Laboratorieskala Produktion og oprensning af et terapeutisk antistof

Summary

Denne protokol beskriver fremstillingen af ​​et terapeutisk antistof i en mammal ekspressionssystem. De beskrevne fremgangsmåder omfatter fremstilling af vektor-DNA, stabil transfektion og serumfrit tilpasning af en human embryonal nyre 293 cellelinie, der er nedsat af skala kulturer og oprensning store ved hjælp af affinitetskromatografi.

Introduction

Succesen af ​​terapeutiske antistoffer fortsætter med at drive betydelig investering i antistof udvikling som en bølge af næste generation af lægemidler begynder. Forventes Antistoffet marked, der skal omformes ved antistoffragmenter ^1, antistof-drug konjugater ^2, bispecifikke antistoffer ³ og manipuleret antistoffer med gunstige egenskaber ^4. En anden klasse vinder farmaceutisk interesse er biosimilars. Biosimilære antistoffer er "meget ens« replikere produkter af en terapeutisk antistof, der allerede har modtaget myndighedernes godkendelse. Et forslag biosimilært skal være sammenlignelige med ophavsmanden antistof med hensyn til dets struktur, funktion, dyr toksicitet, kliniske sikkerhed og effektivitet, menneskelige farmakokinetik (PK), farmakodynamik (PD) og immunogenicitet ^{5, 6.}

Godkendelsen rater af biosimilære antistoffer har været langsomme på grund af de strenge begrænsninger på den endelige kvalitet af produktet. De nøjagtige fremstillingsprocesser såsom specifikke cellelinjer og dyrkningsbetingelser igennem til de endelige procestrin kan forblive proprietær. Hvad mere er, fremstillingen af ​​antistoffer i sagens natur indebærer en grad af variabilitet, som kan føje til den udfordring at producere et meget lignende produkt. En omfattende fysisk-kemiske og biofysisk karakterisering og sammenligning er ganske vanskeligt, men en række undersøgelser, der viser karakteristika biosimilære antistoffer dukker i litteraturen ^{7, 8, 9.}

Generering af en terapeutisk antistof begynder med transfektion af pattedyrsværtsceller med en vektor, der bærer generne for det respektive antistof. Vector design, cellelinje og dyrkningsbetingelser er centrale overvejelser for opsætning af expression system.

DNA sekvenser af antistoffer kan hentes fra Drug Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) eller forskningspublikationer herunder patenter. For eksempel sekvensen af ​​trastuzumab er tilgængelig via Drug Bank (DB ID: DB00072). Aminosyresekvensen af ​​de variable regioner kan undergå gen design og optimering til syntese i de ønskede værtsart. Det er vigtigt for et biosimilært antistof der ingen ændring sker på aminosyresekvensen. Når syntetiseret, kan antistofgener subklones i den passende valgte vektor.

Humane IgG-antistoffer består af to identiske tunge kæder og to identiske lette kæder. Tæt reguleret ekspression af begge kæder er afgørende for optimal produktion af heterologt IgG protein i pattedyrceller ^10. Intra- såvel som inter-kæde disulfidbindinger skal dannes, og en række post-translationelle modifikationer skal være iintroduceret under proteinbiosyntese. En række vektorer er til rådighed, der er blevet designet specifikt til at udtrykke antistofgener (se tabel of Materials). Disse antistof-specifikke vektorer udtrykker normalt de konstante regioner for både tunge og lette kæder så kun de variable regioner i hver kæde kræver kloning.

Transfektion af celler med to uafhængige konstruktioner (co-transfektion) er den mest almindelige metode til afgivelse tunge og lette kæde-gener. Det vil sige, er hvert gen drevet af sin egen promotor og transskriberes som separate antistofkæder inden de samles i det endoplasmatiske reticulum. På den anden side, multi-cistroniske vektorer har interne ribosomindgangssted (IRES) elementer inkorporeret som tillader ekspression af multiple gener som en enkelt mRNA-transkript med oversættelse tilladt fra interne regioner af mRNA ^11. I dette tilfælde er de tunge og lette kæde gener er koblet i en Arrangement at opnå co-ekspression af begge antistofkæder ^{10, 12.}

Mens forbigående transficerede celler gav tilstrækkelig protein til at udføre et begrænset antal eksperimenter, kan stabilt transficerede cellelinjer, der har undergået selektion for genom integration levere højere udbytter. Højere proteinmængder mulighed for assay udvikling vedrørende in vitro karakterisering og kan give en indikation af antistof kvalitet i betragtning for downstream-applikationer såsom klonal cellelinie og bly kandidat udvælgelse.

