Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

مختبر إنتاج مقياس وتنقية من الأجسام المضادة العلاجية

Published: January 24, 2017 doi: 10.3791/55153
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Faculty of Pharmacy, University of Sydney

Summary

يصف هذا البروتوكول إنتاج الأجسام المضادة العلاجية في نظام التعبير الثدييات. وتشمل الأساليب المذكورة إعداد الحمض النووي ناقلات، ترنسفكأيشن مستقرة والتكيف المصل خالية من الجنينية خط الخلية الكلى 293 البشري، وإنشاء الثقافات على نطاق واسع وتنقية باستخدام تقارب اللوني.

Introduction

استمر نجاح الأجسام المضادة العلاجية لدفع استثمارات كبيرة في تطوير الأجسام المضادة كوسيلة لموجة من العلاجات الجيل القادم تبدأ. ومن المتوقع أن يتم إعادة تشكيل بشظايا الضد 1، تقارن الضد المخدرات 2، والأجسام المضادة bispecific 3 والأجسام المضادة هندسيا مع خصائص مواتية 4 السوق الأجسام المضادة. فئة أخرى كسب الفائدة الدوائية هي البدائل الحيوية. الأجسام المضادة بدائل حيوية هي "مشابهة للغاية" تكرار المنتجات من الأجسام المضادة العلاجية التي حصلت بالفعل على موافقة الجهات التنظيمية. يجب أن تكون بدائل حيوية المقترحة قابلة للمقارنة مع الأجسام المضادة المنشئ فيما يتعلق بنيته، وظيفة، سمية الحيوانية والسلامة السريرية والفعالية والدوائية الإنسان (PK)، الدوائية (PD) والمناعية 5، 6.

موافقة صوقد آتش الأجسام المضادة بدائل حيوية بطيئا بسبب القيود الصارمة على الجودة النهائية للمنتج. عمليات التصنيع الدقيقة مثل خطوط الخلايا وشروط زراعة محددة وصولا إلى خطوات المعالجة النهائية يمكن أن تبقى الملكية. ما هو أكثر من ذلك، تصنيع الأجسام المضادة ينطوي بطبيعته على درجة من التباين التي يمكن أن تضيف إلى التحدي المتمثل في إنتاج منتج مماثل للغاية. توصيف والمقارنة الفيزيائية والفيزياء الحيوية شامل من الصعب جدا، ولكن عددا من الدراسات مما يدل على خصائص الأجسام المضادة بدائل حيوية تظهر في الأدب 7، 8، 9.

توليد الأجسام المضادة العلاجية يبدأ ترنسفكأيشن من الخلايا المضيفة الثدييات مع ناقلات تحمل جينات الأضداد منها. تصميم ناقلات، خط الخلية والثقافة الشروط هي الاعتبارات الأساسية لإعداد السابقنظام الضغط و.

تسلسل الحمض النووي من الأجسام المضادة يمكن أن يكون مصدر من البنك المخدرات (www.drugbank.ca)، IMGT (www.igmt.org) أو المنشورات البحثية بما فيها براءات الاختراع. على سبيل المثال، وتسلسل تراستوزوماب يتوفر من خلال بنك المخدرات (ID DB: DB00072). تسلسل الأحماض الأمينية من المناطق المتغيرة يمكن أن يخضع تصميم الجينات والاستغلال الامثل للتركيب في الأنواع المضيفة المطلوب. من المهم بالنسبة الأجسام المضادة بدائل حيوية أن يتم إجراء أي تعديل لتسلسل الأحماض الأمينية. مرة واحدة توليفها، الجينات الأجسام المضادة يمكن subcloned في ناقلات المناسبة في الاختيار.

تتكون الأجسام المضادة البشرية من سلسلتين الثقيلة متطابقة وسلسلتين ضوء متطابقة. التعبير ينظم بإحكام كل السلاسل هو ضروري لإنتاج الأمثل للمغاير البروتين مفتش في خلايا الثدييات 10. داخل الإقليم مثل جيدا يجب أن تشكل السندات ثاني كبريتيد بين سلسلة وعدد من التعديلات بعد متعدية يجب أن تكون فيعرضوا خلال الحيوي البروتين. تتوفر التي تم تصميمها خصيصا للتعبير عن الجينات الأجسام المضادة (الرجوع إلى جدول المواد) وهناك عدد من ناقلات. هذه النواقل الضد محددة عادة ما تعبر عن ومناطق ثابتة لسلاسل حد سواء الثقيلة والخفيفة وذلك فقط في مناطق مختلفة من كل سلسلة تتطلب الاستنساخ.

ترنسفكأيشن من الخلايا مع اثنين من بنيات المستقلة (شارك في ترنسفكأيشن) هو النهج الأكثر شيوعا لإيصال الجينات الثقيلة والخفيفة ترميز السلسلة. وهذا هو، هو الدافع وراء كل جين من قبل المروج الخاص بها ونسخها كما سلاسل الأجسام المضادة منفصلة قبل أن يتم تجميعها في الشبكة الإندوبلازمية. من ناحية أخرى، ناقلات متعددة cistronic لها العناصر الداخلية الريبوسوم دخول موقع (IRES) تأسست التي تسمح التعبير عن الجينات متعددة كما نسخة مرنا واحد مع ترجمة المسموح بها من المناطق الداخلية للمرنا 11. في هذه الحالة، تقترن جينات ترميز السلسلة الثقيلة والخفيفة في arrangement لتحقيق التعاون في التعبير عن كل من سلاسل الأجسام المضادة 10 و 12.

في حين أن الخلايا transfected عابر إنتاج البروتين الكافي لإنجاز عدد محدود من التجارب، وخطوط الخلايا ستابلي التي خضعت لاختيار التكامل الجينوم يمكن أن يحقق عائدات أعلى. ارتفاع كميات البروتين تسمح للتنمية فحص المتعلقة في المختبر توصيف ويمكن أن توفر مؤشرا على نوعية الأجسام المضادة في الاعتبار لتطبيقات المصب مثل خط خلية نسيلي والرائدة اختيار المرشحين.

