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Genetics

Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

Published: February 17, 2017 doi: 10.3791/55143
Automatic Translation
1,2,3, 4, 5
1Koch Institute for Integrative Cancer Research, Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 2Howard Hughes Medical Institute, 3Division of Health Sciences and Technology, Harvard Medical School, 4The Barbara K. Ostrom (1978) Bioinformatics and Computing Facility in the Swanson Biotechnology Center, Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 5BioMicro Center, Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology

Summary

sequenciamento de uma única célula é uma ferramenta cada vez mais popular e acessível para lidar com alterações genômicas em alta resolução. Nós fornecemos um protocolo que utiliza a sequenciação de célula única para identificar alterações no número de cópias em células individuais.

Abstract

Detecção de alterações genômicas em resolução única célula é importante para a caracterização heterogeneidade genética e evolução em tecidos normais, cânceres, e as populações microbianas. Os métodos tradicionais de avaliação da heterogeneidade genética têm sido limitados pela baixa resolução, baixa sensibilidade, e / ou baixa especificidade. sequenciamento de uma única célula tem emergido como uma poderosa ferramenta para detectar heterogeneidade genética com alta resolução, alta sensibilidade e, quando adequadamente analisado, alta especificidade. Aqui nós fornecemos um protocolo para o isolamento, amplificação do genoma inteiro, sequenciamento e análise de células individuais. Nossa abordagem permite a identificação correcta das variantes do número de cópia escala megabase em células individuais. No entanto, também pode ser aplicado aspectos deste protocolo para investigar outros tipos de alterações genéticas em células individuais.

Introduction

As alterações no número de cópias de ADN pode variar em tamanho desde vários pares de bases (número de cópias variantes) (CNVs) para cromossomas inteiros (aneuploidia). Alterações no número de cópias que afectam grandes regiões do genoma pode ter consequências significativas fenotípicas alterando a expressão de até milhares de genes de 1, 2. CNVs que estão presentes em todas as células de uma população pode ser detectado por sequenciação de grandes quantidades ou métodos baseados em microarrays 3, 4. No entanto, as populações também pode ser geneticamente heterogênea, com CNVs existentes em um subconjunto da população ou mesmo uma única célula. Heterogeneidade genética é comum em cancro, dirigindo a evolução do tumor, e também presente em tecidos normais, com consequências desconhecidas 5, 6, 7, 8, 9 10.

Tradicionalmente, a heterogeneidade genética foi avaliada tanto por abordagens citológicas ou seqüenciamento em massa. Abordagens citológicas, como a hibridização fluorescente in situ (FISH), os spreads de cromossomos, e cariotipagem espectral (SKY), tem o benefício de alterações de identificação presentes em células individuais, mas têm taxas de erro elevadas devido a artefatos de hibridização e espalhar 11. Estas abordagens também são limitados em sua número de cópias resolução revelando apenas muda abrangendo vários megabases. Sequenciamento ou microarrays de DNA em massa, embora maior em precisão e resolução, é menos sensível. A fim de detectar a heterogeneidade genética por abordagens baseadas na população, as variantes devem estar presentes em uma fracção substancial de células na população. O surgimento de métodos para amplificar o ADN genómico a partir de células individuais, tornou possível sequenciar o genoma de células individuais. Seque única célulancing tem as vantagens de alta resolução, de alta sensibilidade, e, quando os métodos de controlo da qualidade adequados são aplicados, de alta precisão 12.

Aqui, nós descrevemos um método para detectar alterações no número de cópias escala megabases em células individuais. Nós isolar células individuais por microaspiração, amplificar DNA genómico usando vinculador-adaptador de PCR, preparar bibliotecas de sequenciamento de última geração, e detectar número de cópias variantes tanto pelo modelo oculto de Markov e segmentação binário circular.