Målet med denne artikel er at beskrive den stabile ekspression og oprensning af et terapeutisk antistof produceret i en mammal ekspressionssystem. Faktisk kan denne fremgangsmåde anvendes til ekspressionen af ​​et biosimilært antistof. Fremgangsmåden kan anvendes til den første karakterisering af antistoffer før man går videre til det kritiske, omend tidskrævende steps identificere en ønskelig klon for større produktionsskala. Desuden kan denne metode anvendes til at udtrykke andre proteiner og ikke kun antistoffer.

Følgende detaljeret protokol beskriver udtryk for terapeutiske antistoffer trastuzumab. Denne består af fremstilling af vektor-DNA, efterfulgt af stabil transfektion i HEK-293-cellelinien og oprensning af antistof-protein ved en automatiseret kromatografisk metode.

Protocol

BEMÆRK: En egnet pattedyrekspressionsvektor skal anvendes til denne protokol. Her anvendes en enkelt konstruktion indeholdende to ekspressionskassetter (dvs. tung og let kæde-ekspression drives af separate promotorer). Trastuzumab tunge og lette kæder blev tidligere klonet ind i vektoren. Denne vektor var en gave fra Andrew Beavil, opnået gennem en ikke-for-profit-plasmidet repository ^13.

1. Inddrivelse og opskalering af vektor-DNA

BEMÆRK: Vector DNA blev modtaget som en blød agar stikkultur i Escherichia coli XL-1 Blue-stammen; vektor bærer hygromycinresistens.

1. Indsæt en steril inokulation stab eller loop i den bløde agar af stikkultur derefter streak en Luria Bertani (LB) agarplader fremstillet med 75 ug / ml hygromycin for isolerede kolonier. Inkubér pladen ved 37 ° C i 18-24 timer.
2. Inokulere en enkelt koloni i 5 ml Terrific Broth (TB) indeholdende 75 ug / ml hygromycin. INCUbate kulturen ved 37 ° C i 18-24 timer med 225 rpm rystning.
3. Brug overnatskultur at fremstille en glycerolstamopløsning af vektor-DNA ved forsigtigt at blande 800 pi kultur med 200 pi 80% glycerol i et kryohætteglas og fryse ved -80 ° C.
   1. Tilsættes 100 pi af overnatskulturen til 100 ml TB indeholdende 75 ug / ml hygromycin i en forvirret rystekolbe (dvs. 1 / 1.000 fortynding). Inkuber kulturen ved 37 ° C i 18-24 timer med 225 rpm rystning.
4. Efter dyrkning natten over udvinde og oprense DNA ifølge producentens anvisninger midi / maxi forberedelse kit med følgende undtagelse; under det sidste trin, elueres eller resuspender DNA med vand (pH 7,0-8,5).
5. Check koncentration og renhed af DNA ved absorbanslæsninger ved 260 og 280 nm derefter opbevare DNA ved -20 ° C.
   BEMÆRK: Valgfri (anbefales): Sekvens DNA ved hjælp af vektorgrafik-specifikke primere til at bekræfte identiteten.

