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Genetics

नकल संख्या बदलाव की जांच सिंगल सेल अनुक्रमण का उपयोग

Published: February 17, 2017 doi: 10.3791/55143
Automatic Translation
1,2,3, 4, 5
1Koch Institute for Integrative Cancer Research, Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 2Howard Hughes Medical Institute, 3Division of Health Sciences and Technology, Harvard Medical School, 4The Barbara K. Ostrom (1978) Bioinformatics and Computing Facility in the Swanson Biotechnology Center, Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 5BioMicro Center, Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology

Summary

एकल कोशिका अनुक्रमण उच्च संकल्प पर जीनोमिक परिवर्तन के समाधान के लिए एक तेजी से लोकप्रिय और सुलभ साधन है। हम एक प्रोटोकॉल एकल कक्ष अनुक्रमण का उपयोग करता है एकल कक्षों में नकल संख्या परिवर्तन की पहचान करने के लिए प्रदान करते हैं।

Abstract

एकल कक्ष संकल्प पर जीनोमिक परिवर्तन का पता लगाने सामान्य ऊतकों, कैंसर, और माइक्रोबियल आबादी में आनुवंशिक विविधता और विकास निस्र्पक के लिए महत्वपूर्ण है। आनुवंशिक विविधता का आकलन करने के लिए पारंपरिक तरीकों कम संकल्प, कम संवेदनशीलता, और / या कम विशिष्टता द्वारा सीमित किया गया है। एकल कोशिका अनुक्रमण उच्च संकल्प, उच्च संवेदनशीलता और, जब उचित विश्लेषण किया, उच्च विशिष्टता के साथ आनुवंशिक विविधता का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है। यहाँ हम अलगाव, पूरे जीनोम प्रवर्धन, अनुक्रमण, और विश्लेषण एकल कक्षों के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हमारा दृष्टिकोण एकल कक्षों में megabase पैमाने पर नकल संख्या वेरिएंट के विश्वसनीय पहचान के लिए अनुमति देता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल के पहलुओं को भी एकल कक्षों में आनुवंशिक परिवर्तन के अन्य प्रकार की जांच के लिए लागू किया जा सकता है।

Introduction

डीएनए नकल संख्या में बदलाव कई आधार जोड़े से आकार में लेकर कर सकते हैं (प्रतिलिपि संख्या वेरिएंट) (CNVs) पूरे गुणसूत्रों (aneuploidy) करने के लिए। नकल संख्या जीनोम के बड़े क्षेत्रों को प्रभावित करने परिवर्तन अप जीन 1, 2 के हजारों करने की अभिव्यक्ति बदलकर महत्वपूर्ण प्ररूपी परिणाम हो सकते हैं। CNVs कि आबादी के सभी कोशिकाओं में मौजूद थोक अनुक्रमण या माइक्रोएरे आधारित विधियों 3, 4 से पता लगाया जा सकता है। हालांकि, आबादी भी आनुवंशिक रूप से विषम हो सकता है, आबादी या यहां तक ​​कि एकल कक्षों के एक सबसेट में मौजूदा CNVs के साथ। जेनेटिक विविधता, सामान्य ऊतकों में मौजूद कैंसर में आम है, ट्यूमर के विकास ड्राइविंग, और भी अज्ञात परिणाम 5, 6, 7, 8, 9 के साथ 10।

परंपरागत रूप से, आनुवंशिक विविधता या तो कोशिकीय दृष्टिकोण या थोक अनुक्रमण द्वारा मूल्यांकन किया गया था। ऐसे सीटू संकरण (मछली), गुणसूत्र फैलता है, और वर्णक्रमीय karyotyping (आकाश) में प्रतिदीप्ति के रूप में कोशिकीय दृष्टिकोण, व्यक्ति की कोशिकाओं में उपस्थित पहचान के परिवर्तन का लाभ उठा रहे हैं लेकिन संकरण और 11 के प्रसार की कलाकृतियों के कारण उच्च त्रुटि दर है। इन तरीकों को भी अपने संकल्प-ही खुलासा प्रतिलिपि संख्या में सीमित कई megabases फैले परिवर्तन कर रहे हैं। अनुक्रमण या थोक डीएनए के प्रोटीन, हालांकि सटीकता और संकल्प में उच्च, कम संवेदनशील है। आदेश में जनसंख्या आधारित दृष्टिकोण से आनुवंशिक विविधता का पता लगाने के लिए, वेरिएंट आबादी में कोशिकाओं का एक बड़ा अंश में मौजूद होना चाहिए। तरीकों एकल कक्षों से जीनोमिक डीएनए बढ़ाना के उद्भव यह एकल कक्षों के जीनोम अनुक्रम को संभव बना दिया है। एकल कोशिका sequencing उच्च संकल्प, उच्च संवेदनशीलता, और, जब उचित गुणवत्ता नियंत्रण विधियों लागू कर रहे हैं, उच्च सटीकता 12 के फायदे हैं।

यहाँ, हम एकल कक्षों में megabase पैमाने पर नकल संख्या परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक विधि का वर्णन है। हम microaspiration द्वारा एकल कोशिकाओं को अलग, जीनोमिक डीएनए बढ़ाना लिंकर-एडाप्टर पीसीआर का उपयोग कर, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए पुस्तकालयों को तैयार है, और पता लगाने प्रतिलिपि संख्या दोनों छिपे हुए मार्कोव मॉडल और परिपत्र द्विआधारी विभाजन से वेरिएंट।

