प्रकार WTB पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए thermocycling शर्त निर्धारित करें 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 है, प्राइमर annealing के लिए 1 मिनट 20 s के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर 30 s के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण, और विस्तार के 40 चक्र; 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार।
        ध्यान दें: सर्वश्रेष्ठ अभ्यास एक शारीरिक रूप से अलग क्षेत्र में प्रोटोकॉल के शेष को पूरा करने amplicon संदूषण से बचने के शामिल मैंn भविष्य सेटअप।
  4. पहले बताए प्रोटोकॉल 14 के अनुसार क्रम में निर्धारित करने के लिए करता है, तो WTB पीसीआर सफल रहा था और गैर टेम्पलेट नियंत्रण में प्रवर्धन की कमी की पुष्टि करने के जेल वैद्युतकणसंचलन निष्पादित करें।
  5. चुंबकीय मोतियों से पीसीआर उत्पाद की शुद्धि
    1. 4 डिग्री सेल्सियस से चुंबकीय मोती निकालें और कमरे के तापमान को लाने के लिए।
    2. एक नई पीसीआर थाली करने के लिए 10 μL पीसीआर उत्पाद में स्थानांतरित करें।
    3. भंवर चुंबकीय मोती सख्ती पूरी तरह से चुंबकीय कणों resuspend।
    4. 18 μL नई प्लेट पर प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए चुंबकीय मोतियों जोड़ें। पिपेट 10 बार मिश्रण।
    5. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    6. समाधान से अलग मोती के लिए 2 मिनट के लिए उप-skirted चुंबक प्लेट पर पीसीआर थाली रखें।
    7. एक multichannel विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला Aspirate, मनका गोली से परहेज।
    8. अच्छी तरह से प्रत्येक में 150 μL 70% इथेनॉल बांटना और कमरे के तापमान के लिए पर सेतेआर कम से कम 30 है। एक multichannel विंदुक के साथ इथेनॉल Aspirate और सुझावों त्यागें। एक बार फिर इस धोने प्रक्रिया दोहराएं।
    9. एक 20 μL multichannel विंदुक अच्छी तरह से प्रत्येक से शेष इथेनॉल aspirate और सुझावों त्यागने का उपयोग करना।
    10. एक बार कुओं शुष्क हैं (~ 10 मिनट), चुंबक थाली से हटा दें और 15 बार या भंवर धीरे प्रत्येक अच्छी तरह से और पिपेट मिश्रण करने के लिए 40 μL nuclease मुफ्त पानी जोड़ें।
    11. 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    12. पीसीआर थाली चुंबक प्लेट पर समाधान से अलग मोती के लिए 1 मिनट के लिए रखें।
    13. एक नई पीसीआर थाली पर स्थानांतरण 35 शुद्ध उत्पाद की μL। यह शुद्ध पीसीआर उत्पाद अब द्वि-दिशात्मक अनुक्रमण के साथ आगे बढ़ना करने के लिए तैयार है या जब तक जरूरत -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      नोट: जब एक नया परख विकास, शुद्ध पीसीआर उत्पाद की मात्रा की आवश्यकता हो सकती। 1 - 3 एनजी / μL amplicon डीएनए द्वि-दिशात्मक अनुक्रमण के लिए इष्टतम है। अगर एकाग्रता लगातार कम रहती है, पीसीआर उत्पाद और चुंबकीय मोती वृद्धि proportionally (1: 1.8)। अगर एकाग्रता लगातार उच्च है, पानी का अधिक से अधिक मात्रा के साथ elute।