2. Stabil transfektion af HEK-293-celler

1. Vokse og opretholde HEK-293-celler (suspensionsceller) ifølge standard protokoller i serumfrit medium suppleret med 0,1% ikke-ionisk overfladeaktivt middel i Erlenmeyerkolber. Oprethold ved 2 x 10 ⁵ celler / ml og subkultur hver fjerde dag. Dyrke celler ved 37 ° C med _5% CO2 og 120 rpm rotation.
   BEMÆRK: Celler burde have været i kultur i ikke mindre end 4 dage og ikke mere end 4 uger før transfektion. HEK-293-celler dyrket som monolag i serum-holdige medier kan også anvendes til denne procedure.
2. På dagen før transfektion, frø HEK-293-celler ved 3 x 10 ⁵ celler / ml i brønde i en plade med 12 brønde i 2 ml Dulbeccos Modified Eagle Media (DMEM) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum ( FBS). På dagen for transfektion, kontrollere, at cellerne har nået 80-90% sammenflydning
3. Fortynd DNA og polyethylenimin (PEI) særskilt transfektions- medier derefter blandes sammen.
   1. Fortynd 1,25 ug vektor-DNA pr brønd (15 ug i 12 brønde) i 300 pi transfektion medier. Der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
   2. Fortynd 2,5 pi 1 mg / ml PEI-opløsning (30 pi i 12 brønde, dvs. 1: 2-forhold af DNA til PEI) i 300 pi transfektion medier. Der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
   3. Tilføj fortyndet DNA til fortyndet PEI, forsigtigt blandes og inkuberes ved stuetemperatur i 15 min.
4. Der tilsættes 50 pi DNA / PEI-blanding dråbevis til hver brønd i pladen. Rock pladen forsigtigt for at fordele transfektionsblandingen derefter placere pladen ved 37 ° C, _5% CO2 i 24 timer.
5. Tilsæt 50 ug / ml hygromycin B per brønd og returnere pladen til 37 ° C, _5% CO2 i 10 dage.
   BEMÆRK: På dag 10, vil un-transficerede celler er døde og aftages fra overfladen af ​​pladen, hvorimod stabilt-transficerede celler vil være levedygtige og fastgjort til pladen.
6. Udskift mediet i brønde med1/4 volumen serumfrie medier og 3/4 volumen DMEM suppleret med 10% FBS (dvs. 0,5 ml serumfrit medium + 1,5 ml DMEM = 7,5% endelig serumkoncentration) og inkuberes i 4 dage.
7. Udskift mediet i brønde med 1/2 volumen serum-frie medier og 1/2 volumen DMEM suppleret med 10% FBS (dvs. 1 ml serum-frie medier + 1 ml DMEM = 5% endelig serum koncentration) og inkuberes i 4 dage.
8. Udskift mediet i brønde med 3/4 volumen serum-frie medier og 1/4 volumen DMEM suppleret med 10% FBS (dvs. 1,5 ml serum-frie medier + 0,5 ml DMEM = 2,5% endelig serumkoncentration) og inkuberes i 4 dage.
9. Erstatte medierne i brøndene med 2 ml serumfrit medium suppleret med 0,1% ikke-ionisk overfladeaktivt middel (dvs. 0% endelig serumkoncentration) og inkuberes i 4 dage.
   BEMÆRK: Oprethold 50 ug / ml hygromycin B selektivt tryk på celler under serum-fri tilpasning. Celler tilpasset serumfri medier løsnes fra overfladen af ​​brønde og kan klynge in suspension. Se trin 2.1 for dyrkningsbetingelser med ekstra tillæg på 50 ug / ml hygromycin B.
10. Ved hjælp af en pipette forsigtigt blande suspensionskulturer i 12-brønds plade og pool celler i et separat rør.
    1. Anvendelse af et hæmocytometer, optælle puljede celler og frø i 30 ml serumfrie medier i en Erlenmeyer kolbe ved 2 x 10 ⁵ celler / ml. Dyrke celler ved 37 ° C med _5% CO2 og 120 rpm rotation. Subkultur og udvide hver fjerde dag.
11. Fortsætte med at ekspandere kultur størrelse til den ønskede celledensitet for at opnå 10 hætteglas på 1 x 10 ⁷ celler / hætteglas for kryopræservering i flydende nitrogen. Frys cellerne i serumfrit medium indeholdende 10% dimethylsulfoxid (DMSO).
    BEMÆRK: Konditionerede medier indeholdende antistof kan høstes ved hver subkultur at bekræfte proteinproduktion eller anvendes til at optimere oprensningsbetingelser. At høste konditionerede medier og opretholde celler til subkultur, centrifugeres kulturen på300 xg i 5 minutter og filtreres derefter-sterilisere supernatanten gennem et 0,22 um filter. Filtrerede supernatant kan opbevares ved 4 ° C i 1-2 uger eller -20 ° C i længere tids opbevaring.

3. Stor Scale Antibody Produktionen fra Batch overgrow Culture

BEMÆRK: Antistof produktion kan følges på fra trin 2.11 hvor eksisterende celler udvidet til den ønskede celletæthed baseret på batch overgrow kultur volumen til at være setup. Ellers celler der er blevet optøet fra kryopræservering begynder i denne fase en gang udvidet til en passende celledensitet og volumen. Forskellige kultur kosttilskud kan anvendes til at optimere antistof-produktion; anvendelse af trypton at øge antistofudbytte demonstreres i denne protokol.

1. Seed celler på 2 x 10 ⁵ celler / ml i 100 ml serum-frie medier i to Erlenmeyerkolber (at sammenligne antistof udbytter fra un-suppleret og næringsfattige suppleret kulturer). Kultur på 37 ° C, _5% CO2
2. Efter 24 timer tilsættes trypton til en endelig koncentration på 0,5% til næringsstof-suppleret kultur. Udligne volumen af ​​un-suppleret kultur med serumfrie medier.
3. Fra dag 8, udføre celletællinger af kulturerne daglige anvendelse af et hæmocytometer at overvåge cellelevedygtighed. Høste kultursupernatanter, når cellelevedygtighed er mindre end 80%.
   1. Harvest supernatanten ved centrifugering af kulturerne ved 3.000 x g i 15 min og filtreres derefter-sterilisere supernatanten (indeholdende antistof) gennem et 0,22 um filter. Opbevar supernatanterne ved 4 ° C (kortvarigt) eller nedfryses ved -20 ° C (langvarig).