Protocol

1. एकल कोशिकाओं को अलग

  1. microaspirator तैयार
    1. Aspirator ट्यूब विधानसभा से स्पष्ट प्लास्टिक अंत निकालें और 3/16 "भीतरी व्यास के साथ एक 1 फुट लंबी पीवीसी टयूबिंग के एक छोर में संकीर्ण अंत डालें।
    2. 3/6 "भीतरी व्यास के साथ 1 फुट लंबी पीवीसी टयूबिंग के दूसरे छोर में एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के आउटलेट डालें।
    3. 5/16 "भीतरी व्यास के साथ एक 6 इंच लंबी पीवीसी टयूबिंग के एक छोर में 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के इनलेट डालें।
    4. वैकल्पिक: छमाही में 5/16 "भीतरी व्यास के साथ 6 इंच लंबी पीवीसी टयूबिंग कट और दो हिस्सों के बीच एक लाइन में पानी के जाल डालें।
    5. 1 एमएल स्नातक स्तर की पढ़ाई पर एक 5 एमएल प्लास्टिक सीरम वैज्ञानिक पिपेट तोड़ और 5/16 "भीतरी व्यास के साथ पीवीसी टयूबिंग के खुले अंत में टूटी अंत डालें।
    6. एक Aspirator ट्यूब विधानसभा का लचीला अंत (जहां स्पष्ट प्लास्टिक अंत में 5 एमएल प्लास्टिक सीरम वैज्ञानिक पिपेट के आउटलेट डालेंहटा दिया गया था)।
    7. भंडारण के लिए, एक बाँझ प्लास्टिक ट्यूब के साथ Aspirator ट्यूब विधानसभा के लाल मुखपत्र कवर।
    8. एक लेम्प बर्नर लौ के पास ट्यूब के बीच लाने और ट्यूब के दोनों छोर पर तनाव को लागू करने से 10-30 माइक्रोन की एक आंतरिक व्यास के लिए एक गिलास केशिका ट्यूब बाहर ड्रा। बीच में खींचा ट्यूब तोड़ दो संभावित खींचने की मशीन सुई बनाने के लिए। के रूप में केवल कुछ ट्यूबों एक आंतरिक व्यास कि एकल कक्षों चुनने के लिए उपयुक्त है साथ खत्म हो जाएगा कई ट्यूबों के साथ इस चरण को दोहराएँ।
    9. भंडारण के लिए, एक 15 सेमी पेट्री डिश में क्ले मॉडलिंग के दो स्ट्रिप्स जगह और स्ट्रिप्स भर में खींचने की मशीन सुई सुरक्षित।
  2. कोशिकाओं को चुनें
    1. एक एकल कक्ष निलंबन सेल प्रकार और प्रयोग के लिए के रूप में उपयुक्त तैयार करें। उदाहरण के लिए, इस तरह के मानव fibroblast सेल लाइनों, उचित मीडिया वाले एक शंक्वाकार ट्यूब trypsinization और हस्तांतरण कोशिकाओं द्वारा फसल कोशिकाओं के रूप में पक्षपाती कोशिकाओं को तैयार करने के लिए।
    2. इससे पहले, दौरान, या एकfter एकल कक्ष निलंबन (कितनी देर तक यह एकल कक्ष निलंबन तैयार करने के लिए लेता है पर निर्भर करता है), सेटअप पूरे जीनोम प्रवर्धन के लिए हुड की तैयारी।
      1. डाकू, पिपेट टिप बक्से, और 10% ब्लीच के साथ पिपेट सुझावों की सतह के नीचे स्प्रे और एक कागज तौलिया के साथ पोंछे। 70% इथेनॉल के साथ इस चरण को दोहराएँ।
      2. एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली के अलग-अलग कुओं के लिए पूरे जीनोम प्रवर्धन (WGA) किट से पानी की 8 μL जोड़ें, प्रत्येक कक्ष के लिए एक अच्छी तरह से अनुक्रमित किया। एक 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट और बर्फ पर जगह से एक ढक्कन के साथ 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट कवर।
    3. 10 एमएल मीडिया या फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के लिए 1,000 कोशिकाओं को एक 15 सेमी पेट्री डिश में डालें और बर्फ पर पकवान जगह पकवान का पालन करने से कोशिकाओं को रोकने के लिए।
    4. 10x उद्देश्य के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के लिए बर्फ पर ढक्कन के साथ पेट्री डिश में कोशिकाओं और 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली ले आओ।
    5. धीरे वीं के अंत में बाहर खींचा दोहन से खींचने की मशीन सुई के उद्घाटन के अवसर बढ़ाएँएक कठिन सतह पर ई खींचने की मशीन सुई की नोक से टूट जाता है कि इस तरह के। microaspirator के स्पष्ट अंत में खींचने की मशीन सुई के व्यापक अंत डालें।
    6. खुर्दबीन मंच पर कोशिकाओं से युक्त पेट्री डिश रखें। मुंह में खींचने की मशीन के लाल मुखपत्र रखें। कोशिकाओं से युक्त पेट्री डिश स्थानांतरित करने के लिए खींचने की मशीन सुई और दूसरी ओर स्थानांतरित करने के लिए एक हाथ का प्रयोग करें। एकल कोशिकाओं की पहचान अनुक्रम किया जा सके।
    7. मुंह सक्शन का उपयोग करना, साथ मीडिया या पीबीएस के ~ 1-2 μL साथ खींचने की मशीन सुई में एक एकल कोशिका आकर्षित। 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली का एक भी अच्छी तरह से अंदर पानी की 8 μL में सेल स्थानांतरण। बुलबुले शुरू जब सेल में परिवर्तित करने से बचें।
    8. दोहराएँ कदम 1.2.7 जब तक कोशिकाओं की वांछित संख्या पृथक किया गया है। बर्फ पर पीसीआर थाली रखें और उठा कोशिकाओं के बीच में ढक्कन के साथ कवर किया। कुओं कि कोशिकाओं को प्राप्त हुआ है निशान।
      1. एकल कक्षों उठा, वहीं 10X एकल सेल और पूरे जी से विखंडन बफर पिघलनाenome प्रवर्धन किट। कोशिकाओं की वांछित संख्या को चुनने के बाद, पूरे जीनोम प्रवर्धन करने के लिए तुरंत आगे बढ़ें।