والهدف من هذه المقالة هو لوصف التعبير مستقر وتنقية الأجسام المضادة العلاجية التي تنتج في نظام التعبير الثدييات. في الواقع، يمكن تطبيق هذه الطريقة للتعبير عن الأجسام المضادة بدائل حيوية. ويمكن استخدام طريقة لتوصيف الأولي من الأجسام المضادة قبل الشروع في لالحرجة، وإن كان الظريف تستغرق وقتا طويلاملاحظة تحديد استنساخ المرغوب فيه التصنيع على نطاق أوسع. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم للتعبير عن البروتينات الأخرى، وليس الأجسام المضادة فقط.

يصف بروتوكول مفصلة التالية التعبير عن تراستوزوماب الأجسام المضادة العلاجية. وهذا يتكون من إعداد الحمض النووي ناقلات تليها ترنسفكأيشن مستقرة في خط خلية كلوة-293 و تنقية البروتين الأجسام المضادة باستخدام أسلوب الكروماتوغرافي الآلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يجب استخدام ناقلات التعبير الثدييات مناسبة لهذا البروتوكول. هنا، يتم استخدام بناء واحد يحتوي على اثنين من أشرطة التعبير (أي هو الدافع وراء التعبير سلسلة الثقيلة والخفيفة من قبل المروجين منفصلة). تم استنساخ سلاسل الثقيلة والخفيفة تراستوزوماب سابقا في ناقلات. وكان هذا ناقلات هدية من أندرو Beavil، التي تم الحصول عليها من خلال الأرباح غير هادفة للبلازميد مستودع 13.

1. الإنعاش ومقياس المتابعة من ناقلات الحمض النووي

ملاحظة: كان في استقبال ناقلات الحمض النووي كثقافة طعنة أجار لينة في سلالة كولاي XL-1 الأزرق؛ ناقلات تحمل المقاومة هيغروميسين.

  1. اضافة الى وجود طعنة التلقيح المعقمة أو حلقة في أجار لينة من ثقافة طعنات متتالية ثم لوريا Bertani (LB) لوحة أجار أعدت مع 75 ميكروغرام / مل هيغروميسين للمستعمرات معزولة. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة.
  2. تلقيح مستعمرة واحدة في 5 مل مرق رائع (السل) التي تحتوي على 75 ميكروغرام / مل هيغروميسين. Incuباتي الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة مع 225 دورة في الدقيقة تهتز.
  3. استخدام الثقافة بين عشية وضحاها لإعداد المخزون الجلسرين من الحمض النووي ناقلات عن طريق خلط بلطف 800 ميكرولتر من ثقافة مع 200 ميكرولتر 80٪ الجلسرين في cryovial وتجميد في -80 درجة مئوية.
    1. إضافة 100 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 100 مل السل التي تحتوي على 75 ميكروغرام / مل هيغروميسين في قارورة شاكر حيرة (أي 1/1000 تمييع). احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة مع 225 دورة في الدقيقة تهتز.
  4. بعد ثقافة بين عشية وضحاها، واستخراج وتنقية الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة من إعداد مجموعة ميدي / ماكسي مع الاستثناء التالي. خلال هذه الخطوة، أزل أو و resuspend الحمض النووي النهائي مع الماء (درجة الحموضة 7،0-8،5).
  5. تحقق التركيز والنقاء من الحمض النووي عن طريق قراءات الامتصاصية في 260 و 280 نانومتر ثم تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: اختياري (يوصى): تسلسل الحمض النووي باستخدام بادئات ناقلات محددة لتأكيد الهوية.