Protocol

1. Isolamento de células individuais

  1. Prepare o microaspirator
    1. Remova a extremidade de plástico transparente do conjunto do tubo de aspirador e inserir a extremidade mais estreita em uma extremidade de um tubo de PVC de 1 pé de comprimento com "diâmetro interno de 3/16.
    2. Inserir a saída de um filtro de seringa de 0,2 m, na outra extremidade do tubo de PVC, um pé de comprimento com "diâmetro interno 3/6.
    3. Inserir a entrada do filtro de seringa de 0,2 um em uma extremidade de um tubo de PVC de 6 polegadas de comprimento com "diâmetro interior de 5/16.
    4. Opcional: Corte o tubo de PVC de 6 polegadas de comprimento com "diâmetro interno de 5/16 ao meio e inserir um separador de água in-line entre as duas metades.
    5. Ruptura de uma pipeta serológica 5 mL de plástico na graduação de 1 mL e inserir a extremidade quebrada na extremidade aberta do tubo de PVC com "diâmetro interior de 5/16.
    6. Inserir a tomada da pipeta serológica 5 mL de plástico flexível para a extremidade de um conjunto do tubo de aspiração (em que a extremidade de plástico transparentetinha sido removida).
    7. Para o armazenamento, cobrir o bocal vermelho do conjunto do tubo de aspiração com um tubo de plástico estéril.
    8. Desenhar um tubo capilar de vidro para um diâmetro interno de 10-30 um, trazendo o meio do tubo perto de uma chama do queimador de Bunsen e aplicando tensão sobre uma ou outra extremidade do tubo. Quebrar o tubo desenhado no meio para criar duas agulhas aspirador potenciais. Repita este passo com vários tubos já que apenas alguns tubos vai acabar com um diâmetro interno que é apropriado para a colheita de células individuais.
    9. Para o armazenamento, coloque duas tiras de massa de modelar em uma placa de Petri de 15 cm, e garantir as agulhas de aspiração através das tiras.
  2. células pegar
    1. Prepara-se uma suspensão de células individuais conforme apropriado para o tipo de célula e da experiência. Por exemplo, para preparar células aderentes tais como linhas humanas de fibroblastos de células, as células de colheita de células tripsinização e transferir para um tubo cônico contendo mídia apropriada.
    2. Antes, durante, ou umepois de preparação da suspensão única célula (dependendo de quanto tempo leva para preparar a suspensão de célula única), a instalação do exaustor para a amplificação do genoma inteiro.
      1. Spray para baixo da superfície do capô, caixas de ponta de pipeta e pontas de pipeta com 10% de lixívia e limpe com uma toalha de papel. Repita este passo com 70% de etanol.
      2. Adiciona-se 8 mL de água a partir do kit de amplificação do genoma completo (WGA) para poços individuais de uma placa com 96 poços de PCR, um bem para cada célula a ser sequenciado. Cobrir a placa com 96 poços de PCR com uma tampa de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços e colocar em gelo.
    3. Adicionar 1000 células para 10 ml de meio ou tampão fosfato salino (PBS) numa placa de Petri de 15 cm e colocar o prato em gelo para evitar que as células adiram ao prato.
    4. Traga as células na placa de Petri e a placa com 96 poços com tampa de PCR em gelo para um microscópio de luz com objectiva 10X.
    5. Aumentar a abertura da agulha de aspiração batendo ligeiramente na extremidade desenhada fora do the aspirador de agulha sobre uma superfície dura de modo a que a ponta rompe. Inserir a extremidade larga da agulha de aspiração para dentro da extremidade clara do microaspirator.
    6. Colocar a placa de Petri contendo as células na platina do microscópio. Colocar o bocal vermelho do aspirador na boca. Utilize uma mão para mover a agulha de aspiração e a outra mão para mover a placa de Petri contendo células. Identificar células individuais a ser sequenciado.
    7. Usando sucção boca, desenhar uma única célula para dentro da agulha de aspiração juntamente com ~ 1-2 mL de mídia ou PBS. Transferir a célula em 8 mL de água dentro de um único poço da placa de 96 poços de PCR. Evitar a introdução de bolhas ao transferir a célula.
    8. Repetir o passo 1.2.7 até que o número desejado de células foram isolados. Mantenha a placa de PCR em gelo e coberto com tampa entre células colheita. Marque os poços que receberam células.
      1. Ao escolher uma única célula, descongelar o único lise 10X celular e tampão fragmentação de todo o gkit de amplificação enome. Depois de escolher o número desejado de células, avança imediatamente para amplificação do genoma inteiro.