2. पूरे जीनोम प्रवर्धन

  1. पूरे जीनोम प्रवर्धन के दौरान प्रदूषण को रोकने के लिए, एक टिशू कल्चर हुड के अंदर सभी अभिकर्मकों जोड़ने के लिए, फिल्टर के साथ पिपेट सुझावों का उपयोग करें, और कुओं के बीच में पिपेट टिप बदल जाते हैं।
  2. पूरे जीनोम प्रवर्धन (WGA) किट से काम कर रहे एक सेल और विखंडन बफर समाधान तैयार है। अप करने के लिए 32 कोशिकाओं के प्रत्येक सेट के लिए, एक microcentrifuge ट्यूब में की proteinase कश्मीर समाधान के 10x एकल सेल और विखंडन बफर और 2 μL 32 μL गठबंधन। समाधान मिश्रण करने के लिए ट्यूब भंवर।
  3. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए सेल और विखंडन बफर समाधान काम करने का 1 μL जोड़ें और विंदुक ऊपर और नीचे मिश्रण करने के लिए।
  4. प्लेट कवर और एक प्लास्टिक की फिल्म के साथ सभी कुओं सील। संक्षेप में एक मिनी प्लेट स्पिनर में थाली अपकेंद्रित्र।
  5. foll के रूप में थर्मल साइकिलOWS: 50 डिग्री सेल्सियस, 1 घंटे और 99 डिग्री सेल्सियस, 4 मिनट।
  6. बर्फ पर थाली कूल और संक्षेप में एक मिनी प्लेट स्पिनर में थाली अपकेंद्रित्र।
  7. पूरे जीनोम प्रवर्धन किट से काम कर रहे एक पुस्तकालय तैयारी बफर समाधान तैयार है। प्रत्येक कक्ष के लिए, 1x एकल कक्ष पुस्तकालय तैयारी बफर के 2 μL और एक microcentrifuge ट्यूब में पुस्तकालय स्थिरीकरण समाधान के 1 μL गठबंधन। एक ही microcentrifuge ट्यूब में कई कक्षों के लिए काम कर समाधान तैयार है।
  8. प्लास्टिक की फिल्म निकालें और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए पुस्तकालय तैयारी बफर समाधान काम करने का 3 μL जोड़ें। मिश्रण करने के लिए अच्छी तरह से ऊपर और नीचे की सामग्री को पिपेट। प्लास्टिक की फिल्म बदलें।
    नोट: प्लास्टिक की फिल्म पूरे जीनोम प्रवर्धन प्रक्रिया में पुन: उपयोग किया जा सकता है जब तक कुओं फिल्म में बोर छेद करने के लिए शुरू करते हैं। जब ऐसा होता है, एक नया प्लास्टिक की फिल्म के लिए स्विच।
  9. संक्षेप में एक मिनी प्लेट स्पिनर में थाली अपकेंद्रित्र और 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  10. बर्फ और संक्षिप्त पर थाली कूलएक मिनी प्लेट स्पिनर में थाली अपकेंद्रित्र।
  11. प्लास्टिक की फिल्म निकालें, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 1 μL जोड़ने के पुस्तकालय तैयारी एंजाइम, और अच्छी तरह से ऊपर की सामग्री को पिपेट और नीचे मिश्रण करने के लिए। बर्फ पर या इस कदम भर में एक ठंड ब्लॉक में पुस्तकालय तैयारी एंजाइम रखें। प्लास्टिक की फिल्म बदलें।
  12. इस प्रकार के रूप में संक्षेप में मिनी प्लेट स्पिनर और थर्मल चक्र में थाली अपकेंद्रित्र: 16 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट, 24 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट, 75 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
  13. बर्फ पर थाली कूल और संक्षेप में एक मिनी प्लेट स्पिनर में थाली अपकेंद्रित्र।
  14. पूरे जीनोम प्रवर्धन किट से काम कर रहे एक प्रवर्धन मिश्रण तैयार करें। प्रत्येक कक्ष के लिए, 48.5 μL पानी, 7.5 μL 10x प्रवर्धन मास्टर मिश्रण है, और एक microcentrifuge ट्यूब में 5 μL WGA डीएनए पोलीमरेज़ गठबंधन। एक ही microcentrifuge ट्यूब में कई कक्षों के लिए काम कर मिश्रण तैयार करें। बर्फ पर काम कर मिश्रण रखें।
  15. प्लास्टिक की फिल्म निकालें, 61 प्रवर्धन मिश्रण काम कर μL जोड़नेअच्छी तरह से ऊपर और नीचे के प्रत्येक कुएं, और पिपेट सामग्री के मिश्रण करने के लिए। बर्फ पर या इस कदम भर में एक ठंड ब्लॉक में काम कर प्रवर्धन मिश्रण रखें। प्लास्टिक की फिल्म बदलें।
  16. इस प्रकार के रूप में संक्षेप में एक मिनी प्लेट स्पिनर में थाली और थर्मल चक्र अपकेंद्रित्र: 95 डिग्री सेल्सियस, 3 मिनट, 94 डिग्री सेल्सियस के 25 चक्र, 30 सेकंड और 65 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
  17. चरण 3 में उपयोग के लिए 20 डिग्री सेल्सियस - स्थानांतरण 60 में एक अलग microcentrifuge ट्यूब और स्टोर करने के लिए प्रत्येक नमूने की μL।
  18. प्रत्येक नमूना (यानी 3 6x की μL डीएनए नमूना लोड हो रहा है के 15 μL करने के लिए डाई) की शेष मात्रा करने के लिए डीएनए लोडिंग डाई जोड़ें और एक 1% agarose जेल पर प्रत्येक प्रतिक्रिया से 5 μL चलाते हैं।
    नोट: प्रकोष्ठों कि सफलतापूर्वक 250 से 1,000 बीपी के लिए एक धब्बा रूप में दिखाई देगा परिलक्षित। नमूने है कि एक धब्बा नहीं दिखा है या केवल एक बेहोश धब्बा दिखा उपयोगी अनुक्रमण डेटा उपज की संभावना नहीं है।