2. ترنسفكأيشن مستقرة من كلوة-293 الخلايا

  1. النمو والحفاظ على كلوة-293 الخلايا (خلايا تعليق) وفقا لبروتوكولات موحدة في وسائل الإعلام المصل خالية تستكمل مع 0.1٪ السطحي غير الأيونية في قوارير زجاجية أخرى. الحفاظ على 2 × 10 5 خلية / مل وثقافة فرعية كل يوم الرابع. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 120 دوران دورة في الدقيقة.
    كان ينبغي أن يكون خلايا في الثقافة لمدة لا تقل عن 4 أيام وقبل ما لا يزيد عن 4 أسابيع لترنسفكأيشن: ملاحظة. ويمكن أيضا كلوة-293 الخلايا كما نمت الطبقات الوحيدة في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل أن تستخدم لهذا الإجراء.
  2. في اليوم قبل ترنسفكأيشن والبذور كلوة-293 الخلايا في 3 × 10 5 خلية / مل في الآبار من لوحة ال 12 أيضا في 2 مل من Dulbecco لتعديل النسر وسائل الإعلام (DMEM) تستكمل مع 10٪ للحرارة المعطل مصل بقري جنيني ( FBS). يوم ترنسفكأيشن، تأكد من أن الخلايا قد وصلت 80-90٪ confluency
  3. تخفيف الحمض النووي وpolyethylenimine (PEI) على حدة في وسائل الإعلام ترنسفكأيشن ثم تخلط معا.
    1. تمييع 1.25 ميكروغرام ناقلات الحمض النووي لكل بئر (15 ميكروغرام لمدة 12 بئرا) في 300 وسائل الإعلام ترنسفكأيشن ميكرولتر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    2. تمييع 2.5 ميكرولتر من 1 ملغ حل / مل جزيرة الأمير إدوارد (30 ميكرولتر لمدة 12 بئرا، أي 1: 2 نسبة الحمض النووي لجزيرة الأمير إدوارد) في 300 وسائل الإعلام ترنسفكأيشن ميكرولتر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    3. إضافة الحمض النووي المخفف إلى المخفف جزيرة الأمير إدوارد، مزيج بلطف واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  4. إضافة 50 ميكرولتر من الحمض النووي / جزيرة الأمير إدوارد خليط قطرة قطرة إلى كل بئر من لوحة. صخرة لوحة بلطف لتوزيع الخليط ترنسفكأيشن ثم وضع لوحة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة.
  5. إضافة 50 ميكروغرام / مل هيغروميسين B لكل بئر والعودة لوحة إلى 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 10 يوما.
    ملاحظة: قبل يوم 10، سيكون قد مات خلايا الامم المتحدة وtransfected وفصل من سطح اللوحة، في حين أن الخلايا ستابلي، ستكون قادرة على البقاء وتعلق على لوحة.
  6. استبدال وسائل الإعلام في الآبار مع1/4 حجم وسائل الإعلام الحرة المصل و3/4 حجم DMEM تستكمل مع FBS 10٪ (أي 0.5 مل سائل الإعلام الحرة المصل + 1.5 مل DMEM = 7.5٪ تركيز مصل النهائي)، واحتضان لمدة 4 أيام.
  7. استبدال وسائل الإعلام في الآبار مع 1/2 حجم وسائل الإعلام الحرة المصل و1/2 حجم DMEM تستكمل مع FBS 10٪ (أي وسائل الإعلام الحرة المصل 1 مل + 1 مل DMEM = 5٪ تركيز مصل النهائي)، واحتضان لمدة 4 أيام.
  8. استبدال وسائل الإعلام في الآبار مع 3/4 حجم وسائل الإعلام الحرة المصل و1/4 حجم DMEM تستكمل مع FBS 10٪ (أي 1.5 مل سائل الإعلام الحرة المصل + 0.5 مل DMEM = 2.5٪ تركيز مصل النهائي)، واحتضان لمدة 4 أيام.
  9. استبدال وسائل الإعلام في الآبار مع 2 مل من وسائل الاعلام المصل خالية تستكمل مع 0.1٪ غير الأيونية بالسطح (تركيز مصل النهائي 0٪ أي)، واحتضان لمدة 4 أيام.
    ملاحظة: الحفاظ على 50 ميكروغرام / مل هيغروميسين B ضغط انتقائي على الخلايا خلال التكيف خالية من المصل. خلايا تتكيف مع وسائل الإعلام الحرة المصل فصل من سطح الآبار وقد تتجمع طن تعليق. الرجوع إلى الخطوة 2.1 لظروف التربية مع ملحق إضافي من 50 ميكروغرام / مل هيغروميسين B.
  10. باستخدام ماصة، المزيج بلطف الثقافات تعليق في الخلايا لوحة وتجمع ال 12 أيضا في أنبوب منفصل.
    1. باستخدام عدادة الكريات، تعداد خلايا المجمعة والبذور في 30 مل سائل الإعلام خالية من المصل في دورق مخروطي في 2 × 10 5 خلية / مل. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 120 دوران دورة في الدقيقة. ثقافة فرعية وتوسيع كل يوم الرابع.
  11. مواصلة توسيع حجم الثقافة لكثافة الخلايا المطلوبة للحصول على 10 قارورة في 1 × 10 7 خلايا / قارورة لحفظ البرودة في النيتروجين السائل. تجميد الخلايا في وسائل الإعلام المصل خالية تحتوي على 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
    ملاحظة: مكيفة وسائل الإعلام التي تحتوي على الأجسام المضادة يمكن أن تحصد في كل ثقافة فرعية لتأكيد إنتاج البروتين أو استخدامها لتحسين الظروف تنقية. حصاد سائل الإعلام مكيفة والحفاظ على الخلايا لثقافة فرعية، الطرد المركزي الثقافة في300 x ج لمدة 5 دقائق ثم يصفى تعقيم طاف من خلال مرشح 0.22 ميكرون. يجوز إبقاء طاف تصفيتها عند 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع أو -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.

3. على نطاق واسع جسم إنتاج من دفعة اكتسى الثقافة

ملاحظة: يمكن اتباعها إنتاج الأجسام المضادة على من الخطوة 2.11 حيث يتم توسيع الخلايا الموجودة لكثافة الخلايا المطلوبة على أساس دفعة حجم ثقافة اكتسى أن يكون الإعداد. خلاف ذلك، والخلايا التي تم إذابة من الحفظ بالتبريد تبدأ في هذه المرحلة مرة واحدة موسعة لكثافة الخلية المناسبة والحجم. ويمكن استخدام المكملات ثقافة مختلفة لتحسين إنتاج الأضداد. استخدام تريبتون لزيادة يتجلى العائد الأجسام المضادة في هذا البروتوكول.

  1. خلايا البذور في 2 × 10 5 خلية / مل في وسائل الإعلام الحرة المصل 100 مل في اثنين من قوارير مخروطي (للمقارنة بين عائدات الضد من ثقافات الامم المتحدة وتستكمل وتستكمل المواد الغذائية). الثقافة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2
  2. بعد 24 ساعة، إضافة تريبتون إلى تركيز النهائي من 0.5٪ إلى ثقافة تستكمل المغذيات. تعادل حجم ثقافة تستكمل الامم المتحدة مع وسائل الإعلام خالية من المصل.
  3. من يوم 8، نفذ عدد الخلايا من الثقافات يوميا باستخدام عدادة الكريات لمراقبة سلامة الخلية. حصاد supernatants الثقافة مرة واحدة بقاء الخلية أقل من 80٪.
    1. حصاد طاف بواسطة الطرد المركزي من الثقافات في 3000 x ج لمدة 15 دقيقة ثم يصفى تعقيم طاف (التي تحتوي على الأجسام المضادة) من خلال مرشح 0.22 ميكرون. تخزين supernatants في 4 درجات مئوية (قصيرة الأجل) أو تجميد في -20 درجة مئوية (على المدى الطويل).