2. Whole Genome Amplification

  1. Para evitar a contaminação durante a amplificação do genoma inteiro, adicionar todos os reagentes dentro de uma capa de cultura de tecidos, usar pontas de pipeta com filtros, e mudar a ponta da pipeta entre poços.
  2. Prepara-se uma solução de lise tampão de trabalho e fragmentação do kit de amplificação do genoma completo (WGA). Para cada conjunto de até 32 células, combinar 32 ul de 10x de lise de célula única e tampão de fragmentação e 2 mL de solução de proteinase K em um tubo de microcentrífuga. Vortex do tubo para misturar as soluções.
  3. Adicionar 1 mL de trabalho e solução tampão de lise a cada poço fragmentação e pipetar para cima e para baixo para misturar.
  4. Cobrir a placa e selar todos os poços com um filme plástico. Centrifugar brevemente a placa em um mini giratório placa.
  5. ciclo térmico como follOWS: 50 ° C, 1 h e 99 ° C, 4 min.
  6. Arrefece-se a placa sobre gelo e centrifugar brevemente a placa em uma mini placa fiandeira.
  7. Prepara-se uma solução de tampão de preparação de biblioteca de trabalho de todo o kit de amplificação do genoma. Para cada célula, combinar 2 uL de tampão 1x preparação única biblioteca de células e 1 mL de solução de biblioteca de estabilização num tubo de microcentrífuga. Preparar a solução de trabalho de várias células no mesmo tubo de microcentrífuga.
  8. Remover a película de plástico e adicionar 3 mL de solução de trabalho tampão de preparação de biblioteca a cada poço. Pipetar os conteúdos do poço cima e para baixo para misturar. Substituir o filme plástico.
    NOTA: A película de plástico pode ser reutilizado ao longo de todo o processo de amplificação do genoma até os poços de começar a furos na película. Quando isso ocorre, mudar para um novo filme plástico.
  9. Resumidamente centrifugar a placa em uma mini Spinner placa e incubar a 95 ° C durante 2 min.
  10. Arrefecer a placa de gelo e brevementecentrifugar a placa em um mini giratório placa.
  11. Remover a película de plástico, adicionar 1 ul de enzima biblioteca preparação a cada poço, e pipetar os conteúdos do poço cima e para baixo para misturar. Mantenha a enzima preparação biblioteca no gelo ou em um bloco frio em toda esta etapa. Substituir o filme plástico.
  12. Resumidamente centrifugar a placa na mini placa fiandeira e ciclo térmico do seguinte modo: 16 ° C, 20 min, 24 ° C, 20 min, 37 ° C, 20 min, 75 ° C, 5 min, e manter a 4 ° C.
  13. Arrefece-se a placa sobre gelo e centrifugar brevemente a placa em uma mini placa fiandeira.
  14. Prepare uma mistura de amplificação de trabalho de todo o kit de amplificação do genoma. Para cada célula, combinar 48,5 ul de água, 7,5 mL de 10x amplificação mistura principal, e 5 ul de polimerase de ADN de WGA num tubo de microcentrífuga. Preparar a mistura de trabalho de várias células no mesmo tubo de microcentrífuga. Mantenha a mistura trabalhando em gelo.
  15. Retire o filme plástico, adicionar 61 mL de trabalho mistura de amplificaçãoA cada poço, e conteúdo da pipeta de bem cima e para baixo para misturar. Manter a mistura de amplificação trabalhando em gelo ou em um bloco frio em toda esta etapa. Substituir o filme plástico.
  16. Resumidamente centrifugar a placa em uma mini placa fiandeira e ciclo térmico do seguinte modo: 95 ° C, 3 min, 25 ciclos de 94 ° C, 30 seg e 65 ° C, 5 min, e manter a 4 ° C.
  17. Transferir 60 uL de cada amostra para um tubo de microcentrífuga separados e armazenar a - 20 ° C para utilização no passo 3.
  18. Adicionar corante de carga de ADN para o volume restante de cada amostra (isto é, 3 uL de corante de carga de ADN de 6x a 15 uL da amostra) e executar 5 uL de cada reacção sobre um gel de agarose a 1%.
    NOTA: As células que amplificados com sucesso aparecerá como uma mancha de 250 a 1.000 pb. As amostras que não mostram uma mancha ou só mostram uma leve mancha não são susceptíveis de produzir dados de sequenciamento úteis.