3. WTB पीसीआर उत्पाद का अनुक्रमण

  1. द्वि-दिशात्मक अनुक्रमण
    ध्यान दें: निम्नलिखित प्रोटोकॉल निर्माता के निर्देशों कि कम अभिकर्मकों उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया गया है का एक संशोधित रूप है।
    1. आगे तैयार करें और रिवर्स अनुक्रमण प्रतिक्रिया 0.25 μL तैयार रिएक्शन मिश्रण, 1.88 μL अनुक्रमण बफर, 1.78 माइक्रोन M13-F या M13-आर अनुक्रमण प्राइमरों और साथ घुलमिल जोड़ने और DNase, RNase मुक्त, अल्ट्रा शुद्ध एच 2 हे एक अंतिम समाधान बनाने के लिए प्रतिक्रिया प्रति 9 μL की मात्रा। यह अनुक्रमण प्रतिक्रिया मिश्रण एक वर्ष के लिए के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
    2. आगे अनुक्रमण प्रतिक्रिया के लिए एक नया 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में से प्रत्येक कुएं में आगे अनुक्रमण प्रतिक्रिया मिश्रण के पिपेट 9 μL। रिवर्स अनुक्रमण प्रतिक्रिया के लिए एक अलग प्लेट पर दोहराएँ।
    3. शुद्ध WTB पीसीआर उत्पाद टी का 1 μL जोड़ेंओ प्रत्येक अच्छी तरह से दोनों पर आगे और प्लेट रिवर्स।
    4. सुनिश्चित करने के लिए समाधान अच्छी तरह से प्रत्येक के नीचे तक पहुँच जाता है प्लेट और अपकेंद्रित्र संक्षेप में सील।
    5. एक thermocycler पर पीसीआर प्लेट लोड करें।
      1. इस प्रकार अनुक्रमण प्रतिक्रिया के लिए thermocycling की स्थिति निर्धारित करें: 1 मिनट के लिए 96 डिग्री सेल्सियस; 10 एस के लिए 96 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र, 5 एस के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, 4 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस; शुद्धि के लिए तैयार है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
  2. शुद्ध अनुक्रमण उत्पाद
    1. 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच 5.2) और 100% इथेनॉल के एक ताजा 01:25 समाधान तैयार करें।
    2. एक ताजा 70% इथेनॉल समाधान तैयार करें।
    3. सोडियम एसीटेट के 30 μL / 100% इथेनॉल दोनों आगे और रिवर्स अनुक्रमण प्लेटें और पिपेट मिश्रण 5 बार से प्रत्येक अच्छी तरह का हल जोड़ें।
    4. प्लेट reseal और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में सेते हैं।
    5. 15 मिनट के लिए 2,250 XG पर थाली अपकेंद्रित्र।
    6. थाली सीलर निकालें और बर्बादी से अधिक को उलटनेकंटेनर।
      नोट: उलटें केवल एक या गोली अच्छी तरह से नीचे से ढीला कर सकते हैं।
    7. 1 मिनट के लिए 150 XG पर एक साफ कागज तौलिया और अपकेंद्रित्र पर उल्टे थाली रखें।
    8. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 150 μL 70% इथेनॉल जोड़ें।
    9. 5 मिनट के लिए 2250 XG पर थाली और स्पिन reseal।
    10. दोहराएँ 3.2.6 और 3.2.7 कदम दूर है।
    11. कुओं पूरी तरह से सूख नहीं हैं, तो कमरे के तापमान पर हवा शुष्क करने के लिए उन्हें अनुमति देते हैं। यकीन है कि नमूने प्रकाश से सुरक्षित हैं सुखाने जबकि बनाओ।
    12. प्रत्येक अच्छी तरह से और पिपेट मिश्रण करने के लिए 10 μL Formamide जोड़े 10 बार। प्लेट reseal।
    13. 3 मिनट 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के बाद के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर thermocycler पर denature।
    14. Denaturing के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार 15 अनुक्रमण मंच पर एक सेप्टा और अनुक्रम के साथ थाली सीलर की जगह।

4. का अनुक्रमण परिणाम विश्लेषण

  1. एक अनुक्रमण Dat का उपयोग कर अनुक्रमण निशान कल्पनाएक विश्लेषण सॉफ्टवेयर निर्माता के निर्देशों 16 और संबंधित संदर्भ दृश्यों को संरेखित करने के लिए अनुसार। एन सी बी आई संदर्भ अनुक्रम "NM_002468" करने के लिए MYD88 संरेखित करें।