4. Antistof Oprensning ved affinitetskromatografi under anvendelse af en automatiseret Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System

BEMÆRK: Følgende procedure kan generelt anvendes på de fleste automatiserede systemer. Oprensning kan udføres ved stuetemperatur eller ved 4 ° C (hvis FPLC-system er holdt i et køligt rum).kan udføres en række scouting tests for at identificere de optimale rensning forhold, herunder relevante kolonne matrix, bindende buffer, elueringsbuffer og pH for at sikre maksimal genvinding af oprenset antistof fra konditioneret medie (se afsnittet Resultater). De optimale betingelser er afhængige af antistoffet eller proteinet blive oprenset. Oprensninger blev udført på et automatiseret FPLC-system. Oprensninger blev udført ved stuetemperatur under anvendelse af en 5 ml Protein A-søjle.

1. Forbered følgende buffere hjælp ultrarent vand og justere til den anbefalede pH derefter filtreres gennem et 0,22 um filter.
   1. Forbered 1 L phosphatbufret saltvand (PBS) pH 7,4 (bindingsbuffer) ved at blande følgende: 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCI, 0,01 M Na ₂ HPO ₄ og 0,001 M KH ₂ PO _4. Indstil pH om nødvendigt før filtrering bufferen.
   2. Forbered 500 ml 0,1 M glycin-HCI pH 2,7 (elueringspuffer). Indstil pH før filtrering buffis.
   3. Forbered 50 ml 1 M Tris pH 9,0 (neutralisering buffer).
2. Kontroller, at alle systemets magt og kommunikationsforbindelser med computer er lavet. Enheder skal være synlige i softwaren "System Control 'modul. Sikre UV-celle er sat til 280 nm bølgelængde. Valgfrit: Kalibrer pH-meter hvis den er tilsluttet, og der skal anvendes.
3. Fordybe indløbsrør af A, B og prøve pumpe i ultrarent vand til vaskning af systemet. Rense pumperne med en sprøjte, hvis der er luft i slangen eller mistanke om luft i systemet. Vask systemet med vand ved manuel drift via systemstyreenheden eller via en automatiseret metode. Bemærk at tryk, ledningsevne, UV280 opsporing og pH forbliver konsekvent og at grænsen pres for kolonnen ikke overskrides som pr producentens specifikationer.
   BEMÆRK: Abnormiteter kan indikere luft eller blokering i systemet, der bør behandles, før du fortsætter.
4. I systemet regulatormodulet, starte strømningshastighed, ved 1ml / min manuelt via pumpe A i enten belastning (spring prøve loop) eller injicere (gennem prøven løkken) position for at begynde at forbinde kolonnen. Afbryd slangesystemet ved kolonnens position indløb og fjerne proppen forbindes med kolonnens indløb.
   1. Tillade vand at strømme fra slangesystemet dråbevis på toppen af ​​kolonnen derefter vedhæfte slangesystemet til søjlen. Under kolonnen indløb og indløb montering fyldt med dråber af vand sikrer en forbindelse er fri for luftbobler.
5. Fastgør kolonnen udløb ved den nedstrøms udløb og kontrollere alle fittings er stramt spændt. Med kolonnen nu fastgjort til systemet, ikke overstiger grænserne for maksimumgrænse tryk og strømningshastighed som skitseret i kolonne specifikationer.
6. Vask søjlen med 5 søjlevolumener (CV) vand. Hvis det er nødvendigt, fortsætte kolonne vask indtil UV280 sporing er stabiliseret.
7. Fordybe indløbsrør af A i bindingspuffer, B i elueringsbuffer og prøvepumpen i bindingsbuffer to bringe systemet i ligevægt i korrekte buffere. Fyld indløbs- rør med buffer hjælp PumpWash ved manuel betjening.