4. الأجسام المضادة تنقية من الانجذاب اللوني باستخدام الآلي البروتين سريع اللوني السائل نظام (FPLC)

ملاحظة: عموما يمكن أن يطبق الإجراء التالي على أكثر الأنظمة الآلية. تنقية لا يمكن أن يؤديها في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية (إذا كان يتم الاحتفاظ نظام FPLC في غرفة باردة).سلسلة من الاختبارات الكشفية لا يمكن أن يؤديها لتحديد الظروف المثلى لتنقية بما في ذلك مصفوفة الأعمدة المناسبة، العازلة، شطف العازلة ودرجة الحموضة ملزمة لضمان استرداد الحد الأقصى من الأجسام المضادة تنقيته من وسائل الإعلام مكيفة (يرجى الرجوع إلى قسم النتائج). الظروف المثلى تعتمد على الأجسام المضادة أو البروتين يجري تنقيتها. أجريت التنقيات على نظام FPLC الآلي. أجريت التنقيات في درجة حرارة الغرفة باستخدام البروتين 5 مل عمود.

  1. إعداد مخازن التالية باستخدام الماء عالى النقاء والتكيف مع درجة الحموضة أوصى ثم تصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرون.
    1. إعداد 1 لتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.4 (العازلة ملزمة) عن طريق خلط ما يلي: 0.14 M كلوريد الصوديوم، 0.0027 M بوكل، 0.01 م نا 2 هبو 4 و 0.001 M KH 2 PO 4. ضبط درجة الحموضة إذا لزم الأمر قبل تصفية العازلة.
    2. إعداد 500 مل من 0.1 M الجلايسين حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 2.7 (شطف العازلة). ضبط درجة الحموضة قبل تصفية برتقاليإيه.
    3. تجهيز 50 مل من 1 M تريس درجة الحموضة (العازلة تحييد) 9.0.
  2. ضمان كافة الاتصالات السلطة ونظام الاتصالات مع الكمبيوتر مصنوعة. وينبغي أن تكون أجهزة مرئية في برنامج وحدة "نظام التحكم". ومن المقرر ضمان خلية للأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر الطول الموجي. اختياري: معايرة درجة الحموضة متر وإذا كان متصلا واستخدامها.
  3. تزج أنابيب مدخل من A، B ومضخة العينة في الماء عالى النقاء لغسل النظام. تطهير مضخات مع حقنة حالة وجود الهواء في الأنبوب أو اشتباه في الهواء في النظام. يغسل النظام مع المياه من خلال التشغيل اليدوي عن طريق وحدة تحكم النظام أو عبر طريقة تلقائية. نلاحظ أن ضغط، الموصلية، تتبع UV280 ودرجة الحموضة على ثبات وأن الحد الضغط عن العمود لا يتم تجاوز وفقا لمواصفات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: شذوذ قد تشير إلى الهواء أو انسداد في النظام التي ينبغي معالجتها قبل المتابعة.
  4. في وحدة تحكم النظام، بدء معدل التدفق في 1مل / دقيقة يدويا عن طريق مضخة وإما في الحمل (تجاوز عينة حلقة) أو حقن (خلال الحلقة العينة) موقف لبدء ربط العمود. أنابيب نظام قطع الاتصال عند مدخل موضع العمود وإزالة سدادة متصلا مدخل عمود.
    1. السماح لتدفق المياه من قطرة قطرة نظام الأنابيب على رأس العمود ثم إرفاق أنابيب نظام إلى العمود. وجود مدخل عمود ومدخل المناسب تفيض مع قطرات من الماء يضمن اتصال خالية من فقاعات الهواء.
  5. إرفاق منفذ عمود في منفذ المصب والتحقق يتم تثبيتها بإحكام جميع التجهيزات. مع العمود تعلق الآن على النظام، لا تتجاوز حدود الحد الأقصى الضغط ومعدل التدفق على النحو المبين في مواصفات العمود.
  6. غسل العمود مع 5 أحجام العمود (CV) من الماء. إذا لزم الأمر، ومواصلة غسل العمود حتى استقر UV280 البحث عن المفقودين.
  7. تزج أنابيب مدخل من ألف في التجليد عازلة، B في شطف العازلة ومضخة العينة في المخزن ر ملزمس تتوازن النظام في مخازن الصحيحة. ملء أنابيب مدخل مع العازلة باستخدام PumpWash من التشغيل اليدوي.
  8. في وحدة في "محرر أسلوب 'من البرنامج، استخدم معالج طريقة لإعداد وسيلة اللوني تقارب للعمود الذي يهدف إلى استخدامها.
    ملاحظة: الأنظمة الأوتوماتيكية لFPLC تأتي مع أساليب ما قبل مليئة الإعدادات الموصى بها (أي معدل التدفق والحد من الضغط) وتشغيل الخطوات بناء على عمود (الصانع، مصفوفة وحجم) التي اختيرت لتنقية.
    1. اتبع الخطوات التالية لتشغيل البروتين واللوني تقارب:
      1. تتوازن النظام مع 5 السيرة الذاتية العازلة ملزمة وجمع flowthrough في حاوية النفايات.
      2. عينة الحمل على العمود (حجم ليتم تحميلها يتم تحديد يدويا في طريقة) وجمع flowthrough في وعاء منفصل.
      3. يغسل النظام مع 5 السيرة الذاتية العازلة ملزمة وجمع flowthrough في وعاء منفصل.
      4. العمود أزل مع isocrat 5 السيرة الذاتيةجيم تجزئة باستخدام شطف العازلة وجمع عينة الأجسام المضادة النقاء كما الكسور جامع الكسر.
      5. تتوازن النظام مع 5 السيرة الذاتية العازلة ملزمة وجمع flowthrough في حاوية النفايات.
  9. مرة واحدة كانت طريقة الإعداد، تحديد حجم وسائل الإعلام مكيفة ليتم تطبيقها على العمود وحفظ الأسلوب.
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم المحدد في طريقة 5-10 مل أقل من الحجم الفعلي لتجنب إدخال الهواء أثناء تشغيل العينة. وحدة التخزين المحددة المستخدمة في هذا البروتوكول هو 90-120 مل.
  10. غمر أنابيب ضخ العينة في الإناء الذي يحتوي على وسائل الإعلام مكيفة.
  11. تحضير وعاء منفصل لجمع flowthrough عينة عن طريق الأنابيب منفذ محدد.
    ملاحظة: من المهم لجمع flowthrough في حالة حدوث خطأ أثناء التشغيل أو قدرة ربط العمود تجاوز تتطلب flowthrough إلى إعادة تطبيق إلى العمود أو ص تنقيةepeated.
  12. إعداد أنابيب جمع في جامع الكسر. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة تحييد لكل 1 مل حجم الكسر. سيقوم النظام FPLC أزل تلقائيا الكسور في أنابيب جمع.
  13. في وحدة 'مكافحة النظام' من البرنامج، افتح طريقة ليتم تشغيلها.
    ملاحظة: يتم بدء تشغيل الأسلوب في سلسلة من الصفحات التي تشمل فحص متغيرات طريقة، والإعداد جامع جزء وتحديد اسم الملف نتيجة وموقع التخزين.
  14. انقر فوق ابدأ لبدء التشغيل. ويمكن رصد التشغيل في وحدة 'مكافحة النظام'.
  15. عند الانتهاء من تشغيل تنقية، والتحقق من اللوني مما أسفر عن وحدة 'تقييم' في برنامج النظام.
  16. الجمع بين جميع الكسور التي تحتوي على البروتين في أنبوب، وتبادل عازلة منفصل والتركيز في برنامج تلفزيوني باستخدام جهاز الطرد المركزي فلتر مع 30 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قطع. تنفيذ الخطوات الطرد المركزي وفقا لالصانعتعليمات.
  17. قياس تركيز الأجسام المضادة باستخدام فحص الحمض bicinchoninic (BCA) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  18. إذا المدى تنقية آخر هو أن يقوم رئيس وأنابيب ضخ العينة في المخزن ملزمة وكرر الخطوات 4،9-4،14.
  19. عند الانتهاء من يدير تنقية، تزج أنابيب مدخل من A، B ومضخة العينة في الماء عالى النقاء ويغسل نظام والعمود كما يؤديها في الخطوة 3.
  20. غمر ألف وباء وعينة مضخة الأنابيب في 20٪ من الإيثانول وتكرار إجراء غسيل للتخزين للنظام والعمود.
  21. فصل عمود من منفذ المصب واستبدال العمود سدادة، ثم قطع عمود في مدخل واستبدال سدادة، إعادة أنابيب إلى النظام. تخزين العمود في 4 درجات مئوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وأكد إنتاج مستقر من تراستوزوماب التي كتبها transfected خلايا كلوة-293 باستخدام التداخل طبقة الحيوي (BLI) على النحو المبين في الشكل 1. تم إنشاء منحنى قياسي مفتش عن طريق قياس معدل ملزم بين مستوى الأجسام المضادة مفتش والبروتين وجهاز الاستشعار البيولوجي (الشكل 1A). تم قياس عينة طاف الخام على نحو مماثل، ثم تركيزه محرف من المنحنى القياسي (الشكل 1B). وقد تم قياس تركيز طاف إلى أن ما يقرب من 25 ميكروغرام / مل (عينات من 50 مل جمعها في ثقافة فرعية) بعد أسبوعين من التكيف خالية من المصل وقبل إنشاء خلايا للثقافات دفعة اكتسى.