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Representative Results

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विस्तार के दौरान WTB पीसीआर की एक वैचारिक सिंहावलोकन चित्र 1 में प्रस्तुत किया है। क्योंकि अवरोधक डीएनए संकर में एक भी न्यूक्लियोटाइड बेमेल बहुत इसके पिघलने का तापमान कम हो जाती है (ΔT मीटर = 20 - 30 डिग्री सेल्सियस), WT एलील की प्रवर्धन अवरुद्ध जबकि उत्परिवर्ती टेम्पलेट डीएनए विस्तार 17 को पूरा करने के लिए स्वतंत्र है। इस तरीके में, उत्परिवर्ती डीएनए तेजी से परिलक्षित करते हुए WT डीएनए रैखिक और बढता है है।

WTB पीसीआर द्वारा प्राप्त उत्परिवर्ती संवर्धन का एक प्रदर्शन चित्र 2 में प्रस्तुत किया है। साथ और म्यूटेशन के बिना रोगियों से जीनोमिक डीएनए द्वारा परीक्षण किया गया दोनों पारंपरिक और WTB पीसीआर और फिर WTB पीसीआर द्वारा प्राप्त ठेठ संवर्धन और WT डीएनए में झूठे सकारात्मक की कमी को प्रदर्शित करने के अनुक्रम। WTB पीसीआर MMX में इस्तेमाल अवरोधक का काम कर रहे एकाग्रता अनुमापन प्रयोगों और एस द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिएजबकि गलत परिणामों की, जिसके परिणामस्वरूप या पूरी तरह से WT डीएनए के प्रवर्धन अवरुद्ध नहीं hould उत्परिवर्ती संवर्धन के वांछित स्तर को प्राप्त करने के। WTB पीसीआर उत्पाद का अनुक्रमण विश्लेषण उत्परिवर्ती युग्मजीविकल्पी के लिए संवर्धन और एक पारंपरिक पीसीआर 3 में 16% के साथ तुलना में WT की पृष्ठभूमि में 0.5% उत्परिवर्ती युग्मजीविकल्पी से अधिक का पता लगाने की सीमा को दर्शाता है।

नैदानिक ​​परीक्षण में संवेदनशीलता में इस वृद्धि के प्रभाव नमूनों का परीक्षण में नियोप्लास्टिक कोशिकाओं के रिश्तेदार मात्रा के आधार पर बदलती सकता है। एक तरीकों तुलना अध्ययन में, WTB पीसीआर परख यहाँ वर्णित का प्रदर्शन किया है कि MYD88 म्यूटेशन के 64% WM या MGUS 3 के साथ रोगियों के पारंपरिक परीक्षण द्वारा याद किया जाएगा।

संकेत तीव्रता (चित्रा 3) में एक विशेषता ड्रॉप-ऑफ अक्सर देखा जाता है, तो बहुत अधिक अवरोधक की एकाग्रता अगर बाद पीसीआर purifica इस्तेमाल किया या हैtion अवरोधक द्वि-दिशात्मक अनुक्रमण करने से पहले दूर करने के लिए असफल रहा। जब चुंबकीय मनका शुद्धि एंजाइमी शुद्धि के लिए दिया जाता है उत्तरार्द्ध का प्रदर्शन किया है। हालांकि एंजाइमी शुद्धि जब अधिक से अधिक नमूना संख्या के साथ काम कर रहे एक आकर्षक विकल्प है, यह WTB पीसीआर के साथ आवेदन के लिए अनुपयुक्त है के रूप में यह समाधान से अनुक्रमण करने से पहले अवरोधक दूर करने के लिए विफल रहता है।