3. Sequencing

  1. Purifica-se amostras com esferas paramagnéticas.
    1. ThaAmostras de DNA w no gelo. grânulos paramagnéticos vortex até a solução estar homogénea e incubar as pérolas à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min.
    2. Transferir 20 uL de cada amostra de ADN para um tubo de microcentrífuga limpo. O restante da amostra pode ser armazenada a -20 ° C.
    3. Adicionar 30 uL (1,5x) de contas paramagnéticas de cada amostra de ADN e agitar com vortex para misturar. Incubam-se as amostras à temperatura ambiente durante 10 min. Deixar a solução estoque de grânulos à temperatura ambiente para utilização na etapa 3.4.
    4. Colocar os tubos em um tubo de tira magnética, durante 2 minutos, ou até que as esferas de formar um pelete e o sobrenadante é clara.
    5. Usando uma pipeta de P200, como remover a maior parte do sobrenadante quanto possível, sem perturbar as esferas.
    6. Adicionar 180 ul de etanol a 80% para a mistura de ADN-grânulo. Rodar os tubos várias vezes em relação ao íman de "lavar" os grânulos através da solução de etanol.
    7. Usando uma pipeta de P200, como remover a maior parte do etanol de lavagem possíble sem perturbar as contas.
    8. Repita 3.1.6 e 3.1.7.
    9. Ar secar os grânulos para cerca de 10 min ou até não haver mais etanol é visível. Vá para a próxima etapa, quando as contas aspecto partido ou cair fora da parede do tubo.
    10. Retirar as amostras da faixa magnética. Adicionar 40 ul de Tris 10 mM, pH 8,0, para eluir o ADN a partir das esferas e as amostras vortex para ressuspender as esferas. Incubar durante 2 min à temperatura ambiente.
    11. Resumidamente centrifugar as amostras para recolher o líquido na parte inferior do tubo e coloque os tubos em um tubo de tira magnética durante pelo menos dois minutos. Transferir o eluente em tubos de microcentrífuga limpo sem perturbar as esferas.
  2. normalização amostra
    1. Quantificar a concentração de cada amostra utilizando um espectrofotómetro. As concentrações deverão variar de 10 a 30 ng / mL.
    2. Dilui-se cada amostra para 0,2 ng / mL utilizando tampão Tris 10 mM, pH 8,0. As etapas a seguir vai exigir um mínimo intrada de 5 ul deste diluição.
  3. preparação biblioteca
    1. Prepare bibliotecas de sequenciamento, seguindo as instruções do kit de preparação biblioteca 13.
  4. a limpeza final
    1. Limpe as amostras de acordo com o passo 3.1. Para comprimentos de leitura de 50 pb, 75 pb, ou 150 pb, usar uma proporção de talão de provar volume de 1,5x, 1x, ou 0,6x, respectivamente. Eluir com 15 ul de Tris 10 mM, pH 8,0.
    2. Executar as amostras num analisador de fragmento de verificar a distribuição do tamanho da biblioteca 14. A distribuição de tamanho deve ser uniformemente distribuído 150-900 pb.
  5. Quantificar amostras utilizando qPCR
    1. Utilizando um kit de biblioteca de quantificação, definir-se uma reacção de qPCR de acordo com as instruções do kit de 15. Deixe uma coluna em branco para adicionar padrões positivos (normas de DNA do kit) e padrões negativos (água ou outra solução em branco).
    2. ciclo térmico como folbaixos: 95 ° C, 5 min (velocidade de rampa de 4,8 ° C / seg) e 35 ciclos de 95 ° C, 30 segundos (velocidade de rampa de 4,8 ° C / seg) e 60 ° C, 45 seg (velocidade de rampa de 2,5 ° C / segundo).
  6. pooling
    1. Determinar como são necessárias muitas pistas sobre a célula de fluxo e dividir as amostras em grupos, com um grupo por pista.
    2. Para cada grupo de amostras, escolher a amostra com a menor concentração com base nos dados qPCR do passo 3.5.2 e normalizar todas as amostras em que o grupo a que a concentração, utilizando Tris a 10 mM, pH 8,0.
    3. Reunir as amostras em cada grupo em conjunto.
  7. Sequencing
    1. Pools de carga sobre a próxima geração de máquina de sequenciamento seguintes procedimentos padronizados 16.