طاف جمعها في كل ثقافة فرعية بعد أن تم تجميع التكيف خالية من مصل الدم ويستخدم لتحسين الظروف تنقية. تم إجراء استطلاع للمخازن ملزمة وشطف كما هو مبين في الشكل 2 الشكل 2A بناء على إشارة UV280. مرة واحدة على البروتين equilibrates عمود، وزيادة في إشارة UV280 تمثل عينة التحميل. ومن المقرر أن طاف flowthrough يمر خلال العمود (التي تحتوي على البروتينات غير منضم التي تمتص الأشعة فوق البنفسجية في هذا الطول الموجي) هذه الزيادة، في حين تم القبض على الأجسام المضادة من جانب العمود. مرة واحدة العينة قد انتهى التحميل، وإشارة UV280 ترجع إلى الأساس، ويتم غسلها أي البروتينات غير منضم المتبقية بعيدا. يحدث شطف مع انخفاض درجة الحموضة لدرجة الحموضة المثلى للافراج عن الأجسام المضادة التي تم التقاطها بواسطة عمود، يصور زيادة في إشارة UV280 مع الأجسام المضادة مزال مجزأة والتي تم جمعها من قبل جامع الكسر. في جميع أنحاء تشغيل العينة، يجب أن تبقى التغييرات الموصلية على أساس تركيز الملح في مخازن في حين ضغط النظام ثابت نسبيا. وقد مستكشف شطف المثلى، ودرجة الحموضة وعازلة أولا (الشكل 2B)؛ لوحظ أن الأجسام المضادة ايلuted أكثر كفاءة من العمود في الرقم الهيدروجيني أقل باستخدام إما 0.1 M الجلايسين حمض الهيدروكلوريك أو حمض الستريك. ومع ذلك، أقل من الرقم الهيدروجيني 2.7 لم يكن هناك مزيد من التحسن في التشكيل شطف. وبالإضافة إلى ذلك، قمم شطف مع 0.1 M الجلايسين حمض الهيدروكلوريك يبدو أقل توسيع بالمقارنة مع 0.1 M حمض الستريك في درجة الحموضة مماثلة (الشكل 2B). وفي وقت لاحق، تم استخدام 0.1 M الجلايسين حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 2.7 عازلة لتحسين الظروف العازلة ملزمة (الشكل 2A). وتمت مقارنة تأثير مخازن ملزمة مختلفة على شطف أيضا (الشكل 2A). ولوحظ أن برنامج تلفزيوني ودرجة الحموضة 7.4 و 20 ملي فوسفات الصوديوم درجة الحموضة 7 كانت لهما ملامح شطف مماثلة، في حين أن إضافة 3 M كلوريد الصوديوم إلى عازلة فوسفات الصوديوم (لتعزيز الأجسام المضادة ملزمة للعمود) لم يكن مواتيا. نظرا لسهولة إعداد العازلة في برنامج تلفزيوني، وقد تم اختيار برنامج تلفزيوني 7.4 درجة الحموضة مثل العازلة ملزمة لالتنقيات في المستقبل.