8. I "Method Editor 'modul af softwaren, skal du bruge den metode guiden til opsætning en affinitetskromatografi metode til den kolonne, er beregnet til at blive brugt.
   BEMÆRK: Automatiseret FPLC systemer kommer med metoder fyldte med de anbefalede indstillinger (dvs. gennemstrømning og tryk grænse) og køre trin baseret på kolonnen (producent, matrix og størrelse) er valgt til rensning.
   1. Brug følgende køre trin for Protein A affinitetskromatografi:
      1. Ækvilibrer systemet med 5 CV bindingsbuffer og indsamle gennemstrømning i affaldsbeholder.
      2. Load prøve på søjlen (volumen, der skal lastes er angivet manuelt i fremgangsmåden) og indsamle gennemstrømning i en separat beholder.
      3. Vask-system med 5 CV bindingsbuffer og indsamle gennemstrømning i en separat beholder.
      4. Eluer kolonnen med 5 CV isocratic fraktionering under anvendelse elueringsbuffer og indsamle oprenset antistof prøve som fraktioner ved fraktionsopsamler.
      5. Ækvilibrer systemet med 5 CV bindingsbuffer og indsamle gennemstrømning i affaldsbeholder.
9. Når fremgangsmåden har været setup, angive mængden af ​​konditionerede medier, der skal påføres søjlen og gemme metoden.
   BEMÆRK: Det angivne volumen i metode bør være 5-10 ml mindre end det faktiske volumen for at undgå introduktion af luft under prøven løb. Den angivne mængde anvendes i denne protokol er 90-120 ml.
10. Sænk prøven pumpe slangen i beholderen indeholdende de konditionerede medier.
11. Forbered en separat beholder til opsamling prøve gennemstrømning via den angivne stikkontakt slangen.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at indsamle gennemstrømning i tilfælde der opstår en fejl under kørslen eller bindingskapacitet af søjlen er overskredet kræver gennemstrømning skal genanvendes til den kolonne eller rensning repeated.
12. Forbered opsamlingsrør i fraktionsopsamleren. Tilsæt 100 pi neutralisering buffer pr 1 ml fraktion volumen. Det FPLC systemet automatisk eluere fraktionerne i indsamling rør i.
13. I "System Control 'modul af softwaren, skal du åbne metode, der skal køres.
    BEMÆRK: Metoden run initieres i en række sider, der omfatter kontrol variablerne i metoden, fraktion opkøber opsætning og definerer resultat filnavn og opbevaringssted.
14. Klik på START for at starte kørslen. Løbet kan overvåges i "System Control 'modul.
15. Ved afslutningen af ​​rensning køre, tjek den resulterende kromatogram i "Evaluering" modul i systemsoftwaren.
16. Kombiner alle proteinholdige fraktioner i et separat rør, buffer udveksling og koncentrer i PBS under anvendelse af en centrifugal filter enhed med 30 kDa molekylvægtsafskæring. Udfør centrifugeringstrin ifølge producentensinstruktioner.
17. Mål antistofkoncentration ved anvendelse bicinchoninsyre-assay (BCA) ifølge producentens instruktioner.
18. Hvis en anden rensning køre skal udføres, prime prøven pumpe slangen i Binding buffer og gentag trin 4,9-4,14.
19. Ved afslutningen af ​​oprensningskørsler, fordybe indløbsrør af A, B og prøve pumpe i ultrarent vand og vask systemet og søjle som udføres i trin 3.
20. Nedsænke A, B og prøvepumpen slanger i vaskeprocedure 20% ethanol og gentag til opbevaring af systemet og kolonne.
21. Afbryd kolonne fra nedstrøms stikkontakten og erstatte kolonne prop, og afbryd derefter kolonnen ved indløbet og erstatte prop, tilslut slangen til systemet. Opbevar søjlen ved 4 ° C.