Análise 4. Dados

NOTA: Um ambiente baseado em Unix é necessário para executar os programas e scripts nesta seção. Instalar o software mencionado no protocolo após a sua em guias stalação. Todos os scripts podem ser encontradas em https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/.

  1. Apare as leituras a 40 nt usando fastx_trimmer de FASTX-Toolkit versão 0.0.13 17.
    fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l 40 -o example.trim.fastq
  2. Alinhe o lê ao genoma apropriado de referência (MM9 para rato, hg19 para humano) usando BWA versão 0.6.1 com as opções padrão 18.
    BWA ALN mm9.fa example.trim.fastq> example.sai
    BWA SAMSE mm9.fa example.sai example.trim.fastq> example.sam
  3. Remover alinhamentos para CHRM e cromossomas aleatórios, em seguida, classificar e indexar o arquivo BAM resultante usando SAMTools versão 0.1.19 19.
    grep -v -w CHRM example.sam | grep -v random> example.filtered.sam
    samtools ver example.filtered.sam -uSh | samtools tipo - example.filtered
    samtools índice example.filtered.bam
  4. Execute HMMcopy para detectar CNVs= "Refex"> 20
    1. Use gcCounter em HMMcopy para gerar um arquivo de referência percentual GC para o genoma. Use a opção "-w 500000" para especificar o tamanho da janela. Usar a mesma versão do arquivo de referência fasta utilizado na etapa 4.2, mas certifique-se CHRM e cromossomas aleatórios são removidos do arquivo fasta.
      gcCounter -w 500000 mm9.fa> mm9_gc.wig
    2. Use generateMap.pl em HMMcopy para gerar um arquivo de manobra para mappability. Use a opção "-w 40" para especificar ler comprimento. Use o mesmo arquivo de referência fasta utilizado no passo 4.4.1.
      generateMap.pl -b mm9.fa
      generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig
    3. Use mapCounter em HMMcopy para gerar um arquivo de referência mappability para o genoma. Use a opção "-w 500000" para especificar o tamanho da janela.
      mapCounter -w 500000 mm9.bigwig> mm9_map.wig
    4. Use readCounter em HMMcopy para gerar um arquivo de manobra para cada arquivo BAM.
      readCounter -w 500000 example.filtered.bam> input.wig Modificar os caminhos para os arquivos de referência nos scripts R (run_hmmcopy.mm9.r ou run_hmmcopy.hg19.r), use os arquivos gerados anteriormente em 4.4.1 (por exemplo, mm9_gc.wig) e 4.4.3 (por exemplo, mm9_map. peruca) para as variáveis ​​gfile e MFILE, que se referem ao arquivo de arquivo de referência percentual GC e referência mappability, respectivamente. Em seguida, executar o script R fornecido "run_hmmcopy.mm9.r" ou "run_hmmcopy.hg19.r".
      R CMD run_hmmcopy.mm9.r LOTE
      ou
      R CMD run_hmmcopy.hg19.r LOTE
    5. Para processamento em lote de um conjunto de arquivos BAM, coloque os arquivos BAM em uma única pasta e executar o script "HMMpipe.pl" fornecido no pacote para chamar segmentos e calcular pontuações de variabilidade (VS). Siga o formato:
      perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles MM9
  5. Execute DNAcopy para detectar CNVs 21.
    1. Use SAMtools versão 0.1.19 para extrair mapeados exclusivamente lê cada arquivo BAM.
      samtools ver -h -F 0x0004 example.filtered.bam | egrep -i "^ @ | XT: A: U" | samtools ver -shu -> example.mapped.bam
    2. Use MarkDuplicates em Picard versão 1.94 para marcar duplicatas PCR no BAM arquivo 22.
      java -jar MarkDuplicates.jar entrada = example.mapped.bam OUTPUT = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = true
    3. Use coveragebed em bedtools versão 2.17.0 para contar mapeadas lê em cada uma das janelas dinâmica 500kb mapeáveis predefinidos no arquivo de cama "mm9.500k.dynamic.win.bed" ou "hg19.500k.dynamic.win.bed" 23 .
      coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | tipo -k1,1 -k2,2n> example.nondup.counts
    4. Use o script Perl fornecido "normalizeGC.pl" para normalizar as contagens de leitura com base no arquivo de referência fornecida conteúdo GC "mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt" ou "hg19.500k.dynamic.win.fa. gc.txt ".
      perl normalizeGC.pl mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts> example.bam.norm.counts
    5. Use a R script "dnacopy.r" fornecido para chamar os segmentos.
      R CMD dnacopy.r LOTE
  6. identificar CNVs
    1. Excluir as células para as quais a VS calculadas em 4.4.6 seja superior a 0,26.
    2. Filtrar os segmentos designados por HMMcopy em 4.4.6 para incluir apenas aqueles para os quais a razão de log médio 2 é maior do que 0,4 (ganho putativo) ou inferior a -0,35 (perda putativo).
    3. Filtrar os segmentos designados por DNAcopy em 4.5.5 para incluir apenas aqueles para os quais o segmento significa é maior do que 1,32 ou menos do que 0,6.
    4. Sobrepõem os segmentos de 4.6.2 e 4.6.3, chamando CNVs apenas em regiões onde tanto HMMcopy e DNAcopy identificar um ganho putativa ou perda putativo.