अनुक्रम कलाकृतियों का एक उदाहरण अक्सर साइटोसिन deamination के परिणामस्वरूप FFPE व्युत्पन्न डीएनए में पाया (सी: जी> टी: ए) चित्रा 4 3, 18, 19, 20 में प्रस्तुत कर रहे हैं। हालांकि साइटोसिन deamination के वास्तविक कारणों खराब समझ रहे हैं, किसी भी पीसीआर आधारित परख है कि उत्परिवर्ती युग्मविकल्पी के लिए समृद्ध इन कम आवृत्ति कलाकृतियों 21, 22 की पहचान करेगा। dea की वजह से गलत सकारात्मकmination सबसे अच्छा उच्च गुणवत्ता टेम्पलेट सामग्री के साथ शुरू करने से परहेज कर रहे हैं; कई मामलों में जहां यह संभव नहीं है में, निष्कर्षण के दौरान uracil डीएनए glycosylase (UDG) के साथ इलाज के आवृत्ति और deamination कलाकृतियों की तीव्रता को सीमित करने में सहायता कर सकते हैं। UDG (डीएनए FFPE किट का हिस्सा है) निष्कर्षण के दौरान FFPE ऊतक के उपचार सीमा कर deaminated जिससे कृत्रिम रूप से प्रेरित सी रोकने साइटोसिन अवशेषों: जी> टी: एक म्यूटेशन। हालांकि, 5 मिथाइलसिटोसाइन अवशेषों कि अक्सर CPG dinucleotides में पाए जाते हैं थाइमिन, जो UDG द्वारा excised नहीं किया जा सकता करने के लिए deaminated कर रहे हैं। जिसके परिणामस्वरूप अनुक्रमण कलाकृतियों काफी पहचानने योग्य होते हैं और जैसा कि चित्र 4 में अक्सर मिलकर म्यूटेशन के रूप में दिखाई देते हैं। नमूने पहले से ही निकाला गया है, UDG उपचार अपेक्षाकृत कम डीएनए नुकसान के साथ एक उच्च माध्यमिक निष्कर्षण में लागू किया जा सकता।

आकृति 1
चित्र 1: वैचारिक ओवWTB पीसीआर की rview। अवरोधक डीएनए संकर में एक एकल न्यूक्लियोटाइड बेमेल अप करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस से टी मीटर कम हो जाती है। द्वारा अवरुद्ध oligonucleotide डिजाइनिंग 10 का एक टी मीटर के लिए - 15 डिग्री सेल्सियस विस्तार के दौरान तापमान से ऊपर, WT डीएनए के प्रवर्धन जबकि उत्परिवर्ती डीएनए के प्रवर्धन की इजाजत दी अवरुद्ध है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: के साथ और म्यूटेशन के बिना रोगियों से जीनोमिक डीएनए द्वारा परीक्षण किया गया दोनों पारंपरिक और WTB पीसीआर और फिर ठेठ संवर्धन WTB पीसीआर द्वारा प्राप्त प्रदर्शित करने के लिए अनुक्रम। WTB पीसीआर प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया अवरोधक के अंतिम एकाग्रता जबकि WT डीएनए में झूठे सकारात्मक कारण या amplifica अवरुद्ध नहीं अधिकतम उत्परिवर्ती संवर्धन प्राप्त करने के लिए चयनित किया गया थाWT डीएनए पूरी तरह के tion। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र 3: संकेत तीव्रता में विशेषता ड्रॉप-ऑफ देखा जब एंजाइमी पीसीआर शुद्धि बजाय चुंबकीय मोतियों की प्रयोग किया जाता है। इसका कारण यह है एंजाइमी शुद्धि अवरोधक द्वि-दिशात्मक अनुक्रमण करने से पहले दूर करने के लिए विफल रहता है की संभावना है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्र 4: सी: जी> टी: एक अनुक्रमण कलाकृतियों FFPE ऊतकों में पैदा होती है जब साइटोसिन या मिथाइल साइटोसिन deaminated रहे vuracil या थाइमिन क्रमशः आइए formalin निर्धारण। Uracil डीएनए glycosylase (UDG) अनुक्रमण कलाकृतियों को कम करने के लिए मदद WTB पीसीआर से पहले uracil आबकारी कर सकते हैं। हालांकि, deaminated 5 मिथाइलसिटोसाइन, जो अक्सर CPG द्वीप पर होता है से उत्पन्न थाइमिन, UDG द्वारा excised नहीं किया जा सकता। WTB पीसीआर में इस्तेमाल अवरोधक की एकाग्रता कम अनुक्रमण कलाकृतियों कि UDG उपचार द्वारा की भरपाई नहीं कर रहे हैं की घटना कम करने में मदद कर सकते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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WTB पीसीआर परख यहाँ वर्णित विस्तार (चित्रा 1) के दौरान WT डीएनए के प्रवर्धन ब्लॉक करने के लिए तैयार किया गया एक अवरुद्ध oligo साथ प्राइमरों की एक सामान्य सेट का उपयोग करता। WTB पीसीआर उत्पाद तो उत्परिवर्तनीय विश्लेषण के लिए अनुक्रम है। WTB पीसीआर / सेंगर की उपयोगिता अपनी सादगी, उच्च संवेदनशीलता, और उच्च प्रवाह क्षमता में निहित है। दिशा निर्देशों यहाँ वर्णित का उपयोग करना, सबसे मौजूदा सेंगर आधारित assays बस एक अवरुद्ध oligonucleotide बहुत संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए के अलावा के माध्यम से संशोधित किया जा सकता। यहाँ प्रस्तुत उदाहरण परख में पीसीआर के लिए एक एकल अवरुद्ध oligonucleotide के अलावा WTB पीसीआर परख 3 में> 0.5% करने के लिए पारंपरिक परख के लिए WT की पृष्ठभूमि में लगभग 16% उत्परिवर्ती युग्मजीविकल्पी से पता लगाने की सीमा में वृद्धि हुई। जो के प्रभाव झूठी नैदानिक परीक्षण 3 में देखा नकारात्मक में एक 64% की कमी है। MYD88 में उत्परिवर्तन की उपस्थिति की पुष्टि महत्वपूर्ण निदान और शकुन impl हैications; झूठा नकारात्मक रूप में एक मामले की रिपोर्ट करने के लिए समग्र चिकित्सा और रोगी प्रबंधन पर गंभीर परिणाम हो सकते हैं। WTB पीसीआर के साथ परीक्षण काफी महत्व की है इसलिए, विशेष रूप से अपेक्षाकृत कम असामान्य कोषमयता के साथ रोगियों में।