والاستشرابية تنقية دفعة اكتسى cultuوتظهر الدقة في الشكل (3). تتم مقارنة ثقافة تستكمل تريبتون للثقافة تستكمل الامم المتحدة. ولوحظ أن إضافة تريبتون للثقافة تستكمل أدت إلى زيادة إشارة UV280 خلال الخطوة تحميل عينة، بالمقارنة مع الثقافة تستكمل الامم المتحدة. أسفرت ثقافة تستكمل تريبتون 3.8 ملغ وتستكمل الامم المتحدة ثقافة 1.7 ملغ من تراستوزوماب، بناء على بروتين تعافى بعد تبادل العازلة والتركيز. وأكد لمراقبة الجودة من الأجسام المضادة تنقيته من الصوديوم دوديسيل الكهربائي كبريتات بولي أكريلاميد هلام (SDS-PAGE) كما هو مبين في الشكل (4). تراستوزوماب نمت في تستكمل الامم المتحدة والشروط تستكمل تريبتون النتائج في ملفات تعريف الأجسام المضادة مماثلة تحت غير الحد والحد من الظروف. كما هو متوقع، فرقة بارزة في حوالي 150 كيلو دالتون يؤكد الأجسام المضادة مطوية بشكل صحيح؛ وتمثل عصابات أشكال أخرى مجزأة من الأجسام المضادة، نتيجة الكسر ثاني كبريتيد السندات وartefac-طريقة التي يسببهات. وبالمثل، شريطين في 50 و ما يقرب من 25 كيلو دالتون تؤكد وجود الأجسام المضادة سلاسل الثقيلة والخفيفة، على التوالي.

شكل 1
الشكل 1: التأكيد من إنتاج البروتين من الخلايا كلوة-293 ستابلي باستخدام التداخل طبقة الحيوي (BLI). (أ) تم إنشاؤها منحنى قياسي من خلال قياس معدل ملزم من مفتش مستوى الأجسام المضادة لبروتين وجهاز الاستشعار البيولوجي أكثر من 120 ثانية (رمادي) تليها عينة طاف الخام من تراستوزوماب transfected جزيرة الأمير إدوارد (جزيرة الأمير إدوارد، Tmab، أسود). ومحرف (ب) تركيز بروتين الأجسام المضادة في طاف الخام (فتح دائرة سوداء) من المنحنى القياسي (مغلقة الدوائر السوداء) من خلال التآمر تركيز القياسية مفتش الأضداد مقابل معدل ملزمة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا و igure.

الشكل 2
الشكل 2: الاستشرابية تنقية شطف وملزمة التجارب الكشفية العازلة. (A) وصفت خطوات تنقية وفقا لإشارة UV280 (الأزرق وخطوط خضراء أو سوداء)؛ عينة تحميلها على العمود تليها عمود يغسل ليغسل البروتينات غير منضم ثم شطف من البروتين ملزمة من العمود. وتتم مراقبة قياس درجة الحموضة (خط أحمر)، والموصلية (الخط البني) وضغط النظام (خط رمادي) في جميع أنحاء تشغيل. تم اختبار ثلاثة مخازن لأفضل ملزمة من تراستوزوماب إلى العمود وتجرف من البروتين غير منضم إلى تعظيم العائد شطف. (ب) 0.1 M جليكاين، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 2،5-3،3) و 0.1 M حمض الستريك (درجة الحموضة 2،5-3،5) تم اختبار مخازن لشطف الأمثل للتراستوزوماب من البروتين عمود.الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): الاستشرابية تنقية تراستوزوماب (TmAb) دفعة اكتسى الثقافات نمت مع أي ملحق أو تستكمل مع تريبتون. كانت ستابلي الخلايا كلوة-293 الإعداد في 2 × 10 5 خلية / مل وتربيتها لمدة 8 أيام إما من الامم المتحدة وتستكمل (120 مل؛ خط أسود) أو تستكمل مع 0.5٪ تريبتون (90 مل، الخط الأخضر). بعد الحصاد، وتنقيته supernatants باستخدام برنامج تلفزيوني 7.4 درجة الحموضة (العازلة ملزمة) و 0.1 M الجلايسين حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة (شطف العازلة) 2.7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل (4): تحليل تراستوزوماب تنقيته بواسطة SDS-PAGE. وأخذت عينات (+) أو الثقافات تستكمل تريبتون بنسبة 10٪ SDS-PAGE تحت ظروف غير مخفضة أو خفض - ما يقرب من 2 ميكروغرام من تراستوزوماب تنقيته من الامم المتحدة وتستكمل (). اتسخت الجل مع coomassie R-250. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تفاصيل هذا البروتوكول ترنسفكأيشن والتعبير مستقر وتنقية الأجسام المضادة العلاجية في كلوة-293 الخلايا. التعبير مستقر للجينات الجسم المضاد هو الخطوة الأولى في توليد خط الخلية المنتجة للأجسام المضادة لتطوير وتصنيع الأجسام المضادة العلاجية. في حين الصيني الهامستر المبيض (CHO) خلايا تظل منصة التعبير المفضل للالبروتينات العلاجية، خط خلية كلوة-293 تكتسب أهمية مع إدراك أن البروتينات التي تنتج في هذه الخلايا هي مباراة أقرب إلى طبيعيا البروتينات البشرية، من حيث مشاركة التعديلات -translational وظيفة 14 و 15.