Representative Results

O aspirador montada deverá ser semelhante ao da Figura 1A. A agulha deve ser desenhada de tal modo que seja suficientemente grande para acomodar uma única célula, mas não tão grande que um grande volume é elaborado com a única célula. Aspiração células individuais é mais fácil quando há entre um e cinco células em um campo 10X (Figura 1B).

Se amplificação do genoma inteiro é bem sucedida, a amostra irá aparecer como uma mancha sobre um gel de agarose (Figura 2, pistas 1, 2, 4, 5, 6 e 7). Um esfregaço de fraca ou ausente indica uma reacção de amplificação falhou e da amostra não devem ser sequenciadas (Figura 2, pistas 3 e 8).

Depois da preparação da biblioteca, a distribuição de tamanho de fragmento das amostras deve ser avaliada por electroforese capilar num analisador de fragmento.Êxito bibliotecas preparadas terão uma distribuição uniforme, em vez de tamanhos de fragmentos de 150-900 pb (Figura 3, A, B). Preparação biblioteca Falha irá resultar numa distribuição de tamanho de fragmento enviesada e tais bibliotecas não deve ser sequenciado (Figura 3C).

Processamento de dados de sequenciamento através do modelo oculto de Markov (HMMcopy) e segmentação binário circular (DNAcopy) irá analisar o genoma de cada célula em segmentos de número de cópias estimado. Estes segmentos podem ser, em seguida, filtrada para identificar aqueles com um número de cópias estimado consistente com ganho ou perda de uma única célula (Tabela 1). Estes segmentos filtrados de HMMcopy e DNAcopy deve, então, ser sobrepostos para identificar de alta confiança CNVs.

figura 1
Figura 1. isolamento de células único. ( A) Uma montada microaspirator. (B) Um campo de 10X mostrando células (setas) e agulha microaspirator (canto inferior direito) dissociados. Aspiração células individuais é mais fácil quando há entre um e cinco células em um campo 10X. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Amplificação do genoma inteiro. electroforese em gel de agarose de 5 ul de produtos de amplificação do genoma completo. As amostras que amplificam com sucesso aparecerá manchas tão brilhante a partir de 100 bp a 1 kb (pistas 1, 2, 4, 5, 6 e 7) e pode ser sequenciado. Amostras que não amplificam com sucesso irá produzir manchas fracas ou sem mancha (pistas 3 e 8) e não deve ser sequenciado.large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Preparação da biblioteca. Os resultados representativos de um analisador de fragmento. Os gráficos mostram o tamanho do fragmento (em pb) no eixo X e unidades de fluorescência relativas (RFU) no eixo Y. À direita de cada gráfico é uma pista gel simulada. (A) Resultados para uma amostra ideal, com uma distribuição uniforme entre 150 e 900 pb e sem picos pontiagudos ou viés em direção a um lado. Esta amostra é aceitável para a sequenciação. (B) Os resultados de uma amostra ok, com uma distribuição de tamanho desviada para tamanhos dos fragmentos menores. Enquanto isso não é o ideal, a amostra ainda pode ser sequenciado. (C) Os resultados de uma amostra falhou, com tamanhos predominantemente pequenos fragmentos. Isto é provavelmente causado pela incubação prolongada durante o passo de tagmentationpreparação de biblioteca. Esta amostra não deve ser sequenciado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