3. अनुक्रमण

  1. समचुंबक मोतियों के साथ नमूने शुद्ध।
    1. Thaबर्फ पर डब्ल्यू डीएनए नमूने हैं। भंवर समचुंबक मोती जब तक समाधान समरूप है और कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मोती सेते हैं।
    2. एक साफ microcentrifuge ट्यूब में प्रत्येक डीएनए नमूने के 20 μL स्थानांतरण। नमूना के शेष -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
    3. समचुंबक मोती के 30 μL (1.5x) प्रत्येक डीएनए नमूने और मिश्रण करने के भंवर में जोड़े। 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने सेते हैं। शेयर 3.4 कदम में उपयोग के लिए कमरे के तापमान पर मोती के समाधान छोड़ दें।
    4. एक चुंबकीय पट्टी ट्यूब पर ट्यूबों 2 मिनट के लिए जगह है, या जब तक मोती एक गोली के रूप में और सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट है।
    5. एक P200 विंदुक का प्रयोग, मोती परेशान बिना संभव के रूप में सतह पर तैरनेवाला की बहुत दूर।
    6. 80% इथेनॉल के 180 μL डीएनए मनका मिश्रण में जोड़ें। नलियों चुंबक के सापेक्ष इथेनॉल समाधान के माध्यम से "कुल्ला करने के लिए" मोती कई बार घुमाएं।
    7. एक P200 विंदुक का प्रयोग, possi के रूप में इथेनॉल धोने की बहुत दूरमोती परेशान बिना ble।
    8. 3.1.6 और 3.1.7 दोहराएँ।
    9. एयर लगभग 10 मिनट के लिए या जब तक कोई और अधिक इथेनॉल दिख रहा है मोतियों सूखी। अगले कदम के लिए आगे बढ़ें जब मोती फटा दिखाई देते हैं या ट्यूब की दीवार से गिर जाते हैं।
    10. चुंबकीय पट्टी से नमूने निकालें। 10 मिमी Tris पीएच 8.0 से 40 μL मोतियों से डीएनए elute और नमूने भंवर मोती resuspend में जोड़े। कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए सेते हैं।
    11. संक्षेप में नमूने अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे तरल इकट्ठा करने और कम से कम दो मिनट के लिए एक चुंबकीय पट्टी ट्यूब पर ट्यूबों जगह है। मोती परेशान बिना साफ microcentrifuge ट्यूब में eluent स्थानांतरण।
  2. नमूना सामान्यीकरण
    1. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर प्रत्येक नमूने की एकाग्रता यों। सांद्रता 10 से 30 एनजी / μL करने के लिए सीमा चाहिए।
    2. 0.2 एनजी / μL 10 मिमी Tris पीएच 8.0 का उपयोग करने के लिए प्रत्येक नमूना पतला। निम्नलिखित कदम एक न्यूनतम आवश्यकता होगी मैंइस कमजोर पड़ने से 5 μL के Nput।
  3. पुस्तकालय तैयारी
    1. पुस्तकालय तैयारी किट 13 के निर्देशों का पालन करके अनुक्रमण पुस्तकालयों तैयार करें।
  4. अंतिम सफाई
    1. 3.1 कदम के अनुसार नमूने को साफ करें। 50 बीपी, 75 बीपी, या 150 बीपी के पढ़ने के लिए लंबाई क्रमश: 1.5x, 1x, या 0.6x की मात्रा नमूने के लिए, मनका के एक अनुपात का उपयोग करें। 10 मिमी Tris पीएच 8.0 के 15 μL के साथ Elute।
    2. पुस्तकालय 14 के आकार के वितरण की जांच करने के लिए एक टुकड़ा विश्लेषक पर नमूने चलाएँ। आकार के वितरण समान रूप से 150 से 900 बीपी के लिए प्रसार किया जाना चाहिए।
  5. qPCR का उपयोग कर नमूने यों
    1. एक पुस्तकालय मात्रा का ठहराव किट का उपयोग करना, किट निर्देश 15 के अनुसार एक qPCR प्रतिक्रिया की स्थापना की। सकारात्मक मानकों (किट से डीएनए मानकों) और नकारात्मक मानकों (पानी या अन्य खाली समाधान) जोड़ने के लिए एक स्तंभ खाली छोड़ दें।
    2. fol के रूप में थर्मल साइकिलचढ़ाव: 95 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट (4.8 डिग्री सेल्सियस / सेकंड की रैंप दर) और 95 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड (रैंप 4.8 डिग्री सेल्सियस / सेकंड की दर) और 60 डिग्री सेल्सियस, 45 सेकंड (2.5 की रैंप दर के 35 चक्रों डिग्री सेल्सियस / सेक)।
  6. पूलिंग
    1. निर्धारित कैसे flowcell पर कई गलियों की जरूरत है और समूहों में विभाजित नमूने, लेन प्रति एक समूह के साथ।
    2. नमूने के प्रत्येक समूह के लिए, कदम 3.5.2 से qPCR डेटा के आधार पर सबसे कम एकाग्रता के साथ नमूना चुनें और कहा कि एकाग्रता 10 मिमी Tris पीएच 8.0 का उपयोग करने के लिए है कि समूह में सभी नमूने मानक के अनुसार।
    3. प्रत्येक समूह में एक साथ पूल के नमूने।
  7. अनुक्रमण
    1. मानक प्रक्रियाओं 16 निम्नलिखित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मशीन पर लोड पूल।

