Abstract
Skjelettmuskulatur er sammensatt av myofibers, de største cellene i pattedyrkroppen og en av de få syncytia. Hvordan de komplekse og evolusjonært konserverte strukturer som komponerer det er satt sammen er fortsatt under etterforskning. Deres størrelse og fysiologiske funksjoner ofte begrense manipulasjon og bildebehandlingsprogrammer. Den kultur av udødeliggjorte cellelinjer er mye brukt, men den kan bare gjenskape de tidlige trinnene for differensiering.
Her beskriver vi en protokoll som muliggjør enkel genetisk manipulering av myofibers stammer fra primære muse myoblasts. Etter en uke av differensiering, de myofibers viser kontraktilitet, justert sarcomeres og triader, samt perifere kjerner. Hele differensieringsprosessen kan etterfulgt av levende avbildning eller immunfluorescens. Dette systemet kombinerer fordelene ved de eksisterende ex vivo og in vitro-protokoller. Muligheten for enkel og effektiv transfeksjon i tilleggenkel tilgang til alle differensieringsstadier utvider mulige bruksområder. Myofibers senere kan brukes ikke bare for å løse relevante utviklings- og cellebiologi spørsmål, men også for å reprodusere muskelsykdom fenotyper for kliniske applikasjoner.
Introduction
Skjelettmuskulatur komponerer opptil 40% av den menneskelige kroppsvekt 1. Muskel-forbundet lidelser representerer en enorm helse og økonomisk byrde to. Hvordan dette svært komplekse og organisert vev dannes, opprettholdes, og regenerert utgjør et omfattende og godt etablerte forskningsfelt. Avhengig av den spesifikke vitenskapelig interesse, kan den mest egnet tilnærming spenner fra enkle myotube kulturer til komplekse in vivo-modeller 3 - 6.
Målet med denne protokollen er å gi en in vitro system som gjør det mulig for overvåking av myogenesen gjennom live bildebehandling og immunfluorescens. Sammenlignet med tradisjonelle tilnærminger, har dette systemet en meget fullstendig og dynamisk innsikt i mus myogenisk prosessen. Celler kan følges fra myoblast scenen til den modne, multinucleated myofiber viser tverrgående triader og perifere kjerner 7. Denne modningsnivå kanoppnås ved hjelp av vanlige cellekulturer utstyr, uten behov for kompliserte stimulerende eller mekaniske anordninger. Selv om noen vellykkede in vitro systemer har blitt rapportert 8,9, så vidt vi vet, er dette den eneste protokollen generere modne muse myofibers med T-tubuli tvers paret med sarkoplasmatisk retikulum (SR). Således kan dette in vitro-system kan brukes til å studere de molekylære mekanismer for triaden formasjon, som fortsatt er dårlig forstått 10.
En ytterligere fordel ved å bruke dette systemet er tilgjengeligheten av validerte mus-målrettede ressurser, for eksempel antistoffer, medikamenter, og RNAi verktøy. Den relativt enkel protokoll krever ikke arbeidskrevende trinn, svært dyktig manipulering, eller dyrt og dedikert utstyr. Forfalt myofibers begynne å vises etter 5 d av kultur differensiering 7, viser kontraktilitet kombinert med kalsium gnister (upubliserte data). I en uke, de forskjellige utviklingsal stadier av en av de mest komplekse celler i pattedyrkroppen kan studeres i kombinasjon med et utvalg av in vitro analyser.
Protocol
MERK: En mus frambringer tilstrekkelig myoblasts for ca to 35 mm retter eller to live bilde retter, så planlegger mattings, disseksjon og belegg (trinn 2.6) tilsvarende. Siden myoblaster isoleres ved sekvensielle sentrifugeringer og forhåndspåleggingen, bør protokollen gjøres i grupper på 5 - 10 dyr.
Alle prosedyrer som involverer dyr fag ble godkjent av dyreetikk Utvalget ved Instituto de Medicina Molecular og Universitetet Pierre et Marie Curie
1. Disseksjon av Neonatal Mus Hind-lem muskler
- Forbered alle løsninger på forhånd (Materialer Table) og sterilisere ved filtrering (0,22 mikrometer filter). Sørge for at alle medier ved 37 ° C før tilsetning til cellene, bortsett fra preparater som inneholder basalmembran matriks (f.eks Matrigel).
- Steriliser disseksjon materiale (en av hver av: buede saks, rette saks, vanlig pinsett,og fin-spiss tang) og en arbeidsbenk ved å tørke dem med 70% etanol.