HMMcopy
Amostra Segmento Chr Começar Fim Estado Mediana
D15-4998 23 CHR8 144500001 146500000 6 0.5008794
D15-4998 29 chr10 67000001 134500000 6 0.4031945
D15-4998 52 chr19 1 20.000.000 6 0.4616884
D15-4998 57 chry 1 59500000 2 -1,506532
DNAcopy
Amostra Chrom Iniciar bin End bin Começar Fim Seg média med seg
D15-4998 chr10 88 197 62612945 129971511 1,4688 0,157
D15-4998 CHR19 0 31 0 28416392 1,4141 0,1674
D15-4998 chrX 77 126 51659160 95343369 1,3548 0,1874
D15-4998 chry 0 14 0 23805358 -2,7004 0,3591

Tabela 1. A análise dos dados. segmentos filtrados gerados por HMMcopy e DNAcopy a partir de uma única célula. Sobreposição de dois destes resultados revela um ganho no cromossoma 10 de 67 a 130 Mb, assim como um ganho no cromossoma 19 de 0 a 20 Mb. Descobrimos que os ganhos sobre a porção proximal do cromossoma 19 é um artefato do sequenciamento única célula 12.

Discussion

Tradicionalmente, a identificação de CNVs e aneuploidia no nível de células individuais necessários métodos citológicos, como peixes e SKY. Agora, sequenciamento única célula surgiu como uma abordagem alternativa para tais perguntas. sequenciação de célula única tem vantagens sobre os peixes e SKY como é tanto de todo o genoma e de alta resolução. Além disso, quando os métodos de controlo da qualidade adequados são aplicados, sequenciamento de uma única célula pode fornecer uma avaliação mais confiável de CNVs e aneuploidia, pois não é suscetível às hibridação e espalhando artefatos inerentes à FISH e SKY. No entanto, muitas das recentes aplicações de sequenciamento de uma única célula não foram fundamentadas por uma avaliação aprofundada da sensibilidade e especificidade dos métodos e análises. De fato, algumas das abordagens analíticas utilizadas por outros estudos estão associados a altas freqüências (> 50%) de falsa CNV positiva chama 12. A abordagem que descrevem foi rigorosamente testado utilizando células de kNfardo CNV própria, a fim de determinar o verdadeiro eo falso taxas de detecção e optimizar a sensibilidade e especificidade da CNV detecção 12. Usando o controle de qualidade e abordagens analíticas descritas neste protocolo, aproximadamente 20% dos 5 ganhos Mb, 75% dos 5 derrotas Mb, e todos CNVs superior a 10 Mb pode ser detectado. Embora a determinação da taxa de detecção falsa de sequenciação de célula única é difícil, estimámos que seja inferior a 25%. Este protocolo pode ser aplicado a células a partir de uma variedade de fontes, os scripts pode ser modificado para ajustar a resolução de detecção de CNV, e o protocolo pode ser adaptado para identificar outros tipos de alterações genómicas.

Há uma variedade de meios de dissociar tecidos frescos em células isoladas, e muitas publicações descrevem procedimentos optimizados para tecidos específicos, tais como a pele 24 e 25 cérebro. Nós preferimos isolar células individuais por microaspiração, pois permite fo r avaliação visual de cada célula a ser sequenciado. No entanto, também é possível isolar células individuais por separação de células activada por fluorescência (FACS) 26 e os dispositivos de microfluidos 27. Se o isolamento de células individuais e a amplificação do genoma completo é executada manualmente, é razoável para isolar e amplificar-se a células quarenta numa única sessão. A fim de obter os dados de sequenciação de célula única de elevada qualidade, é crucial que a amplificação do genoma de célula única é uniforme e completa. Nós descobrimos que a qualidade de células individuais isolados, bem como a eficiência de lise e a amplificação tem um impacto significativo sobre a qualidade dos dados de sequenciação. Como tal, as células devem ser colhidas a partir do seu ambiente nativo apenas antes do isolamento e amplificação do genoma inteiro deve começar imediatamente após as células são isoladas. Além disso, o passo de lise e fragmentação deve ser seguido exactamente, como descrito na 2,3-2,6 passos.