4. डेटा विश्लेषण

नोट: एक यूनिक्स आधारित पर्यावरण कार्यक्रम और इस खंड में स्क्रिप्ट चलाने के लिए आवश्यक है। अपने में निम्नलिखित प्रोटोकॉल में उल्लेख किया सॉफ्टवेयर स्थापित stallation गाइड। सभी लिपियों https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/ पर पाया जा सकता है।

  1. ट्रिम 40-NT FASTX-टूलकिट संस्करण 0.0.13 17 से fastx_trimmer उपयोग करने के लिए पढ़ता है।
    fastx_trimmer -Q33 -मैं example.fastq -l 40 -o example.trim.fastq
  2. संरेखित उचित संदर्भ जीनोम (माउस के लिए mm9, मानव के लिए hg19) बीडब्ल्यूए संस्करण 0.6.1 का उपयोग कर मूलभूत विकल्पों के साथ 18 को पढ़ता है।
    बीडब्ल्यूए AlN mm9.fa example.trim.fastq> example.sai
    बीडब्ल्यूए samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq> example.sam
  3. CHRM और यादृच्छिक गुणसूत्रों के लिए संरेखण निकालें, तो सॉर्ट और SAMTools संस्करण 0.1.19 19 का उपयोग कर सूचकांक जिसके परिणामस्वरूप बेम फ़ाइल।
    ग्रेप वी डब्ल्यू CHRM example.sam | ग्रेप -v यादृच्छिक> example.filtered.sam
    samtools -uSh example.filtered.sam देखने | samtools क्रमबद्ध करें - example.filtered
    samtools सूचकांक example.filtered.bam
  4. HMMcopy भागो CNVs पता लगाने के लिए= "Xref"> 20
    1. HMMcopy में gcCounter प्रयोग जीनोम के लिए एक जीसी प्रतिशत संदर्भ फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए। खिड़की के आकार को निर्दिष्ट करने के विकल्प का प्रयोग करें "500000 डब्ल्यू"। FASTA संदर्भ 4.2 कदम में इस्तेमाल फ़ाइल का एक ही संस्करण का उपयोग करें, लेकिन यकीन है कि CHRM बनाने के लिए और यादृच्छिक गुणसूत्रों FASTA फ़ाइल से हटा रहे हैं।
      gcCounter डब्ल्यू 500000 mm9.fa> mm9_gc.wig
    2. HMMcopy में generateMap.pl प्रयोग mappability के लिए एक wiggle फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए। लंबाई पढ़ निर्दिष्ट करने के लिए विकल्प का उपयोग करें "40 डब्ल्यू"। एक ही FASTA संदर्भ कदम 4.4.1 में इस्तेमाल फ़ाइल का उपयोग करें।
      generateMap.pl बी mm9.fa
      generateMap.pl डब्ल्यू 40 -मैं mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig
    3. HMMcopy में mapCounter प्रयोग जीनोम के लिए एक mappability संदर्भ फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए। खिड़की के आकार को निर्दिष्ट करने के विकल्प का प्रयोग करें "500000 डब्ल्यू"।
      mapCounter डब्ल्यू 500000 mm9.bigwig> mm9_map.wig
    4. HMMcopy में readCounter का प्रयोग करें प्रत्येक बेम फ़ाइल के लिए एक wiggle फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए।
      readCounter डब्ल्यू 500000 example.filtered.bam> input.wig आर लिपियों में संदर्भ फाइल करने के लिए रास्तों को संशोधित (run_hmmcopy.mm9.r या run_hmmcopy.hg19.r), 4.4.1 (जैसे, mm9_gc.wig) और 4.4.3 (जैसे, mm9_map में उपरोक्त उत्पन्न फ़ाइलों का उपयोग करें। विग) चर gfile और mfile, जो क्रमशः जीसी प्रतिशत संदर्भ फ़ाइल और mappability संदर्भ फ़ाइल का उल्लेख करने के लिए। तो प्रदान आर स्क्रिप्ट "run_hmmcopy.mm9.r" या "run_hmmcopy.hg19.r" चलाते हैं।
      आर सीएमडी बैच run_hmmcopy.mm9.r
      या
      आर सीएमडी बैच run_hmmcopy.hg19.r
    5. बेम फ़ाइलों का एक सेट के बैच प्रोसेसिंग के लिए, खंडों (वी एस) कहते हैं और गणना परिवर्तनशीलता स्कोर करने के लिए पैकेज में एक ही फ़ोल्डर में बेम फ़ाइलें डाल दिया है और प्रदान की स्क्रिप्ट "HMMpipe.pl" चलाते हैं। प्रारूप का पालन करें:
      पर्ल HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles mm9
  5. DNAcopy भागो CNVs 21 पता लगाने के लिए।
    1. SAMtools संस्करण 0.1.19 का प्रयोग विशिष्ट रूप से मैप किया गया प्रत्येक बेम फ़ाइल से पढ़ता निकालने के लिए।
      samtools देखने ज एफ 0x0004 example.filtered.bam | egrep -मैं "^ @ | एक्सटी: एक: यू '| samtools देखने -Shu -> example.mapped.bam
    2. बेम में पीसीआर डुप्लिकेट फाइल 22 चिह्नित करने के लिए पिकार्ड संस्करण 1.94 में MarkDuplicates का प्रयोग करें।
      MarkDuplicates.jar इनपुट जार जावा = example.mapped.bam उत्पादन = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = सच
    3. Bedtools संस्करण 2.17.0 मैप किया गिनती करने में coveragebed उपयोग प्रदान बिस्तर फ़ाइल "mm9.500k.dynamic.win.bed" या "hg19.500k.dynamic.win.bed" 23 में पूर्वनिर्धारित गतिशील 500KB mappable खिड़कियों में से प्रत्येक में पढ़ता ।
      coverageBed -abam example.nondup.bam बी mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | क्रमबद्ध -k1,1 -k2,2n> example.nondup.counts
    4. पढ़ें प्रदान की जीसी सामग्री संदर्भ फ़ाइल "mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt" या "hg19.500k.dynamic.win.fa के आधार पर गिना जाता है सामान्य करने के लिए प्रदान की पर्ल स्क्रिप्ट" normalizeGC.pl "का प्रयोग करें। gc.txt "।
      पर्ल normalizeGC।पीएल mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts> example.bam.norm.counts
    5. वर्गों को फोन प्रदान की आर स्क्रिप्ट "dnacopy.r" का प्रयोग करें।
      आर सीएमडी बैच dnacopy.r
  6. CNVs पहचानें
    1. जिसके लिए वी.एस. 4.4.6 में गणना 0.26 से अधिक कोशिकाओं को बाहर।
    2. 4.4.6 में खंडों HMMcopy द्वारा बुलाया फ़िल्टर को शामिल करने के लिए केवल उन जो के लिए औसत लॉग 2 अनुपात से अधिक 0.4 (ख्यात लाभ) या कम से कम -0.35 (ख्यात हानि) है।
    3. 4.5.5 में खंडों DNAcopy द्वारा बुलाया फ़िल्टर को शामिल करने के लिए केवल उन जिसके लिए खंड मतलब से अधिक 1.32 या 0.6 की तुलना में कम है।
    4. 4.6.2 और 4.6.3 से खंडों ओवरलैप करते हैं, केवल उन क्षेत्रों में जहां दोनों HMMcopy और DNAcopy एक ख्यात लाभ या हानि ख्यात की पहचान में CNVs बुला रही है।