خطوط الثدييات خلية تضم CHO (على سبيل المثال، شو-DG44 وCHO-K1) فضلا عن عدم المناعي المفرزة للخطوط الخلايا الفئران ب NS0 وSP2 / 0 تستخدم في الغالب في إنتاج الصيدلانية البيولوجية. وتستند أنظمة التعبير على أساس هذه خطوط الخلايا على بروك اختيارesses حيث يتم يسببها استنساخ إنتاج عالية واختيار من خلال إضافة الإضافية للدواء انتقائية محددة 16 و 17. وبالتالي يمكن للعملية الاختيار لاستنساخ مستقرة تكون شاقة وتستغرق وقتا طويلا. بالمقارنة مع هذه الأساليب القائمة، خط خلية كلوة-293 transfects بقوة مع كفاءة عالية. تم تبسيط عملية الاختيار وتتكيف بسهولة جدا لثقافة تعليق المصل خالية، مما يجعلها نظام التعبير المثالي لإنتاج معملي من البروتينات 18.

وجود قيود على ترنسفكأيشن مستقر هو الوقت الذي قدر عملي من البروتين يمكن أن تنتج وتستخدم في التجارب. لمحاولة التغلب على هذا، يصف البروتوكول الحالي خطوة زراعة التي يمكن أن تحقق كميات كبيرة من البروتين في غضون 3-6 أسابيع من ترنسفكأيشن. الدفعة اكتسى الثقافات (الإنتاج على نطاق واسع) إتاحة الفرصة لإنتاج كميات كبيرة منالأجسام المضادة لإعداد التجارب في المختبر توصيف في الفترة التي تسبق اختيار خط الخلية نسيلي والمرشحين الرصاص. وهذا له مزايا واضحة على ترنسفكأيشن عابرة، والتي يمكن أن تتطلب كميات أكبر من الحمض النووي والكواشف. وبالإضافة إلى ذلك، فإن العائد البروتين لا يمكن استنساخه من دفعة لدفعة منذ التعبير هو مؤقت والتي تحدد كفاءة ترنسفكأيشن فقط.

قدمت إضافة تريبتون في هذا البروتوكول زيادة الغلة في التعبير البروتين. وقد تبين إضافة تريبتون على الثقافات ترنسفكأيشن سابقا لتحسين تخليق البروتين 19، 20. أسفرت ثقافة تريبتون تستكمل في تحسين غلة الأجسام المضادة تراستوزوماب من 40 ملغم / لتر مقابل ثقافة الامم المتحدة وتستكمل من 14 ملغ / لتر (الشكل 3). SDS-PAGE التحقق منها ما يلي: (1) تم إنتاج الأجسام المضادة بشكل صحيح؛ و (2) إضافة تريبتون لم يغير الهيكل على أساس كومparison من العصابات الأجسام المضادة في إطار غير الحد والحد من الشروط (الشكل 4). إضافة تريبتون على ثقافات اختيارية، ويستخدم بشكل خاص لتحقيق عائدات أعلى من البروتين. واعتبرت مكملات اخرى لتعزيز التعبير البروتين مثل الزبدات الصوديوم وحمض فالبوريك 21، 22، 23.

الحاجز الأول من البروتوكول هو تأكيد أن بروتين يتم إنتاجها بواسطة خط الخلية transfected. هذه الخطوة يمكن تنفيذ أي وقت بعد فترة أسبوعين من الضغط الانتقائي المستخدمة لتحديد transformants مستقرة. ويمكن استخدام عدد من الأساليب لتأكيد إنتاج البروتين بما في ذلك التداخل طبقة الحيوي (الشكل 1) أو نهج مماثل لELISA مفتش. بدلا من ذلك، يمكن إجراء طخة غربية باستخدام الأجسام المضادة كشف المضادة للمفتش لتحديد بروتين الأجسام المضادة في طاف الخامأو تنقية العينة.

وقد أظهرت باحثون آخرون أن ارتفاع كفاءة ترنسفكأيشن يتحقق باستخدام الخلايا الملتصقة في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل 24. وجود ملاحق من أصل حيواني غير مرغوب فيه لإنتاج الصيدلانية البيولوجية. ولذلك، فإن التكيف متتابعة إلى وسائل الإعلام خالية من المصل هو خطوة حاسمة في البروتوكول التي تتطلب الصبر والرصد الدقيق للبقاء الخلية. فترة دوران 4 أيام اقترح في هذا البروتوكول هو دليل وحتى إذا واجهت مشاكل في تركيز مصل معين، فمن المستحسن أن الخلايا يتم subcultured 2-3 مرات في نسبة السابقة من وسائل الإعلام خالية من المصل المحتوية على مصل قبل المتابعة مع نسبة المقبلة. قبل إنشاء الثقافات دفعة والحفظ بالتبريد من الخلايا، نرى أن معظم خطوط الخلايا وتعتبر تكيفت تماما بعد ثلاث ثقافات فرعية في 100٪ وسائل الإعلام الحرة المصل.