Representative Results

Stabil produktion af trastuzumab af transficerede HEK-293-celler blev bekræftet under anvendelse bio-lag interferometri (BLI) som beskrevet i figur 1. En IgG-standardkurve blev dannet ved at måle bindingen på mellem et IgG-antistof, og protein A biosensor (figur 1A). Det rå supernatant prøve blev målt på samme måde, så dens koncentration interpoleret fra standardkurven (figur 1B). Koncentrationen supernatanten blev målt til at være ca. 25 ug / ml (samplet fra 50 ml opsamlet ved subkultur) to uger efter serumfrit tilpasning og før opsætning af celler til overgrow batchkulturer.

Supernatant indsamlet ved hver subkultur efter serumfrit tilpasning blev puljet og anvendt til at optimere oprensningsbetingelser; scouting af bindende og elueringsbuffere blev udført som vist i figur 2 figur 2A baseret på UV280 signal. Når protein A-søjlen i ligevægt, en stigning i UV280 signal repræsenterer prøve loading; denne stigning skyldes supernatant gennemstrømning passerer gennem søjlen (indeholdende ubundne proteiner, som absorberer UV-lys ved denne bølgelængde), mens antistoffer er blevet fanget af søjlen. Når prøven er loadet, det UV280 signalet vender tilbage til udgangspunktet som eventuelle resterende ubundne proteiner vaskes væk. Eluering optræder som pH falder til den optimale pH for at frigive antistofferne fanget af kolonnen, vist med en stigning i UV280 signal med eluerede antistoffer fraktionerede og indsamles af fraktionsopsamleren. Hele prøven sigt bør ledningsevne ændringer baseret på saltkoncentrationen i bufferne mens systemtryk forblive relativt konstant. Optimal eluering, pH og puffer blev undersøgt først (figur 2B); Det blev observeret, at antistof elFullrate mere effektivt fra søjlen ved lavere pH under anvendelse af enten 0,1 M glycin-HCI eller citronsyre. Men under pH 2,7 var der ingen yderligere forbedring i elueringsprofilen. Endvidere optrådte elueringstoppe med 0,1 M glycin-HCI mindre udvidet sammenlignet med 0,1 M citronsyre ved lignende pH (figur 2B). Efterfølgende blev 0,1 M glycin-HCI pH 2,7 buffer anvendes til at optimere bindende pufferbetingelser (figur 2A). Virkningen af forskellige bindingssteder buffere på eluering blev også sammenlignet (figur 2A). Det blev observeret, PBS pH 7,4 og 20 mM natriumphosphat pH 7 havde sammenlignelige elueringsprofiler, mens tilsætning af 3 M NaCl til natriumphosphatpuffer (at forbedre antistofbinding til søjlen) blev ikke gunstige. På grund af den lette PBS-buffer præparat, blev PBS pH 7,4 valgt som bindingsbuffer for fremtidige oprensninger.

Oprensningsprocedurerne kromatogrammer af batch overgrow cultures, er vist i figur 3; trypton-suppleret kultur sammenlignes med un-suppleret kultur. Det blev bemærket, at tilsætning af trypton til det supplerede kultur resulterede i en øget UV280 signal under prøven påsætningstrinnet, sammenlignet med den ikke-supplerede kultur. Den trypton-suppleret kultur gav 3,8 mg og un-suppleret kultur 1,7 mg trastuzumab, baseret på protein udvundet efter buffer udveksling og koncentration. Kvalitetskontrol af det oprensede antistof blev bekræftet ved natriumdodecylsulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) som vist i figur 4. Trastuzumab dyrket i un-suppleret og trypton-suppleret betingelser resulterer i lignende antistof profiler under ikke-reducerende og reducerende forhold. Som forventet, en fremtrædende bånd ved ca. 150 kDa bekræfter korrekt foldet antistof; andre bands repræsenterer fragmenterede former af antistoffet, et resultat af disulfidbinding brud og en fremgangsmåde-induceret artefact. Ligeledes to bånd ved 50 og ca. 25 kDa bekræfte tilstedeværelsen af ​​antistof-tunge og lette kæder, henholdsvis.

Figur 1: Bekræftelse af proteinproduktion ved stabilt transficerede HEK-293-celler under anvendelse af bio-lag interferometri (BLI). (A) standardkurve blev genereret ved at måle binding sats af IgG antistof standard til protein A biosensor over 120 sekunder (grå) efterfulgt af rå supernatant prøve af PEI-transficeret trastuzumab (PEI-Tmab, sort). (B) Koncentration af antistofprotein i rå supernatant (åben sort cirkel) blev interpoleret fra standardkurven (lukkede sorte cirkler) ved afbildning IgG-antistof standard i forhold til bindingsenergi sats. Klik her for at se en større version af denne f igur.