- Forbered en 100 mm petriskål med 5 ml Dulbeccos fosfatbufret saltvann (DPBS) for muskel innsamling og holde det på is inntil hakking trinn.
- Halshogge P6 - P8 mus med rette saks og sterilisere huden med 70% etanol.
- Lag et snitt i ryggen huden og dra den forsiktig mot baklemmene til den er fjernet, helt utsette hind-lem muskulatur.
- Bruk pinsett til å fjerne fettvev uten å skade musklene.
- For å fjerne rygg hind-lem muskler, holde lem strekkes og bøyes labben for å avdekke hæl sener. Bruk buet saks for å skille muskel fra benet, fra sener, ved å skyve og kutte oppover. Skjære musklene og plassere dem i avkjølt DPBS.
- Isolere quadriceps ved å knipe musklene med fin-tip pinsett og kutte rundt det uten å skade femur eller kneleddet.
- Etter dissekere alle dyr, videre til en steril laminær cellekultur hette, der alle de følgende trinn skal utføres.
2. Myoblast Isolation
- Fjerne overskuddet av DPBS. Hakke vevet med sterilisert buede saks for å oppnå en ensartet masse.
- Samle kvernet vev i et 50 ml konisk sentrifugerør ved hjelp av 5 mL fordøyelse blanding og inkuber det under omrøring ved 37 ° C i 90 min.
- Stopp fordøyelse ved å tilsette 6 ml av disseksjon medium og sentrifuger suspensjonen i 5 min ved 75 x g for å pelletere den gjenværende vev.
- Samle forsiktig supernatanten. Sørg for å ikke samle vev rusk. Sentrifuger det ved 350 xg i 5 min; resuspender den i 5 ml disseksjon medium.
- Filtrer cellesuspensjonen gjennom en 40 um celle sil. Legg 25 ml disseksjon medium og preplate det i en 150 mm skål i 4 timer i en cellekulturinkubator (37 ° C og 5% CO 2 </ Sub>) for å tillate fibroblaster å følge.
- Mens forhåndspåleggingen, belegge retter med 500 pl basalmembran matrise fortynnet 1: 100 i kaldt IMDM i 1 time ved RT. Vask en gang med DPBS og plate cellene umiddelbart (trinn 2.8) eller la med vekstmedium til plating.
- Etter at forhåndspåleggingen, samle supernatanten og sentrifugere det ved 350 xg i 10 min.
- Resuspender den i vekstmedium og tell cellene på et hemocytometer. Juster volumet slik at mellom 150.000 og 250.000 celler er belagt per basalmembran matrix-belagt parabolen. Holde cellene i en cellekulturinkubator.
3. Myofiber Differensiering
MERK: Etter tre d, bør cellene begynner å smelte og danne myotubes på rundt 70% konfluens (figur 1B).
- På dette punktet, transfektere cellene, om ønskelig, med et siRNA eller DNA av interesse. Hvis cellene er ikke å bli tilført, endre direkte til differensiering medium og skip til trinn 3.4.
- Transfektere med transfeksjon reagenser etter produsentens anvisninger. Cellene inkuberes i 5 timer med siRNA-lipid-komplekser (20 nM + 1 pl av reagens) eller DNA-lipid-komplekser (1 pg + 1 pl av reagens). Optimalisere siRNA og DNA-konsentrasjoner ved behov.
- Vask dem en gang med differensiering medium og deretter bytte til ny differensiering medium.
- Den følgende dag, fortynne basalmembranen matriksen 1: 2 i iskald differensiering medium. Fjern den eksisterende medium og tilsett 200 mL av iskald matrise til hver tallerken.
- Inkuber i 30 minutter i en cellekulturinkubator.
- Supplere differensieringsmedium med agrin (100 ng / ml) og tilsett forsiktig 2 ml til cellene.
- endre nøye halvparten av mediet hver to d, alltid supplere med agrin til en endelig konsentrasjon på 100 ng / ul.
- Overvåk celledifferensiering og levedyktighet. Avhengig av en rekke faktorer (for eksempel FBS og chicken embryo ekstrakt opprinnelse), kan cellene ta mellom 5-10 differensiering d å nå full modning (figur 2).
4. Farging i Glass-bunn Retter
- For farging, når som helst punkt av interesse, vaske cellene gang med DPBS og fikse dem med 4% PFA ved RT i 10 min.
- Vask dem to ganger med DPBS. På dette punktet, kan cellene bli lagret ved 4 ° C.
- Permeabilize dem med 0,5% Triton X-100 i 5 min ved RT.