Representative Results

इकट्ठे Aspirator चित्रा 1 ए में एक के समान दिखाई देनी चाहिए। सुई ऐसे तैयार किया जाना चाहिए कि यह पर्याप्त रूप से एक एकल कोशिका को समायोजित करने के लिए विस्तृत है, लेकिन इतना व्यापक नहीं है कि एक बड़ी मात्रा में एकल कक्ष के साथ तैयार की है। एकल कक्षों Aspirating सबसे आसान है जब वहाँ एक और पांच के बीच एक 10X क्षेत्र (चित्रा 1 बी) में कोशिकाओं रहे है।

पूरे जीनोम प्रवर्धन सफल होता है, नमूना एक agarose जेल पर एक धब्बा के रूप में प्रकट (चित्रा 2, गलियों 1, 2, 4, 5, 6, और 7) होगा। एक बेहोश या अनुपस्थित धब्बा एक असफल प्रवर्धन प्रतिक्रिया इंगित करता है और नमूना नहीं अनुक्रम किया जाना चाहिए (चित्रा 2, 3 गलियों और 8)।

पुस्तकालय तैयारी के बाद, नमूने का टुकड़ा आकार के वितरण एक टुकड़ा विश्लेषक पर केशिका वैद्युतकणसंचलन द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए।सफलतापूर्वक तैयार पुस्तकालयों 150 से 900 बीपी के लिए टुकड़ा आकार के एक नहीं बल्कि भी वितरण होगा (चित्रा 3, ए, बी)। विफल पुस्तकालय तैयारी एक विषम टुकड़ा आकार के वितरण में परिणाम होगा और इस तरह के पुस्तकालयों नहीं अनुक्रम किया जाना चाहिए (चित्रा 3 सी)।

छिपे हुए मार्कोव मॉडल (HMMcopy) और परिपत्र द्विआधारी विभाजन (DNAcopy) के माध्यम से अनुक्रमण डेटा प्रसंस्करण अनुमान प्रतिलिपि संख्या के क्षेत्रों में प्रत्येक कोशिका के जीनोम पार्स जाएगा। इन क्षेत्रों तो लाभ या एक एकल कोशिका (तालिका 1) में हानि के साथ लगातार एक अनुमान के अनुसार नकल संख्या के साथ उन लोगों की पहचान करने के लिए फ़िल्टर किया जा सकता है। HMMcopy और DNAcopy से ये फ़िल्टर खंडों तो पहचान करने के लिए उच्च आत्मविश्वास CNVs छा जाना चाहिए।

आकृति 1
चित्रा 1. एकल कोशिका अलगाव। ( ए) एक microaspirator इकट्ठे हुए। (बी) के एक 10x क्षेत्र दिखा कोशिकाओं (तीर) और microaspirator सुई (निचले सही कोने) अलग। एकल कक्षों Aspirating सबसे आसान है जब वहाँ एक और पांच के बीच एक 10X क्षेत्र में कोशिकाओं रहे है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 पूरे जीनोम प्रवर्धन। पूरे जीनोम प्रवर्धन उत्पादों के 5 μl के agarose जेल वैद्युतकणसंचलन। नमूने है कि सफलतापूर्वक 1 केबी के लिए 100 बीपी से के रूप में उज्ज्वल स्मीयर दिखाई देगी बढ़ाना (गलियों 1, 2, 4, 5, 6, और 7) और अनुक्रम किया जा सकता है। नमूने है कि सफलतापूर्वक बेहोश स्मीयर या कोई धब्बा (गलियों 3 और 8) का उत्पादन होगा बढ़ाना नहीं है और अनुक्रम नहीं किया जाना चाहिए।large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. पुस्तकालय तैयारी। एक टुकड़ा विश्लेषक से प्रतिनिधि परिणाम है। रेखांकन एक्स अक्ष और रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों (RFU) वाई अक्ष पर टुकड़ा आकार (बीपी) में दिखा। प्रत्येक ग्राफ के अधिकार के लिए एक नकली जेल लेन है। (ए), एक आदर्श नमूना के लिए परिणाम और 150 और 900 बीपी के बीच तेज चोटियों या एक पक्ष की ओर पूर्वाग्रह के बिना एक भी वितरण के साथ। यह नमूना अनुक्रमण के लिए स्वीकार्य है। (बी) के एक ठीक नमूना से परिणाम, एक आकार के वितरण के साथ कम टुकड़ा आकार की ओर विषम। हालांकि यह इष्टतम नहीं है, नमूना अभी भी अनुक्रम किया जा सकता है। (सी), एक असफल नमूना से परिणाम मुख्य रूप से छोटे आकार के साथ टुकड़ा। यह संभावना tagmentation चरण के दौरान लंबे समय तक ऊष्मायन के कारण होता हैपुस्तकालय तैयारी की। यह नमूना अनुक्रम नहीं किया जाना चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