"> Os algoritmos podem ser ajustados para alterar a resolução de detecção CNV, com efeitos sobre a sensibilidade e especificidade 12 opostas. É também possível ajustar os limiares para detecção de todo o cromossoma aneuploidia na definição de tetraploidia 11. No entanto, descobrimos que nossa abordagem é limitada à detecção de CNVs superior a 5 Mb, como o ruído introduzido durante a amplificação do genoma complica a detecção de variantes menores 12. Futuras melhorias em abordagens de amplificação do genoma inteiro em última análise, aumentar a resolução de detecção de CNV utilizando sequenciamento única célula.

Sequenciamento de uma única célula permite a investigação de não apenas alterações no número de cópias, mas também variações de nucleotídeo único 28, 29 e variação estrutural 30. Nosso protocolo para o isolamento de células individuais podem ser aplicados para responder a estas outras thatstions. No entanto, a escolha do método de amplificação do genoma inteiro depende da aplicação específica. O método descrito neste protocolo, que é baseado na reação em cadeia da polimerase, é mais adequado para a detecção de alterações no número de cópias, porque está associada com níveis mais baixos de viés de amplificação 32. Para investigar outros tipos de alterações genómicas, tais como os polimorfismos de um único nucleótido, são acreditados outros métodos de amplificação do genoma inteiro para ser mais apropriada 31, 32.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos Stuart Levine para comentários sobre este manuscrito. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde Grant GM056800 e Kathy e Curt Marble Cancer Research Fund para Angelika Amon e em parte pelo P30-CA14051 Koch Institute Suporte Grant. Angelika Amon é também um investigador do Instituto Médico Howard Hughes e da Fundação Glenn for Biomedical Research. KAK é suportado pelo NIGMS Training Grant T32GM007753.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma A5177
PVC tubing (ID 3/16", OD 5/16", ~1 foot) VWR 89068-500
PVC tubing (ID 5/16", OD 7/16", ~6 inches) VWR 89068-508
Acrodisc Syringe Filter with HT Tuffryn Membrane (diameter 25 mm, pore size 0.2 µm) VWR 28144-040
Serological pipette (5 mL) BioExpress P-2837-5 Any plastic 5 mL pipette should suffice
In-Line Water Trap for Oxygen Use Amazon.com 700220210813
Capillary Melting Point Tubes (ID 0.8-1.1 mm, 100 mm length) VWR 34502-99
Modeling clay VWR 470156-850
Petri dish (150 mm diameter) VWR 25384-326 Surface should be non-adherent to facilitate aspiration of single cells
Hard-Shell Full-Height 96-Well Semi-Skirted PCR Plates Bio-Rad HSS9601 Any 96-well PCR plate should suffice
96-well tissue culture plate VWR 62406-081 Any 96-well tissue culture plate should suffice
GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit Sigma WGA4
Microseal 'A' Film Bio-Rad MSA5001
Mini plate spinner Thomas Scientific 1225Z37
Thermal cycler Bio-Rad 1861096  Any thermal cycler should suffice so long as it can accommodate a 96-well PCR plate
Agencourt Ampure Beads Beckman Coulter A63880
Dynamag-2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Any similar magnetic tube strip should suffice
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1096
Nextera XT Index Kit Illumina FC-121-1012
Complete kit (optimized for Roche LightCycler 480) Kapa Biosystems KK4845  This kit is optimized for the Roche LightCycler 480 real-time PCR machine. If using a different machine, substitute a kit optimized for your machine.

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References

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Knouse, K. A., Wu, J., Hendricks, A. Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing. J. Vis. Exp. (120), e55143, doi:10.3791/55143 (2017).

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