- Vasker dem to ganger med PBS og blokker med blokkeringsløsning i 30 minutter ved RT.
- Inkuber dem med primært antistoff fortynnet i blokkeringsløsning O / N ved 4 ° C.
- Vask 3 ganger med DPBS i 5 min ved RT.
- Inkuber dem med det sekundære antistoff og 0,2 ug / ml av DAPI i 1 time ved RT.
- Vask 3 ganger med DPBS i 5 min ved RT.
- Tilsett 200 mL av monteringsmedium og fortsett til bildebehandling.
Representative Results
Omfanget av myofiber utvikling er hovedsakelig bestemt av renhet og levedyktigheten av de isolerte myoblaster. Den adhesjon, spredning, og fusjons kapasitet kan brukes for empirisk å få tilgang til disse parametrene (figur 1 A, B). Ved spredning D2, bør myoblasts har overholdt og skal vise den typiske fusiform form. Spredning er forventet å skje i stor utstrekning på dette stadium, som fører til spontan myotube formasjon påfølgende dag (figur 1B).
Cell konfluens trenger små justeringer. Det bør økes hvis myoblasts ta mer enn tre d til spredning og sikring. Det bør bli redusert hvis myofibers ikke får lov til å vokse og forlenge relativt rett på grunn av deres tetthet. Konfluens avtar vanligvis fra sentrum til periferien av fatet, så de beste myofibers bør finnes mot ytre strøk.
Myotubes vil raskt forlenges og vise flere sentralt justert kjerner (figur 1C). Ved D5, noen celler begynner å anskaffe striper og flytte sine kjerner til periferien. Antallet myofibers med modne egenskaper vil øke med tiden, så vel som med celletykkelsen (figur 1D).
Graden av differensiering kan videre observeres ved immunfluorescens. Myofibers fast ved differensiering D8 nåværende tverrgående triader. Dette kan bekreftes ved bilde komponenter av T-tubuli (DPHR) og SR (triadin), som forventes å colocalize på triader (figur 2).
Funksjonaliteten til myofibers kan løses av levende avbildning. Fra differensiering D3 og utover, cellene vise spontan rykninger. Ved trans en kalsium sensor (f.eks., GCaMP6f 11), er det mulig å observere at sammentrekningene er kombinert med kalsium topper (figur 3).
Ved hjelp av dette systemet, var vi i stand til å identifisere en ny molekylær vei som blir forstyrret i centronuclear myopatier og Myotonic dystrophies, som derfor kan være en roman mål for innovative molekylære terapi 7. Vi har også tilpasset denne metoden til å studere utviklingen av nevromuskulære krysset (NMJ) 12. Gjennom coculture med rotte ryggmargs explants, har vi beskrevet en rolle for dynein i NMJ formasjon 13.
Figur 1: utviklingsstadier av Myoblast Culture. A) Ved spredning D2, har myoblasts levd og startet voksende. B) På formeringenbeid D3, en confluency på 60 - 80% er nådd, og myoblasts starte fusing spontant. C) Ved differensiering D3, myotubes inneholder sentralt beliggende kjerner er dominerende. D) Fra differensiering D5 og utover (f.eks, dag 8), myofibers begynne å stille striper og perifere kjerner og begynner å tykne. Skala: 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representant Confocal Bilde av en D8 Myofiber immunfarging. A) farging for dihydropyridine reseptor (DHPR, topp panel) og triadin (TRDN, midtre panelet). Et overlegg av DHPR, TRDN, og DAPI kanaler viser colocalization av triaden komponenter. B) En intensitet profil av den gule linje trukket under A. C) En 3D-bilde av volumgjengivelse av myofibers farget for α-actinin (grønn) og DAPI (blå). Scale bar og grid bredde: 5 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Levende Imaging av kalsiumnivåer i Myofibers med Spontan Rykninger. A) Høyhastighets time-lapse (20 ms rammer) mikroskopi av en kalsium gnist i et rykninger myofiber. Kalsium ble oppdaget gjennom uttrykket av GCaMP6f (Addgene plasmid # 40755). B) Kvantifisering av fluorescens-intensitet over tid for kalsium sensoren i panel A._blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Bruken av denne protokoll for dyrking av primære myoblaster gir opphav til en spesiell nisje som i stor grad gir næring til utvikling av myofibers. Dette er delvis på grunn av andre celletyper som også er til stede i meget små mengder. En balanse mellom myoblast konsentrasjon og kultur renhet må oppnås. En god cellekultur er også avhengig av kvaliteten av de anvendte produkter for mediet formulering. Alle produkter som stammer fra dyr bør bli grundig testet. I vår erfaring, bør fordøyelsen forholdene også overvåkes.