HMMcopy
नमूना खंड Chr प्रारंभ समाप्त राज्य मंझला
D15-4998 23 chr8 144500001 146500000 6 0.5008794
D15-4998 29 chr10 67000001 134500000 6 0.4031945
D15-4998 52 सीhr19 1 20,000,000 6 0.4616884
D15-4998 57 chrY 1 59500000 2 -१.५,०६,५३२
DNAcopy
नमूना क्रोम प्रारंभ बिन अंत बिन प्रारंभ समाप्त Seg मतलब Seg मेड
D15-4998 chr10 88 197 62612945 129971511 1.4688 0.157
D15-4998 chr19 0 31 0 28416392 1.4141 0.1674
D15-4998 chrX 77 126 51659160 95343369 1.3548 0.1874
D15-4998 chrY 0 14 0 23805358 -२.७,००४ 0.3591

तालिका 1. डेटा विश्लेषण। छानने का खंडों एक एकल कोशिका से HMMcopy और DNAcopy द्वारा उत्पन्न। इन दोनों के परिणामों ओवरलैपिंग 67 से 130 एमबी से 10 गुणसूत्र पर एक लाभ के रूप में अच्छी तरह से 0 से 20 एमबी से गुणसूत्र 19 पर एक लाभ का पता चलता है। हमने पाया है कि गुणसूत्र 19 के समीपस्थ हिस्से पर लाभ एकल कक्ष अनुक्रमण 12 के एक विरूपण साक्ष्य हैं।

Discussion

परंपरागत रूप से, एक ऐसी मछली और आकाश के रूप में कोशिकीय तरीकों आवश्यक कोशिकाओं के स्तर पर CNVs और aneuploidy पहचान। अब, एकल कोशिका अनुक्रमण इस तरह के सवालों के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में उभरा है। क्योंकि यह दोनों जीनोम चौड़ा और उच्च संकल्प है एकल कोशिका अनुक्रमण मछली और आकाश पर फायदे हैं। इसके अलावा, जब उचित गुणवत्ता नियंत्रण विधियों लागू कर रहे हैं, एकल कोशिका अनुक्रमण CNVs का एक और अधिक विश्वसनीय आकलन और aneuploidy प्रदान कर सकते हैं के रूप में यह मछली और आकाश को निहित संकरण और प्रसार कलाकृतियों के लिए अतिसंवेदनशील नहीं है। हालांकि, एकल कोशिका अनुक्रमण के हाल के अनुप्रयोगों के कई संवेदनशीलता का पूरी तरह से आकलन और तरीकों की विशिष्टता की पुष्टि नहीं की गई है और विश्लेषण करती है। दरअसल, विश्लेषणात्मक अन्य अध्ययनों द्वारा इस्तेमाल के तरीकों में से कुछ झूठी सकारात्मक CNV कॉल 12 के उच्च आवृत्तियों (> 50%) के साथ जुड़े रहे हैं। दृष्टिकोण का वर्णन हम कड़ाई से केएन की कोशिकाओं का उपयोग कर परीक्षण किया गया हैआदेश में सही और गलत की खोज की दरों का निर्धारण और संवेदनशीलता और CNV का पता लगाने के 12 की विशिष्टता का अनुकूलन करने में खुद CNV बोझ। गुणवत्ता नियंत्रण और विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण इस प्रोटोकॉल में वर्णित, 5 एमबी लाभ का लगभग 20%, 5 एमबी नुकसान के 75%, और सभी CNVs 10 एमबी से अधिक उपयोग कर पता लगाया जा सकता है। हालांकि एकल कक्ष अनुक्रमण के झूठे खोज दर का निर्धारण करने के लिए कठिन है, हम इसे 25% से कम होने का अनुमान है। इस प्रोटोकॉल के स्रोतों की विविधता से कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है, लिपियों CNV का पता लगाने के संकल्प को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, और प्रोटोकॉल जीनोमिक परिवर्तन के अन्य प्रकारों की पहचान करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