WTB पीसीआर तकनीक में काफी भिन्नता है और कभी कभी LNA, BNA, या PNA की मध्यस्थता पीसीआर clamping या पीसीआर क्लैंप-जांच assays 2, 4, 23, 24 के लिए भी जाना जाता है। WTB पीसीआर का उपयोग कुछ बदलाव एक qPCR परख जरूरी है जो प्रत्येक विशिष्ट उत्परिवर्तन के लिए एक अतिरिक्त फ्लोरोसेंट जांच डिजाइनिंग शामिल है। एक महत्वपूर्ण इस तकनीक के साथ जुड़े चुनौती प्रतिस्पर्धात्मक रूप से बाध्यकारी जांच को सटीक ढंग से WT और उत्परिवर्ती जेनेटिक तत्व के बीच भेद को विकसित करने की जरूरत भी शामिल है। इसके अलावा, क्योंकि एक परिवर्तन विशिष्ट जांच की आवश्यकता है, qPCR दृष्टिकोण अज्ञात mutatio पता लगाने की क्षमता का अभाव हैएनएस। एक एलील विशिष्ट ढंग से WTB पीसीआर ब्लॉक WT प्रवर्धन की एक और भिन्नता। इसके बजाय तथापि उत्परिवर्तन विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग कर के, WT एलील के लिए एक अवरुद्ध जांच विशिष्ट बंधन पूरा प्राइमर को रोकता है। हालांकि यह दृष्टिकोण qPCR की तरह एक उत्परिवर्तन विशेष जांच की आवश्यकता नहीं है, यह उत्परिवर्तन और पोलीमर्स प्रेरित त्रुटियों में वृद्धि हुई झूठे सकारात्मक को जन्म दे सकता बीच भेद करना विफल रहता है। पीसीआर के माध्यम से उन पोलीमर्स प्रेरित त्रुटियों की घातीय प्रवर्धन दुर्लभ उत्परिवर्तनीय घटनाओं का पता लगाने के छंट जाते हैं। किसी भी दृष्टिकोण पीसीआर प्रवर्धन का उपयोग करता है म्यूटेशन के लिए बेहतर बनाने के लिए पीसीआर त्रुटियों 25, 26, 27 की आवृत्ति के आधार पर सीमित इसकी शुद्धता गया है। कई अन्य उच्च संवेदनशीलता के तरीके से अधिक WTB पीसीआर / सेंगर की एक मौलिक लाभ यह है कि यह दोनों WT टेम्पलेट और उत्परिवर्ती टेम्पलेट जिसका म्यूटेशन जीन क्षेत्र अवरुद्ध oligonucleoti द्वारा लक्षित बाहर होने की प्रवर्धन से बचाता हैडे। इसलिए, पीसीआर त्रुटियों पोलिमेरासिज़ द्वारा शुरू की प्रभावी ढंग से WT डीएनए के साथ फ़िल्टर किए जाते हैं। के रूप में पीसीआर या qPCR तथापि के विपरीत, संवर्धन अज्ञात म्यूटेशन है कि इस क्षेत्र को अवरुद्ध oligo द्वारा कवर के भीतर होने के लिए रखा जाता है। MYD88 के मामले में, WTB पीसीआर दोनों L265P और R264 * म्यूटेशन 3 का पता लगाने की अनुमति दी। अन्य लोग इसी तरह कई, कम आवृत्ति WTB पीसीआर 4, 28 के उपयोग के साथ म्यूटेशन का पता लगाने की सूचना दी है। यह दोनों अनुसंधान और नैदानिक ​​प्रयोजनों के लिए WTB पीसीआर आदर्श बनाता है।