Som vanlig for primærkulturer, kan eksperimentell variabilitet være høyere enn i studier med isolerte fibre eller udødelig myoblasts. Denne variasjonen kan bli redusert ved standardisering av mellomstore og fordøyelse komponenter, mus alder og størrelse, og tidspunktene for kultur manipulasjon og resultater samling. Likevel fordelen av saumfarer i sanntid intrikate mekanismernødvendig for myofiber utvikling i stor grad overgår variasjonen ulempe.
Denne protokollen overfører fordelene ved in vitro-metoder uten at det går celledifferensiering. Myofibers modnes inntil treklanger dannes og sammentrekninger er koplet til kalsium gnister. kan nås disse funksjonelle utgangene i forskjellige eksperimentelle betingelser. Videre kan det være mange tekniske variasjoner som er gjort i protokollen. Myoblasts kan høstes fra neonatale mus med mutasjoner av interesse knyttet til muskel utvikling. Celler kan bli lysert for biokjemiske analyser på forskjellige tidspunkter differensiering. Kalsium indikatorer kan legges til kultur for å følge dens dynamikk. Optogenetic konstruksjoner kan anvendes for å innføre visse signalveier eller for å indusere spesifikke lokale reaksjoner. Endelig kan myofibers bli cocultured med andre celletyper for å studere deres interaksjoner.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II | Gibco | 17105041 | |
| Collagenase type V | Sigma-Aldrich-Aldrich | C9263 | |
| IMDM, Glutamax supplemented | Gibco | 31980022 | |
| Matrigel Growth reduced factor | Corning | 354230 | protein concentration of the lot should be around 10 mg/mL and endotoxin result should be <1.5 |
| Chicken Embryo Extract | MP biomedical | 2850145 | it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012)) |
| Recombinant rat agrin | R&D systems | 550-AG-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Horse Serum | GE Healthcare | 11581831 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | used to transfect siRNA |
| Lipofectamine LTX | Invitrogen | 15338-100 | used to transfect DNA |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668030 | used to transfect siRNA plus DNA |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Eurobio | CVFSVF0001 | |
| Cell strainer | Corning | 21008-949 | |
| Fluorodishes | World precision instruments | FD35-100 | dishes used to cultivate cells for live imaging |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 16% PFA (Paraformaldehyde) | Science Services GmbH | E15710 | |
| Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| BSA (Bovine Serum Albumine) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Saponine | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | use at 200 ng/µL |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and Media | |||
| Digestion Mix | in DPBS 5 mg/mL collagenase 3.5 mg/mL dispase sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 °C |
||
| Dissection Medium | in IMDM Glutamax supplemented 10% FBS 1% Penicillin/Streptomycin sterile filtered |
||
| Growth Medium | in IMDM Glutamax supplemented 20% FBS 1% Chicken Embryo Extract 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
| Differentiation Medium | in IMDM Glutamax supplemented 2% Horse Serum 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
| Blocking Solution | in DPBS 10% Goat Serum 5% BSA add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).
- Manring, H., Abreu, E., Brotto, L., Weisleder, N., Brotto, M. Novel excitation-contraction coupling related genes reveal aspects of muscle weakness beyond atrophy-new hopes for treatment of musculoskeletal diseases. Front Physiol. 5, 37 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. J Vis Exp. (73), (2013).
- Meng, H., Janssen, P. M. L., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers. J Vis Exp. (106), (2015).
- Falcone, S., Roman, W., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Mol Med. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Flucher, B. E., Phillips, J. L., Powell, J. A. Dihydropyridine receptor alpha subunits in normal and dysgenic muscle in vitro: expression of alpha 1 is required for proper targeting and distribution of alpha 2. J Cell Biol. 115 (5), 1345-1356 (1991).
- Cooper, S. T., Maxwell, A. L., et al. C2C12 co-culture on a fibroblast substratum enables sustained survival of contractile, highly differentiated myotubes with peripheral nuclei and adult fast myosin expression. Cell Motil Cytoskeleton. 58 (3), 200-211 (2004).
- Al-Qusairi, L., Laporte, J. T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases. Skelet Muscle. 1, 26 (2011).
- Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. A system to study mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance. Development. , (2016).
- Vilmont, V., Cadot, B., Vezin, E., Le Grand, F., Gomes, E. R. Dynein disruption perturbs post-synaptic components and contributes to impaired MuSK clustering at the NMJ: implication in ALS. Sci Rep. 6, 27804 (2016).