Figur 2: Oprensning kromatogrammer af eluering og bindingsbuffer scouting eksperimenter. (A) De forskellige trin i oprensningen er afbildet ifølge UV280 signal (blå, grøn eller sorte linjer); prøvepåfyldning på søjlen efterfulgt af kolonne vaske at vaske væk ubundne proteiner derefter eluering af bundet protein fra søjlen. Måling af pH (rød linje), ledningsevne (brun linje) og systemtryk (grå linie) overvåges under hele kørslen. Tre buffere blev testet for optimal binding af trastuzumab til søjlen og bortvaskning af ubundet protein at maksimere eluering udbytte. (B) 0,1 M glycin-HCI (pH 2,5 til 3,3) og 0,1 M citronsyre (pH 2,5-3,5) buffere blev testet for optimal eluering af trastuzumab fra protein A-søjle.target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Rensning kromatogrammer af trastuzumab (TmAb) batch overgrow kulturer dyrket uden supplement eller suppleret med trypton. Stabilt transficerede HEK-293-celler blev setup på 2 x 10 ⁵ celler / ml og dyrket i 8 dage enten un-suppleret (120 ml; sort linie) eller suppleret med 0,5% trypton (90 ml; grøn linje). Efter høst blev supernatanter oprenses under anvendelse af PBS pH 7,4 (bindingsbuffer) og 0,1 M glycin-HCI pH 2,7 (elueringspuffer). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Analyse af oprenset trastuzumab ved SDS-PAGE. Ca. 2 ug trastuzumab oprenset fra un-suppleret (-) eller trypton-suppleret (+) -kulturer blev udtaget med 10% SDS-PAGE under ikke-reducerede eller reducerede forhold. Gelen farves med Coomassie R-250. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne protokol detaljer transfektionen stabil ekspression og oprensning af et terapeutisk antistof i HEK-293-celler. Stabil udtryk for antistofgener er det første skridt i at generere et antistof-producerende cellelinje til udvikling og fremstilling af et terapeutisk antistof. Mens kinesisk hamster ovarie (CHO) celler forbliver ekspressionen foretrukne platform for terapeutiske proteiner, er HEK-293-cellelinje få fremtrædende med erkendelsen af, at proteiner produceret i disse celler er en tættere match med naturligt forekommende humane proteiner i form af indlæg -translational ændringer og funktion ^{14, 15.}

Mammale cellelinjer, herunder CHO (f.eks CHO-DG44 og CHO-K1) samt ikke-immunoglobulin secernerende murine B-cellelinier NS0 og SP2 / 0 hovedsagelig anvendes i biofarmaceutisk produktion. Ekspressionssystemer baseret på disse cellelinier er baseret på udvælgelse proccesser, hvor højt producerende kloner induceret og udvalgt via trinvis tilsætning af et bestemt selektiv lægemiddel ^{16, 17.} Udvælgelsesprocessen for en stabil klon kan derfor være vanskelig og tidskrævende. I sammenligning med disse eksisterende metoder, HEK-293-cellelinje håndfast transfects med høj effektivitet. Udvælgelsesprocessen er forenklet og meget nemt tilpasser sig serumfrit suspension kultur, hvilket gør det til et ideelt udtryk for laboratorieskala produktion af proteiner ^18.

En begrænsning ved stabil transfektion er tid til en praktisk mængde protein kan produceres og anvendes i eksperimenter. At forsøge at overvinde denne, den nuværende protokol beskriver en dyrkning skridt, der kan opnå væsentlige mængder af protein inden for 3-6 uger efter transfektion. Partiet overgrow kulturer (produktion i stor skala) giver mulighed for at producere betydelige mængder afantistof til opsætning af in vitro karakterisering eksperimenter i spidsen op til valget af en klonal cellelinje og bly kandidater. Dette har klare fordele i forhold til transient transfektion, hvilket kan kræve større mængder af DNA og reagenser. Desuden er proteinet Udbyttet er ikke reproducerbar fra batch til batch, eftersom ekspression er kun midlertidig og bestemmes ved transfektionseffektivitet.

Tilsætningen af ​​trypton i denne protokol billede et forøget udbytte i proteinekspression. Tilsætning af trypton for transfektion kulturer er tidligere blevet vist at forbedre proteinsyntese ^{19, 20.} Den trypton suppleret kultur resulterede i forbedrede trastuzumab antistof udbytter af 40 mg / l versus un-suppleret kultur af 14 mg / l (figur 3). SDS-PAGE verificeret, at: (1) antistoffet blev produceret korrekt; og (2) tilsætning af trypton ændrede ikke struktur baseret på comsammenligning af de antistof-bånd under ikke-reducerende og reducerende betingelser (figur 4). Tilsætningen af ​​trypton til kulturerne er valgfrit og anvendes især til at opnå højere proteinudbytter. Andre kosttilskud er blevet anset for at forbedre protein udtryk som natriumbutyrat og valproat ^{21, 22, 23.}

Den første checkpoint af protokollen er bekræftelsen af, at proteinet bliver produceret af den transficerede cellelinje. Dette trin kan udføres på ethvert tidspunkt efter perioden på to uger af selektivt tryk anvendes til at udvælge stabile transformanter. En række fremgangsmåder kan anvendes til at bekræfte proteinproduktion herunder bio-lag interferometri (figur 1) eller den lignende fremgangsmåde i et IgG ELISA. Alternativt kan et western blot udføres under anvendelse af et anti-IgG detektionsantistof at identificere antistofprotein i den rå supernatanteller oprenset prøve.