उच्च संवेदनशीलता और झूठे सकारात्मक को नष्ट करने के लिए निहित आंतरिक नियंत्रण के साथ साथ, अवरोधक डिजाइन के साथ बहुत कुछ अतिरिक्त कदम के साथ एक मौजूदा अनुक्रमण परख अनुकूल के लिए WTB पीसीआर के लचीलेपन की स्थापना की assays के साथ कई प्रयोगशालाओं के लिए यह आकर्षक विकल्प। एक पारंपरिक परख में इस्तेमाल पीसीआर प्राइमरों के एक ही सेट आमतौर पर WTB पीसीआर भिन्नता में इस्तेमाल किया जा सकता है। OTउसके प्रोटोकॉल परिवर्तन है कि अत्यधिक FFPE ऊतक और उचित बाद पीसीआर शुद्धि के UDG उपचार WTB पीसीआर सहित के लिए सिफारिश कर रहे हैं समान रूप से हस्तांतरणीय के तरीके-कर रहे हैं। अवरोधक डिजाइन, इसलिए एक WTB पीसीआर परख को लागू करने में महत्वपूर्ण तत्व है। हालांकि इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत दिशा निर्देश है कि डिजाइन में सबसे अधिक प्रासंगिक कारकों का प्रतिनिधित्व करते हैं, विभिन्न अवरुद्ध ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स पीसीआर को माध्यमिक प्रभाव के बिना एक है कि ब्लॉक WT प्रवर्धन कुशलता से खोजने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए। यह जोड़ने या टी मीटर समायोजित करने के लिए अवरोधक ठिकानों को हटाने, WT टेम्पलेट को अवरुद्ध oligo रिश्तेदार की स्थिति को बदलने वाले, और oligo की कुल लंबाई को बदलने के भी शामिल है। अवरोधक अनुमापन प्रयोगों भी अनुक्रमण कलाकृतियों और पता लगाने की सीमा के स्वीकार्य घटनाओं के बीच एक संतुलन स्थापित करने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए।

म्यूटेशन कि मिनट सेल भागों में मौजूद हैं का पता लगाने के लिए एक उपयुक्त पद्धति का चयन वें पर बहुत निर्भर करता हैई आवेदन और रोग / उत्परिवर्तन प्रकार के। उत्परिवर्ती मात्रा वांछित है, तो qPCR या डिजिटल पीसीआर WTB पीसीआर / सेंगर की तुलना में अधिक व्यवहार्य समाधान दे सकते हैं। हालांकि WTB पीसीआर मुख्य रूप से एक गुणात्मक परख है, यह समानांतर में पारंपरिक और WTB पीसीआर के साथ एक नमूना परीक्षण द्वारा उत्परिवर्ती युग्मजीविकल्पी आवृत्ति का एक मोटा अनुमान निर्धारित करने के लिए संभव है। क्योंकि पारंपरिक परख के लिए पता लगाने की सीमा ~ 10 है - 20% WT की पृष्ठभूमि में उत्परिवर्ती युग्मजीविकल्पी, यह उचित है यह निष्कर्ष निकला कि म्यूटेशन WTB पीसीआर परख द्वारा पता लगाया लेकिन पारंपरिक नहीं एक एकाग्रता सीमा से कम में मौजूद हैं पारंपरिक परख के लिए पता लगाने के। कुछ assays बहुमुखी प्रतिभा, सरलता, और WTB पीसीआर की मजबूती प्रदान करते हैं। कम लागत और कम वापसी समय यह उपचार के बाद अवशिष्ट रोग का आकलन करने या चिकित्सा के दौरान विकसित प्रतिरोधक क्षमता के म्यूटेशन की निगरानी के लिए आदर्श बनाता है। साथ ही, पहले से undescribed म्यूटेशन पता लगाने की क्षमता अनुसंधान प्रयोजनों के लिए WTB पीसीआर आदर्श बनाते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes Eppendorf 05-402-25
100% alcohol VWR 89370-084 Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol
3730XL sequencer ABI or equivalent
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 For magnetic bead PCR purification
Aluminum sealing foils GeneMate T-2451-1 For PCR and cold storage
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit Life Technologies 4337455 For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 Series Eppendorf A-2-DWP rotor (for PCR plate)
Cold plate for 96 well plates Eppendorf Z606634
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water
dNTPs (100 mM) Invitrogen 10297-117
DynaMag-96 Side-Skirted Magnet Thermo Fisher Scientific 12027 For use in PCR Purification.
Ethanol Absolute  Sigma E7023 200 proof, for molecular biology
Exiqon website Oligo Tools www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL) Roche 12032937001 With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2
Gel electrophoresis apparatus 2% agarose gel
GeneRead DNA FFPE extraction Kit  Qiagen 180134 Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts
Hi-Di Formamide ABI 4311320 For sequencing.
LNA oligonucleotide Exiqon 500100 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)
M13-F Sequencing Primer ABI 5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequencing Primer ABI 5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S Thermocycler Eppendorf E950030020
Microcentrifuge Model 5430 Eppendorf FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes)
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
PCR forward primer IDT 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primer IDT 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR plates GeneMate T-3107-1
Pipettors 20, 200, 1,000 µL
Plate septa, 96 well ABI 4315933
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen 51304 For BM aspirate and peripheral blood
SeqScape Sortware v3.0 ABI 4474978 For sequencing analysis
Slide basket
Sodium Acetate (3 M, pH 5.2)  Sigma S7899
Sterile filtered pipette tips 20, 200, 1,000 µL
Thermomixer C  Eppendorf 5382000023
Vortex genie Scientific Industries SI-0236
Wash reservoir ~ 1,000 mL
Xylene VWR 89370-088 Histology grade

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References

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जंगली प्रकार अवरुद्ध पीसीआर कम आवृत्ति दैहिक उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक अति संवेदनशील विधि के रूप में प्रत्यक्ष अनुक्रमण के साथ संयुक्त
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Albitar, A. Z., Ma, W., Albitar, M. Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations. J. Vis. Exp. (121), e55130, doi:10.3791/55130 (2017).More

Albitar, A. Z., Ma, W., Albitar, M. Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations. J. Vis. Exp. (121), e55130, doi:10.3791/55130 (2017).

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