वहाँ एकल कक्षों में ताजा ऊतकों को अलग कर के साधनों की एक किस्म है, और कई प्रकाशनों ऐसी त्वचा 24 और मस्तिष्क 25 के रूप में विशिष्ट ऊतकों के लिए अनुकूलित प्रक्रियाओं, का वर्णन है। हम microaspiration द्वारा एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए पसंद के रूप में इसके लिए अनुमति देता है प्रत्येक कोशिका के आर दृश्य मूल्यांकन अनुक्रम किया जा सके। हालांकि, यह भी प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) 26 और 27 microfluidic उपकरणों द्वारा एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए संभव है। तो एकल कक्ष अलगाव और पूरे जीनोम प्रवर्धन मैन्युअल किया जाता है, यह अलग और एक बैठे ही में चालीस कोशिकाओं के लिए ऊपर बढ़ाना उचित है। आदेश में उच्च गुणवत्ता एकल कक्ष अनुक्रमण डेटा प्राप्त करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि एकल कोशिका जीनोम के प्रवर्धन वर्दी और पूरा हो गया है। हम एकल कक्षों की गुणवत्ता सेल और प्रवर्धन की दक्षता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अलग-थलग अनुक्रमण डेटा की गुणवत्ता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है कि लगता है। जैसे, कोशिकाओं अलगाव और पूरे जीनोम प्रवर्धन करने के लिए बस से पहले उनके पैतृक वातावरण से काटा जाना चाहिए शुरू करना चाहिए तुरंत बाद कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं। इसके अलावा, सेल और विखंडन कदम वास्तव में कदम 2.3-2.6 में वर्णित के रूप में पालन किया जाना चाहिए।

"> एल्गोरिदम संवेदनशीलता और विशिष्टता 12 पर प्रभाव का विरोध करने के साथ, CNV का पता लगाने के संकल्प को बदलने के लिए समायोजित किया जा सकता है। यह भी tetraploidy 11 की सेटिंग में पूरे गुणसूत्र aneuploidy पता लगाने के लिए थ्रेसहोल्ड समायोजित करने के लिए संभव है। हालांकि, हम पाते हैं कि हमारे दृष्टिकोण, CNVs से अधिक 5 एमबी का पता लगाने के लिए सीमित है के रूप में पूरे जीनोम प्रवर्धन के दौरान पेश शोर छोटे वेरिएंट 12 का पता लगाने के पेचीदा हो। पूरे जीनोम प्रवर्धन दृष्टिकोण में भविष्य में सुधार अंततः एकल कक्ष अनुक्रमण का उपयोग CNV का पता लगाने के संकल्प को बढ़ाने चाहिए।

एकल कोशिका अनुक्रमण न केवल नकल संख्या परिवर्तन की जांच, लेकिन यह भी एकल nucleotide रूपों 28, 29 और संरचनात्मक बदलाव 30 के लिए अनुमति देता है। एकल कक्ष अलगाव के लिए हमारी प्रोटोकॉल इन अन्य कुए जवाब देने के लिए लागू किया जा सकताstions। हालांकि, पूरे जीनोम प्रवर्धन विधि का चुनाव विशिष्ट अनुप्रयोग पर निर्भर करता है। विधि इस प्रोटोकॉल है, जो पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन पर आधारित है में वर्णित है, सबसे अच्छा है क्योंकि यह प्रवर्धन पूर्वाग्रह 32 के निचले स्तर के साथ जुड़ा हुआ है प्रतिलिपि संख्या परिवर्तन का पता लगाने के लिए अनुकूल है। ऐसे एकल nucleotide बहुरूपताओं के रूप में जीनोमिक परिवर्तन, के अन्य प्रकार की जांच के लिए, पूरे जीनोम प्रवर्धन के अन्य तरीकों के 31, 32 और अधिक उपयुक्त माना जाता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम इस पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए स्टुअर्ट लेविन धन्यवाद। इस काम के स्वास्थ्य अनुदान GM056800 के राष्ट्रीय संस्थानों और कैथी और रूखा संगमरमर कैंसर रिसर्च फंड एंजलिका आमोन करने से और कॉख संस्थान सहायता अनुदान P30-CA14051 द्वारा समर्थित किया गया था। एंजलिका आमोन भी हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट और जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए ग्लेन फाउंडेशन के एक अन्वेषक है। काक NIGMS प्रशिक्षण अनुदान T32GM007753 द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma A5177
PVC tubing (ID 3/16", OD 5/16", ~1 foot) VWR 89068-500
PVC tubing (ID 5/16", OD 7/16", ~6 inches) VWR 89068-508
Acrodisc Syringe Filter with HT Tuffryn Membrane (diameter 25 mm, pore size 0.2 µm) VWR 28144-040
Serological pipette (5 mL) BioExpress P-2837-5 Any plastic 5 mL pipette should suffice
In-Line Water Trap for Oxygen Use Amazon.com 700220210813
Capillary Melting Point Tubes (ID 0.8-1.1 mm, 100 mm length) VWR 34502-99
Modeling clay VWR 470156-850
Petri dish (150 mm diameter) VWR 25384-326 Surface should be non-adherent to facilitate aspiration of single cells
Hard-Shell Full-Height 96-Well Semi-Skirted PCR Plates Bio-Rad HSS9601 Any 96-well PCR plate should suffice
96-well tissue culture plate VWR 62406-081 Any 96-well tissue culture plate should suffice
GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit Sigma WGA4
Microseal 'A' Film Bio-Rad MSA5001
Mini plate spinner Thomas Scientific 1225Z37
Thermal cycler Bio-Rad 1861096  Any thermal cycler should suffice so long as it can accommodate a 96-well PCR plate
Agencourt Ampure Beads Beckman Coulter A63880
Dynamag-2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Any similar magnetic tube strip should suffice
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1096
Nextera XT Index Kit Illumina FC-121-1012
Complete kit (optimized for Roche LightCycler 480) Kapa Biosystems KK4845  This kit is optimized for the Roche LightCycler 480 real-time PCR machine. If using a different machine, substitute a kit optimized for your machine.

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References

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आनुवंशिकी अंक 120 नकल संख्या परिवर्तन aneuploidy जीनोमिक विविधता एकल कक्ष पूरे जीनोम प्रवर्धन पूरे जीनोम अनुक्रमण
नकल संख्या बदलाव की जांच सिंगल सेल अनुक्रमण का उपयोग
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Knouse, K. A., Wu, J., Hendricks, A. Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing. J. Vis. Exp. (120), e55143, doi:10.3791/55143 (2017).

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