واحدة من أهم الخطوات في مرحلة تنقية هو رانه الكشفية لالظروف المثلى ومخازن لضمان كفاءة ملزمة من الأجسام المضادة لعمود وشطف ثم كامل من العمود (الشكل 2). وسائل الإعلام مكيفة التي تم جمعها في كل ثقافة فرعية هي مفيدة لهذا الغرض. في هذه الحالة، وشطف العازلة حمض الستريك درجة الحموضة 3.5 يوصى بها عموما للبروتين وكان اللوني تقارب غير صالحة للشطف من تراستوزوماب من العمود. وأظهرت التجربة الكشفية باستخدام اثنين من مخازن شطف مختلفة في مختلف الحموضة بوضوح أنه حتى داخل نطاق ضيق من الرقم الهيدروجيني اختبار، ودرجة شطف تأثر (الشكل 2B).

من حيث التجهيز النهائي من الكسور الأجسام المضادة بعد تنقيتها، والأجسام المضادة يمكن العازلة-تبادل باستخدام عمود تحلية إما عن طريق التشغيل اليدوي أو الآلي. بدلا من ذلك، غشاء غسيل الكلى يمكن أن تستخدم أيضا. تركيز البروتين النهائي يمكن تحديده من خلال أساليب البروتين الكمي الأخرى بما في ذلك قياسللإشارة الامتصاصية في 280 نانومتر مع تركيز بالضد من القانون البيرة لامبرت على أساس معامل الانقراض من الأجسام المضادة.

وقد أنتجت هذا البروتوكول بنجاح البروتين الضد من تراستوزوماب بواسطة ترنسفكأيشن مستقرة من كلوة-293 الخلايا. تم تنقية الأجسام المضادة، وتميزت لتأكيد سلامة. الخطوات في هذا البروتوكول تفاصيل إعداد الحمض النووي، وترنسفكأيشن مستقرة تليها التكيف خالية من المصل والإنتاج على نطاق واسع وتنقية الآلية يمكن نقلها إلى إنتاج بروتينات أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pFUSE vector series InvivoGen N/A Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.
mAbXpress vector series ACYTE Biotech Pty Ltd. Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 vector N/A N/A Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.  Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS vector series Lonza Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.
Multi-cistronic vector series 1 N/A N/A Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic vector series 2 N/A N/A Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ Addgene 61883 Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro Agar Jomar Life Research fas-hg-s Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin.
Fast-Media Hygro TB Jomar Life Research fas-hg-l Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin. 
Glycerol, BioXtra, ≥99% Sigma-Aldrich G6279 Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit Astral Scientific G221020 Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).
FreeStyle 293-F Cells Life Technologies R790-07 HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.
FreeStyle 293 Expression Medium Life Technologies 12338-018 Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.
Kolliphor P188 Sigma-Aldrich K4894 Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
DMEM, high glucose  Life Technologies 11995-065
Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum Life Technologies 10082-147
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000  Polysciences, Inc. 23966 Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use.
OptiPro SFM Life Technologies 12309-050 Transfection formulated serum-free media
Hygromycin B Solution Jomar Life Research ant-hg-1
Dimethylsulphoxide (DMSO) Thermo Fisher Scientific AJA2225
Tryptone (casein peptone) Thermo Fisher Scientific LP0042B Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. 
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml Astral Scientific 09-2051-100
HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column Sigma-Aldrich GE17-0403-01
AKTApurifier 100 GE Healthcare 28406266 Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.
Glycine-HCl Sigma-Aldrich G2879
Citric Acid, monohydrate Astral Scientific BIOC2123
Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate  Astral Scientific BIOCB0035
1 M Tris-HCl solution pH 9.0 Astral Scientific BIOSD8146
Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO) Merck Millipore UFC803008/UFC903008 Used to buffer exchange and concentrate purified protein.
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227
BLItz System fortéBIO 45-5000 Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.
Protein A biosensors fortéBIO 18-5010
Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution Astral Scientific 786-502
Ammonium Persulfate (APS) Astral Scientific AM0486
TEMED Astral Scientific AM0761
Coomassie Brilliant Blue R-250 Astral Scientific 786-498
Precision Plus Dual-Color Protein Standard Bio-Rad 1610374

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nelson, A. L., Reichert, J. M. Development trends for therapeutic antibody fragments. Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).
  2. Drake, P. M., Rabuka, D. An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety. Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).
  3. Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Bispecific antibodies. Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).
  4. Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).
  5. Food and Drug Administration. 22, Food and Drug Administration. eds U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), & Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) (2015).
  6. European Medicines Agency. 13, European Medicines Agency. eds European Medicines Agency (EMA) & Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) (2014).
  7. Lopez-Morales, C. A., et al. Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab. Biomed Res Int. 2015, 427235 (2015).
  8. Jung, S. K., et al. Physicochemical characterization of Remsima. MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).
  9. Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
  10. Li, J., et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).
  11. Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus. Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).
  12. Ho, S. C., et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).
  13. Dodev, T. S., et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4, 5885 (2014).
  14. Walsh, G. Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals. Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).
  15. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), 96 (2008).
  16. Bebbington, C. R., et al. High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker. Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).
  17. Kaufman, R. J., et al. Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells. Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).
  18. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  19. Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).
  20. Pham, P. L., et al. Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency. Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).
  21. Yang, W. C., et al. Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers. Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).
  22. Backliwal, G., et al. Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures. Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).
  23. Jiang, Z., Sharfstein, S. T. Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility. Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).
  24. Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 119، بدائل حيوية، والأجسام المضادة، الأجسام المضادة العلاجية، وإنتاج الأجسام المضادة، وإنتاج البروتين، كلوة-293، ترنسفكأيشن، وتنقية البروتين، تقارب اللوني، FPLC
مختبر إنتاج مقياس وتنقية من الأجسام المضادة العلاجية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elgundi, Z., Sifniotis, V., Reslan,… More

Elgundi, Z., Sifniotis, V., Reslan, M., Cruz, E., Kayser, V. Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody. J. Vis. Exp. (119), e55153, doi:10.3791/55153 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter