Abstract
Точное обнаружение и идентификация мутаций низких частот может быть проблематичным при оценке остаточной болезни после терапии, скрининг для новых мутаций устойчивости во время терапии, или когда пациенты имеют несколько циркулирующих опухолевых клеток. Дикого типа блокирования ПЦР с последующим анализом секвенирования обеспечивает высокую чувствительность, гибкость и простоту в качестве методики для обнаружения этих низкочастотных мутаций. При добавлении специально созданных заперт олигонуклеотид нуклеиновой кислоты к новому или ранее установленные обычному анализу секвенирования на основе ПЦРА, чувствительность приблизительно 1 мутантной аллели в фоне 1000 WT аллелей может быть достигнута (1: 1000). Секвенирование артефакты, связанные с дезаминирования событий обычно находятся в фиксированных формалином парафином тканей могут быть частично устранены за счет использования урацила ДНК-гликозилазы во время стадии экстракции. Оптимизированный протокол здесь специфичен для обнаружения мутации MyD88, но может служить в качестве шаблона для разработки любогоWTB-ПЦР-анализ. Преимущества анализа WTB-PCR по сравнению с другими, обычно используемыми анализами для обнаружения низких мутаций частот, включая аллели специфического ПЦР в реальное время количественный ПЦР включают в себя меньшее количестве вхождений ложных срабатываний, большую гибкость и простоту реализации, а также способность обнаруживать как известные и неизвестные мутации.
Introduction
Sanger секвенирования традиционно является золотым стандартом тестирования как известных, так и неизвестных соматических мутаций. Одним из ограничений Sanger секвенирования является его пределом обнаружения (~ 10 - 20% мутантная аллель в фоне WT) 1. Этот уровень чувствительности не подходит для выявления соматических мутаций низкого уровня, которые могут присутствовать в образцах из тканей предраковых или пациентов с небольшим количеством циркулирующих опухолевых клеток, или, когда костный мозг (ВМ) является неоднородным. Это также делает оценки остаточной болезни после терапии или обнаружение новых мутаций устойчивости во время терапии затруднена только 2 обычной последовательностью. Путем замены обычной ПЦР с запертой нуклеиновой кислоты (LNA) -опосредованной дикого типа блокирующий ПЦР (WTB-ПЦР) в Sanger секвенирования, чувствительность до 0,1% мутантного аллеля в фоне WT может быть достигнуто 2, 3, 4. ВWTB-ПЦР, обогащение мутантных аллелей достигается с помощью добавления короткого (~ 10 - 14 NT) блокирующего (МШУ) олигонуклеотид, который связывается преимущественно с БТ ДНК, тем самым предотвращая амплификации ДНК WT. Мутант, обогащенный продукт WTB-ПЦР может быть затем секвенировали. Блокируя WT ДНК, а не для выбора специфических мутаций WTB-ПЦР позволяет для обогащения известных и неизвестных мутаций, присутствующих в мельчайших фракциях клеток.
Различные методы в настоящее время используются для обнаружения мутаций в клетках небольших фракций. Это включает в себя аллель-специфической ПЦР-амплификации рефрактерной системы мутации (ARMS), денатурирующих высокоэффективной жидкостной хроматографии (DHPLC), шариков, эмульсий, усиления и магнетизмом (сияя), выпуск электрического поля индуцированный и измерения (EFIRM), высокое разрешение температура плавления и другие. Тем не менее, большинство из этих методов ограничены ложноположительных и способность обнаруживать только одну мутацию , что анализ был разработан для 4 5, 6.
Здесь показано увеличение чувствительности достигается за счет WTB-ПЦР в скрининга мутаций в миелоидной дифференцировки фактор 88 гена , как описано Albitar и соавт. 3 MyD88 mutatioнс являются важными диагностическими и прогностическими факторами в макроглобулинемии Вальденстремы (WM), IgM моноклональной гаммапатии неизвестного значение (IgM-MGUS), селезеночная лимфомы маргинальной зоны (SMZL) и диффузный крупноклеточные В-клеточная лимфому (ДВККЛО). MyD88 мутации встречаются практически во всех случаях WM и приблизительно 50% пациентов с иммуноглобулином М (IgM) -secreting MGUS. И наоборот, MyD88 мутации встречаются только в 0-6% пациентов с SMZL и отсутствуют в множественной миеломой 7, 8. Из - за перекрывающие морфологические, иммунофенотипический, цитогенетические и клинические характеристики между WM и SMZL или IgM-множественной миеломой часто может осложнить дифференциальные диагнозы, наличие мутации MyD88 может служить полезным идентифицирующим фактором 9. MyD88 мутация также была связана с большим бременем болезни у пациентов с ДВККЛОМ и плохой общей выживаемостью после лечения 7, 10. Кроме того, поскольку MyD88 мутация чаще обнаруживается в активированных В-клетках, как (ABC) ДВККЛО чем зародышевый центр В-клеточный тип (БКИ) ДККВЛ или первичную лимфому медиастинальных В-клетки (ПМБЛ), статус мутации MyD88 могут служить суррогатный маркер для подтипа ABC 11, 12.