Andre forskere har vist, at højere transfektionseffektivitet opnås ved anvendelse adhærente celler i serum-holdige medier ^24. Tilstedeværelsen af ​​kosttilskud fra animalske er uønsket til biofarmaceutisk produktion. Derfor er den sekventielle tilpasning til serum-frie medier er et afgørende skridt i protokollen, der kræver tålmodighed og omhyggelig overvågning af cellelevedygtighed. Omsætningen periode 4-dages foreslået i denne protokol er en guide og så hvis der opstår problemer på et bestemt serumkoncentration, anbefales det, at cellerne subkultiveret 2-3 gange i den tidligere forhold mellem serumholdigt til serumfrit medium før du fortsætter med næste forhold. Forud for etablering af batch kulturer og nedfrysning af celler, mener, at de fleste cellelinjer anses fuldt tilpasset efter tre subkulturer i 100% serum-frie medier.

En af de mest afgørende trin ved rensningstrinnet er than scouting for optimale betingelser og puffere for at sikre effektiv binding af antistoffet til kolonnen og derefter fuldstændig eluering fra søjlen (figur 2). De konditionerede medier opsamlet ved hver subkultur er anvendelige til dette formål. I dette tilfælde elueringspufferen af ​​citronsyre pH 3,5 anbefales generelt for protein A-affinitetskromatografi var uegnet til eluering af trastuzumab fra søjlen. Scouting forsøg under anvendelse af to forskellige elueringsbuffere ved forskellige pH viste klart, at selv inden for snævert område af pH testet, blev graden af eluering påvirket (figur 2B).

Med hensyn til nedstrøms bearbejdning af de antistoffraktioner Efter oprensning antistoffet kan buffer-udveksles ved anvendelse af en afsaltningskolonne enten ved manuel eller automatisk drift. Alternativt kan dialysemembran også anvendes. Endelig proteinkoncentration kan bestemmes ved andre protein kvantificeringsmetoder herunder målingaf absorbansen signal ved 280 nm med koncentration udledes Beer Lamberts lov baseret på ekstinktionskoefficienten for antistoffet.

Denne protokol har med succes antistoffet produceres proteinet af trastuzumab ved stabil transfektion af HEK-293-celler. Antistoffet blev oprenset og karakteriseret for at bekræfte integriteten. Trinene i denne protokol beskriver DNA forberedelse, kan stabil transfektion efterfulgt af serum-frit tilpasning, produktion i stor skala og automatiseret rensning overføres til at producere andre proteiner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pFUSE vector series	InvivoGen	N/A	Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.
mAbXpress vector series	ACYTE Biotech Pty Ltd.		Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 vector	N/A	N/A	Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.  Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS vector series	Lonza		Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.
Multi-cistronic vector series 1	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic vector series 2	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ	Addgene	61883	Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro Agar	Jomar Life Research	fas-hg-s	Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin.
Fast-Media Hygro TB	Jomar Life Research	fas-hg-l	Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin.
Glycerol, BioXtra, ≥99%	Sigma-Aldrich	G6279	Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit	Astral Scientific	G221020	Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).
FreeStyle 293-F Cells	Life Technologies	R790-07	HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.
FreeStyle 293 Expression Medium	Life Technologies	12338-018	Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.
Kolliphor P188	Sigma-Aldrich	K4894	Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
DMEM, high glucose	Life Technologies	11995-065
Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum	Life Technologies	10082-147
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000	Polysciences, Inc.	23966	Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use.
OptiPro SFM	Life Technologies	12309-050	Transfection formulated serum-free media
Hygromycin B Solution	Jomar Life Research	ant-hg-1
Dimethylsulphoxide (DMSO)	Thermo Fisher Scientific	AJA2225
Tryptone (casein peptone)	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml	Astral Scientific	09-2051-100
HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column	Sigma-Aldrich	GE17-0403-01
AKTApurifier 100	GE Healthcare	28406266	Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.
Glycine-HCl	Sigma-Aldrich	G2879
Citric Acid, monohydrate	Astral Scientific	BIOC2123
Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate	Astral Scientific	BIOCB0035
1 M Tris-HCl solution pH 9.0	Astral Scientific	BIOSD8146
Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)	Merck Millipore	UFC803008/UFC903008	Used to buffer exchange and concentrate purified protein.
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
BLItz System	fortéBIO	45-5000	Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.
Protein A biosensors	fortéBIO	18-5010
Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution	Astral Scientific	786-502
Ammonium Persulfate (APS)	Astral Scientific	AM0486
TEMED	Astral Scientific	AM0761
Coomassie Brilliant Blue R-250	Astral Scientific	786-498
Precision Plus Dual-Color Protein Standard	Bio-Rad	1610374