Подробный протокол, представленный здесь служит в качестве матрицы, с которой новые анализы могут быть разработаны или большинство существующего секвенирования анализов могут быть легко адаптированы для точного обнаружения низкочастотных мутаций в разных типах образцов. Подход также может быть использован для контроля и обнаружения устойчивых мутаций, которые могут возникнуть в опухолях или даже бактерий, которые могут возникнуть в то время как пациенты проходят лечение с целевой терапией или антибиотиками. Кроме того, в нем рассматривается и средства правовой защиты, многие из проблем, связанных с обогащением мутаций, особенно в формалине фиксированного парафина (FFPE) ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: Все испытания образцов человека было проведено после получения наблюдательного совета Institutional (IRB) одобрения.
1. экстракции ДНК из FFPE ткани, периферической крови и костного мозга Аспирируйте
- Для костного мозга FFPE ткани с использованием набора для экстракции ДНК FFPE
- Начнем с FFPE ткани из неокрашенных слайдов (5 - 10 секции на 5 - толщина мкм 10).
Примечание: Если начало стружки ткани, использует 3 - 6 секций по 5 - 10 мкм толщины и перейти к этапу 1.1.6. - Поместите слайды в слайд корзины и подготовить четыре промывки резервуаров (два для ксилола и два на 100% алкоголя). Добавить минимальный объем 600 мл раствора в каждую корзину.
- Deparaffinize слайдов, делая 5 мин мыть ксилол в первом лотке. Передача слайдов на второй промывной резервуар ксилола в течение еще 5 мин.
- После депарафинизации, мыть слайды с 100% -ным спиртом в течение 5 мин. Передача слайдов в секундуспирта резервуар для стирки в течение еще 5 мин.
- Разрешить слайды высохнуть полностью под капотом, прежде чем выскабливание их с лезвием бритвы в микроцентрифужной трубку.
Примечание: Если слайд-Н & Е с областью опухоли показал, доступно, выровнять слайды и скрести только область опухоли. - Действуйте с инструкциями производителя раздаточный включены в комплект.
- Начнем с FFPE ткани из неокрашенных слайдов (5 - 10 секции на 5 - толщина мкм 10).
- Для BM аспираты и периферической крови
- Извлечение согласно инструкции раздаточного изготовителя с этими характеристиками.
Примечание: Существует многочисленные коммерчески доступные наборы и способы для выделения ДНК из тканей и клеток FFPE. Практически все они могут быть использованы. Используйте метод, который устанавливается в лаборатории.- Используйте 200 мкл периферической крови (PB) или 100 мкл ВМ + 100 мкл PBS.
- С помощью 4 мкл РНКазы А исходного раствора.
- Элюции с 100 мкл буфера для элюции.
- Извлечение согласно инструкции раздаточного изготовителя с этими характеристиками.
- Количественная ДНК
- Измерение концентрации ДНК с помощью спектрофотометра обеспечения / 280 нм соотношение 260 нм приблизительно 1,8 (для чистой ДНК). Если отношение заметно ниже, это может указывать на наличие белка, фенола, или других загрязняющих веществ, которые могут мешать вниз по течению приложений.
- Регулировка концентрации ДНК примерно 50 - 100 нг / мкл с соответствующим буфером для элюции.
2. дикого типа Блокирование ПЦР
- Грунтовка Design
- Конструкция и праймеры для получения интересующих генов в соответствии с ранее описанными общие принципы проектирования праймеров ПЦР - 13. Включить М13-прямого и обратного праймеров универсальные секвенирования в ПЦР-праймеров.
Примечание: Анализ MyD88 был разработан для амплификации экзона 5 из MyD88 (G259 - N291) и 110 нуклеотидов расположены в 5'-интронной области, чтобы покрыть сайт сплайсинга и часть интрона 4. прямые и обратные праймеры были разработаны с 5' -M13 последовательность (М13 вперед: TGT AAA ACG ACG GCC AGT; М13-обратное: CAG GAA ACA ATG GCT соотв) , чтобы обеспечить для отжига комплементарных праймеров секвенировани (см Материалы таблицу).
- Конструкция и праймеры для получения интересующих генов в соответствии с ранее описанными общие принципы проектирования праймеров ПЦР - 13. Включить М13-прямого и обратного праймеров универсальные секвенирования в ПЦР-праймеров.
- Закрытый нуклеиновые кислоты олигонуклеотид Design
- Конструкция блокирующего олигонуклеотида, чтобы быть приблизительно 10 - 15 оснований в длину и в дополнение к шаблону WT, где требуется мутант обогащение.
Примечание: Более короткий олиго улучшит рассогласования дискриминации. Для достижения высокой целевой специфичностью, важно не использовать слишком много блокирующих нуклеотиды, так как это может привести к очень «липким» олигонуклеотида. Содержание и длина и блокирование нуклеотид должны быть оптимизировать в зависимости от конкретного нуклеотида, которые должны быть заблокированы. Важно, чтобы достичь высокой специфичности связывания без ущерба для вторичной структуры и рисковать самое-комплементарность. - Конструкция блокирующего олиго иметь T M 10 - 15 ° C выше удлинительной TEMPERATЮр во время термоциклирования. Регулировка T м путем добавления или удаления блокирующих оснований или путем замены оснований для блокирования ДНК, избегая при этом длинные отрезки (3 - 4 оснований) блокирования G или C оснований.
- Перейдите на веб - сайт олиго инструментов (см таблицу материалов) и выберите «блокирующий Oligo Tm Предсказание» инструмент.
- Вставить последовательность матрицы WT, что желательно, чтобы быть заблокирован в поле «Oligo Sequence». Добавить «+» перед основаниями для обозначения блокатор оснований.
- Нажмите кнопку «Рассчитать» , чтобы определить приблизительное T м гибрида ДНК-блокатор.
- Конструкция блокирующего олий, чтобы избежать образования вторичной структуры или сами-димеры.
- Перейдите на веб - сайт олиго инструментов (см таблицу материалов) и выберите «блокирующий Oligo Оптимизатор» инструмент.
- Вставить последовательность матрицы WT, что желательно, чтобы быть заблокирован в поле, Добавить «+» перед основаниями для обозначения блокировки оснований.
- Выберите две коробки для «вторичной структуры» и «только на себя». Нажмите кнопку Analyze для обзора ольих для потенциально проблемных вторичных структур или самих-димеров.
Примечание: Оценки представляют собой очень грубые оценки Т м «s вторичных структур и сами-димеров. Более низкие оценки являются оптимальными и может быть достигнуто за счет ограничения блокатор-блокатор спаривание. Блокирующий олигонуклеотид для MyD88 [MYD88blocker (TCAGA + Ag + С + С + А + С + Т + С + А + Т + CC / invdT /)] был разработан, чтобы покрыть аминокислоты Q262-I266 и особенности 3'-перевернутой дТ ингибировать как расширение с помощью ДНК-полимеразы и деградации с помощью 3'-экзонуклеазы. Это специфическое блокирование олиго является 17mer с 10 блокирующих оснований, которые обозначены как «+ N». Остальные 7 оснований являются обычными нуклеотидами ДНК.
- Конструкция блокирующего олигонуклеотида, чтобы быть приблизительно 10 - 15 оснований в длину и в дополнение к шаблону WT, где требуется мутант обогащение.
- Установка WTB-ПЦР и термоциклирование
- Подготовьте WTB-PCR мастер-мих (ММХ) с использованием 2,5 мкл ПЦР - реакции буфера 10х Вт / 20 мМ MgCl 2, 250 мкМ дНТФ, 0,2 мкМ прямого и обратного праймера, 1,2 мкМ MYD88blocker и ДНКазы, РНКазы, сверхчистой H 2 O , чтобы создать окончательный объем раствора 21,75 мкл на реакцию.
Примечание: Рабочие концентрации для конечного объема реакционной смеси 25 мкл (после добавления ДНК-матрицы и полимеразы). Обычный ПЦР ММХИ получают, просто опустив добавление блокатора. Все шаги протокола остаются одинаковыми для обоих WTB и обычной ПЦР. Это может быть использовано в валидации и определение обогащения достигается добавлением блокатора.- При расчете количества MMX подготовить убедитесь, чтобы учесть 3 дополнительных реакций (положительных и отрицательных контролей и управления нешаблонного для проверки загрязнения) и по меньшей мере одна дополнительная реакция на ошибку пипетирования.
- Vortex MMX тщательно. ММХ можно хранить при температуре -80 ° С в течение до аууха.
- Добавить 0,25 мкл Taq ДНК-полимеразы на реакцию на MMX и инвертировать перемешать. После того, как полимеразная добавлен к MMX, держать его на льду.
- Поместите новый 96-луночный ПЦР планшет на холодную пластину и пипеткой 22 мкл MMX с полимеразой для каждой реакции хорошо.
- Добавьте 3 мкл геномной ДНК (50 - 100 нг / мкл в каждую из лунок, содержащих MMX с полимеразой.
- Уплотнение пластины и центрифуги кратко, чтобы обеспечить раствор достигнет нижней части каждой лунки.
- Загрузка пластины ПЦРА на амплификаторе.
- Установите условия термоциклирования для реакции WTB-ПЦР следующим образом: начальная денатурация при 95 ° С в течение 6 мин; 40 циклов денатурации при 95 ° С в течение 30 с, отжиг праймеров при 56 ° С в течение 30 секунд и удлинение при 72 ° С в течение 1 мин 20 с; Окончательное удлинение при 72 ° С в течение 10 мин.
Примечание: Лучшая практика включает в себя завершении оставшейся части протокола в физически отдельной области, чтобы избежать загрязнения ампликона яп будущих расстановок.
- Установите условия термоциклирования для реакции WTB-ПЦР следующим образом: начальная денатурация при 95 ° С в течение 6 мин; 40 циклов денатурации при 95 ° С в течение 30 с, отжиг праймеров при 56 ° С в течение 30 секунд и удлинение при 72 ° С в течение 1 мин 20 с; Окончательное удлинение при 72 ° С в течение 10 мин.
- Подготовьте WTB-PCR мастер-мих (ММХ) с использованием 2,5 мкл ПЦР - реакции буфера 10х Вт / 20 мМ MgCl 2, 250 мкМ дНТФ, 0,2 мкМ прямого и обратного праймера, 1,2 мкМ MYD88blocker и ДНКазы, РНКазы, сверхчистой H 2 O , чтобы создать окончательный объем раствора 21,75 мкл на реакцию.
- Выполнение гель - электрофореза в соответствии с ранее описанными протоколами 14 для того , чтобы определить , является ли WTB-ПЦР была успешной и подтвердить отсутствие амплификации в контроле без шаблона.
- Очистка ПЦР продукта с помощью магнитных шариков
- Удалить магнитные шарики от 4 ° С и довести до комнатной температуры.
- Передача 10 мкл ПЦР-продукта на новую пластину ПЦР.
- Vortex магнитных шариков энергично, чтобы полностью ресуспендировании магнитных частиц.
- Добавить 18 мкл магнитных гранул в каждую лунку на новой пластинкой. Пипетка смешать 10 раз.
- Инкубирую при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Поместите пластину ПЦР на боковой пластине огибала магнита в течение 2 мин до отдельных шариков из раствора.
- Аспирата супернатант с помощью многоканальной пипетки, избегая шарик гранул.
- 150 мкл 70% этанола в каждую лунку и инкубируют при комнатной температуре Foг, по меньшей мере 30 с. Аспирируйте этанол с помощью многоканальной пипетки и отбросить советы. Повторите эту процедуру промывания еще раз.
- Использование 20 мкл многоканальной пипетки аспирата оставшегося этанола из каждой лунки и отбросить советы.
- После того, как скважины сухие (~ 10 мин), снять с магнитной пластины и добавить 40 мкл нуклеазы свободной воды в каждую лунку, и смесь пипеткой в 15 раз или вихрь мягко.
- Инкубирую при комнатной температуре в течение 2 мин.
- Поместите пластину ПЦР на магнитной пластине в течение 1 мин до отдельных шариков из раствора.
- Передача 35 мкл очищенного продукта на новую пластину ПЦР. Это очищенный продукт ПЦР теперь готов приступить к двунаправленной последовательности или могут храниться при температуре -20 ° С до тех пор, пока это необходимо.
Примечание: При разработке нового анализа, может потребоваться определение количества очищенного продукта ПЦР. 1 - 3 нг / мкл ДНК-ампликон является оптимальным для двунаправленного секвенирования. Если концентрация стабильно низкая, увеличить продукт ПЦР и магнитные шарики proportionally (1: 1,8). Если концентрация стабильно высокая, элюирование с большим объемом воды.
3. Секвенирование WTB-PCR продукта
- Bi-Directional Секвенирование
Примечание: Следующий протокол представляет собой модифицированную форму инструкции изготовителя, которые были оптимизированы для использования меньшего количества реагентов.- Приготовьте вперед и обратная реакция секвенирования смешивается с 0,25 мкл Ready реакционной смеси, 1,88 мклы Sequencing буфера, 1,78 мкМ М13-F или М13-R секвенирование праймеров и добавлять и ДНКазы, РНКазы, сверхчистая H 2 O для создания окончательного решения объем 9 мкл на реакцию. Это секвенирование реакционная смесь можно хранить при температуре -20 ° С в течение до одного года.
- Пипетка 9 мкл реакционной смеси секвенирование вперед в каждую лунку 96-луночного новой ПЦР пластины для реакции секвенирования вперед. Повторите на отдельной пластине для обратной реакции секвенирования.
- Добавить 1 мкл очищенного WTB-PCR продукта Tо каждой лунке на оба прямых и обратные пластины.
- Уплотнение пластины и центрифуги кратко, чтобы обеспечить раствор достигнет нижней части каждой лунки.
- Загрузка пластины ПЦРА на амплификаторе.
- Установите условие термоциклирования для реакции секвенирования следующим образом: 96 ° С в течение 1 мин; 30 циклов 96 ° С в течение 10 сек, 50 ° C в течение 5 сек, 60 ° C в течение 4 мин; удерживать при 4 ° С до готовности для очистки.
- Очищают секвенирования продуктов
- Подготовьте свежий 1:25 раствор 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 100% -ным этанолом.
- Подготовьте свежий 70% -ный раствор этанола.
- Добавьте 30 мкл ацетата натрия / 100% -ный раствор этанола в каждую лунку обоих прямого и обратного секвенирования пластин и пипеткой смеси 5 раз.
- Reseal пластины и инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Центрифуга планшет при 2250 х г в течение 15 мин.
- Снимите пластину герметик и инвертировать над тратойконтейнер.
Примечание: Обратить только один раз или гранулы могут ослабнуть из скважины грунтов. - Поместите перевернутую тарелку на чистое бумажное полотенце и центрифуге при 150 мкг в течение 1 мин.
- Добавить 150 мкл 70% этанола в каждую лунку.
- Reseal пластины и вращение при 2,250 мкг в течение 5 мин.
- Повторите шаги 3.2.6 и 3.2.7.
- Если скважины не являются полностью сухими, позволяют им высохнуть на воздухе при комнатной температуре. Убедитесь в том, что образцы были защищены от света во время сушки.
- Добавляют 10 мкл формамида в каждую лунку и пипетку смесь 10 раз. Reseal пластины.
- Денатурации на амплификаторе при 95 ° С в течение 3 мин с последующей 4 ° С в течение 5 мин.
- После денатурации, заменить пластину герметик с перегородками и последовательностью на секвенирование платформы в соответствии с инструкциями изготовителя 15.
4. Анализ результатов секвенирования
- Визуализируйте секвенирование следы использования секвенирования DATпрограммное обеспечение анализа в соответствии с инструкциями изготовителя 16 и выравнивают с соответствующими опорными последовательностями. Совместите MyD88 к NCBI эталонной последовательности «NM_002468».
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Концептуальный обзор WTB-PCR во время расширения представлена на рисунке 1. Поскольку один нуклеотид несоответствие в гибридном блокаторе-ДНК значительно снижает его температуру плавления (t м = 20 - 30 ° C), усиление аллель WT блокируется , а мутант матричной ДНК является свободной , чтобы завершить расширение 17. Таким образом, мутант ДНК усиливается в геометрической прогрессии, а БТ ДНК усиливается по линейному закону.
Демонстрация мутантного обогащения достигается за счет WTB-ПЦР представлены на фиг.2. Геномная ДНК у пациентов с и без мутаций были испытаны как обычные, так и WTB-ПЦР и затем секвенировал, чтобы продемонстрировать типичное обогащение достижимо WTB-ПЦР и отсутствие ложных срабатываний в WT ДНК. Рабочая концентрация блокатора, используемый в WTB-PCR MMX должна быть определена экспериментально и титрования сhould достичь желаемого уровня мутантного обогащения, а не в результате ложных срабатываний или блокирования амплификации ДНК WT полностью. Секвенирование анализ продукта WTB-ПЦР показывает обогащение для мутантного аллеля и предел обнаружения свыше 0,5% мутантного аллеля в фоне WT по сравнению с 16% в обычной ПЦР 3.
Эффекты этого увеличения чувствительности в клинических испытаниях могут варьироваться в зависимости от относительного количества опухолевых клеток в испытанных образцах. В исследовании сравнения методы, анализ WTB-ПЦР , описанный здесь показал , что 64% MyD88 мутаций будет не хватать обычного тестирования пациентов с WM или MGUS 3.
Характерные высадки в интенсивности сигнала (рисунок 3) часто наблюдаются , если слишком высокая концентрация блокатора используются или если пост-ПЦР purificaТион не удалось удалить блокировщик до начала двунаправленного секвенирования. Последнее продемонстрировано, когда очистка магнитных гранул заменяется ферментативной очистки. Хотя ферментативные очистки является привлекательным вариантом при работе с большими номерами образцов, это не подходит для применения с WTB-ПЦРОМ, как он не может удалить блокатор из раствора перед секвенирование.
Пример артефактов последовательности часто встречаются в FFPE-ДНК , полученной в результате цитозин дезаминирования (C: G> Т: А) представлены на рисунке 4 3, 18, 19, 20. Хотя фактические причины цитозина дезаминирования мало изучены, любой основе анализа ПЦР , который обогащает для мутантных аллелей будет обнаружить эти низкочастотные артефакты 21, 22. Ложные срабатывания из-за DEAвенгр лучше избегать, начиная с высококачественным материалом шаблона; во многих случаях, когда это невозможно, лечение с помощью ДНК урацила гликозилазы (UDG) во время экстракции, может помочь в ограничении частоты и интенсивности дезаминирования артефактов. УДГ лечение FFPE ткани во время экстракции (как часть набора ДНК FFPE) акцизные дезаминируются цитозин остатков таким образом, предотвращая искусственно индуцированные C: G> Т: А мутация. Тем не менее, 5-метилцитозин остатки, которые часто возникают при CpG динуклеотидов являются дезаминируются на тимин, которые не могут быть вырезанным по UDG. Полученные в результате секвенирования артефакты довольно узнаваемый и часто появляются как тандемных мутаций , как показано на рисунке 4. Если образцы уже были извлечены, лечение УДГА может быть реализовано в виде вторичной экстракции с относительно низких потерь ДНК.
Рисунок 1: Концептуальная Овеrview из WTB-PCR. Один нуклеотида несоответствие в гибридном Блокаторе-ДНК уменьшается Т м до 30 ° C. При проектировании блокирующего олигонуклеотида , чтобы иметь Т м 10 - 15 ° C выше температуры во время расширения, усиление WT ДНК блокируется, позволяя амплификации мутантной ДНК. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: геномная ДНК у пациентов с и без мутаций были испытаны как обычные , так и WTB-ПЦР и затем секвенировал , чтобы продемонстрировать типичное обогащение достигаемого WTB-PCR. Конечная концентрация блокатора используется для достижения WTB-ПЦРА была выбрана для достижения максимального мутантного обогащения, а не вызывая ложные срабатывания в ДНК WT или блокирования amplificaТион из WT ДНК полностью. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Характеристика высадки в интенсивности сигнала видно при ферментативной очистки ПЦР используют вместо магнитных шариков. Это, вероятно, из-за очистки ферментативных не удается удалить блокировщик перед двунаправленным секвенирование. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: С: G> Т: А секвенированией артефакты возникают в FFPE ткани , когда цитозин или метилированный цитозин дезаминируется vИ. формалина фиксации в урацил или тимин, соответственно. Урацил-ДНК-гликозилаза (УДГ) может иссечь урацил до WTB-PCR помогает уменьшить секвенирование артефактов. Тем не менее, тимин в результате дезаминированного 5-метилцитозина, который часто происходит при CpG островков, не может быть вырезана с помощью UDG. Уменьшение концентрации блокатора, используемого в WTB-ПЦР может помочь уменьшить возникновение секвенирования артефактов, которые не устранены путем обработки UDG. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ WTB-ПЦР , описанный здесь используется общий набор праймеров с блокирующим олигонуклеотидом , предназначенным для блокирования амплификации ДНК WT при растяжении (рисунок 1). Продукт WTB-ПЦР секвенировали для мутационного анализа. Полезность WTB-PCR / Sanger заключается в его простоте, высокой чувствительности и высокой пропускной способностью. Используя принципы, описанные здесь, большинство существующих на основе Sanger анализов могут быть просто модифицированы путем добавления блокирующего олигонуклеотида значительно повысить чувствительность. В примере анализа , представленного здесь добавление одного блокирующего олигонуклеотида к ПЦР увеличен предел обнаружения приблизительно от 16% мутантной аллели в фоне WT для обычного анализа до> 0,5% в анализе WTB-PCR 3. Эффект которого является снижение на 64% в ложноотрицательных видели в клинических испытаниях 3. Подтверждая наличие мутаций в MyD88 имеет существенные диагностические и прогностические осущийications; ложно сообщая случай как отрицательный, может иметь серьезные последствия для общей терапии и лечения пациента. Тестирование с WTB-ПЦРОМ имеет большое значение, особенно у больных с относительно низкой ненормальной ячеистости.
Методы WTB-ПЦР значительно различаются , и иногда называют взаимозаменяем с МШИТЕ, BNA или ПНК-опосредованного ПЦР или ПЦР зажимных-зажим-зонд анализов 2, 4, 23, 24. Некоторые варианты, использующие WTB-ПЦР включать анализ КПЦРА что требует дополнительного проектирование флуоресцентного зонда для каждой конкретной мутации. Существенная проблема, связанная с этой техникой, включает в себя необходимость разработки конкурентного связывания зондов, которые точно различающих WT и мутантных аллелей. Кроме того, поскольку требуется мутация специфический зонда, подход КПЦРА отсутствует способность обнаруживать неизвестные mutatioнс. Другой вариант WTB-ПЦР-амплификации блоков WT в аллель-специфическим образом. Вместо использования мутации специфических праймеров, однако, блокирующий зонд, специфичный для аллели WT ингибирует полную грунтовку связывания. Хотя такой подход не требует мутацией специфического зонда как кПЦР, он не дискриминировать между мутациями и полимеразы индуцированных ошибок может привести к увеличению ложных срабатываний. Экспоненциальное усиление этих ошибок полимеразы индуцированных посредством ПЦР может скрывать обнаружение редких мутационных событий. Любой подход , который использует ПЦР - амплификации для обогащения мутаций его точность ограничена частотой ошибок ПЦР 25, 26, 27. Фундаментальное преимущество WTB-PCR / Sanger в течение многих других методологий высокой чувствительности является то, что он предотвращает усиление как шаблона WT и мутантного шаблон, чьи мутации происходят за пределами области гена мишени блокирующего oligonucleotiде. Таким образом, ПЦР ошибка, вносимая полимеразы эффективна отфильтрована вместе с WT ДНК. В отличие от AS-PCR или КПЦР однако, обогащение сохраняется для неизвестных мутаций, которые происходят в пределах области, охватываемой блокирующего олигонуклеотида. В случае MyD88, WTB-ПЦР позволило обнаружение обоих L265P и R264 * 3 мутаций. Другие аналогично сообщили об обнаружении множественных низкочастотных мутаций с использованием WTB-ПЦР 4, 28. Это делает WTB-PCR идеально подходит как для научных исследований и клинических целей.
Наряду с высокой чувствительностью и присущим внутренним контролем для устранения ложных срабатываний, гибкость WTB-PCR для адаптации существующего анализа секвенирования с очень мало дополнительными шагами с дизайном блокатора делает его привлекательным вариант для многих лабораторий с устоявшимися анализами. Же набор PCR-праймеров, используемых в обычном анализе, обычно могут быть использованы в варианте WTB-PCR. Ветхий Заветее изменения протокола, которые настоятельно рекомендуется для WTB-ПЦР, включая UDG обработку FFPE ткани и соответствующие очистки после ПЦР-методик одинаково передаваемом. дизайн окон, поэтому является важным элементом в осуществлении анализа WTB-PCR. Хотя принципы, представленные в данном протоколе представляют собой наиболее существенные факторы в этой конструкции, различные блокирующие олигонуклеотиды должны быть проверены, чтобы найти один, который блокирует WT амплификации эффективно без вторичных эффектов для ПЦР. Это включает в себя добавление или удаление блокатора оснований для регулировки Т м, сдвигая положение блокирующего олигонуклеотида по отношению к шаблону WT, и изменение общей длины олигонуклеотида. Эксперименты титрования Blocker должны также быть использованы, чтобы установить баланс между приемлемыми вхождениями секвенирования артефактов и пределом обнаружения.
Выбор соответствующей методологии для обнаружения мутации, которые присутствуют в мельчайших фракциях клеток в значительной степени зависит от того, гое применение и типа болезни / мутации. Если мутант Количественное желательно, КПЦР или цифровой ПЦР может предложить более эффективные решения, чем WTB-PCR / Sanger. Хотя WTB-ПЦР в первую очередь качественный анализ, можно определить приблизительную оценку мутантного частоты аллеля путем тестирования образца с обычным и WTB-ПЦР параллельно. Так как предел обнаружения для обычного анализа составляет ~ 10 - 20% мутантная аллель в фоне WT, уместно сделать вывод о том, что мутации обнаружены с помощью анализа WTB-ПЦР, но не обычные присутствуют в концентрации менее, чем предел обнаружения для обычного анализа. Немногие анализы предлагают универсальность, простоту и надежность WTB-ПЦР. Низкая стоимость и короткое время обработки делают его идеальным для оценки остаточного заболевания после терапии или мониторинга возникающих мутаций устойчивости во время терапии. Кроме того, способность обнаруживать ранее не описанные мутации делает WTB-ПЦР идеально подходит для исследовательских целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05-402-25 | |
| 100% alcohol | VWR | 89370-084 | Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol |
| 3730XL sequencer | ABI | or equivalent | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | For magnetic bead PCR purification |
| Aluminum sealing foils | GeneMate | T-2451-1 | For PCR and cold storage |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit | Life Technologies | 4337455 | For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer |
| Centrifuge 5804 Series | Eppendorf | A-2-DWP rotor (for PCR plate) | |
| Cold plate for 96 well plates | Eppendorf | Z606634 | |
| DNAse, RNAse-free, ultra-pure water | |||
| dNTPs (100 mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
| DynaMag-96 Side-Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | For use in PCR Purification. |
| Ethanol Absolute | Sigma | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| Exiqon website Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
| FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL) | Roche | 12032937001 | With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2 |
| Gel electrophoresis apparatus | 2% agarose gel | ||
| GeneRead DNA FFPE extraction Kit | Qiagen | 180134 | Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts |
| Hi-Di Formamide | ABI | 4311320 | For sequencing. |
| LNA oligonucleotide | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases) |
| M13-F Sequencing Primer | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
| M13-R Sequencing Primer | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
| Mastercycler Pro S Thermocycler | Eppendorf | E950030020 | |
| Microcentrifuge Model 5430 | Eppendorf | FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes) | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| PCR forward primer | IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG | |
| PCR reverse primer | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
| PCR plates | GeneMate | T-3107-1 | |
| Pipettors | 20, 200, 1,000 µL | ||
| Plate septa, 96 well | ABI | 4315933 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | For BM aspirate and peripheral blood |
| SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | For sequencing analysis |
| Slide basket | |||
| Sodium Acetate (3 M, pH 5.2) | Sigma | S7899 | |
| Sterile filtered pipette tips | 20, 200, 1,000 µL | ||
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash reservoir | ~ 1,000 mL | ||
| Xylene | VWR | 89370-088 | Histology grade |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
- Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).
- Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).
- Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).
- Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15 (8), 420 (2014).
- Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).
- Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).
- Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).
- Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).
- Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).
- Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).
- Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).
- Applied Biosystems. User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).
- Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).
- Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).
- Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).
- Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).
- Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).
- Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).
- Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).
- Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).
- Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).
- Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).
- Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).
- Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126 (23), 716 (2015).
